NO319586B1 - Monoklonale antistoffer som gjenkjenner TIE-reseptor og deres anvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt antistoffer som er reaktive med Tie, en tyrosinkinasereseptor funnet på forskjellige endotelceller og i visse tumorcellepopulasjoner. I tillegg angår den foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter til å detektere Tie i en biologisk prøve og fremgangsmåter til diagnostisering av sykdommer, anvendelse av antistoffet til å fremstille et farmasøytisk preparat og en farmasøytisk sammensetning som inneholder antistoffet. Spesifikt angår foreliggende oppfinnelse anti-Tie-monoklonale antistoffer som et diagnostisk verktøy for å detektere visse hematopoetiske celler og hematologiske og angiogeneseassosierte betingelser, som et verktøy for billeddannelse av blodkar og som et terapeutisk middel.

Kardiovaskulære sykdommer og kreft er meget vanlig i vestlige land, og disse sykdomsgrupper er økonomisk viktige fordi pasienter som lider av dem, typisk er' sykmeldte og har behov for å bli behandlet i lange perioder. Blodkar spiller en viktig rolle i utvikling av kardiovaskulære sykdommer såvel som i patogenesen til kreft. En sentral rolle i patogenesen til vaskulære sykdommer innehas av endotelceller som forer blodkarenes indre vegger. Traumer og metabolske forstyrrelser i endotelceller gir opphav til såkalte aterom api akker og videre til arteriosklerose. Neovaskul ari sering indusert ved kreftceller via vekstfaktorer som stimulerer endotelceller er en viktig hendelse i forskjellige cancere. Det er kjent fra eksperi-mentelle undersøkelser at for å utvikle og dyrke kolonier av kreftceller er det nødvendig med neovaskularisering for å sikre transport av næringsmidler og oksygen inn i det voksende vevet.

Cellulær adferd som er ansvarlig for utvikling, opprettholdelse og reparasjon av differensierte celler og vev, er hovedsakelig regulert ved intercellulære signaler formidlet via vekstfaktorer og lignende ligander og deres reseptorer. Reseptorene er lokalisert på overflaten til responderende celler, og de binder peptid eller polypéptid vekstfaktorer såvel som andre hormonlignende ligander. Som et resultat av denne interaksjon, skjer hurtige biokjemiske forandringer i de responderende celler som fører både til en hurtig og en langtids justering av cellulær ge-nekspresjon. Flere reseptorer assosiert med forskjellige celleoverflater kan binde spesifikke vekstfaktorer.

Tyrosinfosforylering er en av nøkkelmåtene til signaltransduksjon over plasma-membranen. Flere for tiden kjente protein tyrosinkinasegener koder transmembrane reseptorer for polypeptidvekstfaktorer og hormoner, såsom epidermal vekstfaktor (EGF), insulin, insulinlignende vekstfaktor (IGF-I), blodplateavledede vekstfaktorer (PDGF-AA, AB og BB) og fibroblastvekst-faktorer (FGF). Se f.eks. Heldin og Westermark, Cell Reg., 1:555-556 (1990); Ullrich og Schlessinger, Cell, 61:2243-354, (1990). Vekstfaktor-reseptor på endotele celler er av spesiell interesse pga. den mulige innblanding av vekstfaktorer, såsom FGF i forskjellige viktige fysiologiske og patologiske prosesser: angiogenese, arteriosklerose og inflammatoriske sykdommer (Folkman og Klagsbrun, Science, 235:442-447, 1987). I tillegg er reseptorene til flere hematopoetiske vekstfaktorer tyrosinkinaser. Disse inkluderer den koloni stimulerende faktor 1 reseptor (Sherr et al., Cell, 41:665-676, 1985) og c-kit, stamcellefaktorreseptor (Huang et al., Cell, 63:225-233, 1990).

Reseptoren for tyrosinkinaser kan deles i evolusjonære underfamilier på basis av strukturell likhet og forskjeller. Disse proteiner avviker i deres spesifisitet og affinitet (Ullrich og Schlessinger, supra). Tyrosinkinasereseptorer er generelt glykoproteiner som består av et ekstracellulært domene, som er istand til å binde vekstfaktor, et transmembrandomene som vanligvis er en alfa-heliks del av proteinet, et juxtamembrandomene hvor reseptoren kan reguleres ved f.eks. proteinfosforylering, et tyrosinkinasedomene som er den enzymatiske komponent til reseptoren og en karboksyterminal hale som i mange reseptorer er innvolvert i gjenkjennelse og binding av deres spesifikke substrater.

Nylig er en ny endotelcellereseptor tyro sinki nase, designert Tie, blitt beskrevet i internasjonal patentpublikasjon WO 93/14124. Tie er et akronym som tilsvarer tyrosinkinaseholdig immunoglobulin og EGF-lignehde domener. Tie er vurdert å være nyttig ved diagnose og behandling av visse sykdommer som omfatter endotelceller og assosierte Tie-reseptorer, såsom neoplastiske sykdommer som involverer tumorangiogenese, sårheling, tromboemboliske sykdommer, aterosklerose og inflammatoriske sykdommer.

Det var derfor en hensikt å tilveiebringe nye monoklonale antistoffer som reagerer mot Tie. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Oppfinnerne har nå fremstilt monoklonale antistoffer mot den ekstracellulære del av endotelcellereseptortyrosinkinase, Tie. Disse monoklonale antistoffer er blitt benyttet til å detektere Tie i cellekulturer og ved in vivo immunohistologiske tester. Resultatene angir at antistoffer som spesifikt gjenkjenner de ekstracellulære deler av Tie kan anvendes for overvåking av hematopoetiske og endotelceller i vevsprøver og i en organisme og for diagnostisering av forskjellige typer av kreftsvulster. Fig. 1 representerer en analyse av MOLT-4 og HEL-celler ved immunofluorescens for Tie og flowcytometri.

Fig. 2 viser immunoperoksidasefarging av Tie i humane blodceller.

Fig. 3 viser biodistribusjon av I-merket monoklonalt antistoff 3C4C7G6 til utvalgt målvev i mus som har et 8 dager gammelt sår. Fig. 4. Immunohistokjemisk farging av Tie i normal hjerne, multiform glioblastom og melanom metastase. Skalastrek: 0,05 mm. Fig. 5. Immunohistokjemiske farginger av hemangioblastom og hemangiopericytom med Tie og vWF eller CD44 som endotelcellespesifikke markører (40x). Fig. 6. Fordeling av anti-TIE-antistoff 10F11 (%ID/g) i viktige organer ved 48, 72, 96 og 120 timer. (N= henholdsvis 3, 3, 3 og 4). Fig. 7. Fordeling av ariti-TIE-antistoff 3c4 (%ID/g) i viktige organer ved 6, 24, 48, 72, 96 og 120 timer. (N= henholdsvis 3, 3, 7, 2 og 2). Fig. 8. Akkumulering av radioaktivitet ved 48, 96 og 120 timer med antistoff 1 OF 11 og ved 6, 24, 48, 96 og 120 timer med antistoff 3c4. Fig. 9. Standardkurve for fire forskjellige par av belagte antistoff/merket antistoff. Fig. 10. Individuelle konsentrasjoner av Tie-antigen (ug/l) i serumprøver fira pasienter med brystkreft (N=2), ovariekreft (N=5) og småcellet lungekreft (N=6). Referanseprøver (N=20) er ikke-kreftpasienter.

Det er en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe diagnostiske fremgangsmåter for å overvåke hematopoetiske og endotelialceller i vevsprøver og i hele organismer. Det er videre en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe kliniske deteksjonsmåter til å beskrive tilstanden til endotelceller (traumer, vekst, etc.) og fremgangsmåter til å detektere endotelceller og således vaskulær vekst i en organisme. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også antistoffer som gjenkjenner Tie. I en foretrukket utforming er antistoffene i henhold til oppfinnelsen rettet mot ekstracellulære deler av Tie.

