NO313865B1 - Mikrovesikler, vandig dispersjon inneholdende disse, fremgangsmÕte for fremstilling av et kontrastmiddel,kontrastmidler samt et sett av reagenser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører mikrovesikler, en vandig dispersjon inneholdende disse, kontrastmidler og fremgangsmåte for fremstilling av disse samt et sett av reagenser. Oppfinnelsen utnytter anvendelsen av hyperpolariserte gasser til magnetisk resonans avbildning "magnetic resonance imaging", (MRI). MRI er en skjermavbildningsteknikk spesielt egnet ved diagnosebetingelser i levende objekter.

I teknikkene til kjernemagnetisk resonans (NMR), virker et magnetisk felt på kjernen til atomer med ikke hele spinnkvantetall og polarisere disse tilpasset til noe utvalgte orienteringer. Under målinger, anvendes radiofrekvenspulser med bestemt resonansenergi som snur kjernespinnet og forstyrrer fordelingen av mellomorienteringene. Deretter returnerer kjernen (relakserer) til utgangsstadiet på en tidsavhengig eksponensiell måte, derved utsendes signaler som elektronisk bearbeides til registrerbare data. Når signalene er rommelig adskilte og av tilstrekkelig styrke kan dataene organiseres og vises som avbildninger på en skjerm. For eksempel beregning av signalene skapt av protonene (<!>H) i vann i kontakt med organisk vev gjør det mulig å danne avbildninger (MRI) tillatende direkte visuallisering av indre organer i levende vesner. Dette er derfor et sterkt verktøy ved diagnose, medisinsk behandling og kirurgi.

På tross av svakheten i den naturlige 'H polarisasjon (6,8 x IO"6), men på grunn av den relative overflod av vann i organisk vev, vil hydrogenkjerner gi tilstrekkelig signal til å bli bearbeidet til bilder av et organ som undersøkes, kontrastene gitt ved forskjellene i spinnrelaksasjon av protonene i kontakt med forskjellige deler av omtalte organ. Faktisk selv om forbindelser inneholdende fluor (spinn 1/2) er blitt undersøkt som NMR-signalgeneratorer ved bestemmelsen av gasser i objekter, er kun vannprotoner regelmessig blitt anvendt inntil nylig til å produsere MRI-avbildninger. Dette skyldes fraværet av andre organiske atomer med kjernespinn, dvs. innholdet av noen naturlig forekommende isotoper av fosfor (<31>P), karbon (<13>C), natrium (<23>Na), svovel og så videre, er alt for lavt til å gi bearbeidelige avbildningssignaler.

Nylig er det blitt foreslått å anvende MRI av pasienters isotoper av noen edelgasser i hyperpolarisert form, f.eks. <3>He, 129Xe, I<31>Xe, <83>Kr, og lignende. Vel, selv om signalet fra disse isotoper i det naturlige polariserede stadium er ekstraordinært svakt (faktisk 5000 ganger svakere enn fra 'H), vil hyperpolarisasjon effektivt øke den med omkring IO<4> til IO5 ganger. Videre påvirkes spinnrelaksasjonsparametrene av de hyperpolariserte gasser meget sterkt av naturen av omgivelsene i hvilke de er fordelt etter administreringen (dvs. de bevirker en detaljert rekke av signaler med forskjellige intensiteter), hvilke gjør dem meget interessante kontrastmidler ved MR-avbildning. Hyperpolariserte edelgasser oppnås vanligvis ved spinnutvekslingsinteraksjon med optisk eksiterte alkalimetaller under tilstedeværelse av eller uten tilstedeværelse av et eksternt påført magnetfelt (se f.eks. G.D. Cates et al., Phys. Rev. A 45 (1992), 4631;

M.A. Bouchiat et al. Phys. Rev. Lett. 5 (1960), 373; X. Zeng et al., Phys. Rev. A 31

(1985), 260). Med slike teknikker, er det mulig å polarisere 90% eller mere, den normale relaksasjon (Ti, T2) værende så lang (fra adskillige minutter til dager i tilfelle av Xe is) at tilstrekkelig manipulering (anvendelse til diagnoseformål) er fullt ut mulig. Ellers kan hyperpolarisasjon oppnås ved metastabil utveksling, f.eks. ved eksitering av <3>He til 23Si stadiet ved strålingspulser, optisk pumping med 1,08 um sirkulær polarisert leselys til den 2<3>P metastabile tilstanden og overføring av polarisasjonen til grunntilstanden ved metastabil utvekslingskollisjoner med grunntilstandsatomer (se L.D. Schaerer, Phys. Lett. 180 (1969), 83; F. Laloe et al., ATP Conf. Proe. #131 (Workshop on Polarized 3He Beams and Targets, 1984).

WO-A-95/27438 beskriver anvendelsen av hyperpolariserte gasser ved diagnostisk MRI. For eksempel, etter å ha vært eksternt hyperpolarisert, kan gassene bli administrert til levende objekter på gass eller væskeform, enten alene eller i kombinasjon med inerte eller aktive forbindelser. Administrering kan utføres ved inhalering eller direkte intravenøs injeksjon av blod som ekstrakorpolært bringes i kontakt med gassen og gjenintroduksjon av det kontaktede blod inn i kroppen. Etter administreringen, bestemmes distribusjonen av gassen inne i området av interesse i objektet ved NMR, og en beregnet visuell representasjon av omtalte distribusjon vises på vanlige måter. Ingen praktiske eksempler på administrering av en parenteral kontrastmiddelsammensetning eller formulering, ingen identifikasjon av ytterligere forbindelser er nevnt.

