NO313703B1 - Diagnostisk analysemetode og kit - Google Patents

Description

Generell beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen omhandler et kit og en metode for klassifisering av bakterier i væsker. I en foretrukket versjon av metoden er væsken melk, og analysen utføres for påvisning av, og klassifisering av bakterier ved akutt mastitt i melkende dyr. Metoden er imidlertid også anvendbar for klassifisering av bakterier i en hvilken som helst væske, herunder væsker som er fremkommet ved ekstraksjon fra en prøve av et helt eller delvis fast materiale.

Oppfinnelsen inkluderer et kit sammensatt av a) en kjemisk reagensblanding for behandling av en prøve slik at denne blir oppløst til et nivå der den er filtrerbar gjennom et filter, men som bevarer bakterierester slik at disse holdes igjen på et filter, b) en filterenhet for oppsamling av rester av bakterier etter behandling av væsken, og c) en kjemisk reagensblanding egnet for identifikasjon av, og klassifisering av bakteriene som var til stede i væskeprøven ved analyse av filteret i filtreringsenheten. Oppfinnelsen inkluderer også en fremgangsmåte for behandling av melkeprøver med et kjemisk reagens, overføring av den behandlede prøven til en filtreringsenhet, og identifisering av bakterier eller bakterierester som er avsatt på filteret ved bruk av en kjemisk reagensblanding hvoretter bakteriene kan påvises ved inspeksjon av fargeforandringer på filteret med det nakne øye, ved hjelp av et spektrofotometer, eller ved mikroskopi.

Oppfinnelsens nytteverdi

Bakterieinfeksjoner utgjør en dominerende sykdomsgruppe i mennesker og husdyr, med betydelige økonomiske og sosiale konsekvenser for verdenssamfunnet. Siden oppdagelsen av penicillinet i 1928 har man imidlertid hatt tilgang til effektive medikamenter til bekjempelse av bakteriesykdommene. Senere har en rekke antibiotika som til sammen er effektive mot de fleste bakterieformer blitt utviklet.

Bruken av antibiotika er imidlertid ikke uten komplikasjoner. Den utstrakte bruken har etter hvert medført at en rekke bakteriestammer har utviklet resistens. Særlig i omgivelser der antibiotika brukes hyppig, for eksempel på sykehus, har det vært stigende problemer med infeksjoner som ikke lenger lar seg behandle med de vanlige hjelpemidlene. Resultatet erat stadig mer bredspektrede medikamenter har blitt tatt i bruk, med dest resultat at ytterligere resistens utvikles og at arsenalet av antibiotika som er effektive mot bakteriesykdommer gradvis skrumper inn.

Denne utviklingen er i ferd med å bli et globalt problem. Dersom problemet utvikler seg videre risikere mein å miste kontrollen over resistensproblemet, og effektiviteten av antibiotika som middel i bekjempelse av bakterielle infeksjoner kan bli sterkt redusert. De helsemessige konsekvenser av denne utviklingen kan bli meget omfattende. For å demme opp for denne utviklingen har WHO satt i verk tiltak som skal redusere forbruket av antibiotika, og derved redusere utviklingen av resistens-problemene, eventuelt reversere utviklingen.

Problemet forsterkes ved den omfattende bruk av antibiotika som brukes profylaktisk i husdyr- og fiskeoppdrettsnæringen. Spormengder av antibiotika overføres dessuten til konsumentene av fisk, kjøtt og melk og sprer derved risikoen for utvikling av resistens videre fra dyr til mennesker. Det har også oppstått en øket utvikling av antibiotikaallergi hos konsumentene.

Analytiske metoder som kan bidra til å avgjøre om en infeksjon skyldes bakterier, og i tilfelle at dette verifiseres, hvilken klasse bakterier, vil være avgjørende redskaper for om antibiotika i det hole tatt bør anvendes i behandlingen, og evt. til å avgrense bruken av antibiotika slik at bruk av unødig bredspektrede medikamenter unngås.

Mastitt (jurbetennelse) er den mest tapsbringende sykdommen hos storfe i Norge, med kostnader som påløper p.g.a. ulike former for produksjonstap: spenetråkk, tilbakeholdt melk, utrangering og tapt elitemelkstillegg. Det årlige tapet er anslått til ca 360 mNOK i 1992 (Veterinærinstituttet og Norske Meierier).

