NO316916B1 - Anvendelse av en bispesifikk antistoffkonstruksjon som er rettet mot CCR5 og CD3 for fremstilling av en farmasoytisk sammensetning for behandling av kronisk artritt, autoimmunesykdommer, allergiske reaksjoner eller for reduksjon av kjemokinreseptoruttrykk - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av antistoff- og kjemokinkonstruksjoner mot kjemokinreseptoruttrykkende celler, spesielt mot monocytter/makrofager, som uttrykker kjemokinreseptoren CCR5 og CCR5+ T-celler. Videre vedrører oppfinnelsen anvendelsen av antistoff- og kjemokinkonstruksjoner for fremstilling av et legemiddel for destruksjon av kjemokinreseptoruttrykkende celler for behandling av autoimmune sykdommer og allergiske sykdommer, spesielt for behandling av kroniske inflammatoriske sykdommer i ledd. Antistoff- og kjemokinkonstruksjoner fra oppfinnelsen mulig-gjør den direkte nedgangen av kjemokinreseptoruttrykkende celler og derved en rettet immunosuppresiv terapi av autoimmune leddsykdommer.

I Tyskland lider omtrent 1% av populasjonen av reumatoid artritt. I tillegg er det et antall av andre reumatoide sykdommer som også fører til artritt. For tiden blir tre grupper medikamenter - ikke-steroidale antireumatika, kortisonprepareringer og andrelinje-midler- og TNFa-blokkerende midler brukt i behandlingen av infiammatoriske leddsykdommer. Hittil har terapien fokusert på lokalinjeksjon av kortisonprepareringer i kom-binasjon med en systemisk administrering av anti flogi stika eller andrelinje-midler.

Ikke-steroidale antireumatika har en mild analgetisk og anti-inflammatorisk effekt, men de har mange bivirkninger når de brukes ofte (f.eks. magesår, nefroser). I høye doser har kortisonprepareringer en sterk dekongestant og analgetisk effekt, som imidlertid fører til en rask tilbakegang etter avslutning av terapien. Dessuten kan ikke kortisonprepareringer stoppe destruksjonsprosessen av leddsykdommen. En langtidsterapi med kortison gir vanligvis alvorlige bivirkninger (infeksjoner, Cushing's fenomen, osteoporose, perga-mentlignende hud, metabolske og hormonelle forstyrrelser). Den lokale injeksjonen av kortison har også den essensielle ulempen at aktiviteten av tilstrammende hvite blodcel-ler bare blir redusert men ikke ødelegges, hvilket fører til en rask tilbakegang når terapien avsluttes. Som nevnt ovenfor skjer det samme ved systemisk applikasjon. Sjelden er en inflammasjon som skyldes den irriterende effekt av kortisonkrystaller forverret etter injeksjon av kortison. Varigheten av effekten av en kortisoninjeksjon varierer enormt, og varierer fra primær ineffektivitet til en varighet av effekten på flere uker.

I reumatologi blir andrelinje-midlene brukt for å oppnå en langtidssuppresjon av inflammasjonen og en reduksjon i kortisonprepareringer. På grunn av den betraktelige toksisiteten (allergier, infeksjoner, maligne sykdommer, nyreinsuffisiens, blodtrykkskri-ser, lungesykdommer) er det nødvendig for medisinske spesialister å være nær pasien-tene. Etter start av behandling kan det være slik at ingen terapeutisk effekt er synlig i de første tre måneder. For tiden er det 4 eller 5 slike andrelinje-midler til disposisjon som blir brukt individuelt først, eller blir kombinert hvis terapien ikke er effektiv. For det meste er det nesten ingen ting kjent om virkningsmåten av andrelinje-midler. Det er ennå ikke fullstendig klart hvorvidt applikasjonen av andrelinje-midler kan forminske destruksjonen av leddet. I de senere år har en ny gruppe substanser blitt introdusert i behandlingen av reumatoid artritt som er basert på blokkeringen av cellesignalsubstan-ser (TNFa) ved hjelp av monoklonale antistoffer eller oppløselige reseptorkonstruksjo-ner.

I tillegg er det pasienter som ikke responderer på de terapier som for tiden er tilgjenge-lige. I andre tilfeller har konvensjonell terapi blitt stoppet på grunn av intolererbare bivirkninger.