US-A-4.586.511 beskriver administrering av organiske fluorinerte forbindelser til levende objekter og bevirke NMR målinger omfattende kjemiske shifter, relaksasjonstider eller spinn-spinn koplinger. MRI er ikke nevnt.

I en artikkel av H. Middleton et al, Mag. Res. Med. 33 (1995), 271, er der beskrevet introdusering av polarisert He 1 lungene på døde marsvin og deretter produsering av MR avbildninger av omtalte lunger.

P. Bachert og al. Mag. Res. Med 36 (1996), 192 beskriver dannelsen av MR-avbildninger av lungene av menneskelig pasienter etter den siste inhalering av hyperpolarisert <3>He. M.S. Chawla et al. (Sammendrag fra møtet om MRI Techniques Vancouver 1997) foreslår anvendelsen av <3>He mikroboblesuspensjoner i en vandig saltbærer til MR vaskulær avbildning. For å stabilisere boblene mot oppdrift, anbefaler Chawla et al. å inkorporere 40% PEG (Mw 3.350) i bærervæsken. Boblene blir generert ved injeksjon av gassen med en sprøyte inn i væsken via en treveis stoppekran. MRI målingene ble effektuert in vitro, ingen in vivo eksperimenter er beskrevet.

Selv om forslaget fra Chawla et al. er interessant, kan den på grunn av den betydelige bobleinstabilitet ikke komme i betraktning ved praktiske anvendelser. Selv om anvendelse av boblestabilisatorer anbefales av Chawla et al., kolapser suspensjoner av mikrobobler av sjeldne gasser i bærevæsker fremstilt ifølge forfatterens forslag i løpet av sekunder under ingen eller moderat ytre trykk. Det faktum at Chawla et al. mikrobobler er så ustabile gjør dem uegnede fra et praktisk synspunkt og av ingen interesse for anvendelse in vivo dvs. til diagnoseanvendelser i pasienter.

Kort beskrivelse av oppfinnelsen

I en hovedutførsel av foreliggende oppfinnelse er det oppdaget injekterbare MRI kontrastsammensetninger eller formuleringer i formen av dispersjoner eller suspensjoner av hyperpolarisert gass mikrovesikler i en farmasøytisk administrerbar bærevæske for praktisk in vivo vaskulær og vev MR visualisering. De er basert på den uventede oppdagelse at tilsetning av en liten porsjon av noen høy Mw fremmede inerte gasser, f.eks. flyktige fluorinerte forbindelser slik som fluorkarboner, til de hyperpolariserte gasser fanget i vesikler (mikrobobler eller mikroballonger) har en sterk stabiliserende effekt. For eksempel en andel så lav som 1-10% (volum) av fluorkarboner slik som C„F(2n+2) [n værende fortrinnsvis 1-12] i mikrobobler av 3He eller <129>Xe stabilisert ved gass/væske faseovergangen av amififile forbindelser f.eks. av en fosforlipid monosjiktovergang (se f.eks. EP-A-0 474 833 og EP-A-0 554 213), vil betydelig øke stabiliteten av boblene under trykk.

Oppfinnelsen vedrører følgelig gassfylte mikrovesikler avgrenset av en gass/væskegrenseflate i et flytende bæremateriale omfattende en eller flere amfifiler som stabiliserer mikrovesikler eller en polymermembran, kjennetegnet ved at gassen omfatter en blanding av en hyperpolarisert edelgass og en halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton.

Ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår av de etterfølgende underkravene.

Tilsvarende i en variant i stedet for mikrobobler, inneholder midler ifølge foreliggende oppfinnelse suspensjoner eller dispersjoner i en bærevæske av mikroballonger fylt med hyperpolariserte gasser og en andel av stabiliserende gass eller gasser. Mikroballongene er vesikler med et virkelig materialehylster, f.eks. av polymerer som beskrevet i EP-A-0 458 745.

Oppfinnelsen omfatter videre en vandig dispersjon omfattende gassmikrovesikler ifølge oppfinnelsen.

En annet formål for foreliggende oppfinnelse var å oppdage teknikker for fremstilling av de tidligere beskrevne formuleringer begynnende med løsninger av overflateaktive stabilisatorer og amfifiler og boblene deri blandinger av hyperpolariserte gasser og en andel av stabiliserende gass eller gasser, eller på annen vis utsette pulver av uttørkede amfifiler og/eller overflateaktive stoffer for hyperpolariserte gasser inneholdende en andel av stabiliserende gass eller gasser, deretter dispergere de utsatte pulvere i en administirerbar bærevæske. De edle gasser er kommersielt tilgjengelig i høy renhetsgrader og de polariserbare isotoper blir anriket ved vanlige måter kjent innenfor kjent teknikk. Hyperpolarisasjon kan bli utført som foreslått i WO-A-96/39912, f.eks. ved elektron-kjerne spinnutveksling med optisk eksitert rubidiumdamp (G.D. Cates et al., Phys. Rev. A 45 (1992), 4631; M.A. Bouchiat et al., Phys. Rev. Lett 5 (1960), 373; X. Zeng et al., Phys. Rev. A 31 (1985), 260).

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av et MRI kontrastmiddel, kjennetegnet ved at det i en bærevæske omfattende en eller flere overflateaktive stoffer i stand til å generere gassholdige mikrovesikler genereres gassmikrovesikler inneholdende en biokompatibel hyperpolarisert edelgass og en halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton.