Ca 75% av mastitt-tilfellene er forårsaket av bakteriell infeksjon i melkekjertler. Symptomene varierer fra sterkt febrile dyr med nedsatt allmenntilstand, til dyr uten påvirket allmenntilstand, men hvor det påvises forandringer i melken. Akutt klinisk mastitt er den hyppigst forekommende, diagnostiserte sykdommen blant melkekyr i Norge (Sviland, S., 1996).

Den norske husdyrnæringen har satt seg som mål å redusere sykdomsforekomsten og antibiotikaforbruket hos husdyra. I mai 1996 ble det vedtatt nye retningslinjer for

behandling av mastitt hos melkeproduserende dyr. Disse retningslinjene stiller større krav til valg av antibiotika i behandlingen av mastitt enn tidligere. Det legges bl.a. stor vekt på å bruke peniicillinspreparater der dette er mulig. Forskningsresultater fra bl.a. Sverige viser at det ikke er noen indikasjon for å bruke antibiotika til behandling av mastitt forårsaket av Escherichia coli.

En optimal bruk av antibiotika i mastitt-terapi krever større bruk av differensial-diagnostiske systemer som kan gi svar mens veterinæren ennå er i fjøset. Kun en rask "på stedet test' vil kunne redusere antibiotikaforbruket fordi den praktiserende veterinær vil måtte sette i gang behandlingen før prøveresultatet fra konvensjonell diagnostikk foreligger.

En god diagnostisk metode som kan veilede veterinæren, vil bidra til redusert smitte-spredning samtidig med at antibiotikaforbruket kan holdes på et lavt, men optimalt nivå. I dag påvises bakterier i melk med tradisjonell dyrkningsmetodikk. Dette krever minst et døgn og tilfredsstiller ikke de reelle diagnostiske behovene. En test som allerede i fjøset kan påvise årsak til mastitt er viktig for å få en best mulig behandling av infeksjonen og vil åpenbart ha et marked i Norge, så vel som i store deler av det øvrige Europa.

Den foreliggende oppfinnelse representerer en hurtig test som bl.a. er egnet for påvisning av mastittassosierte bakterier i melk. Testen er basert på et enkelt prinsipp som gjør den mulig å utføre raskt, og uten særskilte hjelpemidler. Prosedyren krever totalt mindre enn 8 minutter, og kan utføres på 3 minutter etter moderat trening. Resultatet fremkommer som en farge på et filter som skiller bakterier som kan behandles med penicillin fra bakterier som trenger en mer bredspektret behandling. Et ytterligere trinn for å skille Stafylokokker og Streptokokker tar under et minutt.

Oppfinnelsens sentrale fordel er forenklingen i prosedyren i forhold til alternative metoder, og at metoden i det tilfelle den anvendes ved mastitt, kan benyttes til umiddelbar klassifisering av bakteriene som forårsaker tilstanden med påfølgende resultat for valget av antibiotika til behandling av sykdommen.

Det er en vesentlig klinisk drivkraft for å utføre slike analyser ved mastitt at unødig lidelse hos dyra hindres. Videre er metoden egnet til å redusere unødig antibiotika-forbruk som derved kan bidra til å begrense spredning av antibiotikaresistente bakterier. Dessuten kan en tidlig og presis diagnose begrense spredning av mastitt-induserende bakterier som bl.a. S. aureus til andre dyr i besetningen. Mastitt som ikke behandles kan medføre nedslakting av melkekyr, noe som representerer betydelige rekrutteringskostnader, eller at det behandles unødig med et bredspektret antibiotikum som medfører at leveranse av melken må kasseres i et uforholdsmessig langt tidsrom.

Tilsvarende vil hurtig klassifisering av bakterier i væsker som urin, blod, vann og ekstrakter av næringsmidler medvirke til at det blir truffet tiltak av bedre miljømessig og terapeutisk karakter. For alle analyser som utføres på biologiske væsker som blod og urin vil dette kunne settes i sammenheng med administrasjon av det optimale antibiotikum, på like linje med behandling av mastitt. Infeksjoner i urinveiene hos mennesker og dyr er også en kilde til mer bruk av bredspektret antibiotika enn nødvendig. Frekvensen av unødige antibiotikabruk og de tilhørende negative effekter i form av bivirkninger og utvikling av resistens, vil kunne reduseres dersom en hurtig-metode til klassifisering av bakteriene er tilgjengelig.

