NO316923B1 - Bifunksjonelt protein og DNA, vektorer, vertsceller, antistoff, sammensetninger og fremgangsmater derav - Google Patents

Abstract

Et bifunksjonelt protein med evne til å lede en vertscelle til å produsere nevnte protein for spesifikt å gjenkjenne selekterte målceller. Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte protein, en DNA konstruksjon som koder for nevnte protein, en sammensetning som omfatter en vertscelle som uttrykker nevnte DNA og antistoffer som spesifikt gjenkjenner nevnte protein. Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse av en slik vertscelle, for eksempel for selektivt å drepe tumorceller in vitro eller in vivo.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et bifunksjonelt protein med evne til å lede en vertscelle til å produsere nevnte protein for spesifikt og gjenkjenne selekterte målceller. Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte protein, en DNA konstruksjon som koder for nevnte protein, en sammensetning som omfatter en vertscelle som uttrykker nevnte DNA og antistoffer som spesifikt gjenkjenner nevnte protein. Oppfinnelsen vedrører videre anvendelse av en slik vertscelle, for eksempel for selektivt å drepe tumorceller in vitro og til fremstilling av et legemiddel for behandling av cancer.

Prinsippet med adoptiv immunterapi, også referert til som cellulær immunterapi, omfatter overføring av immunologisk aktive celler til et pattedyr for å forsterke pattedyrets immunrespons overfor en sykdomstilstand. Frem til nå er immuncellene blitt fjernet for eksempel fra den humane pasienten eller et annet individ, dyrket, eventuelt i nærvær av immunfremmende midler så som interleukin-2, og deretter på ny administrert til pasienten, fortrinnsvis i nærvær av et immunfremmende middel. I pasienten lindrer immunologiske aktive celler sykdomstilstanden.

Immunologiske aktive celler foreslått for adoptiv immunterapi innbefatter lymfokin aktiverte killer (LAK) celler, avledet fra natural killer (NK) celler, og in vitro sensibiliserte lymfocytter (FVS), avledet fra cytolytiske eller cytotoksiske T lymfocytter eller (CTL), også referert til som killer T lymfocytter. LAK cellene er cytolytiske celler som reagerer med et stort spekter av målceller. De er ikke hoved histokompatibilitets-kompleks (MHC)-hemmet og har evne til å lysere tumorceller, men også normale celler in vitro. CTL har klonale spesifisiteter, dvs. hver klon er spesifikk for en bestemt antigenstruktur på overflaten av en målcelle. En bestemt CTL gjenkjenner og binder et unikt antigen og blir følgelig aktivert og kan deretter formeres og ødelegge målcellene. Gj erkjenningsprosessen er MHC-hemmet og avhengig på grunn av at et antigen blir bare gjenkjent i assosiasjon med et av selv klasse IMHC overflate molekylene uttrykt av målcellen.

Gjenkjenning av et spesifikt antigen ved T cellene blir formidlet av T-celle antigen reseptoren (TCR) (A. Weiss, Cell 73,209-212 (1993)). Binding av en ligand til reseptoren kan utløse cellulære effektor programmer, så som aktivering av tyrosin kinaser, intracellulær kalsium ionefrigjøring og interleukin-2 produksjon (R.T. Abraham et al., Trends Biochem. Sei. 17,434-438 (1992)).

TCR er et multimeriske overflatekompleks som omfatter produkter av minst 6 gener og alle er nødvendige for effektiv plasmamembran ekspresjon. Klonotypiske alfa (a) og beta (B) kjeder til TCR mediert spesifikk målcelle gjenkjenning. Disse kjedene er ikke-kovalentlig assosiert med ikke-polymorfe komponenter av CD3 kompleks gamma (y), delta (8) og epsilon (e) og zeta ( Q kjeden. Disulfid-bundet ^ homodimer er et trans-membranmolekyl og dets cytoplasmiske deler spiller en sentral rolle for TCR-formidlet signaltransduksjon og induksjon av cytolyse. C, kjeden har evne til autonom signal transduksjon, dvs. settet alene er tilstrekkelig for å formidle en respons. Fusjon av kjeden med en ekstracellulær ligand bindende domene kan resultere i et molekyl som kan bli aktivert ved interaksjon med liganden (S.J. Frank et al., Science 249,174-177

(1990); C. Romeo & B. Seed. Cell 64,1037-1046 (1990); F. Letourneur & R.D. Klausner, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88, 8905-8909 (1991). En isoform av eta (n.), representerer en alternativt spleiset form av Q gen transkriptet.

Tumor dannelse innbefatter mutasjon av onkogener og tumorsuppresorgener i somatiske celler. Slike mutasjoner kan resultere i strukturelle endringer eller i overekspresjon av proteinene. Begge heneldsene kan føre til endringer i den intracellulære prosesseringen av disse proteinene og presentasjon av nye antigene strukturer i assosiasjon med hovedhistokompatibilitetsantigenene på overflaten til cellene. Deteksjon av antistoffet rettet mot onkogene produkter i serum til tumorpasienter er en indikasjon på at onkogene produkter kan være antigene. Ytterligere bevis for denne antigenisiteten er utløsning av den cellulære immunresponsen. Fremkomst av CTL som gjenkjenner og eliminerer tumorceller er blitt demonstrert i et antall modellsystemer (T. Boon, Adv. Cancer Res. 58,177-210 (1992); M.W. Kast et al., Cell 59, 603-614 (1989); Disis et al., Cancer Res. 54, 16-20 (1994)).

Tilstedeværende strategier for å bestemme den cytolytiske aktiviteten til T-lymfocytter, for eksempel for behandling av cancer, lider av flere ulemper, så som MHC-hemming av gjenkjenningsprosessen i naturlig forekommende CTL. Det er et behov for en metode for å løse begrensningene som fremkommer.

Det er hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en slik forbedret metode som innbefatter manipulering av CTL-gjenkjenningsspesifisiteten, for eksempel for å danne endrede CTL potente og selektive anti-tumormidler. Denne metoden er basert på identifikasjon av genetiske endringer i benigne og spesielt i maligne tumorceller. Tilveiebringing av CTL med en definert tumorcelle spesifisitet muliggjør målsøking til definerte tumorceller og MHC-uhemmede og MHC-uavhengig destruksjon av målceller. Tumorcelle lysering ved CTL podet med en ny, MHC uavhengig gjenkjennings spesifisitet kan bli gransket in vitro (eks vivo) eller in vivo, for eksempel i et genterapi metode som innbefatter cancer behandling.

Tumorceller er (pre)-definerte eller selekterte målceller i det de inneholder den antigene strukturen (liganden) gjenkjent og bundet av den antigen bindende domenen som er en del av det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører et chimerisk protein med evne til å lede en CTL for spesifikt å gjenkjenne og drepe selekterte tumorceller. Oppfinnelsen tilveiebringer spesielt et chimerisk protein omfattende en gjenkjenningsfunksjon, en hengselsregion og £ kjede til TCR, og et CTL som produserer en eller flere av slike proteinmolekyler. Binding av en celle-bundet ligand til gjenkjenningsdelen av det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen fører til £ kjede-mediert signal transduksjon innenfor CTL og resulterer til slutt i lysering av cellen som bærer liganden.

Det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen er et protein som ikke eksisterer i naturen. Proteinet er bifunksjonelt fordi det har evne til både spesifikk gjenkjenning og binding til en bestemt antigen struktut (via dets gjenkjenningsfunksjonsdomene) og virker som en signaliserende komponent (via C, kjededelen). Hengselsregionen virker som en spacer og forsikrer nødvendig adgang og fleksibilitet ved gjenkjennings funksjonsdomenen. Hengsels regionen er vesentlig for funksjonaliteten til det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen. Arrangementet i det chimeriske proteinet er slik at gjenkjennings^ funksjonen er beliggende ved N-terminusen og koblet til £ kjededelen ved C-terminusen til det chimeriske proteinet via hengselsregionen. Ved at det er et celleoverflate reseptormolekyl omfatter det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen en ekstracellulær domene, en transmembran domene og en cytoplasma domene og blir skutt inn i plasmamembranen til vertscellen, for eksempel CTL. Funksjonaliteten til proteinet ifølge oppfinnelsen innenfor vertscellen er detekterbar i en analyse egnet for å demonstrere signaliseringspotensialets nevnte protein ved binding av en bestemt ligand, for eksempel i en analyse som muliggjør deteksjon av en signaliserende reaksjonsvei som blir utløst ved binding av liganden, så som en analyse som innbefatter måling av en økning av kalsiumionefrigjøringen, intracellulær tyrosin fosforylering, inositol fosfat omdanningen eller interleukin (IL) 2, interferon y, GM-CSF, IL-3, IL-4 produksjonen som dermed blir oppnådd. (R.T. Abraham et al., Trend Biochem, Sei. 17,434-438

(1992)). Slike analyser er lett tilgjengelige for personer innenfor dette området. Det refereres til analyser anvendt i eksemplene. Det fremgår at disse analysene kan bli modifiserte, for eksempel ved anvendelse av andre egnede cellelinjer.