Oppfinnelsen tilveiebringer også, i en foretrukket utforming, monoklonale antistoffer som spesifikt gjenkjenner forskjellige epitoper i de ekstracellulære deler av Tie-reseptoren. Mer spesifikt tilveiebringer denne oppfinnelsen de monoklonale antistoffer designert 3C4C7G6 og 10F11G6. Hybridomcellelinjen som produserer monoklonale 3C4C7G6 er deponert med Deutsche Sammlung von Mikroorganis-men und Zellkulturen GmbH (DSM) under reglene til Budapestavtalen (DSM aksessjonsnummer ACC2159).

Monoklonale antistoffer merket med detekterbare markører er også tilveiebragt. Som brukt heri, omfatter betegnelsen detekterbar markør enhver detekterbar markør som er kjent for de med kunnskap på området. I en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er imidlertid den detekterbare markør valgt fra gruppen som består av radioisotoper, fluorokromer, fargestoffer, enzymer og biotin. For hensikten til foreliggende oppfinnelse inkluderer egnede radioisotoper, men er ikke begrenset til, ,25I og <13>lI.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også monoklonale antistoffer konjugert til et bildedannende middel. Som brukt heri, inkluderer betegnelsen bildedannende middel, men er ikke begrenset til, radioisotoper. Et foretrukket radioisotop er 99m-teknetium.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte til detektering og identifisering av humane vev som gjennomgår neovaskularisering, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene; (a) å oppnå en vevs- og/eller kroppsvæskeprøve som er mistenkt å gjennomgå neovaskularisering, og (b) å bringe nevnte prøve i kontakt med et Tie-spesifikt monoklonalt antistoff under betingelser som er egnet for dannelse av et kompleks mellom det monoklonale antistoff og antigenet, og

(c) å detektere nærvær av ethvert dannet kompleks.

Et vev som kan detekteres ved denne fremgangsmåten er ethvert normalt forkreft eller kreft fast tumorvev med Tie-holdige endotelceller eller leukemiceller som uttrykker Tie-reseptoren. I en utforming av den foreliggende oppfinnelse er det monoklonale antistoff merket med en detekterbar markør som beskrevet heri. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er nyttig for detektering og differensie-ring av forskjellige former av kreft.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte til å diagnostisere og overvåke sykdomstilstanden til forskjellige kreftformer, ved å bestemme mengde av sirkulerende Tie-antigen i humant serum. ^

Monoklonale antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i en fremgangsmåte til å detektere nærvær av Tie-reseptorer i en celleprøve som omfatter trinnene å eksponere en celleprøve til et monoklonalt antistoff i henhold til foreliggende oppfinnelse og detektere binding av nevnte monoklonale antistoff til Tie-reseptorer.

I en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse, kan de monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen anvendes til å detektere og overvåke visse typer av hematopoetiske celler, spesielt celler i B-cellelinjen.

Eksponering av en celleblanding til monoklonale antistoffer i henhold til oppfinnelsen kan være i oppløsning, som er tilfelle for fluorescensaktivert cellesortering, eller det kan være på faste vevsprøver, såsom biopsimateriale eller det kan være med det monoklonale antistoff immobilisert på en fast understøttelse, som er tilfelle med kolonnekromatografi eller direkte immunadherens. Blanding av celler som skal eksponeres til det monoklonale antistoff kan være enhver oppløsning av blodceller eller vevsceller. Fortrinnsvis stammer celleblandingen fra normale pattedyrceller, pattedyrbenmarg, sirkulerende blod eller mistenkt tumorvev, mer fortrinnsvis normale celler, leukemiceller og fast tumorceller. Etter eksponering av celleblandingen til det monoklonale antistoffet, vil celler med Tie-reseptorer bindes til det monoklonale antistoff for å danne et antistoff-Tie-reseptorkompleks. Nærvær av antistoff-Tie-reseptorkompleks og derfor Tie-reseptorer kan detekteres ved fremgangsmåter kjent på området. Disse fremgangsmåter inkluderer ELISA, IRMA (en sandwichtype av immunokjemiassay), immunohistokjemi, RIA ved å bruke <l25>I-merke og autoradiografi.

En anvendelse av et detekterbart merket antistoff til å fremstille et farmasøytisk preparat til å billeddanne nærvær av angiogenese i sårheling, i inflammasjon eller kreft hos humane pasienter, er også tilveiebragt ved foreliggende oppfinnelse. Denne anvendelse omfatter administrering av merkede antistoffer og deteksjon ved billeddannelse på steder hvor endotelceller er engasjert i dannelsen av nye kar eller deteksjon av leukemiske celler i blod, benmarg eller vev.

Humaniserte monoklonale antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være nyttig til å behandle neoplastiske sykdommer som innvolverer endotelceller med assosierte Tie-reseptorer, ved administrering av en terapeutisk effektiv mengde av et antineoplastisk terapeutisk middel konjugert til et slikt monoklonalt antistoff til pasienter som lider av en slik sykdom. En terapeutisk effektiv mengde av et terapeutisk middel er enhver mengde av en forbindelse som vil forårsake inhibering av vekst av tumoren, fortrinnsvis forårsake at de neoplastiske celler dør, og en reduksjon i totalt antall av neoplastiske celler i organismen. Eksempler på slike terapeutiske midler inkluderer antistoffer koblet til radioisotop 90Y eller til toksinkonjugatet såsom ricin og forskjellige mikrobielle toksiner.

Konjugering av leukemiterapeutiske middel til det monoklonale antistoff kan utføres ved å bruke kjent teknikk som beskrevet i f.eks. Press et al., 1. Clin. Oncol. 7:1027-1038 (1989). Fortrinnsvis er konjugeringsstedet på det monoklonale antistoff ved en lokasjon som er adskilt fra bindingssete til det monoklonale antistoff til Tie-reseptoren. Det er også foretrukket at konjugasjonssetet på det . terapeutiske middel kan være på en funksjonell gruppe adskilt fra det aktive sete til det terapeutiske middel. Mer fortrinnsvis vil konjugasjonssetet også være plassert slik at det minimaliserer konformasjonelle forandringer av det monoklonale antistoff eller det terapeutiske middel.

Anvendelse av de monoklonale antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse omfatter administrering av en passende mengde av en farmasøytisk sammensetning som inneholder de monoklonale antistoffer som en aktiv ingrediens. I tillegg til den aktive ingrediens, kan den farmasøytiske blanding også inkludere egnede buffere, diluenter og tilsettingsmidler. Egnede buffere inkluderer Tris-HCl, acetat, glycin og fosfat, fortrinnsvis fosfat med pH-verdi 6,5 til 7,5. Egnede diluenter eller fortynningsmidler inkluderer sterile vandige oppløsninger justert isotonisk med NaCl, laktose eller mannitol, fortrinnsvis NaCl. Egnede tilsettingsmidler inkluderer albumin eller helartin for å hindre adsorpsjon til overflater, detergenter (f.eks. TWEEN 20™, TWEEN 80™), oppløsningsmidler (f.eks. glycerol, polyetylenglykol), antioksidanter (f.eks. askorbinsyre, natriummetabisulfid) og konserveringsmidler (f.eks. THIMERSOL™, benzylalkohol, parabens).

Fortrinnsvis er det farmasøytiske preparat i enhetsdoseform. I slik form blir preparatet oppdelt i enhetsdoser som inneholder passende mengder av den aktive komponent, f.eks. en effektiv mengde for å oppnå den ønskede hensikt.

Den virkelige dose anvendt, kan varieres avhengig av kravene til pasienten og hvor alvorlig lidelsen som blir behandlet er. Bestemmelse av riktig dose for en spesiell situasjon, er innenfor generell kunnskap på området. Generelt blir behandling igangsatt med mindre doser som er mindre enn forbindelsens optimale dose. Deretter blir dosen økt med små forhøyninger inntil optimal virkning blir oppnådd under foreliggende omstendigheter. For enkelthets skyld kan den daglige dose deles og administreres essensielt kontinuerlig eller i porsjoner gjennom dagen dersom det er ønskelig. Mengden og adminstrasjonsfrekvens kan reguleres i henhold til vurderingen til den ansvarlige lege under hensyntagen til faktorer som alder, tilstand og pasientens størrelse såvels om alvorligheten av sykdommen som blir behandlet.