Derfor er det et behov for et nytt terapeutisk konsept for behandling av kroniske inflammatoriske leddsykdommer, eller reumatiske sykdommer generelt, og andre autoimmune sykdommer.

Derfor er det tekniske problemet som ligger til grunn for foreliggende oppfinnelse, å tilveiebringe nye terapeutiske midler for behandling av inflammatoriske leddsykdommer og andre autoimmune sykdommer så vel som allergiske sykdommer, som overvin-ner ulempene innen den kjente teknikken.

Trekkene definert i de selvstendige kravene, tjener til å løse dette problemet.

Fordelaktige utførelsesformer har blitt definert i de respektive uselvstendige krav.

Dette tekniske problemet har blitt løst ved å tilveiebringe antistoff- eller kjemokinkonstruksjoner som er i stand til å binde til en kjemokinreseptor på overflaten av en målcelle, hvori bindingen av konstruksjonen til kjemokinreseptor en resulterer i destruksjonen av målcellene. Antistoff- og kjemokinkonstruksjonene anvendt i oppfinnelsen forårsaker at målceller som uttrykker kjemokinreseptorer, spesielt leukocytter, blir selek-tivt ødelagt. Konstruksjonene inkluderer bispesifikke antistoffer, antistoffkonstruksjoner, kjemokinkonstruksjoner, murine, kimære eller humaniserte antistoffer, og binder både til en kjemokinreseptoruttrykkende målcelle og til et antigen på overflaten av effektorceller, spesielt et CD3-antigen, eller inneholder et toksin. Effektorcellene er foretrukket å være leukocytter, spesielt monocytter/makrofager eller T-celler eller dendritiske celler.

I et studie med mer enn 40 pasienter som lider av forskjellige leddsykdommer, ble det funnet at det er en svært sterk konsentrasjon av monocytter/makrofager som uttrykker kjemokinreseptoren CCR5 og T-lymfocytter i det betente ledd. I leddet uttrykker mer enn 90% av monocyttene og T-lymfocyttene kjemokinreseptoren CCR5, mens i blodet gjør bare 10% eller 20% dette. På grunn av dette ekspresjonsmønsteret er kjemokinreseptoren CCR5, eller kjemokinreseptorer generelt, et svært egnet mål for celleutar-mingsterapi. Derfor ville nesten alle monocytter og T-lymfocyttene i et ledd påvirkes av en CCR5-utarming, mens i blodstrømmen ville bare et lite antall av disse celler bli ut-armet. Når det gjelder kronisk artritt, er monocytter og T-lymfocytter de dominerende celletypene hvor monocyttene hovedsakelig er ansvarlig for ledd-destruksjonen.

Overraskende vil det nå kunne sees at leukocytter som uttrykker kjemokinreseptorer, spesielt CCR5, kan ødelegges ved målrettede metoder av nylig utviklet antistoff- og kj emokinkonstruksjoner.

Mens nåværende behandlingsstrategier i det vesentlige representerer en symptomatisk terapi og kan influere forløpet på en leddsykdom og ledd-destruksjon kun i en begrenset grad og andrelinje-midler, for eksempel blir effektive bare etter flere måneder og, i tillegg, som de andre medikamentene som blir brukt, har en betraktelig toksisitet når det anvendes over lengere tidsperioder, trigger konstruksjonene fra oppfinnelsen en nesten fullstendig utarming av monocytter/makrofager som uttrykker kjemokine reseptorer, spesielt CCR5+, og lymfocytter i leddet innen kun få timer. Disse celletypene er ansvarlige for kronisk inflammasjon og ledd-destruksjon. På grunn av utarming kan en lang-tidseffekt oppnås. Siden monocyttene blir eliminert svært effektivt, gjør anvendelsen av antistoffet fra foreliggende oppfinnelse det mulig for ledd-destruksjonen å bli påvirket på en positiv måte. Den ikke-selektive inhiberingen av immunsystemet ved å etablere andrelinje-midler og TNFcc-blokkerende midler, er forventet å øke disponering for infeksjoner og tumordannelse. I motsetning, på grunn av distribueringen av kjemokinreseptoruttrykkende celler, spesielt av CCR5-uttrykkende leukocytter, kan leukocyttene som er involvert i inflammasjonsprosessen bli eliminiert i høy grad uten å influere im-munforsvaret i noen særlig grad sett samlet. Alt i alt gjør antistoffet en terapi mulig som har små bivirkninger, og som samtidig forbedrer forløpet av leddsykdommen og hindrer ledd-destruksjon.