Gjenkjenningsfunksjonen fremkommer av en antigen bindende domene til antistoffet, spesielt et enkelt kjede antistoff (scFv). Enkelt kjede antistoffer er genfusjoner som omfatter de variable domenene til tunge og lette kjeder av monoklonale antistoffer. Nevnte gjenkjenning og bindende funksjon er gitt av C, kjeden til TCR-kompIekset for å omgå MHC-hemmet antigen gjenkjenning gjennom a/13 kjedene til TCR.

Den antigenbindende domenen kan oppnås fra et monoklonalt antistoff rettet mot og som er spesifikt for et egnet antigen på en tumorcelle.

Et egnet antigen er et antigen med forsterket eller spesifikk ekspresjon på overflaten av en tumorcelle sammenlignet med en normal celle, for eksempel et antigen som kommer fra genetiske endringer i tumorceller. Eksempler på egnede antigener innbefatter duktal-epitelial mucin, gp 36, TAG-72, vekstfaktorreseptorer og glykosphingolipider og andre karbohydrat antigener fortrinnsvis uttrykt i tumorcellene (det refereres til nedenfor angitte antigener og antistoffer). Duktal-epitelial mucin ble sterkere uttrykt på bryst, ovarie og bukspyttkjertel carcinoma celler og blir for eksempel gjenkjent av monoklonalt antistoff SM3 (Zotter et al., Cancer Rev. 11, 55-101 (1988)). Glykoprotein gp36 finnes på overflaten av humane leukemi og lymfom celler. Et eksempelvist antistoff som gjenkjenner nevnte antigen er SN 10. TAG-72 er et pancarcinoma antigen gjenkjent av det monoklonale antistoffet CC49 (Longenecker, Sem. Cancer Biol. 2,355-356). Vekstfaktor reseptorer utgjøres for eksempel av human epidermal vekstfaktor (EGF) reseptor (Khazaie et al., Cancer and Metastasis Rev. 12,255-274 (1993)) og HER2, også referert til som erbB-2 eller gp 185 (A. Ullrich and J. Schlessinger, Cell 61,203-212 (1990)). erbB-2 reseptoren er et transmembran molekyl som blir overuttrykt i en høy prosentandel av humane carcinomer (N.E. Hynes, Sem. in Cancer Biol. 4,19-26

(1993)). Ekspresjon av erbB-2 i normal voksent vev er lavt. Denne forskjellen i ekspresjon identifiserer erbB-2 reseptoren som "tumor forsterket".

Den antigen bindende domenen er oppnåelig fra et monoklonalt antistoff produsert ved anvendelse som immunogen levedyktig humane tumorceller som presenterer antigenet i dets native form. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen bindes gjenkjenningsdelen til det chimeriske proteinet spesifikt til en antigen determinant på den ekstracellulære domenen til en vekstfaktorreseptor, spesielt HER2. Monoklonale antistoffer rettet mot HER-2 vekstfaktor reseptoren er kjent og er for eksempel beskrevet av S. J. Kenzie et al., Oncogene 4, 543-548 (1900), R.M. Hudziak et al., Molecular and Cellular Biology 9,1165-1172 (1989), International Patent Application WO 89/06692 (Genentech) og Japans patentsøknad Kokai 02-150 293 (Ajinomoto KK). Monoklonale antistoffer dannet mot levedyktige humane tumorceller som presenterer HER2 i dets native form, så som SKBR3 celler, er for eksempel beskrevet i europeisk patentsøknad EP-A-502 812 (Ciba-Geigy) som er angitt heri som referanse, og innbefatter antistoffene FRP5, FSP16, FSP77 og FWP51. Hybridoma cellelinjer som produserer disse antistoffene er blitt deponert til European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, UK), november 21,1990 under aksesjonsnr. 90112115,90112116, 90112117 og 90112118.

I det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen er den foretrukne antigen bindende domenen et enkelt-kjede rekombinant antistoff (scFv) omfattende lett kjede variabel domene (VjJ brodannet til tungkjede variable domenen (Vjj) via en fleksibel linker (spacer), fortrinnsvis et peptid. Peptidet består fortrinnsvis av omtrent 10 til omtrent 30 aminosyrer, spesielt naturlig forekommende aminosyrer, for eksempel omtrent 15 naturlig forekommende aminosyrer. Foretrukket er et peptid som består av aminosyrer valgt fra L-Iysin og L-serin, spesielt det 15 aminosyre lange peptidet bestående av 3 repeterende enheter av Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Et enkelt-kjede antistoff er fordelaktig hvor Vjj er beliggende ved den N-terminale enden av det rekombinante antistoffet. Et chimerisk protein er foretrukket hvor enkelt-kjede rekombiant antistoff har den ovenfor angitte foretrukne spesifisiteten, for eksempel et chimerisk protein omfattende et enkelt-kjede rekombinant antistoff hvor tung kjede variable domener og lett kjede variable domener oppnås fra et monoklonalt antistoff, for eksempel et murint monoklonalt antistoff, rettet mot human vekstfaktor reseptor HER2, så som et murint monoklonalt antistoff valgt fra gruppen bestående av FSP16, FSP77, FRP5 og FWP51.

Den variable domenen til et antistoff med lett eller tung kjede består av såkalte sjelett-regioner (FR), som er nokså konserverte i antistoffer ved forskjellige spesifisiteter, og av hypervariable regioner også betegnet komplementaritets bestemmende regioner (CDR), som er typiske for en bestemt spesifisitet. I den antigenbindende domenen til et chimerisk protein ifølge oppfinnelsen er FR fortrinnsvis avledet fra et pattedyr, for eksempel et murint eller spesielt et humant antistoff. scFv derivatet av et monoklonalt antistoff er podet på C, kjeden av TCR/CD3 komplekset.

Spesielt foretrukket er et chimerisk protein som omfatter et enkelt-kjede rekombinant antistoff hvor tungkjede variable domenen omfatter et polypeptid med formelen

hvor polypeptidkjeden er beskrevet å begynne ved den N-terminale ekstremiteten og slutter ved den Oterminale ekstremiteten og FRj er en peptidrest som omfatter minst 25-29, fortrinnsvis 25-33 naturlig forekommende aminosyrer, FR2 er en peptid rest som omfatter 12-16 naturlig forekommende aminosyrer, FR3 er en peptid rest som omfatter 30-34 naturlig forekommende aminosyrer, FR4 er en peptid rest som omfatter minst 6-10, fortrinnsvis 6-13 naturlig forekommende aminosyrer, CDRjh er en peptid rest av aminosyresekvensen 31 til 35 ifølge SEQ ID NO: 2, CDR2H er en peptid rest av aminosyresekvens 50 til 66 ifølge SEQ ID NO: 2 og CDR3H er en peptidrest av aminosyresekvens 99 til 108 ifølge SEQ ID NO: 2 eller CDRjfj er en peptid rest av aminosyresekvens 31 til 35 ifølge SEQ ID NO: 4, CDR2H er en peptid rest av aminosyresekvens 50 til 66 ifølge SEQ ID NO: 4 og CDR3H er en peptid rest av aminosyresekvens 99 til 109 ifølge SEQ ID NO: 4, og hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand som danner S-S-broer. Disse komplementaritetsbestemmende regionene er Asn-Tyr-Gly-Met-Asn (CDRijj), Tip-Ile-Asn-Thr-Ser-Thr-Gly-Glu-Ser-Thr-Phe-Ala-Asp-Asp-Phe-Lys-Gly (CDR2H) og Trp-Glu-Val-Tyr-His-Gly-Tyr-Val-Pro-Tyr (CDR3H) ifølge SEQ ID NO: 2, eller Ser-Tyr-Trp-Met-Asn (CDRih) , Met-Ile-Asp-Pro-Ser-Asp-Ser-Glu-Thr-Gln-Tyr-Asn-Gln-Met-Phe-Lys-Asp(CDR2H= og Gly-Gly-Ala-Ser-Gly-Asp-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val (CDR3H) ifølge SEQ JX> NO: 4.