Oppfinnelsesområdet

Av produkter som er fremstilt for klassifisering av bakterier ved akutt mastitt er den s.k. Selma-skålen (Statens Veterinårmedicinska Anstalt, Sverige) et medium som etter ett døgns inkubering gir svar på hvilke av de vanligste forekommende bakterier som finnes i melk. Dette er en vanlig dyrkningsmetodikk der prøven såes ut på en skål med forskjellige medier delt i sektorer, og hvor hvert medium vil begrense vekst av bakterier til visse grupper.

Den s.k. HY-testen (Hy Laboratories, Israel) er en annen test for bruk ved mastitt. Denne er basert på en stick med forskjellige dyrkningsmedier. Denne påviser E. coli og S. aureus , er basert på vanlig dyrkningsteknikk, og krever et døgn inkuberingstid. LIMAST-testen (Chromogenix AB, Sverige) for bruk ved mastitt er en metode basert på limulushemolysat. Nærvær av bakterietoksiner aktiverer enzymer i lysatet, og disse har evnen til å spalte substrater som gir opphav til en farge som enten kan bedømmes visuelt, eller avleses i et spektrofotometer. Denne testen tar 15 minutter å gjennomføre, men innebærer relativt mange analysetrinn, og behov for særskilt utstyr. Metoden er derfor lite egnet til feltbruk og gir dessuten bare utslag i Gram negative bakterier. Mangel på egenskaper til å klassifisere bakteriene gjør den derfor relativt uegnet som verktøy for veiledning av antibiotikabruk.

Øvrig metodikk for påvisning av bakterier domineres av dyrkning, etterfulgt av analyse i mikroskop, evt. etter farging av bakteriene. Andre metoder som vinner stadig større utbredelse er immunoassays hvor det anvendes antistoffer som er spesifikke mot en enkelt bakterietype. Dessuten anvendes genetisk analyse ved PCR-teknikk. Alle disse metodene er imidlertid tidkrevende, og vil i de fleste tilfelle også kreve spesialutstyr som nedsetter brukbarheten som feltutstyr, eller ved analyser i akutte situasjoner. Noen bestemte immunanalyser for spesielle bakterier er utviklet som hurtiganalyser. Dette gjelder for eksempel Streptokokk A som kan analyser i prøver fra svelget etter noen få minutter ved hjelp av filtreringsanalyser eller immunkromatografiske sticks der et immobilisert første antistoff fanger opp antigener fra en bestemt bakterie, hvoretter bakterien påvises med et andre antistoff som er konjugert til et fargestoff, et enzym som kan gi opphav til dannelsen av en farge, eller andre signalgivende systemer.

Forskjellige metoder har vært anvendt for behandling av prøver før analyse av bakterier. Et spesielt problem har vært å finne en metode til oppløsning av melk slik at melken kan passere et filter som holder igjen bakterier, hvoretter bakteriene kan farges og filteret inspiseres i mikroskop. En metode som ble introdusert i 1980 er beskrevet av Pettipher et al. i Appl. Environ.Microbiol.39 s. 423-429. Denne anvender blanding av en melkeprøve med et reagens slik at sluttkonsentrasjonen av komponentene blir: 0.08 - 0.4% Triton X-100, ca 2% WA/ Trypsin og chymotrypsin, og 40% melkeprøve. Prøven ble deretter inkubert ved 50°C i 10 minutter og ble fulgt av filtrering på et polykarbonatfilter med porestørrelse 0.6 nm hvor filteret på forhånd var vasket med varm løsning av 0.1 - 0.5% Triton X-100. Filteret ble deretter farget med acridin oransje som binder til DNA i bakteriene, hvoretter bakteriene ble visualisert og talt umder mikroskop. Anvendelse av andre fargestoffer som metylenblått, perjodat, bisulfitt toluidinblått og fenolalaninblått ble rapportert å farge også en del annet materiale som gjorde bakterietellingen under mikroskop vanskelig. Metoden forutsetter derfor at prøven behandles slik at bakteriene forblir tilstrekkelige intakte til at de bevarer sitt DNA intracellulært.