En typisk anbefalt doseregime for anvendelse i foreliggende oppfinnelse er fra ca 0,1 til ca 10 mg aktiv ingrediens pr. dag.

Utvikling og anvendelse av mus-mAb som terapeutiske midler lider av det faktum at halveringstiden reduseres pga. dannelse av human anti-mus-antistoffrespons (HAMA). Derfor er virkningsgraden til musmonoklonale antistoffer i pasienter lavere (artikkel av Adair et al., 1990). Også kjedelige bivirkninger skjer når gjentatte administrasjoner av fremmede proteiner blir brukt. Mange av disse problemer kan løses ved å bruke humane monoklonale antistoffer. For tiden kan disse antistoffer genereres fra musmonoklonale antistoffer ved å bruke molekylær-biologiske teknikker, hvor den komplementære bestemmende region (CDR) i mus mAb blir sammenført med humant mAb. Disse humaniserte antistoffer er egnet for anvendelse i immunterapi hos mennesker. Også enkeltkjedede antistoffer (scFv) vil konstrueres. Ved konstruksjon av disse scFv vil forskjellige lengder av linkersek-venser anvendes som beskrevet av Whitlow et al. Protein Eng., 6(8):989-95,

(1993), for å optimalisere binding av antistoffet til antigenet.

Det er klart fra det foregående at antistoffer i henhold til foreliggende oppfinnelse er nyttig i diagnose og identifisering av sykdomstilstander (f.eks. forskjellige krefttyper), deteksjon og overvåking av sårheling, behandling av forskjellige neoplastiske sykdommer og profylakse. Andre anvendelser av de foreliggende krevde gjenstander, er klart for en person med kunnskap på området.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Produksjon av det ekstracellulære domene til Tie i et bakulovirusekspresjons-svstem

cDNA-sekvensen til Tie-proteinet er blitt beskrevet i Partanen J., et al. Mol. Cell Biol. 12:1698-1707, (1992), og inkorporeres heri som referanse. cDNA-sekvensen som koder det ekstracellulære domene til Tie (aminosyrer 24-760) ble PCR-oppformert og klonet inn i BamHI-sete til pVT-Bac-vektor (Tessier et al., Gene, 98:177-183, 1991) ved å bruke PCR-primere.

En sekvens som koder en Faktor X kløyvingssete (IEGR) etterfulgt av seks påfølgende histidinrester ble innskutt i 3-enden av cDNA. Den resulterende vektor, betegnet pVT-Tie, ble deretter transfektert inn i innsektsceller for ekspresjon av "det Tie-ekstracellulære domene.

pVT-Tie-vektor ble kotransfektert med Baculo Gold baculovirus DNA (Phar-mingen Cat. 21100D) inn i SF-9 innsektceller. Virale isolater ble renset ved plakkassay i agarose fra det kondisjonerte medium (TNMFH + 5% FCS) av de transfekterte celler og ble testet for ekspresjon av den rekombinante protei-nekspresjon i High Five insektceller (Invitrogen). En av isolatene (BG-3-virus) ble valgt for proteinproduksjon i stor skala.

High Five celler ble infisert med BG-3-virus og det kondisjonerte medium (EX-CELL 400, JRH Scientific) av de infiserte celler ble oppsamlet etter to dager. Det rekombinante BG-3-protein ble renset fra mediet ved ConA-affinitetskromatografi.

Eksempel- 2

Produksjon av anti- Tie- monoklonale antistoffer i Balb/ C- mus

Tre måneder gamle Balb/c-hunmus ble immunisert ved intraperitonial injeksjon av BG-3 (50 ug/mus) emulgert med Freunds fullstendige adjuvans. "booster"-injeksjoner av 50 ug ble gitt ved tre til fire ukers intervaller og en avsluttende "booster" (20 ug BG-3 i PBS administrert intravenøst) etter enda tre ukers intervall. Fire dager etter den avsluttende "booster"-dose ble musene ofret og miltlymfoide celler fra musene ble fusjonert med plasmacytomceller SP 2/0 i et 2:1 forhold. De fusjonerte celler ble høstet i 96-brønners kulturplater (Nunc) i Ex-Cell 320 medium (Seralab) som inneholdt føtalt kalveserum (FCS, 20%) og HAT-supplement (hypoxahthin-aminopterin-tymidin, Gibco, 043-01060H, fortynnet 50 ganger). Celler ble dyrket ved +37°C, i en 5% CO2 atmosfære. Etter ti dager ble HAT-supplementert medium forandret til HT-supplementert cellekulturs medium (Gibco, 043-01065H, fortynnet 50 ganger). HT-medium var identisk til HAT-medium men uten aminopterin.

To til tre uker etter fusjonering ble spesifikk antistoffproduksjon testet ved antigenspesifikt immunofluorometrisk assay, IFMA, beskrevet i eksempel 5. Herreklonene ble klonet med begrensede fortynninger (Staszewski, 1984). Positive kloner ble utvidet på 24 brønners vevskulturplater (Nunc), reklonet og retestet ved samme metode. Positive kloner ble testet ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS). De stabile klonsekrerte immunoglobuliner hører til IgG-klassen.

En klon, designert 3C4C7G6 ble funnet til å stabilt sekrere monoklonalt antistoff som ble bestemt til å være av immunoglobulin-klasse IgGl av IFMA. Hybridom 3C4C7G6 ble deponert ved the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Department of Human and Animal Cell Cultures and Vimses, Mascheroder Weg Ib, 3300 Braunschweig, Tyskland, 2. desember 1993 og gitt aksesjonsnummer ACC2159.

Ved tilsvarende metoder ble det avledet andre kloner som produserer Tie-spesifikk monoklonale antistoffer rettet mot samme eller forskjellige epitoper. En slik klon 10F11G6 ble valgt for ytterligere eksperimentering sammen med de ovenfor beskrevede 3C4C7G6.

Balb/c-mus ble brukt til å produsere monoklonale antistoffer som ascitesvæske. Hybridomene ble interperitonealt (i.p.) injisert i mus etter forbehandling av dyrene med pristan (2,6,10,14-tetrametyl-pentadekan 98%, Aldrich-Chemie D-7924 Steinheim, kat.nr. T 2,280-2). 0,5 ml pristan (i.p.) ble injisert ca. to uker før injeksjonen av hybridomcellene. Mengder av celler injisert var 7,5 x 9 x IO<6> pr. mus. Resulterende ascites ble oppsamlet 10-14 dager etter injeksjon av hybridomene, og inneholdt i gjennomsnitt 0,3 mg/ml antistoff som bestemt ved antigen spesifikk IFMA som beskrevet i eksempel 6.

Eksempel 3

In vitro- produksjon av anti- Tie- monoklonalt antistoff i hulfiber bioreaktorer

Monoklonale antistoffer mot Tie ble produsert in vitro ved å bruke Technomouse System (Cellex Inc.). Mediaflasker med hetter og filtere ble først autoklavert ved 121°C og 1,1 bar trykk i en halv time. De ble deretter fylt med 1 L Dulbeccos MEM (Gibco, 042-02501, med glukose 6,4 g/l, glutamin 2 mmol/1 066-1051H, Na-pyruvat 1 mmol/1 066-1840E). Bioreaktorholderen ble aseptisk transformert inn i Technomousetrauet. Pumpen ble lastet opp og mediumlinjene såvel som de tomme skitne flasker (utstrømslinje) aseptisk forbundet.

Fyll- og skylleprogrammet ble utført i henhold til produsentens instruksjoner for å vaske.alt det preserverte materiale fra det intrakapillære rom (IC) i bioreaktoren. Programmet ble startet med en flowhastighet på 150 ml/time i 4 timer. Vaskingen ble fortsatt med en flowhastighet på 50 ml/time i 20 timer med samtidig vasking av det Ekstrakapillære (EC) rom med 5% FCS i Dulbeccos MEM (DMEM). Mediet i EC-rommet ble aseptisk forandret til friskt medium. En dag senere var bioreaktoren klar for inokkulering av hybridomceller.