Spesielt foretrukket er et chimerisk protein hvori det rekombinante enkelt-kjede antistoffet omfatter en tung kjede variabel domene med formel I, hvori skjelettregionene FRj, FR2, FR3 og FR4 er de som fortrinnsvis kan avledes fra et pattedyr, spesielt et murint eller et humant antistoff.

I en første utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er et chimerisk protein mest foretrukket hvori den tungkjede variable domenen til rekombiant enkelt-kjede antistoff omfatter et polypeptid med aminosyresekvens 2 til 120, ifølge SEQ ID NO: 2, hvori eventuelt en eller flere, for eksempel 1, 2,3 eller 4, enkelt aminosyrer innenfor aminosyresekvensene 2 til 30 er erstattet med andre aminosyrer eller deletert, og hvori aminosyren Cys kan være i oksydert tilstand og danner S-S-broer, spesielt et chimerisk protein hvori den tungkjede variable domenen omfatter et polypeptid med aminosyresekvens 6 til 119 ifølge SEQ ID NO: 2, hvori aminosyren Cys kan være i oksydert tilstand og danne S-S-broer.

I en andre utførelsesform ifølge oppfinnelsen er et chimerisk protein mest foretrukket hvori den tungkjede variable domenen til rekombinant enkelt-kjede antistoff omfatter et polypeptid med aminosyresekvens 2 til 120 ifølge SEQ ID NO: 4, hvori eventuelt en eller flere, for eksempel 1,2,3 eller 4, aminosyrer innenfor aminosyresekvensene 2 til 30 (FRi), 36 til 49 (FR2) og/eller 110 til 120 (FR4), er erstattet med andre aminosyrer eller deletert, og hvori aminosyren Cys kan være i oksydert tilstand og danne S-S-broer, spesielt rekombinante antistoffer med en tungkjede variabel domene omfattende et polypeptid med aminosyresekvens 6 til 120 ifølge SEQ ID NO: 4, hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand og danne S-S-broer.

For eksempel kan en hydrofob aminosyre innenfor en skjelettregion bli erstattet av en annen aminosyre, fortrinnsvis også en hydrofob aminosyre, for eksempel en homolog aminosyre, erstattet med to aminosyrer (som resulterer i innskudd av en aminosyre), eller deletert. Likeledes kan en hydrofil aminosyre innenfor en skjelettregion bli erstattet med en annen aminosyre, to aminosyrer eller deletert, i det erstatning av aminosyrene fortrinnsvis opprettholder hydrogen bindingsstrukturen til den tilsvarende skjelett-regionen. En hvilken som helst erstatning av en eller flere aminosyrer tar hensyn til retningslinjene som er kjent innenfor fagområdet for nydannelse eller humanisering av et antistoff. Spesielt oppsiktsvekkende er retningslinjer som skal redusere immunogen-isiteten til det gjendannede antistoffet (sammenlignet med "opprinnelig" monoklonalt antistoff) og/eller konstruering av et antistoff som er omtrent likt eller som overskrider bindingsaffiniteten til det "opprinnelige" antistoffet. En modifikasjon av aminosyrene kan være begrenset til en enkel FR, dvs. FRi, FR2, FR3 eller FR4, eller innbefatter to, tre eller alle fire FR.

Et likeledes foretrukket chimerisk protein ifølge oppfinnelsen omfatter et rekombinant enkelt-kjede antistoff hvori den lettkjede variable domenen omfatter et polypeptid med formelen

hvori polypeptidkjeden er beskrevet å begynne med den N-terminale ekstremiteten og som slutter ved den C-terminale ekstremiteten og FRg er en peptidrest som omfatter naturlig forekommende aminosyrer, fortrinnsvis 19-25, spesielt 19-23 naturlig

forekommende aminosyrer, FR7 er en peptidrest som omfatter 13-17 naturlig forekommende aminosyrer, FRg er en peptidrest som omfatter 30-34 naturlig forekommende aminosyrer, FR9 er en peptidrest som omfatter naturlig forekommende aminosyrer, spesielt 7-11 naturlig forekommende aminosyrer, og CDR^l er en peptidrest av aminosyresekvensen 158 til 168 ifølge SEQ ID NO: 2, CDR2L er en peptidrest av aminosyresekvensen 184 til 190 ifølge SEQ UD NO: 2 og CDR3L er en peptidrest av aminosyresekvensen 223 til 231 ifølge SEQ ID NO: 2 eller CDR^l er en peptidrest av aminosyresekvensen 159 til 164 ifølge SEQ ID NO: 4, CDR2L er en peptidrest av aminosyresekvensen 185 til 191 ifølge SEQ ID NO: 4 og CDR3L er en peptidrest av aminosyresekvensen 224 til 231 ifølge SEQ ID NO: 4, og hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand og danne S-S-broer. Disse spesielle komplementaritetsbestemmende regionene er Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Val-Tyr-Asn-Ala-Val-Ala(CDRiL), Ser-Ala-Ser-Ser-Arg-Tyr-Thr(CDR2L) og Gln-Gln-His-Phe-Arg-Thr-Pro-Phe-Thr (CDR3L) ifølge SEQ ID NO: 2, eller Lys-Ala-Ser-Gln-Asp-Ile-Lys-Lys-Tyr-Ile-Ala (CDRjtJ, Tyr-Thr-Ser-Val-Leu-Gln-Pro (CDR21J og Leu-His-Tyr-Asp-Tyr-Leu-Tyr-Thr (CDR31J ifølge SEQ ID NO: 4.

Spesielt foretrukket er et chimerisk protein hvori det rekombinante antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene med formel II, hvori peptidresidiene til skjelettregionene FR5, FRg, FR7 og FRg er de som er avledet fra et pattedyr, spesielt et murint eller et humant antistoff.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er et chimerisk protein mest foretrukket, hvori det rekombinante antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene omfattende et polypeptid ifølge aminosyresekvensen 135 til 240 ifølge SEQ ID NO: 2, hvori eventuelt en eller flere for eksempel 1, 2, 3 eller 4, aminosyrer innenfor aminosyresekvensene 135 til 157 (FR(5)} 169 til 183 (FR7), 191 til 222 (FRg) og/eller 232 til 240 (FR9) blir erstattet med andre aminosyre eller deletert, og hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand og danne S-S-broer, spesielt en lettkjede variabel domene som omfatter et polypeptid av aminosyresekvensen 135 til 140 ifølge SEQ ID NO: 2, hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand og danne S-S-broer.

I en annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen er et chimerisk protein mest foretrukket, hvori det rekombinante antistoffet omfatter en lettkjede variabel domene som omfatter et polypeptid av aminosyresekvensen 136 til 240 ifølge SEQ ID NO: 4, hvori eventuelt en eller flere, for eksempel 1,2, 3 eller 4 enkelt aminosyrer innenfor aminosyresekvensene 136 til 158 (FRg), 170 til 184 (FR7), 192 til 223 (FRg) og/eller 343 til 240

( FRg) er erstattet med andre aminosyrer eller deletert, og hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand og danne S-S-broer, spesielt en lettkjede variabel domene som omfatter et polypeptid av aminosyresekvensen 136 til 240 ifølge SEQ JD NO: 4, hvori aminosyren Cys kan være i oksidert tilstand som danner S-S-broer.

For eksempel kan aminosyrene innenfor skjelettregionene bli erstattet med andre aminosyrer eller deletert som beskrevet ovenfor for tungkjede.

Spesielt foretrukket er et chimerisk protein som omfatter et enkelt-kjede rekombinant

antistoff hvori den tung-kjede variable domenen og den lett-kjede variable domenen er koblet av en spacergruppe bestående av 10 til 30, for eksempel omtrent 15, aminosyrer, spesielt et enkelt-kjede rekombinant antistoff som omfatter et polypeptid med formelen

hvori polypeptidkjeden er beskrevet å begynne ved den N-terminale ekstremiteten og ragende ved den C-terminale ekstremiteten og FRj, CDRjh, FR2, CDR2H> FR3» CDR3H, FR4, FRg, CDRil, FR7, CDR2L, FRg, CDR3L og FR9 har betydningene angitt før og Sp er en peptidspacer som beskrevet ovenfor.

Den antigenbindende domenen kan bli testet for dens spesifisitet overfor et forutdefinert tumorcelle antigen ifølge fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet, for eksempel ved immun fluorescens farving av celler som uttrykker høye nivåer av antigenet, ved immunblotting enten direkte eller ved immunpresipitering og proteinblotting av immunkompleksene, eller ved annen immunoanalyse så som binding, kryssinhibisjon eller konkurrerende radio- eller enzym immunoanalyse. Bindingsaffiniteten til den antigen bindende domenen kan bli bestemt ved anvendelse av en egnet kvantitativ analyse som lett kan bli bestemt av fagfolk innenfor dette området basert på kjente teknikker og prinsipper. Om ønskelig kan den antigen bindende domenen bli sammenlignet med affiniteten til et egnet referanse antistoff, for eksempel "parenteralt" monoklonalt muse antistoff som det kan aveldes fra.