Varianter av denne metoden er presentert der 1) forskjellige enzymblandinger og rensing av filteret imed alkohol inngår (Buchrieser og Kaspar (1993) Int.J. Food Microbiol. 20, s.227-236); 2) hvor det introduseres bruk av citrat-NaOH-buffer pH 3.0 under filtreringen for å bedre filtrerbarheten (Ubaldina et al., J.Appl.Bacteriol. (1985) 59, s. 493-499), og 3) hvor det anvendes deteksjon med fluorescensmerkede antistoffer (Tortorello og Gendel (1993) J.Food.Prot. 56, s.672 - 677).

En ytterligere optimalisering ble presentert av Fernandez-Astorga et al. i J. Microbiol. Meth.(1995), 24, a. 111-115. Inkubasjonstiden er her redusert til 1.5 minutter, detergentvaskingen av filteret utelatt, og det er gjort justeringer i rekkefølgen av prosedyren som til sammen gir lettere visualiserbare bakterier for mikroskopisk deteksjon på filteret etter fargingen.

Det er også utført en variasjon av metoden der bakteriene påvises med mikroskop etter inkubering med et monoklonalt antistoff konjugert til alkalisk fosfatase og dannelse av et enzymprodukt som feller ut som et blått fargestoff der antistoffene er festet til bakteriene (Batina et al. J.Appl.Microbiol. (1997) 82, s. 619-624).

Ingen av metodene har imidlertid oppnådd muligheten for å påvise bakteriene uten bruk av mikroskop etter behandlingene.

Filtreringsmetoder for analyse av bakterier i prøver som ikke krever behandling med detergenter og enzymer har også blitt presentert. Wallis og Melnick presenterer i US 4,336,337 en metode for urin der bakteriene behandles med en chelator og farges før filtrering gjennom et filter med netto positiv ladning, og med porestørrelse som holder igjen bakteriene. Farging med en kationisk farge gir mulighet til å se nærvær av 10<5> - 10<6> bakterier /ml_ med det blotte øye. Det presenteres også en fargemetode som kan skille Gram positive og Gram negative bakterier. I denne metoden farges bakteriene ved basisk pH med en kationisk substans f.eks. safranin, etterfulgt av at filteret vaskes med en oppløsning av organisk syre ved pH ca 3.0. Denne vaskingen avfarger Gram +positive bakterier mens Gram negative beholder fargen.

Tilsvarende har Longoria et al. i US 5,081,017 presentert en metode der bakterier i urin eller vann behandles med en løsning som medfører at de festes i et filter med netto negativ overflateladning. Deretter følger farging hvoretter nærvær av bakterier kan bedømmes visuelt som en farge på filteret.

Likeledes har Romero et al. i J.CIin.Microbiol. (1988), 26, s. 1378-1382 beskrevet en metode der bakteriekulturer filtreres og klassifiseres med mikroskopisk undersøkelse etter tradisjonell Gramfarging.

Belly et al. beskriver likeledes i US 4,912,035 en metode for isolering av bakterier i urin eller andre kroppsvæsker ved hjelp av filtrering eller sentrifugering, og hvor eventuelle bakterier i prøven påvises spetrofotometrisk ved kombinasjon av en redox reagens og et vannløselig metallisk fargestoff.

Ingen av disse arbeidene har imidlertid funnet noen løsning der man kan analysere bakterier i melk ved en filtermetode, uten bruk av mikroskop. På bakgrunn av dette har man overraskende funnet at etter å ha tilsatt melkeprøver et reagens bestående av detergent, salter, chelator og organiske løsningsmidler som er helt eller delvis blandbare med vann, uten bruk av enzymer og inkubasjon av prøven over lengre tidsrom, lar melkeprøven seg passere gjennom et filter. Videre er det overraskende funnet at til tross for denne behandlingen vil bakterierester bli bevart på en slik måte at de kan holdes igjen på filtre med porestørrelse < 5.0 [ im, optimalt < 1.0 [ im. Videre er det overraskende funnet at i kombinasjon med den ovennevnte behandling lar disse bakterierestene seg farge med forskjellige reagenser på en slik måte at nærvær av bakterier i et antall av 10<6> eller mer pr. mL prøve gjenspeiles som en farge på filteret som kan sees med det blotte øye, eventuelt måles med spektrofotometriske metoder. Mengden av bakterier kan derfor også bedømmes. Det er dessuten overraskende vist at forskjellige fargemetoder kan anvendes for å klassifisering bakteriene i Gram positive og Gram negative typer, og at klassifisering gjennom farging av bakterierestene på filteret korresponderer med klassifisering som oppnås etter tradisjonell dyrkning og identifikasjon av de intakte bakteriene. Et viktig element i oppfinnelsen er at metoden kan utføres uten bruk av mikroskop.