Hybridomceller ble høstet i cellekulturflasker i 10% FCS-DMEM og 72 x IO<6 >celler ble oppsamlet og inokkulert i 5 ml volum av DMEM som inneholder 5% FCS. Mediumgjennomstrømning i intrakapillært rom var 100 ml/time. Resirkula-sjonsmetoden ble brukt til å høste monoklonale antistoffer som følger: mediumlin-jen ble koblet til mediumflaske "ut" som førte medium ut fra flasken til det bioreaktorintrakapillært rom; utstrømslinjen ble koblet til mediumflaskens "inn" for å bringe mediet tilbake til flasken. Monoklonale antistoffer ble høstet tre ganger pr. uke, på mandag, onsdag og fredag, og et 10 ml volum av ferskt medium som inneholder 2,5% FCS i DMEM ble erstattet hver gang.

Anti-BG-3 cellelinje, 3C4C7G6, produserte antistoffer med gjennomsnitlig konsentrasjon på 152 ug/ml i cellekulturmediet. Etter inokulering av cellene i bioreaktoren i Technomousesystemet (72 x IO<6> celler) ble de produserte antistoffer høstet i to til tre dagers perioder. Gjennomsnitlig produksjon var 4,5 mg/uke og den kumulative produksjon over 2 måneder var 37 mg.

Antistoffene produsert enten i ascitesvæske eller i Technomousesystemet ble renset ved Affigel™ protein A MAPS II Kit (BioRad) i henhold til produsentens instruksjon. Kolonnen ble ekvilibrert for renseprosedyren med bindingsbuffer (pH-verdi 9,0). Antistoffene ble sammenkoblet til protein A-matriks i bindingsbuffer og vasket med bindingsbuffer inntil en baselinje ble nådd (detektert ved 280nm ved UV-spektrometri). Det spesifikk bundede materiale ble eluert fra protein-A med elueringsbuffer ved pH-verdi 3,0 og fraksjonene ble oppsamlet i rør som inneholder volumet av 1 mol/l Tris-HCl, pH-verdi 9,0, som var nødvendig for å nøytralise-re fraksjonen øyeblikkelig. Kolonnen ble regenerert med regenereringsbuffer og lagret til neste gangs bruk i 50 mmol/1 Na-fosfatbuffer, pH-verdi 7,5 som inneholder 0,05% NaN3 som preserveringsmiddel.

Eksempel 4

Produksjon av antistoffer mot Tie uttrykt i bakterier

Et Barn HI fragment av Tie cDNA (nukleotider 520-1087) ble subklonet inn i Barn HI setet til en pGEXIT vektor (Pharmacia), som resulterte i en åpen leseramme som koder glutation-S-transferase fusjonert til en region som koder aminosyrene 162-350 i Tie-protein (GST-Tie2). Konstruksjonen ble transformert inn i en E.coli DH5a-stamme og ekspresjon av det fusjonerte protein ble indusert av IPTG. Det resulterende 40 kD fusjonsprotein ble renset i en denaturerende agarosegel (FMC) og brukt for immuniseringer.

Monoklonale antistoffer ble produsert som beskrevet ovenfor for BG-3 Tie-protein. Etter to subkloninger ble det oppnådd åtte kloner som sekrerte antistoffer mot GST-Tie2-proteinet. Disse reagerte tilnærmet like godt med Tie i Western immunoblotting. Ascites fra anti GST-Tie2-kloner ble renset ved å bruke protein-A-kolonne og brukt i Western blotting.

Eksempel 5

Merking av Tie- protein med Europium

Dét ekstracellulære domene av Tie produsert i eksempel 1, BG-3 ble merket for anvendelse i assayer. Merkingen ble utført i henhold til Mukkala et al., Anal. Biochem. 176 (2):319-325 (1989), med følgende modifikasjoner; Et 125 molar overskudd av isotiocyanat DTTA-Eu (NI chelat, Wallac, Finland) ble satt til BG-3 oppløsning (0,5 mg/ml i 50 mmol/1 boratbuffer, pH-verdi 8,6) og pH-verdi ble juster til 9,8 ved tilsetting av en tiendel av 0,5 mol/l natriumkarbonat (Merck) buffer, pH-verdi 9,8. Merkingen ble utført natten over ved +4<C>C. Ubundet merke ble fjernet ved å bruke PD-10 (Pharmacia, Sverige) med TSA-buffer (50 mmol/1 Tris-HCl pH-verdi 7,8 som inneholder 0,15 mol/l NaCl) som elueringsmiddel.

Etter rensing ble 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) satt til det merkede BG-3 og merket ble lagret ved +4°C.

Antall Europiumioner inkorporert pr. BG-3-molekyl var 2,9, bestemt ved å måle fluorescensen i forhold til den til kjent EuC13-standarder (Hemmilå et al., Anal. Biochem. 137:335-343, 1984).

Eksempel 6

Immunofluorometrisk screeningassav ( IFMA)

Antistoffer produsert mot Tie-reseptoren ble screenet ved å bruke en sandwich-type immunofluorometrisk assay ved å bruke mikrotiterstripbrøriner (Nunc, polysorb) belagt med kaninantimus lg (Z 259, Dakopatts, Lovgren et al., Talånta 1984; 31 (10B): 909-916). De forbelagte brønner ble vasket en gang med Platewash. 1296-024 (Wallac) med vaskeoppløsning (DELFIA). DELFIA assaybuffer ble brukt som en fortynningsbuffer for cellekultursupernatanter og for serum til splenektomerte mus (i fortynninger mellom 1:1000 til 1:100000) brukt som positiv kontroll i de preliminære screeningassay.

Anti-BG-3 3C4C7G6 fremstilt som ascitisk væske og renset med Affigel™ protein A MAPS ble brukt som en standard i de. senere assayer ved en konsentrasjon mellom 0,25 ng/ml og 60 ng/ml i assaybuffer (100 ul, DELFIA).

En inkubasjon i 2 timer ved værelsestemperatur (eller alternativt en inkubasjon natten over ved +4°C) ble begynt ved risting på Plateshake (1296-001, Wallac) i 5 minutter etterfulgt av vasking fire ganger med vaskoppløsning som ovenfor.

Eu-merket BG-3 fremstilt i eksempel 4 ble tilsatt i en konsentrasjon på 10 ng/brønn i 100 ul av assaybuffer. Etter 5 minutter på en Plateshakerister og en times inkubasjon ved værelsestemperatur, ble strimlene vasket som beskrevet ovenfor.

Forsterkningsoppløsning (DELFIA) ble tilsatt med 200 ul/brønn. Platene ble ristet i 5 minutter på en Plateshakerister og intensiteten til fluorescensen ble målt med ARCUS-1230 (Wallac) i 10 til 15 minutter (Lovgren et al., I: Collins W.P. (red), Alternative Immunoassays. John Wiley & Sons Ltd, 1985; 203-216).

Sandwichtype DELFIA er meget sensitiv idet den teoretiske sensitivitet er under 0,25 ng/ml for dette anti-Tie-monoklonale antistoff. Skjønt sensitiviteten var egnet for kvantifisering av Mabs produsert i cellekultursupernatanter var også praktisk for kvantifisering av Mabs produsert in vitro. Det lineære området strakk seg fra 0,25 ng/ml til 60 ng/ml (fig. 2). Intraassayvariasjon ble funnet å være meget lav.

Eksempel 7

Radiomerket monoklonalt antistoff for in vivo deteksjon av Tie- reseptor

Det monoklonale antistoff 3C4C7G6 ble merket med <125>I ved å bruke kloramin-T-fremgangsmåten (Greenwood et al., Biochem J. 89:114-123, 1963). Na,<25>I 1 mCi er blitt brukt til å merke 40 ug antistoff. Merket antistoff ble renset ved eluering med Sephadex-G25™ som gir en hovedfraksjon på 1,8 ml.

I-125-merket anti-BG-3 (3C4C7G6) ble administrert i.v. i to forskjellige doser på 1,2 \ ig og 2,4 ug til mus som hadde Lewis-lungekarsinom. Biofordelingen av det merkede antistoffet i mus ble målt ved fire forskjellige tidspunkter: 1) ved 6 timer (N=4), 2) ved 24 timer (N=7), 3) ved 47 timer (N=5), 4) ved 70 timer (N=3) og 5) ved 117 timer (N=2).