I tillegg til den antigenbindende domenen omfatter det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen en hengselsregion som er skutt inn som et kort, fleksibelt teter mellom den antigen bindende domenen og C, domenen. Hengselsregionen er et peptid som omfatter fra omtrent 40 til omtrent 200 naturlig forekommende aminosyrer, fortrinnsvis fra omtrent 60 til omtrent 190 aminosyrer. Hengselsregionen i det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis en immunoglobulin-lignende hengselsregion, for eksempel en hengselsregion som kan avledes fra CD4 molekylet, så som D3D4 immunoglobulin domenene (P.J. Maddon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 84,9155-9159 (1987)) eller en hengselsregion som kan avledes fra CD8a molekylet, for eksempel Lyt-2 (R. Zomoyska et al., Cell 43,153-163 (1985); B.J. Classon et al. Int. Immunol. 4, 2,215-225 (1992)). I aminosyresekvensen angitt i SEQ JD NO: 7 rager hengselsregionen (Lyt-2) fra aminosyren i posisjonen 245 til aminosyren i posisjon 304.

I tillegg til den antigenbindende domenen og hengselsregionen omfatter det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen en funksjonell C, domene som bidrar til transmembranen og som signaliserer domenen til det chimeriske proteinet. En funksjonell C, domene omfatter vesentlig transmembranen og cytoplasmadomenen til C, kjeden, C, domenen formidlet aktivering av TCR ved interaksjon av den antigenbindende domenen til det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen i det et spesifikt antigen utløser flere signaliserende reaksjonsveier, for eksempel de som er angitt ovenfor. Ifølge oppfinnelsen er C, kjeden fra pattedyr, spesielt murin eller human opprinnelse. Innenfor TCR eksisterer C, av en disulfidhomodimer. En funksjonell domene er et protein som ved ekspresjon i T cellehybridomer som mangler endogen C, ekspresjonen har evne til å gjenopprette i nevnte hybridomer en funksjonell aktiv TCR, for eksempel på en slik måte antigen-indusert interleukin-2 sekresjon og vekststimulering blir på ny oppnådd (S. Frank et al., Science 249,174-177 (1990)). Eksempler på en funksjonell ^ domene innbefatter molekyler omfattende aminosyrene 28 til 164 av murin (A.M. Weissman, Science 239,1018-1021 (1988)) og aminosyrene 28 til 163 av human C kjede (nummerering ifølge A. M. Weissman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85, 9709-9713

(1988), fig. 2 som er innkorporert heri som referanse). Det blir betraktet at C, protein anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse skal innbefatte varianter forutsatt at disse variantene er funksjonelle. Varianter av pattedyr, spesielt murin og human opprinnelse er foretrukket.

For eksempel er en variant en naturlig forekommende variant av £ molekylet som tilstede i en bestemt art. En slik variant kan bli kodet av et relatert gen fra samme genfamilien eller en alletisk variant av et bestemt gen. Betegnelsen "variant" omfatter også et modifisert £ molekyl som kan produseres fra et DNA som er blitt utsatt for in vitro mutagenese, forutsatt at proteinet som blir kodet av DNA har den funksjonelle aktiviteten til det autentiske C, molekylet. Slike modifikasjoner kan bestå av addisjon, utveksling og/eller delesjon av en eller flere aminosyrer, i det det sistnevnte resulterer i forkortede varianter.

Et foretrukket chimerisk protein ifølge oppfinnelsen omfatter et protein med aminosyresekvensen som angitt i SEQ ID NO: 7.

Oppfinnelsen omfatter videre et polyklonalt og monoklonalt antistoff som spesifikt blir bundet til et protein ifølge oppfinnelsen. Et slikt antistoff blir dannet ifølge konvensjonelle metoder som er velkjente innenfor fagområdet.

Det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ifølge en fremgangsmåte som i seg selv er kjent, kjennetegnet ved at egnede vertsceller som definert nedenfor produserer et protein ifølge oppfinnelsen blir multiplisert in vitro eller in vivo og om ønskelig blir proteinet isolert. Det er foretrukket at et protein ifølge oppfinnelsen blir produsert ifølge en fremgangsmåte som omfatter dyrking av egnet transdusert sete L under betingelser som muliggjør ekspresjon av DNA konstruksjonen som koder for proteinet og, eventuelt, utførelse av en analyse som detekterer funksjonaliteten til proteinet. Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et chimerisk protein ifølge oppfinnelsen som omfatter dyrking av en egnet vertscelle, spesielt en CTL, som er blitt transdusert med en vektor som omfatter en ekspresjons-kassett omfattende en promoter og et DNA kodende for nevnte protein, i det DNA blir kontrollert av nevnte promoter under betingelser som muliggjør ekspresjon av nevnte DNA. Et foretrukket chimerisk protein ifølge oppfinnelsen blir konstruert å innbefatte en scFv, hengselsregion og et funksjonelt C, molekyl. Fremgangsmåte for produsering av det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen tilveiebringer proteinet i en mengde som er tilstrekkelig for å muliggjøre at den transduserte vertscellen lyserer en målcelle.

Egnede vertsceller innbefatter for eksempel primære cytotoksiske T lymfocytter (CD8<+>), CD4<+>T hjelperceller og natural killer celler (NK). Foretrukket er pattedyrceller, spesielt CTL med pattedyr, spesielt human opprinnelse.

Som angitt ovenfor eller nedenfor betyr in vitro eks vivo og innbefatter følgelig betingelser for celledyrking.

Formering av pattedyrceller in vitro utføres for eksempel i et egnet dyrkningsmedium, omfattende vanlig standardkulturmedium, så som Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) eller RPMI1640 medium, eventuelt tappet for pattedyrserum, for eksempel føtalt kalveserum, eller sporelementer og vekst vedvarende tilsetningsstoffer, for eksempel feeder celler.

Oppfinnelsen vedrører også et rekombinant DNA eller en DNA konstruksjon egnet for manipulering gjenkjenningsspesifisiteten til T-lymfocytter. Oppfinnelsen tilveiebringer spesielt en DNA konstruksjon som kan lede syntesen av et chimerisk protein omfattende en gjenkjenningsfiinksjon, en hengselsregion og ^-kjeden som en signaliserende komponent av TCR. Oppfinnelsen tilveiebringer spesielt en DNA konstruksjon som koder for et chimerisk protein omfattende en antigen bindende domene, en hengselsregion og en C, domene, spesielt en DNA konstruksjon som omfatter minst et poly-nukleotid kodende for en proteindel som angitt ovenfor eller nedenfor. I et foretrukket arrangement utgjør den antigen bindende domenen første delen, hengselsregionen den andre delen og t> kjeden den tredje delen.

Ifølge definisjonen innbefatter DNA ifølge oppfinnelsen kodende enkelttrådet DNA, dobbelttrådet DNA bestående av nevnte kodende DNA og DNA som er komplementære eller selve disse komplementære (enkelttrådede) DNA.

Det er fordelaktig at DNA konstruksjonen ifølge oppfinnelsen omfatter et fjerde del som er beliggende oppstrøms for den første delen (antigen bindende domene) og som koder for et leder peptid. Det er foretrukket at den fjerde delen av DNA konstruksjonen ifølge oppfinnelsen koder for et lederpeptid til et immunoglobulin (lg) gen, for eksempel et lg tungkjede lederpeptid. Ig tungkjede lederpeptidet fremmer målsøking av nakne poly-peptider i hulrommet av endoplasmatiske retikulum og blir deretter spaltet av og proteinet blir sortert gjennom Golgi og membranet til dets transmembrane beliggenhet. Spesielt foretrukket er et lederpeptid med sekvensen: Met-Ala-Trp-Val-Trp-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Met-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-Pro-Lys.