I en annen variant, den tidligere beskrevne teknikk involverer fremstilling av suspensjoner av mikroballonger fylt med hyperpolarisert gass inneholdende en andel av stabiliserende gass eller gasser, dette oppnås ved å anvende emulsjoner av substanser i stand til å polymerisere, og under betingelser hvor mikroballonger av polymer vil dannes og fange de omtalte hyperpolariserte gasser inneholdende en andel av stabiliserende gass eller gasser.

Oppfinnelsen omfatter også et MRI kontrastmiddel kjennetegnet ved at det omfatter gassmikrovesikler inneholdende en biokompatibel hyperpolarisert edelgass og en halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton.

En annen gjenstand for foreliggende oppfinnelse er det å bringe utstyrssett omfattende komponentene nødvendig for in situ å produsere de tidligere omtalte administrerbare sammensetninger inneholdende hyperpolariserte gasser med en andel av stabiliserende gass eller gasser, så vel som deres administrering til objekter og etterfølgende avbildning anvende vanlige MRI fremgangsmåter.

Oppfinnelsen omfatter således et utstyrssett kjennetegnet ved å omfatte en tørr formulering omfattende et overflateaktivt materiale i stand til å danne gassholdige mikrovesikler ifølge krav 1 under en atmosfære av en blanding av en hyperpolarisert gass og minst en biokompatibel halogenert gass og en vandig bærevæske.

Videre omfatter oppfinnelsen også et utstyrssett, kjennetegnet ved å omfatte en tørr formulering omfattende et overflateaktivt materiale i stand til å danne gassholdige mikrovesikler ifølge krav 1, lagret under partialtrykk av den stabiliserende halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton, en annen komponent, en hyperpolarisert gass og en tredje komponent fysiologisk godtagbar bærevæske.

Foreliggende oppfinnelse er basert på den uventede oppdagelse av at der kan bibringes administrerbare MRI kontrastsammensetninger eller formuleringer omfattende vesikler (mikrobobler eller mikroballonger) fylt med en blanding av minst en edelgass i den hyperpolariserte tilstand og en eller flere inerte gasser. Den hyperpolariserte gass er definert som gasskomponent A (hovedkomponent) og den inerte gass er definert som gasskomponent B. Gass B har en relativt høy Mw, dvs. > 80 Dalton. Formålet med gass B er å beskytte blandingen ved stabilisering av tilstedeværelsen av den hyperpolariserte sjeldne gass A inne i vesiklene eller med andre ord hindre kollaps eller koalesenser av, eller utstrømningen av de omtalte hyperpolariserte edelgasser gjennom vesikkelhylsteret, vesiklene værende i suspensjon i en bærevæske med vanlige overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer. Formuleringer kan oppnås som å kombinere ønsket motstand mot trykk og forutbestemt livstid i sirkulasjon, begge av disse parametrer er kontrollerbare etter behag. Så lenge som komponent B er tilstede i en bestemt minste andel og så lenge dens oppløselighet i vann er under 0,0283 ml av gass pr. ml vann under standardbetingelser, vil MRI kontrastsammensetningene medføre diagnose egnede avbildninger in vivo og in vitro, f.eks. av sirkulasjonen og organer tett på. Etter at avbildrungssammensetningen er blitt administrert til et objekt, blir avbildninger generert ved å anvende MRI utstyr som vanlig. Det er ennu ikke kjent om de egnede MR avbildningssignaler blir generert hovedsakelig av andelen av de hyperpolariserte gasser innkapslet i vesiklene, eller av den del defundert derfra etter en tid.

Mengden av forbindelse B i kontrastmediet varierer i de fleste tilfeller fra så lavt som 0,5 volum-% (for substanser med en høy molekylvekt og lav løselighet i vann) til omkring 30-40% (av volum). Praktisk avtar beskyttelseseffekten av gass B av blandingen i høyere andeler av konsentrasjonsområdet, dvs. det er vanligvis ikke interessant å ytterligere øke andelen av B i blandingen når først den ønskede grad av beskyttelse er oppnådd. Med hensyn til dette er det interessant å notere seg at effekten av forbindelse B på de fysiske egenskaper av blandingen av A og B, spesielt med hensyn til inhiberingen mot utsivningen og motstanden mot trykkvariasjoner, er nesten den samme som hvis B ble tatt alene (dvs. i ren form). Ikke desto mindre er det interessant å holde andelen av B i det laveste området samsvarende til en tilstrekkelig mikrovesikkelstabilitet, dette er for å utnytte den høyest mulige konsentrasjon av hyperpolisert gass for å generere avbildningssignalet. Det er spesielt overraskende at relaksasjonsparametrene av de hyperpolariserte gasser fanger inne i vesiklene (som utgjør nøkkelfaktorene ved genereringen av egnede MR avbildninger) ikke signifikant vanskeliggjøres av tilstedeværelsen av den stabiliserende gass, eller substansene som omgir gass/væskefaseovergangen. Faktisk har tilstedeværelsen av en fluorinert gass i oppblanding med den hyperpolariserte gass sannsynligvis effekten av minskningen av mulig tap av polarisasjon av den senest nevnte under bearbeidninger.