Til forskjell fra Wallis et al. i US 4 336 337 har vi dessuten overraskende funnet at bakterier eller bakterierester fra væsker generelt kan holdes igjen på visse filtre med nøytral ladning og farges med en rekke fargestoffer uten at dette medfører bakgrunnsfarging av selve filteret. Eventuell bakgrunnsfarging som oppstår i visse reagenskombinasjoner kan eventuelt fjernes med en oppløsning av detergent, for eksempel 1 % Triton X-100. I en foretrukket versjon av metoden anvendes til dette formålet filtre laget av polysulfon eller polysulfonderivater som for eksempel polyetersulfon. Visse andre typer filtermaterialer, som for eksempel polykarbonat, kan imidlertid også anve ndes. Bakteriene farges med en oppløsning av et fargestoff som i en foretrukket versjon av metoden er en oppløsning av aminsubstituerte fenyl-thiaziner som f.eks. toluidinblått, eller aminsubstituerte fenaziner som f.eks. safranin. En rekke andre fargestoffer er imidlertid også anvendbare. Blant slike fargemetoder er også kolloidale metaller dekket med oligomere eller polymere substanser som inneholder amin-funksjoner. I motsetning til Wallis et al. har vi imidlertid overraskende funnet at behandling av fargede bakterier med en oppløsning med pH 2.7-3.5 avfarger Gram negative bakterier, mens Gram positive bakterier beholder fargen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen omfatter en væske for behandling av prøver som er forventet å inneholde bakterier, slik at disse blir filtrerbare under forhold som holder igjen bakterier og bakterierester på et filter med nøytral ladning. En væske som er egnet til oppløsning av blod og melk inneholder en detergent, salter, et kalsiumchelaterende stoff, og et organisk løsningsmiddel som er helt eller delvis blandbart med vann. Væsker som er egnet til forbehandling av prøver som ikke inneholder fettstoffer eller celler er typisk sammensatt av salter og et kalsiumchelaterende stoff.

Det er mange deteirgenter som egner seg til bruk i væsker med celler og/eller fettstoffer. Herundeir er de nonioniske detergenter av hvilke Triton X-100, detergenter i Tween-serien og IMonidet-serien er typiske eksempler. Av ioniske detergenter er gallesyrer de mest typiske; for eksempel cholat, deoxycholat, og chenodeoxycholat, men også detergenter av typen Saponin og natriumsalter av alkylsulfater som for eksempel natrium dodecylsulfat, er anvendbare. Detergentene kan dessuten foreligge i blanding, der særlig kombinasjonen av nonioniske- og ioniske detergenter er effektivt. Detergentene foreligger i en total konsentrasjon på minst 0.05%, typisk 0.2-5%. I en foretrukken versjon av oppfinnelsen anvendes en detergent-konsentrasjon på ca 1%.

Tilsetning av en chelator som binder divalente kationer, eller kationer med høyere valens har overraskende vist en gunstig effekt på oppløsningen av mange prøver, herunder særlig melk. Særlig proteinfraksjonen i melk oppløses effektivt ved bruk av en chelator. Typiske eksempler på effektive chelatorer er etylendiamino-tetraeddiksyre (EDTA), etylenglycol-bis(p-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (EGTA), dietylentriamine-N,N,N,,N",N"-pentaeddiksyre (DTPA), 1,2-bis(-o-aminofenoxy)-etan-N,N,N',N'-tetraeddiksyre (BAPTA) eller det tilsvarende tetraacetoxymetyl-ester-derivatet (BAPTA-AM). Chelatoren er tilstede i en konsentrasjon på 0.02 -1 mol/L ved en pH-verdi over 8.0.1 en foretrukket versjon av oppfinnelsen anvendes 0.2 M EDTA ved pH > 10.