Foretrukket er et DNA som omfatter et DNA kodende for proteinet ved aminosyresekvensen angitt i SEQ ID NO: 7, for eksempel et DNA som har nukleotidsekvensen angitt i SEQ ID NO: 5. DNA sekvensen angitt i SEQ ID NO: 7 har følgende trekk: beskrivelse av sekvensen: 5'-EcoRI-IgH kjedeleder D6/12-scFv(FRP5):Lyt-2 hengsels: - CD3 zeta (transmembran (TM) og cytoplasmisk (Cyt))-EcoRI-3'

Teknikkens stand er slik at en person innenfor dette området vil kunne syntetisere et DNA molekyl ifølge oppfinnelsen hvis den skrevne informasjonen gitt heri blir fremlagt. En egnet metode for oppnåelse av en DNA konstruksjon ifølge oppfinnelsen innbefatter fremgangsmåter som er velkjente innenfor fagområdet og omfatter for eksempel syntetisering av et antall oligonukleotider, amplifikasjon av spesifikke gensekvenser, for eksempel ved anvendelse av PCR (polymerasekjede reaksjon) teknologi, spleising derav for å tilveiebringe ønsket DNA sekvens og/eller anvendelse av DNA restriksjonsenzymer og ligaser. Et DNA ifølge oppfinnelsen kan bli syntetisert ved kombinering av kjemiske og rekombinante metoder.

Oppfinnelsen omfatter videre en vektor, så som en retroviral vektor, omfattende en DNA konstruksjon ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg en genetisk omkonstruert transdusert CTL som har evne til å ødelegge en målsøkt tumorcelle på en MHC-uavhengig og MHC-uhemmet måte. Ifølge oppfinnelsen produserer CTL ovennevnte chimeriske protein ifølge oppfinnelsen. CTL blir transdusert med et DNA ifølge oppfinnelsen og har følgelig evne til å uttrykke nevnte DNA og produserer proteinet som blir kodet av nevnte DNA. Destruksjon av målsøkt tumorcelle krever at proteinet som følgelig blir produsert er funksjonelt, dvs. den antigenbindende domenen til nevnte protein må ha evne til å gjenkjenne og bli bundet til den målsøkte tumorcellen og C, domenen må ha evne til å utløse det ønskede signalet innenfor CTL. CTL ifølge oppfinnelsen blir dyrket under betingelser som muliggjør (favoriserer) ekspresjon av introdusert DNA, og om ønskelig analysert for produksjon derav. Forlenget og forhøyet ekspresjon av nevnte DNA er foretrukket.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå en CTL med en definert, MHC-uavhengig og MHC-uhemmet tumorcelle spesifisitet ved innføring i nevnte T-lymfocytt en DNA konstruksjon som omfatter en gjenkjenningsfiinksjon, en spacer domene og (^-kjeden som en signaliserende komponent av TCR. DNA konstruksjonen kan bli ført inn i CTL ved DNA-overføirngsmetoder som er innlysende for fagfolk innenfor dette omradet, for eksempel ved hjelp av et vektorsystem, så som et viralt eller ikke-viralt vektorsystem. Egnede virale vektorer innbefatter retrovirale, adenovirale og adeno-assosierte virale vektorer. Prosessen kan anvendes både i in vivo og in vitro situasjoner. In vitro applikasjon er foretrukket.

T-lymfocytten blir dyrket under konvensjonelle betingelser som muliggjør ekspresjon av nevnte DNA konstruksjon og analysert for produksjon derav. Forlenget og forhøyet ekspresjon av nevnte DNA er foretrukket. CTL blir fortrinnsvis dyrket i nærvær av IL-2. Transdusert CTL ifølge oppfinnelsen kan bli selektert for en egnet markør. For eksempel kan transdusert CTL bli selektert for kotransdusert neo resistens markør dersom DNA konstruksjonen ifølge oppfinnelsen blir overført via en retroviral vektor.

Oppfinnelsen vedrører spesielt en sammensetning som omfatter transdusert CTL ifølge oppfinnelsen. En slik sammensetning omfatter for eksempel transdusert CTL som produserer et protein ifølge oppfinnelsen sammen eller blandet sammen med en akseptabel, for eksempel en farmasøytisk akseptabel, bærer. En slik bærer kan være en fast eller flytende bærer. Sammensetningen kan bli anvendt eks vivo, for eksempel for å drepe preselekterte målceller i en sammensetning (for eksempel kroppsvæske eller vev) fjernet fra en pasients legeme. Etter at målcellene er blitt drept (som bør bli undersøkt) blir sammensetningen på ny innført i pasientens legeme. Sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan følgelig bli anvendt for behandling eller adjuvant behandling av tumorer.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes for lysering av selekterte tumorceller omfattende at nevnte tumorceller settes i kontakt med CTL produserende chimerisk protein ifølge oppfinnelsen. En slik fremgangsmåte, som kan anvendes på både in vitro og in vivo situasjoner blir tumorcellen målsøkt av den antigen bindende domenen som er en del av det chimeriske proteinet ifølge oppfinnelsen.

Det er foretrukket å anvende vertens eget CTL, spesielt dersom eksponering og interaksjon skal oppstå in vivo, men om hensiktsmessig kan CTL også bli avledet fra andre kilder. Andre kilder utgjør for eksempel vevskultur eller annet pattedyr fra samme eller annen art.

CTL finnes i pattedyrlegemet: i vev, lymfesystem og i blodet. Egnet CTL blir valgt og fjernet fra pattedyret. For eksempel blir CTL valgt som CD8<+> perifere lymfocytter dyrket in vitro i nærvær av JL- 2. Alternativt blir uselekterte perifere lymfocytter anvendt for gentransduksjon. Om ønskelig kan verten bli behandlet for å øke antall stimulerte

CTL.

Oppfinnelsen kan også ha anvendelse ved behandling av cancer omfattende anvendelse av genetisk omkonstruert CTL ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan en fremgangsmåte omfatte eksponering av selekterte tumorceller for CTL produserende chimerisk protein ifølge oppfinnelsen. En in vitro (som betyr eks vivo) applikasjon av denne metoden for å fremme CTL-mediert lysering kan være selektiv behandling av tumorceller fjernet fra et pattedyr, spesielt et menneske, som trenger cancerbehandling. Et eksempel vil være å anvende CTL ifølge oppfinnelsen for å eliminere tumorceller fra benmargen fjernet fra en pasient, for eksempel en pasient som gjennomgår bestrålningsbehandling før gjen-innføring av benmargen. Som en konsekvens av interaksjonen av tumorcellene og CTL ifølge oppfinnelsen blir tumorcellene lysert. Dersom fremgangsmåten for behandling av cancer blir utført in vivo kan den videre omfatte gjeninnføring av transdusert CTL ifølge oppfinnelsen inn i kroppen til pattedyret, spesielt mennesket, som skal bli behandlet. Det blir også betraktet at CTL som uttrykker et DNA ifølge oppfinnelsen blir produsert ved in vivo transduksjon av DNA, for eksempel i et pattedyr som trenger cancerbehandling.

Foreliggende oppfinnelse vedrører et bifunksjonelt protein, kjennetegnet ved at det omfatter: 1) en antigen bindende domene avledet fra et monoklonalt antistoff rettet mot et egnet antigen på en tumorcelle, 2) en hengsels region som omfatter fra omtrent 40 til omtrent 200 aminosyrer og 3) en funksjonell zeta (Q kjede avledet fra T-celle antigenreseptoren (TCR).

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et DNA kodende for et bifunksjonelt protein, kjennetegnet ved at det omfatter: 1) en antigenbindende domene avledet fra et monoklonalt antistoff rettet mot et egnet antigen på en tumorcelle,

2) en hengselsregion som omfatter fra omtrent 40 til omtrent 200 aminosyrer og

3) en funksjonell zeta (Q kjede avledet fra T-celle antigenreseptoren (TCR).

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en vertscelle, kjennetegnet ved at den uttrykker DNA ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for lysering av selekterte tumorceller, kjennetegnet ved å kontakte nevnte tumorceller med CTL som produserer protein ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å utruste en CTL med en definert, MHC-uavhengig og MHC-uhemmet tumorcelle spesifisitet, kjennetegnet ved å innføre inn i nevnte CTL et DNA ifølge oppfinnelsen.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge oppfinnelsen, karakterisert ved å dyrke en vertscelle ifølge oppfinnelsen under betingelser som muliggjør ekspresjon av et DNA kodende for nevnte protein.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse en sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter en vertscelle ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av vertscellen ifølge oppfinnelsen til fremstilling av et legemiddel for behandling av cancer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et polyklonalt eller monoklonalt antistoff, kjennetegnet ved at det er spesifikt for et protein ifølge oppfinnelsen.

Videre vedrører foreliggende oppfinnelse en vektor, kjennetegnet ved at omfatter et DNA ifølge oppfinnelsen.