Resultatene viser at anti-BG-3-aktivitet var konsentrert til blod, tumor og blodkar og i noen mengder til lunger og ovarier. Aktivitet i blod var høy ved 48 og 70 timer: 9,3% ID/g og 7,9% ID/g (prosentandel av injisert dose pr. gram vev normalisert til en 20 g mus). Anti-BG-3-aktivitet i blod var 11,3% ved 24 timer og 36,2% ved 6 timer.

<125>I-merket anti-BG-3 (3C4C7G6 ) ble også administrert til mus som har 8 dager gammelt sår i hudepitelet ("sårhelende mus"). Antistoffdosen gitt til sårhelende

mus var 0,03 ug pr. dyr. Biofordelingen av antistoffaktivitet er vist i fig. 3.1 den figur, representerer Y-aksen prosent injisert dose (% ID/g) og X-aksen representerer forskjellige tidspunkter for injeksjon: 4 timer (N=2); 24 timer (N=6); 48 timer (N=6); 72 timer (N=4) og 120 timer (N=4). Likevekt etablert mellom mål og plasma er også vist i fig. 3.

Eksempel 8

Tc- 99m- merking av anti- Tie monoklonale antistoffer for billeddannende undersø-kelser

Antistoffet ble merket med tecnetium-99m ved å bruke teknikken til Schwarz et al., J. Nucl. Med., 1987, 28:721, og Mather et al., J. Nucl. Med., 1990, 31:692-697. 2-Mercaptoethanol (ME) ble brukt til å åpne disulfidbindingene til de tunge kjeder i hengselsregionen immunoglobulinet. Antistoff ble konsentrert til ca. 10 mg/l og tilstrekkelig ME tilsatt til oppløsningen av antistoff for å tilveiebringe et molart forhold på 1000:1 (0,47 ul ME/1 mg antistoff). Blandingen ble inkubert ved værelsestemperatur i 30 min. og det reduserte antistoff renset ved gelfiltrasjon på en 20 ml Sephadex-G-50 kolonne og eluert ved å bruke fosfat-buffret saltoppløs-ning som den mobile fase. Antistoffraksjonen ble slått sammen etter mål av optisk tetthet ved 280 nm og lagret ved -20°C som 0,5 mg porsjoner for merking med 99m-Tc.

Etter merking med 99m-Tc ble antistoffporsjonen tint og rekonstituert ved å bruke et metylendifosfonat (MDP) benbilleddannende kit (Amerscan Medronate II Technetium Bone Agent, N. 165) med 5 ml 0,9% steril saltoppløsning i henhold til produsentens instruksjoner. 35 ui av MDP-oppløsningen som inneholder 35 ug MDP og 2,4 ug SnF2, ble satt til antistoffporsjonen og blandet godt. 99mTc perteknetat ble satt til blandingen og ristet forsiktig. Reaksjonene var fullstendig på 10 minutter. Den radiokjemiske renhet ble målt ved høytrykksvæskekromatografi.

Merking av det reduserte antistoff gir et stabilt 99m-Tc-merket immunoglobulin fordi de uspesifikke bindingene av markøren er ved minimum. Merkingsvirknings-graden blir vurdert ved tynnlagskromatografi utviklet i 0,9% saltoppløsning. Immunoreaktiviteten blir beholdt til ikke mindre enn 85%. In vivo stabiliteten vil analyseres ved cysteineksponerings (challenge) assay in vitro.

Anti-Tie-antistoffer merket med 99mTc kan detekteres med et ordinært gammakamera eller med SPECT (Single Photon Emission Computerized Tomography) for å visualisere gjennomstrømningen av antistoff i en menneskelig kropp.

Eksempel 9

Deteksjon av Tie- positive cellelinjer med FACS

Anti-Tie-antistoffer dannet i eksempel 2, 3 og 4 ble brukt til å detektere Tie-protein i humane leukemicellelinjer.

De hematopoetiske cellelinjer, HEL (human erytroleukemi) og MOLT-4 (T-lymfoblastisk leukemi) ble oppnådd fra ATCC. HEL-celler (menneskelig erytro-leukemiceller) som samuttrykker erytroide og megakaryocytmarkører ble brukt til indirekte immunofluorerscensfarging av Tie ved å bruke de monoklonale antistoffer dannet og FACS-analyse. Celler ble telt, vasket og inkubert i nærvær av flere fortynninger av antistoffer (fra 1:1 til 1:200), vasket og deretter inkubert i nærvær av FITC-konjugerte antistoffer mot mus-immunoglobuliner (sekundære antistoffer). Analyse ble gjort med FACS IV. Som en negativ kontroll ble cellene farget med ikke-spesifikke mus-immunoglobuliner, etterfulgt av de samme sekundære antistoffer. Som en negativ cellekontroll brukte vi MOLT4 T-celleleukemilinjen som ikke uttrykker Tie mRNA.

Resultatene viste at anti-Tie-antistoffer farger på i gjennomsnitt 85% av HEL-celler mens mindre enn 1% av MOLT-celler farger positivt for Tie. Når celler fra disse to linjer blir blandet, diskriminerer antistoffene positive HEL-celler fra negative MOLT-celler (fig. 1). Fra humane benmargsprøver farget mindre enn 1% av cellene også positivt med disse antistoffer.

Celler fra den humane leukemicellelinjer MOLT4 (en malign T-cellelinje, som er Tie mRNA negativ) og stor HEL (human erytroleukemicellelinje, Tie mRNA positiv) ble blandet i suspensjon på ca.. 1:1 forhold. Cellene ble deretter farget i suspensjon ved å bruke de monoklonale Tie-antistoffer avledet i eksempel 2 fortynnet 1:10 og FITC-konjugerte anti-mus IgG som det sekundære antistoff. Som en negativ kontroll, ble antistoffet substituert med normalt museserum. Analyse ble gjort ved å bruke FACS IV. Resultatene angir to adskilte cellepopulasjoner, en Tie-positiv den andre Tie-negativ, hvor hver omfatter ca. 50% av hele cellepopulasjo-nene analysert (fig. 1).

Noen av de Tie-positive benmargsceller ble også positive for CD 19 B-call markør og alle var negativ for CD38. Dette viser at Tie blir uttrykt i B-cellelinjen.

Eksempel 10

Analyse av de monoklonale antistoffer

De monoklonale cellekultursupernatanter ble testet for sin evne til å gjenkjenne Tie-reseptor på celleoverflaten ved å bruke FACS-analyse. NIH3T3-celler transfektert med Tie-ekspresjonsvektor (full lengde Tie cDNA i pLTRpoly, Makela et al., 1991), kontrollvektortransfekterte NIH3T3-celler såvel som HEL-celler (en human erytroleukemicellelinje som uttrykker endogen Tie-reseptor) og MOLT-celler (en human T-celleleukemi cellelinje som ikke uttrykker Tie) ble inkubert med kondisjonert medium av forskjellige cellekloner etterfulgt av FITC-merket kanin-antimusantistoffer (Dako). De merkede celler ble analysert med en fluorescensaktivert cellesorteringsanordning (Beckton Dickinson).

Ascites ble også produsert fra de følgende kloner: 1H3H7, 3C4C7, 5C12H9. Klon 3C4D7 ble videre klonet og ga subkloner 3C4C7G6, 3C4C7B11, 3C4C7E7, 3C4C7F9, som var lik hverandre.

Eksempel 11

Immunoperoksidasefarging av Tie i humane blodceller

For å mobilisere hematopoetiske stamceller inn i det perifere blod ble cyklofosfa-mid gitt til en pasient og celler fra det gulgrå laget etter sentrifugering (buffy coat celler) ble oppsamlet fra perifert blod syv dager senere. Røde blodceller ble hemolysert fra cellesuspensjonen og cytocentrigpreparat fremstilt. Disse ble deretter brukt til immunofarging ved å bruke det rensede Tie-monoklohalt antistoff ved C4C7G6 og immunoperoksidasefremgangsmåten. Ved analyse av benmargsceller ved dobbel immunofluorescensfarging kunne Tie-positive celler (mindre enn 1%) ikke bli anvist til en klar hematopoetisk linje. Fem positivt fargende celler ble identifisert blant de ca. 70000 celler på et preparat. I immunoperoksidasefarging ble de Tie-positive celler små og runde, med store kjerner og lite cytoplasma (fig. 2). (Den mørke farging til en positiv celle i figuren er resultatet av peroksidase-reaksjonen og identifiserer en Tie-positiv celle). Således identifiserer anti-Tie-monoklonale antistoffer spesifikke hematopoetiske celler fra benmarg og kan anvendes for identifikasjon av definerte undersett av hematopoetiske celler.