I en foretrukket utførelsesform er konstruksjonen et bispesifikt antistoff med en spesifisitet rettet mot en kjemokinreseptor, fortrinnsvis mot en human kjemokinreseptor og mest foretrukket mot den humane kjemokinreseptoren CCR5, og med den andre spesifisiteten mot et antigen på overflaten av en effektorcelle, fortrinnsvis mot CD3 på overflaten av en T-celle. Oppfinnelsen omfatter også antistoffkonstruksjoner som har en iden-tisk eller lignende epitopspesifisitet.

I en spesielt foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det bispesifikke antistoffet et enkeltkjedet antistoff.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er antistoffkonstruksjonen et bispesifikt antistoff, én spesifisitet som er rettet mot en kjemokinreseptor, fortrinnsvis mot en human kjemokinreseptor og mest foretrukket mot den humane kjemokine reseptoren 5 (CCR5), og den andre spesifisiteten er rettet mot et toksin. I en foretrukket utførelsesform er, også i dette tilfellet, det bispesifikke antistoffet et enkeltkjedet antistoff.

I en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen anvendes en kjemokinkonstruksjon i form av et kjemokintoksin som er et resultat av fusjonen av et modifisert eller umodifisert kjemokin med et modifisert eller umodifisert toksin. Kjemokinene som binder til CCR5, slik som konstruksjonene med MIP 10, MIP la, MCP-2, MCP-3 og RANTES er spesielt foretrukket.

Når det gjelder kjemokinkonstruksjonen, kan kjemokinet bindes kovalent til et toksin. Imidlertid kan også bindingen mellom kjemokinet og toksinet finne sted på forskjellige måter. Via et multimeriseringsdomene kan kjemokinet også bindes til et antistoff som har, atskilt fra et kompatibelt multimeriseringsdomene, en spesifisitet mot et antigen på overflaten av en effektorcelle, fortrinnsvis mot CD3 på overflaten av en T-celle og/eller mot et toksin. Det er også mulig å binde kjemokinet via et multimeriseringsdomene til et toksin med et kompatibelt multimeriseringsdomene. I tillegg kan kjemokinet kovalent bindes til et antistoff som har en spesifisitet mot et antigen på overflaten av en effektorcelle, fortrinnsvis mot CD3 på overflaten av en T-celle og/eller mot et toksin. Dessuten kan kjemokinet via et multimeriseringsdomene, bindes til et toksin via et kompatibelt multimerisereingsdomene bundet til toksinet. Binding til multimeriseirngsdomenet kan utføres in vitro eller in vivo.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er antistoffkonstruksjonen et antistoff mot en kjemokinreseptor, fortrinnsvis mot CCR5, som er kovalent bundet til et toksin. I dette tilfellet er disse såkalte immunotoksiner.

Egnede toksiner inkluderer spesielt forkortet Pseudomonas- toks\ n, forkortet difteritok-sin og lignende toksiner.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelsen av antistoffkonstruksjoner som omfatter et antistoff mot en kjemokinreseptor, fortrinnsvis mot CCR5, som via et multimeirserings-domene i homodimerer/heterodimerer, kan bindes in vitro og/eller in vivo til et andre antistoff rettet mot et antigen på en effektorcelle, fortrinnsvis mot CD3 og/eller mot et toksin.

I tillegg omfatter oppfinnelsen også anvendelse av antistoffkonstruksjoner hvori et antistoff mot en kjemokinreseptor, fortrinnsvis mot CCR5, kan bindes in vitro eller in vivo via et multimeriseringsdomene til et toksin med et kompatibelt multimeriseringsdomene.

Generelt er antistoffkonstruksjonene, kjemokinkonstruksjonene og murine, kimære eller humaniserte antistoffer, substanser som er i stand til å ødelegge kjemokinreseptoruttrykkende celler, spesielt leukocytter, med denne selektive destruksjon som blir brukt for behandling av inflammatoriske sykdommer (autoimmune sykdommer, allergiske sykdommer og lignende).

I forbindelse med oppfinnelsen inkluderer også betegnelsen antistoff eller antistoffkonstruksjoner antistoff-fragmenter som har spesifisiteten(e) for antistoffet eller antistoffkonstruksjonen, såkalte aktive fragmenter.