Oppfinnelsen vedrører spesielt spesifikke utførelsesformer (for eksempel protein, DNA, CTL og fremgangsmåter for fremstilling derav) beskrevet i eksemplene. Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Forkortelser: FCS: føtalt kalveserum; LDH: laktat dehydrogenase; mAb: monoklonalt antistoff; MoMLV: Moloney murin leukemi virus; MoMLV-LTR: Moloney murin leukemi virus-lang terminal gjentagelse, scFv: enkelkjede antistoff: SDS-PAGE: natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese.

Materialer og metoder

Cellelinjer og kulturbetingelser

Klon 96 (C196) er en H-2K<d->hemmet cytotoksisk T cellelinje avledet fra C57BL/6 mus (K. Eichmann et al., J. Immunol. 147,2075-2081 (1991)). Cl96 og infektanter blir opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Gibco) supplementert med 10% FCS (Boehringer), 5 x IO"<5> M2-merkaptoetanol, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin og 3% kondisjonert supematant oppnådd fra X63Ag8-653 plastocytom celler transfektert med murin IL-2 cDNA (H. Karasuyama and F. Melchers, Eur. J. Immunol. 18,97-104 (1988)). Human leukemi T cellelinje Jurkat, retroviral pakkende cellelinje OE (J.P. Morgenstern and H. Land, Nuc. Acids Res. 18,3597-3596 (1990)) og P317 (A.D. Miller and GJ. Rosman, Biotechniques 7,980-990 (1989)) og transfektanter og murin fibroblast cellelinje transfektert med aktivert human erbB-2 reseptor, NJU3T3#3.7 blir dyrket i DMEM supplementert med 10% FCS, HC11R1#11 er en musebryst epitel cellelinje transfektert med humant erbB-2 proto-onkogen (N.E. Hynes et al., Mol. Cell. Biol. 10,4027-4034 (1990)) som blir dyrket i RPMI1640 (Gibco) supplementert med 10% FCS, 10 ng/ml epidermal vekstfaktor og 5 ug/ml insulin.

Eksempel 1: Konstruksjon av scFv( FRP5) :hengsel:zetafoDNA

Et DNA bestående av en gjenkjenningsfunksjon, en spacer domene og (^-kjeden som en signaliserende komponent av TCR/CD3 reseptor komplekset blir konstruert. Gjenkjenningsfunksjonen blir gitt av en scFv domene. Denne domenen er avledet fra det monoklonale antistoffet FRP5 (europeisk patentsøknad EP-A-502 812). FRP5 er spesifikk for den ekstraceullære domenen til erbB-2 reseptoren. scFV (FRP5) omfatter variable domener til tunge og lette kjeder (Vjj og VjJ av monoklonalt antistoff (mAb) koblet av en 15 aminosyre linkersekvens (SEQ ID NO: 2). Denne scFv domenen har evne til å gjenkjenne den ekstracellulære domenen til erbB-2 reseptoren (W. Wels et al., Biotechnology 10, 1128-1132 (1992); W. Wels et al., Cancer Res. 15, 6310-6317

(1992)). En ledersekvens fra en immunoglobulin tungkjede blir tilsatt til N-terminusen av scFv domenen. scFv(FRPS) cDNA blir ligert til en kort linkersekvens kodende for 59 aminosyrer fra den immunoglobulin-lignende hengselsregionen til CD8a genet (R. Zomoyska et al., Cell 43,153-163 (1985)). Transmembran og signaliserende domene ble gitt av ^-kjeden til TCR. Denne kjeden er ansvarlig for signal transduksjon etter TCR aktivering.

cDNA kodende for enkeltkjede antistoff FRP5 spesifikk for den ekstracellulære domenen til erbB-2 molekylet (SEQ ID NO: 1) blir subklonet inn i et plasmid inne-

holdende en immunoglobulin tungkjede leder (Lign)- Både £ cDNA og CD8a hengsel cDNA er avledet fra total RNA til cytotoksisk T cellelinje Cl96 ved anvendelse av en kombinasjon av revers transkripsjon og polymerasekjede reaksjon (RT-PCR). MoMLV revers transkriptase blir anvendt for første tråd cDNA syntese. Reaksjonene blir primet med 3' ^-spesifikt oligonukleotid 5813 (SEQ ID NO: 6) eller 3' CD8o>spesifikt oligonukleotid 8764 (SEQ ID NO: 7). Disse cDNA blir anvendt som PCR templater i det > primerparret 5812/5813 (SEQ JD NO: 8 og 6) innfører et 5' Xbal sete og et 3' Hindlll/Bgin sete og CD8a hengsel primer parret 8763/8764 (SEQ ID NO: 10 og 8) innfører et Xbal sete i begge endene. LigH-scFv(FRPS) DNA blir ligert til £cDNA begynnende fra aminosyreresidiet 28 (nummerering ifølge A. M. Weissman et al., Science 239,1018-1021 (1988)) ved anvendelse av Xbal setet for fusjon. CD8cc hengsel cDNA kodende aminosyreresidier 105 til 164 (nummerering ifølge R. Zomoyska et al., Cell 43,153-163 (1985)) blir deretter skutt inn i Xbal setet og undersøkt for riktig orientering. Resulterende scFv:hengsel: £ cDNA konstruksjon (SEQ ID NO: 7) blir bekreftet ved fullstendig DNA sekvensering og deretter subklonet inn i det unike EcoRI setet til pLXSN retroviral vektor (A.D. Miller and G.J. Rosman, supra) som resulterer i pL(scFv(FRP5):hengsel:QSN konstruksjon. Ekspresjon av DNA blir kontrollert av 5' MoMLV-LTR. Plasmidet bærer også en selekterbar markør for neomycin resistens drevet av SV40 early promoter (SN).

Klonin<g> av pL( scFv:D3/ D4:OSN

Den første molekylære konstruksjonen innbefatter den relativt korte og fleksible immunoglobulin hengsels-lignende regionen til murint Lyt-2 eller CD8a molekylet som teter, den andre konstruksjonen omfatter de to membran-proksimale immunoglobulin-lignende domenene betegnet D3 og D4 av murint L-3T4 eller CD4 molekyl (S.J. Clark et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 1649-1653 (1987)) som en lengre og mere rigid spacer. D3/D4 kodende cDNA blir oppnådd ved PCR ved anvendelse av pcd-L3T4 4.25 plasmid DNA (D. R. Littman and S. N. Gettner, Nature 325,453-455 (1987)). Det spesifikke primerparret #8761/#8762 amplifiserer de kodende sekvensene for aminosyreresidiene 184-370 til CD4 molekylet (P.J. Maddon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84,9155-9159 (1987)) og introduserer Xbal restriksjonsseter i begge endene av cDNA. Produktet blir subklonet inn i Xbal setet til pL(FZ)SN vektoren. Etter undersøkelse for korrekt orientering av innskuddet blir sekvens identiteten til den resulterende konstruksjonen bekreftet ved DNA sekvensering. Strukturen til pL(F4Z)SN er vist i figur 1.

Primerene for amplifikasjon av L3T4/CD4D3/D4 cDNA:

' oppstrøm' - 5' Lyt-2/CD8-spesifikt oligonukleotid #8761 , nedstrøm' -3'Lyt-2/CD8-spesifikt oligonukleotid #8762<!>).

0 Xbal restriksjonssetene er streket under

Eksempel 2: Ekspresjon av scFv( FRP5) :hengsel: ^ DNA etter retroviral genoverføring pLXSN vektorsystemet har evne til å lede effektiv syntese av scFv(FRP5):hengsel: £DNA etter transduksjon inn i cytotoksiske T celler og muliggjør for G418 seleksjon av infekterte celler. En etablering av murin CTL linje, Cl96, ble infisert med pL(ScFv(FRP5):hengsel:QSN kontruksjon ifølge eksempel 1.

Ekotropisk pakkende cellelinje QE blir transfektert ved kalsium-fosfat presipitering med pL(scFv(FRP5):hengsel:QSN plasmid DNA. Transfekterte celler blir stabilt selektert i nærvær av enomycin analogen G418 (Geniticin, 1 mg/ml, Gibco). Virale supematanter blir høstet etter 48 timer fra blandinger av G418 resistente hjelperceller og anvendt for å infisere amfotropiske pakkende cellelinje PA317 i nærvær av 8 mg/ml polybren. Klonale, høy titer produserende linjer blir oppnådd ved seleksjon i 1,0 mg/ml G418 inneholdende medium. Supematanter fra disse produsentlinjene blir anvendt for å infisere Cl96 cellene. Kloner av infiserte celler selektert for høy ekspresjon av scFv(FRP5):hengsel:<£ DNA er avledet og analysert for produksjon av chimeriske celleoverflate proteiner (eksempel 3). Klon CFYZ.l blir oppnådd ved dyrking i 1,0 mg/ml G418. Jurkat cellene blir infisert ved anvendelse av samme prosedyre og klonen JFYZ.4 er avledet ved vekst i 2,0 mg/ml G418.