Tilsetning av salter har vist en gunstig effekt på oppløsning og filtrerbarhet av prøver. Salter som kan anvendes til dette formålet er typiske klorider, bromider, nitrater, sulfater og fosfater av monovalente ioner som natrium og kalium. I en versjon av oppfinnelsen anvendes 0.0.5 - 2.0 mol/L NaCI, typisk 0.1-0.5 mol/L.

Tilsetning av organiske løsningsmidler som er helt eller delvis blandbare med vann har også en gunstig effekt på oppløsning av prøver som inneholder fettstoffer og/eller celler. Derved kan man anvende alkoholer som metanol, etanol, propanoler, butanolerog aromatiske alkoholer som fenol og benzylalkohol. Man kan videre anvende etylenglykol, acetonitril, dimetylsulfoxid, dimetylformamid, tetrahydrofuran, og eventuelt også sammen med stoffer som alene er mindre løselige i vann, som for eksempel kloroform, triklorometan, forskjellige alkaner eller alkener, eller halogenerte derivater av disse. Flere av de mulige filtermaterialer som er tilgjengelige har variabel resistens for ulike løsningsmidler. De foretrukne løsninger vil derfor variere med filtertypen. I en egnet versjon av oppfinnelsen anvendes 10% acetonitril ved filtrering på filtre laget av polykarbonat, polysulfon, eller polysulfonderivater.

En egnet blanding av stoffer i en væske som kan anvendes til oppløsning av melk i forholdet melk : reagens 1:5 er 1% Triton X-100, 0.1 M EDTA pH 12.0, 1.0 M NaCI og 10% acetonitril. Oppløsningen er raskest ved høyere temperatur som for eksempel når blandingen holdes under varmt springvann en kort periode.

Den oppløste melkeprøven settes på et filter hvor det enten øves et positivt trykk ovenfra, eller et negativt trykk fra undersiden. Begge deler kan oppnås ved bruk av en sprøyte koblet til en lukket filterenhet fra for eksempel Millex® eller Swinnex®

(Millipore Corp., USA), eller tilsvarende utstyr fra Pall Gelman Sciences, USA. Negativt trykk fra undersiden kan også oppnås ved å legge filteret i tett kontakt med et sugende underlag av papir eller annet væsketiltrekkende fibermateriale. I slike oppsett vil konseptet forbedres ved å plassere over filteret et vannavstøtende lag med en definert åpning, der det vannavstøtende laget er i ett kontakt med det underliggende filtermaterialet. Dette vil avgrense og definere filteroverflaten, og det vil gi opphav til en viss konsentreringseffekt av væske. I et slikt oppsett kan filteret som er eksponert mot prøven som strømmer gjennom fordelaktig være mindre enn de filterdiametre en vanligvis benytter i ovennevnte filteroppsatser. En gunstig diameter er 0.5-15 mm. I den foretrukne variant av denne metoden anvendes filter-åpninger på 2 - 5 mm. Det kan også være fordelaktig å plassere filteret under et vannavstøtende materiale som er formet som en trakt, eller som et rør. På denne måten kan man lettere påføre større væskemengder, og det kan også påføres væsker som inneholder detergenter og organiske løsningsmidler uten at væsken flyter utover som tilfellet ofte er med en applikasjon på et flatt belegg av for eksempel plastikk. Plastikk er i alle tilfeller et gunstig materiale å anvende til alle de beskrevne typer av utstyr filtrering kan utføres i. Filteret med det underliggende, sugende laget kan også plasseres i en beholder som er koblet til den overliggende trakt- eller rørformede komponent. Denne vil sørge for at brukeren ikke kommer i kontakt med væskene etter at disse har passert filteret, og hele enheten kan kastes etter bruken.

Det kan også være fordelaktig å plassere et forfilter med større porestørrelse, f.eks. 5 - 20 |nm, over det filteret hvor selve analysen utføres. Et slikt forfilter vil fjerne tilfeldige store, uløstei partikler som er tilstede i prøven, og redusere faren for gjenstopping eller uspesifikk farging av analysefilteret. Et slikt forfilter må anrettes slik at dette er lett å fjerne etter den første passasje av prøven, for at resten av prosedyren skal kunne skje med filteret som samler bakteriekomponentene åpent tilgjengelig for visuell inspeksjon.