Bispesifikke antistoffer kan konstrueres ved å anvende fremgangsmåter beskrevet ne-denfor eller ved kjente metoder; kjemisk koplede antistoffer eller antistoff-rfagmenter, konstruksjonen ved hjelp av hybrid-hybridomateknikken, konstruksjonen som bispesifikk enkeltkjedede antistoffer, diastoffer og konstruksjonen ved hjelp av å kople to antistoffer via multimeriseringsdomener, er bare noen få eksempler på dette.

De bispesifikke antistoffene er foretrukket å være enkeltkjedede antistoffer. Forskjellige deler av disse antistoffene kan bindes ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter eller konstruert som tilgrensende protein ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker, f.eks. på en slik måte at et nukleinsyremolekyl som koder for en kimær eller humanisert anti-stoffkjede blir uttrykt for å konstruere et tilgrensende protein (jfr. for eksempel Mack et al., (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 92, s. 7021-7025).

I en spesielt foretrukket utførelsesform anvendes det et enkeltkjedet antistoff med de følgende Fv-fragmentene: sc-Fv-fragment til et monoklonalt antistoff mot kjemokinreseptoren, fortrinnsvis mot CCR5 og et cs-Fv-fragment fra et monoklonalt antistoff mot CD3.1 dette tilfellet kan både Fv-fragmentet rettet mot kjemokinreseptoren og Fv-fragmentet rettet mot CD3, være lokalisert i N-terminal posisjon. Fv-fragmentet mot CCR5 er foretrukket å være i N-terminal posisjon. Rekkefølgen av VL og VH-antistoffdomenene kan være variable i begge konstruksjonene; rekkefølgen av Fv-fragmentet mot CCR5 er fortrinnsvis VL-VH og det ene av Fv-fragmentet mot CD3 er VH-VL. Linkeme mellom de variable domenene såvel som mellom de to Fv-fragmentene består av peptidlinkere, fortrinnsvis av en hydrofil, fleksibel glysin- og serininneholdende linker av 0-25 aminosyrer. En ytterligere histidinkjede på 6 x His i C- eller N-terminal posisjon kan bli brukt for å forenkle rensningen og deteksjonen.

Sammenlignet med konvensjonelle bispesifikke antistoffer, har bispesifikke enkeltkjedede antistoffer den fordel at de består av kun én proteinkjede, og derfor er deres sammensetning nøyaktig definert. De har en lavmolekylvekt på normalt <60 kD, og kan lett bli produsert i stor skale i egnede cellelinjer, f.eks. i CHO-celler, ved å bruke rekombinante teknikker. Den mest essensielle fordelen er imidlertid at de ikke har noen konstan-te antistoffdomener, og derved kun aktiverer T-lymfocytter til å lysere når disse er bundet til deres målceller, dvs. til de kjemikinreseptoruttrykkende cellene. Derfor er ofte enkeltkjedeantistoffer overlegne konvensjonelle bispesifikke antistoffer, siden deres kliniske anvendelse medfører færre eller mindre alvorlige bivirkninger.

En celle av eukaryotisk eller prokaryotisk opprinnelse kan produsere en antistoffkonstruksjon som beskrevet, spesielt et bispesifikt antistoff fra oppfinnelsen eller en in vrtrø-teknikk for proteinproduksjonen.

Kjemokintoksinene som resulterer fra binding av et kjemokin til et toksin, kan bli konstruert ved kjemisk kopling ved å produsere et fusjonsprotein fra et kjemokin og et modifisert eller umodifisert prokaryotisk eller eukaryotisk toksin og ved å binde et kjemokin og et toksin via ytterligere multimeriseringsdomener.

I en spesielt foretrukket utførelsesform anvendes det et rekombinant produsert fusjonsprotein fra et kjemokin som binder til den humane kjemokine reseptoren CCR5 (MIP lp, MIP la, RANTES, MCP-2, MCP-3) og en forkortet versjon av Pseudomonas ekso-toksin A (f.eks. PE38, PE40). I dette tilfellet er kjemokinet bundet til Pseudomonas-toksinet ved hjelp av en kort peptidlinker. Linkeren består fortrinnsvis av en fleksibel og hydrofil aminosyresekvens, spesielt av glyciner og senner, og har en lengde på 0 til 20 aminosyrer.