Eksperimenter har vist at substanser med molekylvekter under 80 ikke er egnet som "beskyttende" forbindelser i de foreliggende gassblandinger, videre er den høye Mw grense for B vanskelig å bestemme, da de fleste forbindelser avprøvet var effektive beskyttere så lenge deres molekylvekt var over 80. Forbindelser med molekylvekt over 240 dalton, slik som dekafluorbutan eller 290 dalton slik som perfluorpentan, er dermed også blitt funnet å være effektive "beskyttende" forbindelser. "Hoved" forbindelsen A tilsvarende tilstede i en mengde fra 60 til 99,5% pr. volum er en hyperpolarisert gass slik som 3He, <129>Xe, <131>Xe, <83>Kr eller lignende. Disse hyperpolariserte gasser er tilgjengelig ifølge fremgangsmåter i kjent teknikk. Eventuelt kan A bestå av en eller flere hyperpolariserte sjeldne gasser i blandinger med en andel av "vanlig" gasser slik som oksygen, luft, nitrogen, karbondioksid eller blandinger herav. Imidlertid kan som komponent A, også andre mindre vanlige gasser i ikke-hyperpolarisert form som argon, xenon, krypton, CHCIF2 eller nitrøse oksider komme i betraktning.

Det var meget uventet å finne at suspendering i en vandig bærer mikrovesikler av en blanding dannet av så lite som 0,5% pr. volum av en substans slik som dodekafluorpentan eller 0,8% pr. volum av dekafluorbutan i en blanding med edelgasser, spesielt <3>He som er meget flyktig, vil produsere mikrovesikler med fortreffelig stabilitet og motstand mot trykkvariasjoner hindrende utstrømning av helium uten detriment av polarisasjonsrelaksasjonene.

Det er blitt vist at hurtig eliminering av He fra mikrobobler skyldes dens lave Mw som gjør det mulig for gassen hurtig å penetrere eksterne barrieremedier. I tilfellet med polarisert <129>Xe forsvinner boblene på grunn av deres høye løselighet i vandig bærer. Selv om utsivningen fra mikrobobler kan reduseres ved forskjellige overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer, foreslås i foreliggende oppfinnelse også mikrovesikler med en materialmur (mikroballonger). Mikrovesikler med murer dannet av naturlig eller syntetiske polymerer slik som lipiddobbeltsjikter (liposomer) eller denaturerte proteiner som albumin uten eller tilstedeværelse av ytterligere additiver blir betraktet. Den dårlige motstand mot trykkvariasjoner bemerket tidligere for mikrobobler generelt og den herav følgende tap av bobleantall, inspirerte til en søkeaksjon for gasspartikler med høyere motstand mot trykkvariasjoner forekommende i blod-strømmen. Selv om tilstedeværelsen av et elastisk avgranskningsmateriale har medført fordeler med hensyn til mikroveshikkelstabilitet under trykk, vil inkorporeringen heri av en andel av stabiliserende gasser slik som svovelheksafluorid eller dodekafluorpentan stadig forbedre bestandigheten. Eksperimenter med disse gasser har indikert at etter injeksjon, er suspensjoner av mikrobobler eller mikroballonger fylt med disse gasser i mindre andel oppblandet med hyperpolariserte gasser virkelige meget motstandsdyktige mot å kollapse under sirkulasjonen. Som et resultat av disse innledende oppdagelser er nesten 200 forskjellige gasser blitt identifisert som potensielt egnede til stabilisering av MRI kontrastmidler inneholdende hyperpolariserte gasser. Det er uventet blitt funnet at ved blanding av relative små andeler av noen av disse gasser med hyperpolariserte edelgasser kan der oppnås mikrovesikler motstandsdyktige overfor trykk. Disse mikrovesikler vil ha godtagbar fysiologisk toleranse og passende resorpsjonshalverings-tid i blodet, passende MRI signalgenereirngsegenskaper og den gode trykkmotstand på grunn av tilstedeværelsen av de beskyttende gasser. Det postuleres at denne overraskende oppførsel av gassblandingene ifølge foreliggende oppfinnelse oppstår på grunn av diffusjon av forbindelse A inn i det omsluttende medium oppbremses av tilstedeværelsen av de store gassmolekyler av forbindelse B. Selv om begrunnelsene for denne overraskende oppførsel ennu er uforklart, kan det postuleres at molekylene av forbindelse B selv om tilstede i meget liten mengde, faktisk "stopper hullerne" i mikroboblene eller mikroballonggrensen og dermed hindre utstrømningen av lav molekylvekt <3>He eller meget løselig <129>Xe, ved transmembranfunksjon.

De foretrukne gasser som anvendes som komponent B i sammensetningene og formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse er substanser som kan være på gassform eller væsker ved romtemperatur men som vil bli flyktige med det samme ved kroppstemperatur. Man kan sitere de følgende substanser: svovel heksafluorid, tetrafluor-metan, klortrifluormetan, bromtrifluormetan, bromklordifluormetan, diklortetrafluoretan, klorpentalfuoretan, heksafluoretan, heksafluorpropylen, oktafluorpropan, heksafluorbutadien, oktafluor-2-buten, oktafluorcyklobutan, dekafluorbutan, perfluorcyklopentan, dodekafluorpentan og mer foretrukket oktafluorcyklobutan, oktafluorpropan og decafluorbutan. Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder fortrinnsvis som gass B en gass valgt fra tetrafluormetan, heksafluoretan, heksafluorpropan, oktafluorpropan, heksafluorbutadien, oktafluor-2-buten, oktafluorcyklobutan, dekafluorbutan, perfluorcyklopentan, dodecafluorpentan og mer foretrukket svovelheksafluorid og/eller oktafluorcyklobutan.