Selve filtermaterialet i oppfinnelsen er både avhengig av den oppløsningsvæske man anvender, spesielt med hensyn på innholdet av løsningsmidler, og avhengig av det fargereagens man anvender. I en versjon av oppfinnelsen er det vist at filtre som inneholder polymere materialer av typen polycarbonat, polysulfonat og derivater av polysulfon som for eksempel polyetersulfon, er særlig gunstige. Det anvendes filtre med en porestørrelse 0.2 - 5.0 jam, typisk 0.45-1.2 ^m.

Bakterier er kjent for å binde en rekke fargestoffer. Det er imidlertid et vanlig problem at prøver inneholder en rekke substanser som også binder disse fargestoffene under samme betingelser, og derved gir opphav til uspesifikke reaksjoner. Videre er det en rekke filtermaterialer som i seg selv absorberer slike fargestoffer, og det er dessuten et utbredt problem med analyse av mange typer prøver at filtre absorberer proteiner og annet oppløst materiale fra melk slik at distinksjon fra farging av bakterier ofte er blir umulig. De ovennevnte artikler viser alle til at vellykket farging av bakterier på filtre kun kan utføres med intakte bakterier. Det er derfor overraskende at selv etter den ovennevnte behandlingen av melk med sterk konsentrasjon av detergent, chelator, sterk alkalisk pH, og organisk løsningsmiddel, at bakteriene fremdeles lar seg spesifikt farge med et utvalg av fargestoffer.

Fargestoffer som kan anvendes til dette formålet kan være aminsubstituerte feno-thiaziner som f.eks. toluidine blått, thionine , og metylenblått; eller aminsubstituerte fenazin-derivater som safranin, og nøytral-rødt; eller aminsubstituerte fenyl-dicyclohexadien-derivater som gentian-fiolett, metyl grønn og fuchsin-derivater, eller amin-holdige porfyrinderivater eller ftalocyaninederivater som f.eks. alcian blått. Fargestoffene er imidlertid ikke begrenset til dette utvalget. I prinsippet omfatter oppfinnelsen bruk av ethvert fargestoff som eksponerer en positiv netto ladning ved pH under betingelsen der bakteriene eksponerer negativ nettoladning. I den klassiske Gramfargingen tilsettes gentianfiolett eller metylfiolett til prøven. Denne behandles deretter med jodinløsning, og preparatet vaskes deretter med etanol. Dersom det er Gram positive bakterier i prøven beholder de fargen, mens Gram negative bakterier mister fargen. De Gram negative bakteriene kan som kontroll motfarges med carbolfuchsin eller safranin.

I en annen variant av denne prosedyren er det overraskende funnet en metode der en del fargestoffer som bindes til bakteriene ved nøytral eller svakt alkalisk pH avvaskes fra Gram negative bakterier når prøven vaskes med en løsning med pH 2.8-3.5, mens de Gram-positive bakteriene vil beholde fargen under de samme betingelsene. Avfargingen av Gram-negative bakterier er i en særlig foretrukket metode foretatt ved med en blanding av 0.01-0.2 M eddiksyre pH 3.0 med 5 -70% etanol. Bruk av denne metoden kan også forbedres ved anvendelse av forutgående farging med en blanding av to eller flere av de ovennevnte fargestoffene, der toluidin blått er til stede som minst en av komponentene i den foretrukne metode.

I en annen variant av oppfinnelsen anvendes metallkolloider tilkoblet substanser som eksponerer positive nettoladninger ved pH der bakteriene eksponerer negative nettoladninger. Metallkolloider er meget intense fargestoffer som øker sensitiviteten i forhold til anvendelse av rene fargestoffer med 10-1000 x. I en foretrukket versjon av metoden anvendes kolloidalt gull som dekkes med polymere eller oligomerer forbindelser som er bærere av primære, sekundære, eller tertiære amin-grupper. Eksempler på slike forbindelser er polylysin eller oligolysin, chitosan (deacetylert chitin), og basiske proteiner som f.eks. histoner. Metoden er imidlertid ikke begrenset til gullkolloider, idet kolloider av andre metaller og metallsalter, og kolloider av hydrofobe fargestoffer av den type man vanligvis benevner disperse fargestoffer, kan anvendes til samme formål.