Eksempel 12

Humanisering av monoklonale antistoff 3C4C7G6

3C4C7G6 kan humaniseres ved å bruke tidligere beskrevede fremgangsmåter (Kolbinger et al., 1993; Kettleborough et al., 1991). Humaniseringsprosedyren omfatter inkorporering av musekappa lett kjede (L) og tung kjede (H) komplemen-taritetbestemmende regioner (CDR) i humane variable (V) regioner og produksjon av punktmutasjoner i humané rammeregioner for å preservere de originale CDR-konformasjoner. De omformede VL- og VH-kjeder vil bli festet til DNA som koder henholdsvis human kappa og gamma-1 konstante regioner, i egnede ekspresjons-vektorer.

Dannelsen av scFv blir utført som tidligere beskrevet ved Whitlow et al., supra

(1993).

Affiniteter til de humaniserte monoklonale antistoffer og scFv blir testet ved å bruke metodene beskrevet tidligere i foreliggende søknad.

Eksempel 13

Konjugasjon av Tie- spesifikt monoklonalt antistoff til et terapeutisk middel Monoklonalt antistoff 3C4C7G6 eller humansierte antistoffer som beskrevet i eksempel 12, kan kobles til eller konjugeres til et utvalg av midler, for diagnostisk bruk som beskrevet i andre eksempler heri eller for terapeutisk bruk av de resulterende konjugat.

For anvendelse i terapi av tumører og av spredde maligne lidelser såsom leukemier, kan antistoffer kobles til radioisotoper såsom <3>2P, ,31I,12<5>I, 9<0>Y, <188>Re, <212>Pb, <2>,<2>Bi eller <10>B (se f.eks. Scheinberg et al., Oncology, 1:31-37, 1987). Konjugering av radioisotoper til antistoffet blir utført ved direkte festing av isotopene til antistoffet, ved fremgangsmåter beskrevet på området (se f.eks. Schwartz J., Nuclear Medicine 28:821, 1987) eller ved hjelp av chelatlinkere, som binder radioisotopen til antistoffet eller ved et sekundært antistoff til det spesifikke antistoff. En variasjon av andre midler kan festes til antistoffene. Slike midler inkluderer antitumormedikamenter og antibiotika som er toksiske pga. interaksjon med DNA via interkalering (f.eks. daunomycin, adriamycin, aklakinomycin) eller spalting av DNA (f.eks. esperamycin, kalkeamycin, neokarzinostatin) og andre toksiske cytostatiske medikamenter, såsom cisplatinum, vinblastin og metotrexat (se f.eks. Greenfield et al., Antibody, Immunocohjugates and Radiopharmacueticals; 4:107-119, 1991). Disse midler blir koblet ved kovalent festing av egnede derivater av midlene.

Mange proteiner og glykoproteiner er også tilgjengelig for anvendelse i terapeutiske konjugater av antistoffene. Disse inkluderer bakterielle toksiner, såsom difteritoksin, Shigellatoksin og Pseudomonas eksotoksin; plantetoksiner, såsom ricin, abrin, modeccin, viscumin, kermesbær antiviralt protein, saporin, momordin og gelonin. Disse toksiner inneholder et katalyttisk fragment og i noen tilfeller fragmenter eller domener som gjenkjenner celleoverflatestrukturer eller fasilitere translokasjon gjennom cellemembranen. Passende modifiserte toksiner blir brukt som tillater forbedret spesifisitet uten tap av styrke. Konjugasjon av toksiner til antistoffene blir gjort ved heterobifunksjonelle tverrbindere, såsom N-succinimidyl-3-(2-pyridylditio)-propionat (SPDP) eller 2-iminotiolan.

Før terapeutisk anvendelse, blir konjugerte antistoffer testet i lys av deres toksiske styrke, målspesifisitet, in vitro og in vivo stabilitet og andre egenskaper (se f.eks. Immunotoxins, Ed. Frankel, Kluwer Academic Publishers, Boston, 1988). Det er ønsket at det konjugerte middels toksisitet og bindingsaffinitet og spesifisiteten til antistoffet blir minimalt påvirket av de anvendte sammenkoblingsprosedyrer. Konjugatene blir derfor testet for binding til Tie-reseptoren (se eks. 10). In vitro toksisitet mot målceller, såsom léukemicellelinjen Dami blir testet ved å måle inkorporering av merkede forbindelser i behandlede versus kontrollkonjugatbe-handlede cellekulturer og mer direkte ved å bestemme kulturene som er istand til å vokse i klonogeniske og cellevekst tilbakeekstrapoleringsassayer. ln vivo-stabilitet, clearance og spesifikk toksisitet blir bedømt ved administrering av konjugater til egnede dyremottagere, såsom mus, rotter, kaniner eller aper. Videre inkluderer slike resipienter normale mus og in vivo tumor og leukemi xenograftmodeller som omfatter humane neoplastiske celler innført i immunodeffekte stammer av mus, såsom nakenmusen eller SICD-mus.

Eksempel 14

Fremstilling av farmasøytisk sammensetning som inneholder monoklonalt antistoff 3C4C7G6

Farmasøytiske sammensetninger i henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer en effektiv mengde av den aktive ingrediens, et Tie-spesifikt monoklonalt antistoff, særlig det monoklonale antistoff 3C4C7G6, alene eller i kombinasjon med en egnet buffer, fortynningsmiddel og/eller tilsetting. Slike sammensetninger blir tilveiebragt som sterile vandige oppløsninger eller som lyofiliserte eller på annen måte tørkede formuleringer. Typisk blir antistoffer formulert i slike vehikler ved konsentrasjoner fra ca. 1 mg/ml til 10 mg/ml.

Et eksempel pa en egnet farmasøytisk sammensetning for injeksjon inneholder

monoklonalt antistoff 3C4C7G6 (1 mg/ml) i en buffret oppløsning (pH-verdi 7,0 + 0,5) av monobasisk natriumfosfat (0,45 mg/ml) og Tween 80™ (0,2 mg/ml) i sterilt H20. Farmasøytiske sammensetninger i henhold til oppfinnelsen blir administrert i doser bestemt av fagmannen ved vurdering av målsykdommen, alvorligheten av symptomer og pasientens egenskaper. F.eks. kan farmasøytiske sammensetninger i henhold til oppfinnelsen appliseres lokalt for å oppnå maksimalt utbytte i å hindre tumorvekst og neovaskularisering eller sårhéling. Forskjellige doser er imidlertid nødvendig for systemisk anvendelse, avhengig av egenskapene til pasienten, såsom vekt, alder, progresjon av sykdommen, metabolisme og andre.

Ytterligere utforminger vil være klare for fagmannen på området ved vurdering av den foregående beskrivelse. Følgelig er den foreliggende oppfinnelse begrenset bare ved de etterfølgende krav.

Eksempel 15

Immunohistokjemisk farging av Tie i normal hjerne, glioblastommultiform-

t

metastaser og melanommetastaser

Ferske prøver av tidligere ubehandlede cerebrale gliom og intrakraniale me-ningeom ble oppnådd fra åpen kirurgi ved Department of Neurosurgery, Helsinki University Central Hospital. Alle tumorpasienter gikk på kortikosteroider. En prøve av ikke-neoplastisk kontrollhjernevev ble oppnådd ved kirurgi for ukontrol-lerbar epilepsi. Flere av tumorprøvene inkluderte tilstøtende hjernevev. Alle prøver ble frosset i flytende nitrogen så raskt som mulig etter kirurgisk fjerning og lagret ved -70°C. Histopatologiske diagnoser var basert på hematoksylin/eosinfargede kryostatsnitt såvel som på rutinemessig farget parafinsnitt av tilstøtende formalde-hydfikserte tumorprøver. En fullstendig liste av prøvene er vist i tabell 3. Steriliserte objektglass ble dyppet i 2% 3-aminopropyltrietoksysiIan (TESPA) i aceton for å sikre vevsadherens. 5 um krystatsnitt ble skåret ved -20°C på de forbehandlede objektglass, fiksert i 4% paraformaldehyd og lagret ved -70°C.