I tillegg blir det tekniske problemet fra oppfinnelsen løst ved å tilveiebringe en farma-søytisk sammensetning som omfatter minst én antistoff- eller kjemokinkonstruksjon fra oppfinnelsen, som omfatter spesielt minst ett bispesifikt antistoff i et kvantum som er tilstrekkelig til å ødelegge kjemokinreseptoruttrykkende celler, og eventuelt en farma-søytisk akseptabel bærer.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter det bispesifikke antistoffet er egnet for parenteral administrering, dvs. subkutant, intramuskulært, intravenøst, intra-artikulært, intraperitonealt, hvori sammensetningene for parenteral administrering vanligvis inkluderer en oppløsning av antistoffet eller en cocktail derav, oppløst i en akseptabel bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. Egnede vandige bærere er for eksempel vann, NaCl-oppløsning og glysin. I tillegg kan sammensetningene inneholde konvensjonelle farma-søytisk akseptable adj uvanter, som for eksempel er brukt for å justere pH-verdien, slik som en buffersubstans eller lignende.

Konsentrasjonen av det bispesifikke antistoffet i sammensetningen kan variere betraktelig, dvs. fra mindre enn omtrent 1+"<7> % vekt/volum til 1% vekt/volum. Konsentrasjonen er foretrukket å være mellom IO"<4> % vekt/volum og 10"<1> % vekt-/volum. Når det gjelder intra-artikulær applikasjon, bør dosen av det bispesifikke antistoffet være 1 mg til

0,0001 mg, og spesielt omtrent 0,02 mg, av det bispesifikke enkeltkjedede antistoffet.

Derfor vil, for en intra-artikulær applikasjon i et kneledd, en egnet sammensetning for eksempel omfatte omtrent 20 ug av det bispesifikke antistoffet eller kjemokintoksinet fra oppfinnelsen, oppløst i omtrent 2-5 ml sterilt NaCl-oppløsning, f.eks. bufret med fosfat eller Tris. En intravenøs injeksjon ville også være en egnet form for applikasjon.

Et ytterligere formål for oppfinnelsen er å tilveiebringe nye muligheter for applikasjon av antistoffet som beskrevet.

Dette formål oppnås ved å bruke minst ett av antistoffene eller én av kjemokintoksinene fra oppfinnelsen, for å utarme kjemokinreseptoruttrykkende celler. I en foretrukket utførelsesform blir antistoffet eller kjemokintoksinet fra oppfinnelsen, brukt for prepareringen av en farmasøytisk sammensetning for å behandle kronisk artritt og andre autoimmune sykdommer eller allergiske sykdommer.

Den selektive kjemokinreseptorutarmingen, spesielt CCR5-utarmingen, har to vesentlige fordeler sammenlignet med tidligere immunosuppressive terapier (f.eks. kortison, metotreksat, cytokinblokkering): For det første retter ikke tidligere terapier seg mot utarming av de infiltrerende leukocyttene, men fører bare til en suppresjon av aktiviteten. Dette fører til en rask tilbakevending etter terminering av terapien, og krever permanent immunosuppresjon. I kontrast til dette er det, når det gjelder utarming av de ansvarlige leukocyttene i leddet, håp om at en langtidsvarende tilbakegang allerede kan være oppnådd allerede etter én eller få behandlinger. Den andre fordelen av en kjemo-kinreseptorutarming blir, på grunn av distribueringen av celler som uttrykker kjemokinreseptorer, spesielt CCR5, bare celler som er involvert i inflammasjonsprosessen utar-met. De andre cellene forblir imidlertid intakte i stor grad.

Metoden for virkning av det bispesifikke antistoffet, er én spesifisitet rettet mot en kjemokinreseptor, og den andre spesifisiteten mot et antigen på overflaten av T-celler som presterer celler, er illustrert i figur 1 (øverst) og figur 2, ved hjelp av en foretrukket utfø-relsesform av oppfinnelsen. Som vist i figur 1 (øverst) binder et bispesifikt antistoff med dets to armer til to forskjellige antigener. I en foretrukket utførelsesform, er disse kjemokinreseptoren CCR5 og overflatemolekylet CD3 på T-lymfocytter. Som vist i figur 2, fører det bispesifikke antistoffet til en kryssbinding av T-lymfocytter og CCR5-uttrykkende celler. På grunn av kryssbindingen, blir T-lymfocyttene aktivert for å lysere, og CCR5+cellene bundet dertil blir ødelagt. Som en konsekvens finner en lysis av CCR5+celler kun sted ved tilstedeværelsen av T-lymfocytter. Disse er til stede i store mengder med alle former av kronisk artritt. På denne måten er det spesielt mulig å mål-bevisst eliminere cellene som er ansvarlige for inflammasjonen ved å injisere det bispesifikke antistoffet inn i det betente leddet.