Når fylt med kontrastgassblanding ifølge foreliggende oppfinnelse og dispergert i vandige bærere inneholdende vanlige overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer, bevirker mikroboblene dannet en egnet MRI kontrastsammensetning. Ut over mikroboblene vil kontrastsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer. Overflateaktive stoffer kan omfatte en eller flere filmdannende overflateaktive stoffer på lamell eller laminær form anvendes til å stabilisere den forgjengelige mikroboblegass/væskegrense. Hydratiseringsmidler og/eller hydrofil stabiliserende forbindelser slik som polyetylenglykol, karbohydrater slik som laktose eller sukrose, dekstran, stivelse og andre polysakkarider eller andre konvensjonelle additiver som polyoksypropylendikol og polyoksyetylenglykol, etrer av fettalkoholer med polyoksyalkylenglykoler, fettsyrer og estrer av fettsyrer med polyoksyalkylensorbitan, seper, glyserolpolyalkylenstearat, glyserolpolyoksy-etylenricinoleat, homo- og kopolymerer av polyalkylenglykoler, polyetoksylert soyaolje og kastorolje så vel som hydrogenerte derivater, etrer og estrer av sukrose eller andre karbohydrater med fettsyrer, fettalkoholer, disse værende eventuelt polyoksyakylert, mono-, di- og triglyserider av mettede eller umettede fettsyrer, glyserider av soyaolje med sukrose kan også anvendes. Overflateaktive stoffer kan være filmdannende eller ikke-filmdannende og kan omfatte polymeriserbare amfifile forbindelser av typen av linoleyl-lecitiner eller polyetylen dodecanoat. Blant ikke-filmdannende overflateaktive stoffer kan også anvendes blokkopolymerer av polyoksypropylen og polyoksyetylen. Fortrinnsvis er de overflateaktive stoffene filmdannende og mer foretrukket er de fosfolipider valgt fra fosfatidsyre, fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylglyserol fosfatidyllinositol, kardiolipin, sfingomyelin og blandinger herav.

Det er blitt nevnt at foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til kontrastformulering bestående av suspensjoner av mikrobobler som vesikler til magnetiserte sjeldne gasser anvendt i foreliggende oppfinnelse. En hvilken som helst egnet hul boblelignende partikkel fylt med kontrastgassblandinger f.eks. liposomer eller mikroballonger med et hylsterprodusert av syntetiske eller naturlige polymerer eller proteiner kan med fordel anvendese. Dermed er det blitt fastslått at mikroballonger fremstilt med albumin eller liposomvesikler eller jodipamidetylesterporøse partikler når fylt med gassformig kontrastblandinger ifølge foreliggende oppfinnelse medfører gode avbildningsmidler. Suspensjoner i hvilke mikroboblene ble stabilisert med sorbitol eller ikke-ionisk overflateaktive stoffer slik som polyoksyetylen/polyoksypropylenkopolymerer (kommersielt kjent som "Pluronic") har demonstrert tilsvarende gode avbildningsevner når sammenlignet med det av originalformuleringene gjort med ren hyperpoliserte gasser tatt alene. Det antas derfor at foreliggende oppfinnelse virker et mer generalisert konsept til MRI kontrastmidler og bevirker bedre kontroll av kontrastmiddelegenskaper. Mediene og kontrastmidlene inneholdende mediene ifølge foreliggende oppfinnelse antas derfor å være produkter som tar MRI teknikken et skritt videre i dens utvikling.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en fremgangsmåte til å gjøre foreliggende MRI kontrastformuleringer, i hvilken en gassblanding av minst to forbindelser A og B er suspendert i en fysiologisk godtagbar vandig bærevæske inneholdende vanlige overflateaktive stoffer og stabilisatorer for således å danne gassfylte mikrobobler eller mikroballonger. Denne metode er kjennetegnet ved at den minste effektive andel av forbindelse (B) i omtalte blanding av gasser blir bestemt ifølge denne formel:

i hvilken Bc% (pr. volumen) er den totale mengde av forbindelsen B i blandingen, K og C er konstanter med hhv. verdiene 140 og -10,8, Mwt representerer molekylvekten av forbindelse B overstigende 80 og b er en kompleks funksjon av driftstemperatur og tykkelse av membranen (en lipidfilm) som stabiliserer mikroboblene. Imidlertid siden

kroppstemperaturen hovedsakelig er konstant og stabiliseringsfilmstrukturen hovedsakelig avhenger av lipid konsentrasjon holder verdien av b seg i intervallet 0,011-0,012, og den kan ansees for å være en konstant. Kontrastmidlet kan ifølge fremgangsmåten omfatte suspensjoner av mikrobobler eller mikroballonger med fortreffelig motstand mot trykkvariasjoner og en relativt hurtig resorpsjon. Begge egenskapene kan kontrolleres i den grad at praktisk skreddersydde MRI midler nå er mulige. Med det ovenfor nevnte kriteriet er det mulig å produsere et middel med ønsket karakteristikk begynnende ut fra et hvilket som helst tilgjengelig ikke-toksisk ("hyllevare") substans som ved kroppstemperatur er gass og som har molekylvekten og løseligheten i vann som forklart ovenfor. Bearbeidingen som er nødvendig for fremstillingen av formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet i detaljer i dokumenter EP-patent A-0 474 833, EP-patent A-0 554 213 og EP-patent A-0 458 745 (beskrivelsene av disse er inkorporert heri ved referanse).