5 um kryostatsnitt fra prøvene brukt for in situ hybridiseringsanalyse, såvel som to ytterligere malignante gliomprøver ble snittet på TESPA-objektglass som beskrevet tidligere. Snittene ble vakuumtørket ved 37°C natten over og farget immunohistokjemisk ved å bruke musmonoklonale antistoffer mot human Tie (en cocktail av monoklonale antistoffer mot Tie ekstracellulært domene) og kaninantistoffer

(Dakopatts) mot den humane von Willebrandfaktor (vWF) som en endotelcellespesifikk markør.

Farging ble utført ved å bruke Vectastain ABC Elite biotin/avidinsystem for mus IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroksidaseaktivitet i de tørkede ufikserte vevssnitt ble blokkert ved behandling med 0,5% H2O2 i metanol i 30 minutter. Etter PBS-vaskinger ble snittene inkubert med fortynnet Vectastain blokkerinsserum i 20 minutter og deretter med ufortynnet Tie-antistoff (1:1) natten over ved 4°C eller von Willebrandfaktor antistoff (1:50) i 1 time ved værelsestemperatur.Biotinylert sekundært antistoff ble tilsatt i 45 minutter, etterfulgt av Vectastain ABC-reagens i 30 minutter. Reaksjonen ble visualisert med 0,2 mg/ml 3-amino 9-etylkarbazol (AEC), 0,03% H202, 14 mM eddiksyre og 33 mM natriumacetat. Normalt serum og antigenblokkert primert antistoff ble brukt som kontroller. Snittene ble lett motfarget i hematoksylin og montert i Aquamount.

Blodkar med normalt kortikalt vev var negative for Tie-protein (fig. 4), men sterk farging ble observert i glioblastomvaskulatur (B) og i endoteliet til vev tilstøtende GBM (innskudd B). Tie-protein ble også oppdaget i endotelialceller som forer karene i melanommetastaser (C) såvel som tilgrensende tumoren (data ikke vist). Ingen spesifikk farging ble observert når snittene ble inkubert med antigenblokkert antistoff eller normalt serum istedenfor Tie-antistoffer. For ytterligere å vurdere ustrekning og spesifisitet av Tie-farging, ble tilstøtende snitt farget for faktor VIII

(D). En oppsummering av Tie-fargeresultater er vist i tabell 4.

Disse resultater støtter en signifikant rolle for Tie i vaskulær angiogenese som

følger tumorprogresjon.

Eksempel 16

Immunohistokiemisk deteksjon av Tie- protein i hemangioblastom og hemangiopericytom

I dette studiet har vi analysert ekspresjon av endotelvekstfaktorer og deres reseptorer i to meget vaskulære CNS-tumører av kontroversiell opprinnelse;

kapillær hemangioblastom og hemangiopericytom.

Ferske prøver av hemangioblastom og hemangiopericytom ble oppnådd ved kirurgi ved avdeling for neurokirurgi, Helsinki University Central Hospital (alle tumorpasienter gikk på kortikosteroider). Prøvene ble hurtig frosset øyeblikkelig etter kirurgisk fjerning og lagret ved -70°C. Histopatologiske diagnoser ble basert på hematoksylin/eosinfarget kryostatsnitt og på rutinefarget parafinsnitt av tilstøtende formaldehydfiksert tumorprøver.

Sterile objektglass ble behandlet med 2% 3-aminopropyltrietoksysilan (TESPA) i aceton for å sikre vevadherens. 5 um kryostatsnitt ble snittet på objektglassene,

fiksert i 4% paraformaldehyd i PBS og lagret ved -70°C.

5 um kryostatsnitt fra prøvene brukt for in situ hybridiseirngsanalyse ble snittet på

TESPA-objektglass som beskrevet tidligere. Snittene ble vakuumtørket ved 37°C natten over og farget immunohistokjemisk ved å bruke musemonoklonale^antistoffer mot humane Tie (monoklonale antistoffer mot Tie ekstracellulært domene; en vennlig gave fra Dr. Juha Partanen) og kaninantistoffer (Dakopatts) mot human von Willebrand-faktor (vWF) og CD34 som en endotelcellespesifikk markør (36).

Farging ble utført ved å bruke Vectastain ABC Elite biotin/avidinsystem for mus IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Endogen peroksidaseaktivitet i de tørkede ufikserte vevssnitt ble blokkert ved behandling med 0,5% H2O2 i metanol i 30 minutter. Etter PBS-vaskinger ble snittene inkubert med fortynnet Vectastain blokkeringsserum i 20 minutter og deretter med ufortynnet Tie-antistoff (1:1) natten over ved 4°C eller CD34/von Willebrand-faktor antistoff (1:50) i l time ved værelsestemperatur. Biotinylert sekundært antistoff ble tilsatt i 45 minutter, etterfulgt av Vectastain ABC-reagens i 30 minutter. Reaksjonen ble visualisert med 0,2 mg/ml 3-amino 9-etylkarbazol (AEC), 0,03% H202, 14 mM eddiksyre og 33 mM natriumacetat. Normalt serum og antigenblokkert primært antistoff ble brukt som kontroller. Snittene ble lett motfarget i hematoksylin og montert i Aquamount.

Sterk ekspresjon av Tie-protein ble observert langs den indre vegg av blodkarene i både hemangioblastom er (fig. 4, A, B) og, til en mindre grad hemangiopericytom (C-F). Nivåene av Tie-protein varierte hovedsakelig innenfor tumorvevet, f.eks. høyere i et hemangiopericytomområde med løs tekstur (E, F), og lavere i en mer typisk tumorprøve (C, D). Totalt var imidlertid ekspresjon signifikant høyere enn den funnet i normale kortikale prøver tidligere analysert (23). 1 sammenligning med vWF immunofarging (B,D, F), ble Tie ikke uttrykt av hemangiopericytomtumor-celler (C-F).

Disse resultater er overensstemmende med hypotesen at Tie kan spille en rolle i angiogenese i disse to vaskulære tumører.

Eksempel 17

In vivo- opptak av anti- Tie- antistoffer i Lewis lungekarsinommodell i mus Vi har undersøkt opptak av radiomerket (I<125>) anti-TIE MoAbs (10F11G6 og 3C4C7G6) i de viktigste organer i en mus og i lungemetastaser for å bestemme muligheten til å benytte en anti-TIE MoAb for å detektere malign vekst. Radiomerking av antistoffene ble utført som følger: 40 ug antistoff ble merket med 37MBq av Na-12<5>l ved å bruke Chloramin-T-fremgangsmåte (Greenwood et al., • supra, 1963). Merket antistoff ble renset med Sephadex-G25 som resulterte i en hovedfraksjon på 1,8 ml. Før in vivo biofordelingsstudier ble affiniteten av tre radiomerkede antistoffer (3c4, 10F11, 7E8) sammenlignet i et celleassay (Lindmo, Nucl. Med. 21:807-810, 1984). Alle antistoffer bindes spesifikt til LE GD 14-2-celler, som er transfekterte museendotelceller som uttrykker Tie-reseptoren på sin ytre overflate, men binding av 10F11 var tre ganger høyere enn de andre (21 pMol/100000 celler versus 6-7 pMol/100000 celler).

I lungekarsinomeksperimenter ble det brukt til 6-8 uker gamle hunmus (C57B1/6, Bomholtgaard, Dainmark) som bærer Lewis lungekarsinom (LLC1/2) xenografter dyrket ved å injisere 1-10 M celler i 0,25 ml pr. dyr i høyrelem, intramuskulært.