Ytterligere utførelsesformer av oppfinnelsen og deres virkemåte er illustrert i de vedlag-te figurer 1 til 9.

På grunn av muligheten for å med hensikt utarme kjemokinreseptoruttrykkende celler, er konseptet ikke bare egnet for kronisk artritt, men også for reumatiske sykdommer og andre autoimmune sykdommer som ble funnet å ha en lignende sterk konsentrasjon av celler som uttrykker kjemokinreseptorer, spesielt CCR5.

Mens det allerede har vært rapportert om forskjellige muligheter for å bruke bispesifikke antistoffer i behandlingen av tumorer (f.eks. Kroesen, BJ. et al. (1993) Cancer Immunol. Immunother. 37:400-7; Nitta. T. et al. (1990) Lancet 335:368-71; Bolhuis, R. L. et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl., 7:78-81; Canevari, S. et al. (1995) J. Nati. Cancer Inst. 87:1463-9; De gast, G. et al. (1995) J. Hematother. 4:433-437; Kroesen, B.J. et al. (1994) Br. J. Cancer, 70:652-61; Tibben, J.G. et al. (1993) J. Nati. Cancer Inst. 85:1003.4), har søknaden for bispesifikke antistoffer for immunosuppresjon hittil ikke blitt beskrevet.

Beskrivelse av figurene:

Figur 1 viser antistoff- og kjemokinkonstruksjoner fra oppfinnelsen som forårsaker kryssbinding av målceller, i dette tilfellet CCR5-uttrykkende celler og effektorceller, i

dette tilfellet T-celler med CD3 på overflaten, øverst: Bispesifikt antistoff med spesifisiteter både mot CCR5 og CD3, i midten: Kjemokinkonstruksjon som består av et kjemokin og et antistoff mot CD3, under: Kjemokinkonstruksjon hvori et kjemokin med mul-timeriseirngsdomene kan bindes til et antistoff rettet mot CD3 via et kompatibelt multimeriseringsdomene.

Som vist skjematisk i figur 2, fører kryssbindingen til aktivering av T-lymfocytter til lysis og til destruksjonen av CCR5-positive celler kryssbundet dertil.

Figur 3 viser antistoff- og kjemokinkonstruksjoner fra oppfinnelsen som fører til en binding mellom målceller, i dette tilfellet CCR5-uttrykkende celler og et toksin, øverst: Bispesifikt antistoff som har spesifisiteter mot både CCR5 og et toksin, under: Kjemokinkonstruksjon som består av et kjemokin og et antistoff mot et toksin.

Kryssbindingen av en målcelle og et toksin som illustrert i figur 4, fører til celledød av den CCR5-positiv målcellen.

Figur 5 viser på samme måte som figur 3 antistoff- og kjemokinkonstruksjoner som fører til en binding mellom en målcelle og et toksin, hvori imidlertid toksinet ikke bindes via spesifisiteten til et antistoff rettet mot toksinet, men er enten kovalent bundet til et antistoff rettet mot kjemokinreseptoren, fortrinnsvis mot CCR5 (figur 5, øverst), eller til et kjemokin (figur 5, midten), eller kan, via et multimeriseringsdomene, bli bundet til et antistoff med et kompatibelt multimeriseringsdomene rettet mot en kjemokinreseptor (figur 5, nederst).