Eksempel 3: Biokjemiske karaktertrekk til celleoverflateproteiner

a) SDS-PAGE analyse av chimerisk scFv(FRP5):hengsel:ij3roteiner produsert av transdusert CTL.

Selekterte kloner ifølge eksempel 2 blir celleoverflate biotinylert, lysert og immunpresipitert med et anti-<£ mAb. For overflate biotinylering blir 3 x 10<? >levedyktige celler vasket tre ganger med biwa buffer (PBS, 1 mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2) og resuspendert i 1,5 ml sulfo-NHS biotin i biwa buffer (Pierce, 0,5 mg/ml). Etter inkubering i 15 minutter ved 4°C blir reaksjonen stoppet ved tilsetning av 25 mM L-lysin i biwa buffer. Cellene blir vasket tre ganger i stopp buffer (25 mM L-lysin i biwa buffer) og lysert i 1% NP-40,150 mM NaCl, 50 mM tris/HCl pH 8,0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF inneholdende buffer supplementert med en proteaseinhibitor cocktail. Postnukleære lysater blir på forhånd gjort klare over natt med protein A Sepharose (Pharmacia). Immunpresipitering blir utført ved tilsetning av 3 mg ^-spesifikk mAb H146-968 som gjenkjenner humane og muse COOH terminusen til (-kjeden, inkubering i 3 timer etterfulgt av 1 times inkubasjon med protein A Sepharose. Presipitatet blir vasket 4 ganger i NET-TON (650 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, 0,5% Triton X-100,1 mg/ml ovalbumin). For deglykosylering blir presipitatene denaturert i 5% SDS med eller uten 10% 2-merkaptoetanol ved 100°C og inkubert med 2.000 U PNGase F (Biolabs) i 1 time ved 37°C. Prøver blir kokt i enten ikke-reduserende eller reduserende Laemmli-prøver buffer og elektroforert gjennom 5-20% SDS-PAGE gradient geler. Proteinene blir overført til en PVDF membran (Millipore) og blokker i PBS-T (PBS, 0,4% Tween-20) inneholdende 5% skummet melkepulver (Fluka). Membranen blir inkubert i 1 time med PBS-T inneholdende horseraddish peroksidase-streptavidin (HRP-Strep, Southern Biotechnology, 1:5.000). Etter vasking av membranen 4 ganger i 7 min. i PBS-T blir blottet utviklet ved anvendelse av ECL-kjemoluminiscens reagens (Amersham). SDS-PAGE analyser av immunpresipitatene under reduserende betingelser viser en serie med bånd med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 48-65 kDa fra lysater av infiserte celler (klon CFYZ.l), men ikke i lysater av parentale celler (C196 celler). 48 kDa båndet tilsvarer scFv(FRPS): hengsel:^ protein med en beregnet molekylvekt på 48.7 kDa. Aminosyresekvensen til nevnte protein er angitt i SEQ JD NO: 5.1 nevnte sekvensliste rager gjenkjenningsdelen avledet fra mAb FRP5 fra aminosyren i posisjon 6 (Gin) til aminosyren i posisjon 240 (Ile), i det hengselsregionen avledet fra CD8a rager fra aminosyren i posisjon 245 (Ile) til aminosyren i posisjon 304 (Phe) og £ kjeden rager fra aminosyren i posisjon 307 (Asp) til aminosyren i posisjon 443 (Arg). Artene med høyere molekylvekt oppstår som en konsekvens av den komplekse glykosyleringen av scFv og hengselsregionen. Deglykosylering med endoglykosidase PNGase F resulterer i et forenklet proteinmønster og reduksjon av tilsynelatende molekylvekt til omtrent 47 kDa. Endogen ^-kjede blir detektert som et 16 kDa bånd (16.3 kDa beregnet) i uinfiserte og infiserte celler. Når SDS-PAGE analyser blir utført under ikke-reduserende betingelser blir både disulfid-koblede scFv:hengsel:£ homodimerer med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 96 kDa samt heterodimerer av scFv(FRP5):hengsel:£ molekyler med endogen C, med tilsynelatende molekylvekt på omtrent 64 kDa observert. PNGase F behandling reduserer til en viss grad molekylvekten til disse to båndene. Detektert 32 kDa båndet tilsvarer endogene C,-C, homodimerer til CTL. b) Flow cytometri analyse av scFv(FRP5):hengsel:i; protein produserende T celler Celleoverflate ekspresjon og erbB-2 reseptor bindende evne til scFv(FRP5):hengel:t; protein i transdusert Cl96 CTL og i transduserte Jurkat celler blir bekreftet ved flow cytometri.

Enkelt-celle suspensjoner av 5 x 10^ levedyktige celler (Jurkat celler, JFYX.4 celler, Cl96 celler, CFYZ.l celler) blir farvet med renset ekstracellulær domene av erbB-2 protein (erbB-2<ecd>, uttrykt i Sf9 insektsceller ved anvendelse av en bakulovirus ekspresjonsvektor: Disis et al., Cancer Res. 54,16-20 (1994)) i 1 time etterfulgt av FTTC-konjugert anti-erbB-2 monoklonalt antistoff FSP77 (europeisk patentsøknad EP-A-502 812) i 45 min. ved 4°C i 100 ul PBS inneholdende 1% BSA og 0,1% natriumazid. FSP77 er også spesifikk for den ekstracellulære domene til erbB-2 reseptoren, men gjenkjenner en annen epitope fra mAb FRP5 (LM. Harwrth et al., J. Biol. Chem. 21, 15160-15167 (1992)). 10.000 forover spredte/side spredte levedyktige celler bli ervervet og analysert med et flow cytometer som viser binding av renset, oppløselig ekstracellulær domene til erbB-2 reseptoren til transduserte T celler JFYZ.4 og CFYZ. 1, men ikke overfor ikke-infiserte Jurkat eller Cl96 celler.

Hengselsregionen tilveiebringer fleksibilitet og adgang til scFv delen og er en nødvendighet for binding av den ekstracellulære domenen til erbB-2 reseptoren til scFv domenen. Innskudd av CD4 D3D4 muliggjør også binding. En konstruksjon hvor en direkte fusjon, uten en hengselsregion eller spacer, av scFv domenen overfor ^-kjeden, blir testet og resulterer i en overflate reseptor som ikke kan bli bundet til erbB-2 proteinet.

Eksempel 4: Sienaltransduksion av scFv( FRP5) :hengsel:Cfusjonsproteinet Intracellulær kalsium (Ca2<+>) konsentrasjon til T celler belastet med et egnet kalsium-chelaterende fluorescens farvestoff blir målt etter inkubasjon med oppløselig erbB-2 reseptor. For dette formålet ble dyrkede JFYZ.4 infektanter og Jurkat celler suspendert med 1 x 10<7>/ml i RPMI1640 supplementert med 2% FCS og 5 mM Indo-l/AM (Calbiochem) (M. Lopez et al., Cytometry 10,165-173 (1989)) og rotert i 45 minutter ved 37°C. Etter to gangers vask ble 3 x 10^ celler inkubert på is med 2 mg renset erbB-2ecd Aktiveringen blir utført ved 37°C ved samtidig administrering av 5 mg anti-erbB-2 mAb FSP77 etterfulgt av kryssbinding med et geite anti-muse lg antiserum (GocM lg, Southern Biotechnology). Som en kontroll ble cellene utløst ved tilsetning av anti-humant CD3e mAb (Serva) og GaM lg. Kalsium fluks blir registrert i 15 min. på et flowcytometer ved måling av emisjonen ved 405 og 525 nm.

Kryssbindingen resulterer i en hurtig økning av intracellulært kalsium u JFCZ.4 celler, men ikke i parenterale Jurkat celler som kan sammenlignes med de som blir oppådd ved kryssbinding av CD3 komplekset med et anti-CD3e mAb i ikke-infiserte celler. Dette indikerer at intracellulær signalisering blir utløst ved kryssbinding av scFv(FRP5):hengsel:£ proteinet via en ekstracellulær ligand domene og at scFv(FRP5):hengsel:£ proteinet er funksjonelt aktivt.