Tyroidblokkade av mus ble startet en dag før injeksjon av radiomerkede antistoffer og fortsatte gjennom eksperimentet med Kl-oppløsning (400 mg/100 ml) ad lib.

Biofordeling av I<125->anti-Tie-antistoffer ble undersøkt ved 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter intravenøs injeksjon av 30 ng antistoffer i 20 mM PBS. 14 dyr som hadde lungemetastaser av Lewis-lunge ca er blitt undersøkt med antistoff 10F11: en ved 24 timer, tre ved 48 timer, tre ved 72 timer, tre ved 96 timer og fire ved 7 dager (se fig. 6). Lungemetastaser har vært tilstede med antistoff 3c4 bare i tre dyr, ved 24,48 og 120 timer (se fig. 7).

3c4 viser ikke binding til metastaser i lungen ved 48 timers tidspunkt (vev-til-blod=0,07), men begge bindes ved 96 timer til metastasene fra Lewis lungekarsinommodell, vev-til-blod-forhold er 2,4 og 2,8 med henholdsvis 3C4C7G6 og 10F11G6.

Opptak av antistoffene 3c4 og 10FI1 i lungemetastase er lik, begge antistoffer bindes til metastasene in vivo, men 10F11 er mer sterkt bundet til serum: 20% ID/g av 10F11 versus 10% ID/g av 3c4 ved 48 timer.

Eksempel 18

Serumprøveanalvse ved IRMA- assav

Serumprøver av ikke-kreft og kreftpasienter er blitt screenet med en sandwichtype immunoradiometrisk (IRMA) assay (Miles L. et al., Nature 219:186-189 (1968), hvor de fangende anti-Tie-antistoffer er blitt belagt med polystyrenrør og de andre anti-Tie-antistoffer er blitt radiomerket med <125>I ved å bruke de tidligere nevnte kloramin-T-fremgangsmåte. Det rekombinante Tie-protein er blitt brukt som et standard preparat for bestemmelse av konsentrasjonen av antigen i serumprøver. Konsentrasjonen av den anvendte totale standardpreparat ble målt ved å bruke absorbance på 280 nm. En serie av fortynninger av antigen ble brukt for å danne standardkurve, konsentrasjoner av Tie-antigen var 0, 18, 36, 72, 144, 720 og 3600 u.g/1. Standardkurven til fire forskjellige par av belagte antistoff/merket antistoff er presentert i fig. 9.

Serumprøver fra brystkreft-, ovariekreft- og av forskjellige typer lungekreftpasien-ter er blitt screenet med dette assay såvel som prøver av pasienter uten kreft. Pasientene som hadde hatt nye metastaser voksende i lungene har forhøyede verdier i dette assay. Pasienter med en stabil sykdom viser tilsvarende verdier som ikke-kreft pasienter. De detekterte konsentrasjoner av antigen i serum til de 20 ikke-kreft pasienter og tre kreftpasienter som hadde ferske nye metastaser er vist i fig. 10. Pasienten med SCLC gav 6 prøver hver, en til to måneder fra hverandre og pasienten med ovariekreft + pelviske metastaser gav 5 prøver. Pasienten med brystkreft og en ny lungemetastase gav 2 prøver. Parene av belagte antistoff/merkede antistoff brukt i fig. 10 var 3C4C7G6/10F11G6 som hadde bedre sensitivitet i henhold til standardkurven (>5 jj,g/l).

Claims (19)

1. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er rettet mot de ekstracellulære deler av en Tie-reseptortyrosinkinase, hvor antistoffet er anti-Tie-monoklonalt antistoff 3C4C7G6, som er fremstilt av en hybridom cellelinje, deponert ved DSM, med aksesjonsnummer ACC2159.

2. Detekterbart merket antistoff som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte detekterbare merket er valgt fra gruppen som består av radioisotoper, fluorokromer, farger, enzymer og biotin.

3. Humanisert monoklonalt antistoff som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at en mus lett og tung kjede komplementærbestem-mende region av nevnte monoklonale antistoff blir fusjonert til en human variabel region og hvor konformasjonen av nevnte musekomplementærbestemmende region er preservert.

4. Monoklonalt antistoff som angitt i krav 1-3, karakterisert ved at det er konjugert til et medlem av gruppen som består av cytotoksiske midler, cytostatiske medikamenter og glykoproteiner.

5. Fremgangsmåte til å detektere Tie i en biologisk prøve, karakterisert ved at den omfatter trinnene: a) å eksponere en prøve mistenkt for a inneholde Tie til et detekterbart merket antistoff som angitt i krav 1 -4, rettet mot den ekstracellulære del av Tie; b) vasking av prøven; og c) detektere nærvær av nevnte detekterbare merkede antistoff i nevnte prøve.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at den biologiske prøven er selektert fra gruppen som består av en oppløsning som inneholder blodceller eller vevsceller eller en fast vevsprøve.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at cellene er valgt fra gruppen som består av leukemiceller og benmargceller.

8. Fremgangsmåte til å diagnostisere sykdommer, kjennetegnet ved proliferasjon av endotelceller som angitt i krav 5, karakterisert ved at den omfatter trinnene: a) å oppnå en vevsprøve fra'en pasient som er mistenkt for å ha en sykdom kjennetegnet ved proliferasjon av en endotelcelle; b) eksponering av nevnte vevsprøve til et detekterbart merket antistoff som angitt i krav 1-4, rettet mot den ekstracellulære del av Tie; c) vasking av nevnte vevsprøve; og d) detektere nærvær av nevnte detekterbart merkede anti-Tie-antistoff i nevnte vevsprøve.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at sykdommen er valgt fra gruppen avneoplastiske sykdommer, så som leukemi, eller sykdommer som omfatter tumorangiogenese, sårheling, tromboemboliske sykdommer, aterosklerose og inflammatoriske sykdommer.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at sykdommen er valgt fra gruppen av megaka-ryoblastisk leukemi, gliom, meningom, metastatisk melanom, hemagioblastom og hemangiopericytom.

11. Anvendelse av et detekterbart merket antistoff som angitt i krav 2, til å fremstille et farmasøytisk preparat for diagnose ved å billeddanne neovaskularisering i en organisme, som omfatter trinnene: a) administrere til nevnte organisme preparatet inneholdende det detekterbart merkede antistoff rettet mot den ekstracellulære del av Tie til et sete mistenkt for å gjennomgå vaskularisering; og b) detektere en mengde av nevnte detekterbart merket anti-Tie-antistoff som bindes til nevnte sete.

12. Anvendelse som angitt i krav 14, hvori det merkede antistoff er merket med 99m-teknetium.

13. Anvendelse som angitt i krav 14-15, hvori nevnte deteksjon blir utført med et gammakamera eller ved enkel fotonemisjonsdatabasert tomografi, SPECT.

14. Fremgangsmåte til å diagnostisere og/eller overvåke sykdomstilstand i kreft som angitt i krav 5, karakterisert ved at den omfatter trinnene: a) å oppnå en serumprøve fra en pasient som er mistenkt for å ha en sykdom kjennetegnet ved proliferasjon av endotelceller; b) eksponere nevnte serumprøve til et detekterbart merket antistoff som angitt i krav 1-4, rettet mot den ekstracellulære del av Tie; c) detektere nærvær av nevnte detekterbart merkede anti-Tie-antistoff i nevnte serumprøve.

15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at sykdomstilstanden som skal overvåkes er kjennetegnet ved metastaser.

16. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved. at deteksjonstrinnet blir utført av en sandwich-type assay.

17. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en terapeutisk effektiv mengde av et antistoff mot den ekstracellulære del av Tie som angitt i krav 1-4, eller derivater derav i en farmasøytisk akseptabel fortynningsmiddel, adjuvans eller bærer.

18. Farmasøytisk sammensetning som angitt i krav 17, karakterisert ved at nevnte effektive mengde på et anti-Tie-antistoff er fra 1 mg/ml til 10 mg/ml.

19. Anvendelse av anti-Tie antistoffer som angitt i krav 1, til fremstilling av et farmasøytisk preparat som angitt i krav 17 til å hindre symptomene til en sykdom kjennetegnet ved unormal vekst av endotelceller.