Som det har blitt vist i figur 6, fører kryssbindingen av en målcelle og et toksin også til celledød for målcellen. Figur 7 viser resultatet av en FACS-analyse (utført som beskrevet i Mack et al. (1998) J. Exp. Med. 187, s. 1215-1224), som forklarer utarmingen av CCR5-positive T-celler og monocytter fra den betente synovial-leddvæsken hos en pasient med kronisk polyartritt eller fra dyrkede perifere blodleukocytter (PBMC). Figur 8 viser cytotoksisiteten av kjemokintoksinet Ra-PE38, eller mer presist, destruksjonen av CCR5-uttrykkende CHO-celler ved kjemokintoksinet Ra-PE38 (10 ng/ml) etter en 24 timers inkubering (høyre, under). CHO-cellene som uttrykker kjemokinreseptoren CXCR4 i stedet for CCR5, blir ikke ødelagt av Ra-PE38 (øverst) siden RANTES ikke binder til CXCR4. Inkubering med medium dreper ikke CHO-celler. Ra-PE38 - et fusjonsprotein av RANTES og et forkortet Pseudomonas- éksotoksin med en molekylvekt på38kD'.

Figur 8 forklarer tilnærmingen som er beskrevet i figur 5, midten.

Figur 9 viser en 48 timers inkubering av synovialvæske med CD3-CCR5-bispesifikke antistoffer. Derfor skal figur 9 sees i sammenheng med figur 7, øverst. Det er en kon-sentrasjonsavhengig utarming av T-lymfocyttene og monocyttene. Med en antistoffkon-sentrasjon på 125 ng/ml, ble monocyttene og T-lymfocyttene redusert med 96% og 97,5%, respektivt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av en bispesifikk antistoffkonstruksjon som er i stand til å binde til en human kjemokinreseptor CCR5 som et første antigen og et CD3-antigen på overflaten av en effektorcelle som et andre antigen, og aktive fragmenter av nevnte bispesifikke antistoffkonstruksjoner for fremstillingen av en farma-søytisk sammensetning for behandling av kronisk artritt, autoimmune sykdommer eller allergiske sykdommer.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelsen av minst én bispesifikk antistoffkonstruksjon som definert i et hvilket som helst av kravene 1 til 8 for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for "depletion" av kjemokinreseptoruttrykkende celler.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Konsentrasjon av et bispesifikt antistoff

For konstruksjonen av bispesifikke antistoffer kan for eksempel den enkeltkjedede teknikken bli brukt (Mack et al. (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 92:7021-7025; Mack et al. (1997) J. Immunol. 158:3965-3970). I dette tilfellet, som vist kjematisk i figurene 1 (øverst) og 3 (øverst), blir de variable domenene av de lette (VL) og de tunge (VH) immunoglobulinkjedene av to forskjellige antistoffer smeltet sammen i en spesiell rek-kefølge, eventuelt en histidinkjede på 6 x His blir i tillegg tilfestet. Fusjonen er effektu-ert på basis av et DNA, slik at en proteinkjede med fire forskjellige variable domener blir dannet etter ekspresjon (jfr. figurene 1 (øverst) og 3 (øverst)). Den tilfestede histi-dinkjeden muliggjør en enkel og effektiv rensing via immobiliserte Ni-ioner i ett trinn. Figur 1 (øverst) viser en foretrukket utførelsesform av den bispesifikke antistoffbind-ingen til CD3-antigenet på overflaten av effektorcellen og det humane CCR5 på overflaten av leukocytter som målceller.

Ved hjelp av RT-PCR blir de variable antistoffdomenene fra hybridomacellene som danner det ønskede antistoffet, amplifisert. PCR-fragmentene som ble ervervet på denne måten blir klonet inn i en vektor og sekvensert. Deretter blir et enkeltkjedet antistoff med en spesifisitet dannet ved hjelp av fusjons-PCR ved å sette inn en linker av (Gly4Seri)3 mellom de to variable antistoffdomenene. I en ytterligere fusjons-PCR, blir antistoff-fragmentet mot CCR5 smeltet til det allerede publiserte antistoff-fragmentet mot CD3, med en linker bestående av Gly4Seri satt inn (jfr. Mack et al. supra). Den føl-gende rekkefølgen av domenene er valgt: VL(1)-VH(1)-VH(2)-VL(2), hvor (1) er spesifisiteten mot CCR5 og (2) spesifisiteten mot CD3.

Eksempel 2: Ekspresjon og rensing av det bispesifikke antistoffet fra eksempel 1

For å uttrykke det bispesifikke antistoffet blir den korresponderende DNA-sekvensen subklonet i en eukaryotisk ekspresjonsvektor (f.eks. PEF-DHFR, Mack et al. (1995) PNAS, supra) og transfektert i DHFR-manglende CHO-celler ved hjelp av elektropo-rering. Det bispesifikke antistoffet blir renset fra supernatanten fra stabile transfekterte CHO-celler ved hjelp av affinitetskromatografi ved Ni-NTA, med eluering ved å senke pH-verdien. Deretter blir pH justert, og proteinet blir justert til en egnet konsentrasjon.