For eksempel, eksempler på fremstillinger av mikroballonger som bør være fordelaktig innenfor definisjonsområdet for foreliggende oppfinnelse involverer omdannelsen av en olje-i-vann emulsjon inn i dråper av en polymerorganisk løsning i en vandig fasebærer, forsakende polymeren og bærematerialet (f.eks. grenseflateutfelling ved fortynning) for å danne vann eller løsemiddelfylte mikrovesikler i suspensjon i bærematerialet, og eventult underkaste suspensjonen betingelser (f.eks. frysetørking) hvorved løsemidlet fanget inne i vesiklene vil fordampe og bli erstattet med gassblandingen ifølge foreliggende oppfinnelse. Polymerer som er kvalifisert til den ovenfor nevnte fremgangsmåte omfatter bionedbrytbare polymer valgt fra polysakkarider, polyaminosyrer, polylaktider og polyglykolider og deres kopolymerer, kopolymerer av laktider og laktoner, polypeptider, poly-(orto)estrer, polydioksanon, poly-6-aminoketoner, polyfosfazener, polyanhydrider og poly(alkyl-cyanoakrylater). Mer spesifikt kan man nevne polyglutamin og polyasparginsyrederivater og deres kopolymerer med andre aminosyrer. Additiver kan også bli inkorporert som blandinger med polymerene, slik som myknere som isopropylmyristat, glyserylmonostearat og lignende for å kontrollere fleksibiliteten, amipatiske substanser slik som overflateaktive stoffer og fosfolipider som lecitiner for å kontrollere permeabiliteten ved økning av porøsiteten og hydrofobe forbindelser slik som høy molekulærvekthydrokarboner slik som paraffin-vokser for å redusere porøsiteten.

Alternativt kan polymerene inneholde fluoratomer som beskrevet i WO-A-96/04018, dvs. ved kovalent binding med en F-inneholdende forbindelse slik som perfluormetyl og perfluor-t.butylgrupper. Ellers kan introduksjonen av fluorinerte grupper bringes tilveie ved reaksjon med perfluorerte gasser slik som perfluorpropan, perfluorinert alkylestrer og perfluorinerte acylhalogenider og anhydrider.

Ytterligere polymerer er også egnet til mikroballongene ifølge foreliggende oppfinnelse, nemlig fluorinerte og/eller deutererte polysiloksaner og polysilaner som beskrevet i WO-A-96/39912.

En mulig måte å oppbevare kontrastmidlet på før bruk er som en tørr formulering omfattende overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer lagret under en gassblanding omfattende en eller flere hyperpolariserte gasser (gasskomponent A) og en eller flere beskyttelsesgasser (gasskomponent B). En tørr formulering omfatter lyofiliseret filmdannende overflateaktive stoffer og eventuelt hydreringsmidler slik som polyetylenglykol eller andre vanlige hydrofile substanser. Før injeksjonen, blandes den tørre formulering med en fysiologisk godtagbar bærevæske for å produsere MRI kontrastsammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse. Det filmdannende overflateaktive stoff er fortrinnsvis en fosfolipid valgt fra fosfatidsyre, fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylglycerolfosfatidylinositol, cardiolipin, sfingomyelin og blandinger herav.

I en variant kan stabiliseringen av mikroboble kortvarige gass/væskehylsteret sikres ved ikke-ioniske overflateaktive stoffer slik som kopolymerer av polyoksyetylen og polyoksypropylen i kombinasjon med et filmdannende overflateaktivt stoff slik som dipalmitoylfosfatidylglycerol. Som tidligere kan den vandige flytende bærer ytterligere inneholde hydrofile additiver slik som glyserol, PEG, sorbitol, osv. Ytterligere egnede midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles med saltløsninger inneholdende "Tween 20", sorbitol, soyabønneolje og eventuelt andre additiver.

Også foreslått er et to-komponent utstyrssett omfattende som en første komponent en tørr formulering av overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer lagret under en blanding av gasser og en annen komponent en fysiologisk godtagbar bærevæske som når brakt i kontakt med den første komponent, utgjør en MRI kontrastformulering. Verktøyssettet kan omfatte et system av to separate ampuller, hver inneholdende en av komponentene, hvilke er forbundet slik at komponentene på egnet måte kan bringes sammen før anvendelsen av kontrastmidlet. Klart vil ampullen inneholdende den tørre formulering samtidig inneholde gassblandingen av komponentene A og B ifølge foreliggende oppfinnelse. Bekvemt kan verktøyssettet være utformet som en formutfylt toroms sprøyte og kan ytterligere omfatte anordningen til anbringelse av en nål på den ene åv dens ender.

Også foreslått er en tre-komponent utstyrssett omfattende en første komponent som en tørr formulering av overflateaktive stoffer, additiver og stabilisatorer lagret under partialtrykk av stabiliseirngsgass (B), en annen komponent en hyperpolarisert gass (A) og en tredje komponent fysiologisk godtagbar bærevæske.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte til å fremstille kontrastformuleringer med mikrobobler inneholdende MRI kontrastgassblandinger av A og B, disse kan anvendes ved avbildning av organer i humane eller animalske pasienter.

Når MRI kontrastmediet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes til avbildning av organer i mennesker eller dyrekropper, administreres den til pasienten i form av en mikrovesikkel vandig suspensjon i den ovenfor beskrevne fysiologiske godtagbare bærevæske og pasienten scannes med et MRI apparat hvorved en avbildning av organet eller delen av kroppen undersøkt produseres.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen ytterligere:

Eksempel 1

Femtiåtte milligram av diarachidoylfosfatidylcholin (DAPC), 2,4 mg av dipalmitoylfosfatidsyre (DPPA) begge fra Avanti Polar Lipids (USA) og 3,94 g polyetylenglykol (PEG 4000) fra Siegfried, CH) ble oppløst ved 60°C i tert-butanol (20 ml). Den klare løsning ble hurtig kjølet til -45°C og frysetørret til et hvitt faststoff. Aliquoter (25 mg) av omtalte hvite faststoff ble anbrakt i 10 ml glassampuller.