Eksempel 5: In vitro cytotoksisitets analyse

Den cytolytiske aktiviteten til infiserte Cl96 (CFYZ.l) celler er bestemt in vitro. Onkogeniske transformerte mus NJU/3T3 fibroblaster og HC11 epitelceller som uttrykker human erbB-2 reseptor (N.E. Hynes et al., supra)) blir anvendt som målceller. Frigjøring av LDH fra disse cellene blir anvendt som et mål på cellelyseringen (T. Decker and M. L. Lohmann-Matthes, J. Immunol. Methods 115,61-69 (1988)). Cytotoksisitetsanalysen blir utført i fenolrød fritt medium tilført med 4% kondisjonert supernatant inneholdende rekombinant murin 11-2 (rmII-2, se ovenfor). Et konstant antall målceller (7.500/brønn) blir tilsatt til en serie 2-ganger fortynning av effektorer (CFYZ.l celler) etterfulgt av 8 timers inkubasjon ved 37°C og 5% CO2. Alle fortynningene blir utført i triplikater. LDH innholdet til en 50 ul alikvot av supema-tanten blir analysert ved anvendelse av CytoTox 96 analyse (Promega) (T. Decker and M. L. Lohmann-Matthes, supra). LDH aktiviteten målt etter lysering av målcellene med 0,4% Triton X-100 blir betraktet som 100%. Målte eksperimentelle verdier blir korrigert for spontan frigjøring av LDH fra effektor og målcellene. Infiserte Cl96 celler som uttrykker scFv(FRP5):hengsel:£ konstruksjon effektivt lyserer erbB-2 uttrykkende NIH/3T3 celler eller HC11 celler ved effektor for å målsøke forhold mellom 1 og 10. Lysering av epitelial og fibroblast målceller transfektert med human erbB-2 reseptor oppstår på en ikke-NHC-hemmet måte som ikke kan skjelnes fra normal antigen-spesifikk cellulær cytotoksisitet. Ingen cellelysering blir observert når parenterale Cl96 celler blir anvendt som effektorer. Mab FRP5 og avledet scFv domenen er spesifikke for det humane erbB-2 molekylet og gjenkjenner ikke muse homologen som blir uttrykt ved lave nivåer på begge cellelinjene. På grunn av dette blir ingen cellelysering observert når utransfekterte NIH/3T3 celler eller HC11 celler blir inkubert med scFv(FRP5):hengsel:£; konstruksjonen som uttrykker T cellene.

Eksempel 6: In vivo anti-tumor aktivitet

To eksperimentelle skjemaer blir anvendt for å vurdere anti-tumor aktiviteten til transdusert CTL (infiserte C196 celler) in vivo. I det første skjemaet blir 5 x 10^ NIH3T3#3.7 tumorceller blandet med 5 x IO<6> CFYZ. 1 celler eller parentale C196 celler (effektor til målforhold 1:10) i 0,1 ml kulturmedium og øyeblikkelig injisert subkutan

(s.c.) inn i den høyre flanken til Balb/c nakne mus (H.J. Winn, J. Immunol. 86,228-234

(1961)). Veksten til tumorene blir fulgt ved kapillær målinger. NTH3T3#3.7 tumor celler alene blir injisert som en kontroll. Hver gruppe består av 5 dyr. I det andre skjemaet blir Balb/c nakne mus inokulert s.c. inn i den høyre flanken med 4 x 10^ NIH3T3#3.7 tumorceller. På dag 4 og 5, når tumorene er palperbare, blir parentale Cl96 celler og CFYZ.l celler injisert intravenøst inn i halevenen (1 x IO<7> celler i 0,2 ml kulturmedium). 500 U rhIl-2 (Hoffmann-La Roche) i 0,2 ml PBS blir administrert intraperi-tonealt på dagene 4, 5 og 6. Veksten av tumorene blir fulgt ved kapillær målinger. NIG3T3#3.7 celler uten IL-2 og med IL-2 blir injisert som kontroller. Hver gruppe består av 5 dyr. NIH/3T3 cellene transformert med human erbB-2 onkogen fører til hurtig dannelse av tumorer etter subkutan injeksjon inn i atymiske Balb/c nakne mus. Samtidig administrering av CFYZ.l infektanter og tumorceller undertrykker fullstendig tumordannelsen i opptil 7 dager. Administrering av uinfiserte parentale Cl96 celler hadde derimot ingen virkning på tumorcelle veksten. Et lignende resultat blir oppnådd når nakne mus blir først inokulert med NIH/3T3-erbB-2 tumorceller og deretter behandlet med CFYZ. I celler i kombinasjon med eksogent IL-2. Administrering av transdusert CTL hemmer veksten av tumorcellene betydelig i løpet av 7 dager og viser følgelig en systemisk in vivo effekt. Cellene har evne til å huse tumoren, til å aktivere og utvise deres cytolytiske aktivitet når administrert på et annet sted.

Disse resultatene viser at spesifisiteten og følgelig det cytolytiske effektor maskineriet til transdusert CTL kan effektivt bli omdirrigert mot et forutbestemt overflate antigen, erbB-2 reseptoren, som spiller en viktig rolle i etiologien til mange humane adeno carcinomer inkludert bryst, ovarie, mave og tarmcancer. Prinsippet med målsøkt T celle virkning utgjør følgelig en nyttig terapi metode og er generelt anvendbart for elimi-nering av tumorceller som uttrykker et overflate antigen ved høyere nivåer enn normale celler. Konstruksjonen muliggjør dannelse av CTL med mange ønskede spesifisiteter ved å utveksel scFv delen og erstatte den med et hvilket som helst eksisterende antigen gjenkjennende funksjon avledet fra et spesifikt monoklonalt antistoff. Anvendelse av effektive overføringssystemer, for eksempel retroviral vektorer, muliggjør overføring av scFv:hengsel:£ DNA inn i celletyper som ikke er så lett transfekterbare.

Deponeringsdata:

Hybridome cellelinjer som produserer antistoffer FRP5, FSP16, FSP77 og FWP51 er blitt deponert til European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC, PHLS Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, UK), november 21, 1990 under aksesjonsnr. 90112115, 90112116, 90112117 og 90112118.

Kort beskrivelse av figuren:

Figur 1: strukturen til pL(F4Z)SN retroviral vektor. En cDNA kodende aminosyre med residie nr. 184 - 370 til CD4 immunoglobulinet blir som D3 og D4 domenene avledet ved PCR og subklonet i Xbal setet til PL(FX)SN vektoren. Aminosyresekvensene til fusjonsgrensene er vist med en bokstav kode.

Claims (14)

1. Bifunksjonelt protein, karakterisert ved at det omfatter:

1) en antigen bindende domene avledet fra et monoklonalt antistoff rettet mot et egnet antigen på en tumorcelle,

2) en hengsels region som omfatter fra omtrent 40 til omtrent 200 aminosyrer og

3) en funksjonell zeta ( Q kjede avledet fra T-celle antigenreseptoren (TCR).

2. DNA kodende for et bifunksjonelt protein, karakterisert v e d at det omfatter:

1) en antigenbindende domene avledet fra et monoklonalt antistoff rettet mot et egnet antigen på en tumorcelle,

2) en hengselsregion som omfatter fra omtrent 40 til omtrent 200 aminosyrer og

3) en funksjonell zeta (Q kjede avledet fra T-celle antigenreseptoren (TCR).

3. DNA ifølge krav 2, karakterisert ved at det koder for et protein hvori den antigen bindende domenen er et enkelt kjede antistoff, spesielt enkelt kjede antistoff betegnet FRP5 (scFv(FRP5)).

4. DNA ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at det koder for et protein hvor hengselsregionen er en immunoglobulin-lignende hengselsregion.

5. DNA ifølge kravene 2-4, karakterisert ved at det koder for et protein hvor den funksjonelle kjeden omfatter transmembran og cytoplasmisk domene.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den uttrykker DNA ifølge et hvilket som helst av kravene 2-5.

7. Vertscelle ifølge krav 6, karakterisert ved at den er en cytotoksisk lymfocytt (CTL).

8. Fremgangsmåte for lysering av selekterte tumorceller, karakterisert ved å kontakte nevnte tumorceller med CTL som produserer protein ifølge krav 1.

9. Fremgangsmåte for å utruste en CTL med en definert, MHC-uavhengig og MHC-uhemmet tumorcelle spesifisitet, karakterisert ved å innføre inn i nevnte CTL et DNA ifølge kravene 2 til 4.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge krav 1, karakterisert ved å dyrke en vertscelle ifølge krav 6 under betingelser som muliggjør ekspresjon av et DNA kodende for nevnte protein.

11. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en vertscelle ifølge krav 6 eller 7.

12. Anvendelse av vertscellen ifølge krav 7 til fremstilling av et legemiddel for behandling av cancer.

13. Polyklonalt eller monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er spesifikt for et protein ifølge krav 1.

14. Vektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA ifølge kravene 2 til 5.