Eksempel 3: In v/ fro- tester ved blodleukocvtter og leukocytter ved betente ledd

For in v/fro-testene blir ledd-effusjonsvæske som inkluderer cellene, inkubert med de bispesifikke antistoffene i én eller flere dager. Etter 24 timer har CCR5-positive lymfocytter og monocytter allerede nesten forsvunnet. Når mediumet blir kontrollert etter lengere inkubering, har monocyttene differensiert til makrofager som er synlige på bun-nen av dyrkingsflasken. Etter en egnet inkubering med det bispesifikke antistoffet, er ingen makrofager synlige.

Et korresponderende resultat kan oppnås når dyrkede PBMC blir inkubert med det bispesifikke antistoffet. I dette tilfellet er det en fullstendig utarming av CCR5-positive monocytter og en nesten fullstendig utarming av CCR5-positive T-lymfocytter. Utarmingen av CCR5-positive T-celler og monocytter er vist i figur 7.

Resultatene viste, i overensstemmelse med eksempel 1, at konstruksjonen fra oppfinnelsen er i stand til fullstendig å ødelegge CCRS-positive monocytter. Dette anvendes både til monocytter fra leddaspiratet og blodmonocyttene som uttrykker CCR5 når dette dif-ferensieres i makrofager. Utarming av monocytter/makrofager finner sted innenfor få antall timer (< 25 timer). Spesielt er utarmingen av monocytter/makrofager i leddet av stor fordel i terapi, siden det er disse cellene som hovedsakelig er ansvarlige for ledd-destruksjonen. Dessuten, når det gjelder aktiveringen av T-lymfocytter, kreves også en interaksjon med makrofager, slik at T-lymfocyttenes funksjon på samme tid blir under-trykket.

I tillegg til utarmingen av moncytter/makrofager, kunne en betraktelig reduksjon i antal-let CCR5-positive T-lymfocytter observeres.

Claims (9)

1. Anvendelse av en bispesifikk antistoffkonstruksjon som er i stand til å binde til en human kjemokinreseptor CCR5 som et første antigen og et CD3-antigen på overflaten av en effektorcelle som et andre antigen for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for behandling av kronisk artritt, autoimmune sykdommer eller allergiske sykdommer.

2. Anvendelsen ifølge krav 1, hvor nevnte bispesifikke antistoffkonstruksjon er enkelkjedeantistoff eller et diabody eller en konstruksjon som omfatter to antistoffer bundet via et multimeriseringsdomene i homodimerer/heterodimerer.

3. Anvendelsen ifølge krav 2, hvor nevnte bispesifikke enkelkjedeantistoff omfatter et scFv-fragment til et monoklonalt antistoff rettet mot human CCR5 så vel som scFv-fragment fra et monoklonalt antistoff rettet mot CD3.

4. Anvendelsen ifølge krav 3, hvor nevnte scFv-fragment mot CCR5 er lokalisert i den N-terminale delen.

5. Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 2 til 4, hvor det bispesifikke enkelantistoffet omfatter følgende rekkefølge av antistoffdomener: hvor (1) er spesifikt mot CCR5 og (2) er spesifikt mot CD3.

6. Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 3 til 5, hvor linkene mellom det variable dome-net så vel som mellom de to Fv-fragmentene består av peptidlinkere.

7. Anvendelsen ifølge krav 6, hvor de bispesifikke antistoffkonstruksjonene omfatter linkere som består av hydrofile, fleksible glycin- og serininneholdende linkere på 0 - 20 aminosyrer.

8. Anvendelsen ifølge ethvert av kravene 1 til 7, hvor effektorcellen er en leukocytt, spesielt en monocytt/makrofag eller en T-celle, eller en dendrittcelle.

9. Anvendelsen av minst én bispesifikk antistoffkonstruksjon som er i stand til å binde til en human kjemokinreseptor CCR5 som et første antigen og et CD3-antigen på overflaten av en effektorcelle som et andre antigen for fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for reduksjon av kjemokinreseptoruttrykkende celler.