Ampullene ble lukket med gummi og evakuert under vakuum. Deretter ble blandingen av xenon med varierende mengde av fluorkarbon introdusert inn i ampullene via en nål gjennom proppen.

Boblesuspensjoner ble oppnådd ved injektering i hver ampull i 10 ml av en 3% glyserolløsning i vann etterfulgt av kraftig blanding. Motstanden mot trykk Pc ble bestemt anvendende en nefelometrisk analyse (som beskrevet i EP-patent A-0 554 213). Verdiene i tabellen korresponderer til trykket (over atmosfærisk) ved hvilket omkring halvdelen av boblene opprinnelig tilstede destrueres. Boblekonsentrasjonen og gjennomsnittlig boblestørrelse ble bestemt ved analyse med en Coulter Multisizer II (Coulter Electronics Ltd). Den gjennomsnittlige boblestørrelse var 2,0 um.

Resultatene overfor indikerer at motstanden av xenonboblene mot kollaps er betydelig øket allerede ved 5% C4F8. Ytterligere som bekreftet ved NMR varer polarisasjonen av hyperpolarisert xenonprøver inneholdende C4F8 lengre under lagring enn de uten fluorokarbon.

Eksempel 2

En vannfri formulering ble fremstilt som i eksempel 1, ved homogenisering sammen med følgende ingredienser:

Disteraroylfosfatidylcholin (DSPC) 30 mg

Dipalmitoylfosfatidylglycerol (DPPG) 30 mg

Polyetylenglykol 4000 (PEG) 3,94 g

Tert-butanol (t.BuOH) 20 ml

20 mg prøver av den ovenfor anførte blanding ble anbrakt i ampuller med gummipropper og etter evakuering under vakuum, gasser eller blandinger av gasser (tabell 2) ble introdusert deri. Porsjoner av 10 ml saltløsning ble anbrakt i ampullene gjennom en nål og boblesuspensjonen ble genert ved omrøring. I tabell 2 nedenfor indikeres de anvendte gassene, bobletellingen (ved start og etter 6 timer), volumenet (ul/ml) av innesluttet gass og det anvendte trykk mmHg nødvendig for å dele bobleantallet med to. Bemerk at for ren He og Xe, eksisterer ingen resultater etter 6 timer siden alle boblene var kollapset. "Ind" betyr at verdien var for lav til å bli bestemt presist.

De ovenfor anførte resultater viser ettertrykkelig viktigheten av andelen av komponent B for å stabilisere boblene.

Eksempel 3

Anvendelse av fremgangsmåten fra eksempel 2 og 20 mg aliquoter ble tatt fra en blanding av DSPC (30 mg); DPPG (30 mg); PEG (3 g), og t.BuOH (20 ml). Prøvene ble anbrakt i ampuller og utsatt for forskjellige gasser eller blandinger av gasser (se tabellen nedenfor). Boblesuspensjoner ble dannet som i de tidligere eksempler og testet. Resultatene er samlet i den følgende tabell.

Dataene i tabellen overfor viser igjen effekten av tilsetningen av forskjellige fluorokarboner til edelgassene på stabiliteten av mikroboblene.

Eksempel 4

Bearbeidelsen i eksempel 3 ble gjentatt anvendende C4F10 som beskyttelsesgass B i forskjellige andeler i hyperpolairsert 3He. Betingelsene og resultatene er summert i tabell 4 nedenfor.

Tabell 5 summerer resultatene når eksperimentene ovenfor utføres med Xe.

Resultatene i tabell 4 og 5 viser at så lite som 1% dekafluorobutan allerede har signifikant stabiliserende effekt på begge hyperpolariserte xenon og helium.

Eksempel 5

NMR spetrum av kontrastmidlet fremstilt ifølge eksempel 3 (90% hyperpolarisert xenon og 10% dekafluorobutan) oppnådd med Oxford magnet ved 2 Tesla er vist i fig. 1. <129>Xe viser dens topp ved 23,55 MHz.

Claims (28)

1. Gassfylte mikrovesikler avgrenset av en gass/væskegrenseflate i et flytende bæremateriale omfattende en eller flere amfifiler som stabiliserer mikrovesikler eller en polymermembran, karakterisert ved at gassen omfatter en blanding av en hyperpolarisert edelgass og en halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton.

2. Mikrovesikler ifølge krav 1, karakterisert ved at den hyperpolariserte gass er valgt fra helium, argon, xenon, xenon eller krypton, fortrinnsvis helium eller xenon.

3. Mikrovesikler ifølge krav 1, karakterisert ved at omtalte halogenerte gass er fluorinert fortrinnsvis perfluorinert.

4. Mikrovesiklene ifølge krav 3, karakterisert ved at den fluorinerte gass er valgt fra minst en av SF6, CF4, C2F6, C3F6, C3F8, C4F6, C4F8, C4F10, C5F10, C5F12, C6F14 og blandinger herav.

5. Mikrovesiklene ifølge krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved å ha en gj ennomsnittlig størrelse på 0,1 -10 um.

6. Mikrovesiklene ifølge et hvilket som helst av de tidligere krav, karakterisert ved at omtalte amfifil er valgt fra sukkerderivater, naturlige eller syntetiske amfifile polymerer, polyoksyetylen-polyoksypropylenblokk-kopolymerer, fosfolipider og lignende.

7. Mikrovesiklene ifølge krav 6, karakterisert ved at omtalte fosfolipider omfatter hydrofile grupper valgt fra gruppen bestående av kolin, etanolamin, serin, glyserol, pentoser og heksoser.

8. Mikrovesiklene ifølge krav 6, karakterisert ved at fosfolipiden omfatter filmdannende mettede fosfolipider.

9. Mikrovesiklene ifølge krav 6, karakterisert ved at fosfolipidene er valgt fra fosfatidsyre, fosfatidylkolin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylglyserol, fosfatidyllinositol, kardiolipin og sfingomyelin.

10. Mikrovesiklene ifølge krav 9, karakterisert ved at fosfolipidene ytterligere inneholder stoffer valgt fra dicetylfosfat, kolesterol, ergosterol, fytosterol, sitosterol, lanosterol, tocoferol, propylgallat, ascorbylpalmitat, butylert hydroksytoluen og fettsyrer.

11. Mikrovesiklene ifølge krav 10, karakterisert ved at fosfolipidene omfatter lecitin og derivater herav.

12. Mikrovesiklene ifølge krav 1, karakterisert ved å omfatte en fluorinert høy molekylvekthydrokarbongass og stabilisert med monosjikter av omtalte fosfolipidmateriale.

13. Mikro vesiklene ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at omtalte polymer er valgt fra naturlige og syntetiske proteiner, hydrokarboner, fluorinerte hydrokarboner, polymeriserbare fosfolipider og polyaminosyrer.

14. Mikrovesiklene ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at polymeren er en bionedbrytbar polymer valgt fra polysakkarider, polyamino-syrer, polylactider og polyglykolider og deres kopolymerer, kopolymerer av lactider og lactoner, polypeptider, poly-(orto)estrer, polydioksanon, poly-6-aminoketoner, polyfosfazener, polyanhydrider og polyalkyl-(cyano)akrylater.

15. Mikrovesiklene ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at membranpolymeren er valgt fra polyglutamin eller polyaspartinsyrederivater og deres kopolymerer med andre aminosyrer.

16. Vandig dispersjon, karakterisert ved at den omfatter gassmikrovesiklene ifølge krav 6 eller krav 13.

17. Vandig dispersjon, karakterisert ved at den omfatter gassmikrovesiklene ifølge krav 6 inneholdende oppløste viskositetsøkere eller stabilisatorer valgt fra linære eller tverrbundne poly- og oligo-sakkarider, sukker, hydrofile polymerer og jodinerte forbindelser i et vektforhold omfattende i forhold til de overflateaktive stoffer mellom omkring 1:5 til 100:1.

18. Vandig dispersjon ifølge krav 17, karakterisert ved ytterligere å omfatte opptil 50 vekt-% ikke-laminære overflateaktive stoffer valgt fra fettsyrer, estrer av fettsyrer og alkoholer eller polyoler og estrer av alkoholer og/eller polyoler.

19. Vandig dispersjon ifølge krav 18, karakterisert ved at polyolene er polyalkylenglykoler, polyalkylerte sukre og andre karbohydrater og polyalkylert glyserol.

20. Vandig dispersjon, karakterisert ved at den omfatter gassmikrovesikler ifølge krav 1 og at den inneholder 10<7->10<8> eller 10<8->10<9> eller 10<10->10n mikrobobler/ml.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av et MRI kontrastmiddel, karakterisert ved at det i en bærevæske omfattende en eller flere overflateaktive stoffer i stand til å generere gassholdige mikrovesikler genereres gassmikrovesikler inneholdende en biokompatibel hyperpolarisert edelgass og en halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den omfatter å ryste eller utsette en fluorinert og en hyperpolarisert gass(er) i en amfifilinneholdende væske omfattende et fosfolipid for lydbevegelser.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at kontrastmidlet isoleres ved frysetørking.

24. MRI kontrastmiddel, karakterisert ved at det omfatter gassmikrovesikler inneholdende en biokompatibel hyperpolarisert edelgass og en halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton.

25. Diagnostisk MRI kontrastmiddel ifølge krav 24, karakterisert v e d at det skal anvendes ved MRI avbildning av organer og vev hos humane eller animale pasienter.

26. Bifunksjonell MRI og ultralydkontrastmiddel, karakterisert v e d at det omfatter gassmikrovesikler inneholdende en biokompatibel hyperpolarisert edelgass og en fluorinert gass med en molekylvekt på >80 dalton i en amfifilinneholdende bærevæske omfattende et fosfolipid.

27. Utstyrssett, karakterisert ved å omfatte en tørr formulering omfattende et overflateaktivt materiale i stand til å danne gassholdige mikrovesikler ifølge krav 1 under en atmosfære av en blanding av en hyperpolarisert gass og minst en biokompatibel halogenert gass og en vandig bærevæske.

28. Utstyrssett, karakterisert ved å omfatte en tørr formulering omfattende et overflateaktivt materiale i stand til å danne gassholdige mikrovesikler ifølge krav 1, lagret under partialtrykk av den stabiliserende halogenert gass med en molekylvekt på >80 dalton, en annen komponent, en hyperpolarisert gass og en tredje komponent fysiologisk godtagbar bærevæske.