Tolkningen av resultatene vil være slik at en farge som indikerer infeksjon med Gram-positive bakterier medfører at det kan behandles utelukkende med penicillin. Som et ytterligere hjelpemiddel for differensial diagnostisering av Gram positive bakterier kan en separat del av melkeprøven tilsettes hydrogenperoksid. Katalase aktivitet vil medføre synlig bobledannelse i prøven etter få sekunder og indikere nærvær av Stafylokokker, mens fravær av bobledannelse vil indikere Streptokokker. Dette vil være av tilleggsverdi for behandlingen da optimalt penicillinregime er forskjellig for disse to bakterieklassene.

Påvisning av Gram-negative bakterier tilsier at dersom infeksjonen er alvorlig, må bredspektrede antibiotika anvendes, som f.eks tetracykliner, eller sulfapreparater.

Et negativt resultat tyder på at infeksjonen ikke skyldes bakterier, men har andre årsaker som har iverksatt en betennelsesreaksjon. Behandling med antibiotika er i slike tilfeller ikke nødvendig.

I noen prøvematerialer, slik som for eksempel melk, kan inneholde partikulært materiale, som ikke lar seg løse ved hjelp av de reagenser som er presentert her. Ved jurbetennelse er det relativt vanlig at melkeprøver har et atypisk utseende, inneholder faste partikler, og har en generelt slimete konsistens. En direkte anvendelse av slike prøver i den beskrevne oppfinnelsen, vil være vanskelig. Men vi har overraskende funnet at slike prøver kan benyttes etter en vellykket filtrering gjennom et ull-lignende materiale eller et prefilter med porestørrelser > 10 pm, eller en kombinasjon av disse, uten signifikant tap av sensitivitet i den påfølgende analytiske metode for å påvise bakterier ved farging. Terminologien prefiltrering beskriver derfor en metode for å behandle prøver før prøvene analyseres for bakterier, slik det er beskrevet andre stedet i denne spesifikasjonen.

I en foretrukket utgave av denne metoden, så er både prefilter og det ull-lignende materialet laget av hydrofobe materialer. Denne behandlingen vil holde tilbake materialer som i noen prøver har en tendens til å stoppe til filtre, uten signifikant tap av bakterier i prøven. En slik forbehandling kan enten utføres direkte på prøvene eller etter blanding med de beskrevne reagenser. I begge tilfeller anvendes denne behandlingen på prøven, før denne settes på et filter.

I en utgave av denne prefiltreringsmetoden, så er dette prefilteret inkludert i den analytiske enhet på en slik måte at det kan fjernes etter at prøven, eller prøven behandlet med den beskrevne reagens, har passert prefilteret, slik at filteret hvor bakteriene er holdt tilbake, kan eksponeres. I en annen utgave av metoden holdes prefilteret i en separat enhet som kan anvendes til å prefiltrere prøver før eller etter blanding med den beskrevne kjemiske reagens.

Hydrofobiske materialer som er egnet for prefiltrering av prøver beskrevet ovenfor, inneholder, men er ikke begrenset til, polyalkener som polyetylen og polypropylen, polyestere, polyvinylklorid, polyuretaner, polyakryler, polyakrylamid, polysulfoner, polyetersulfoner, polykarbonater og nylon. Dog skal dette forstås slik at generelt kan ethvert hydrofobt materiale benyttes til dette formålet. Materialet kan ha en fasong og utseende som et filter, med en porestørrelse > 5 pm, fortrinnsvis med en porestørrelse > 10 pm. Dette materiale kan også benyttes som en ull-lignende matriks (vatt) som i et foretrukket oppsett er plassert inne i en beholder med en inngang og en utgang, som muliggjør en gjennomstrømning av prøvemateriale. Eventuelt kan et hydrofobisk filter med en porestørrelse > 5 pm, fortrinnsvis 15-80 pm, plasseres ved utgangen av beholderen, som inneholder en ull-lignende matriks.

Prosedyren med filtrering kan også gjennomføres i en enhet som tillater en lateral væskestrøm. En velegnet sammensetning er vist i Figur 1. Hele filtreringsenheten i denne figuren en festet på en plastikkholder (1). Imidlertid kan et slikt system også monteres inne i en plastenhet som for en del anvendelser kan beskytte brukeren og omgivelsene hvor brukeren befinner seg, mot kontaminering fra kjemikalier og/eller mikroorganismer.

Alle lagene i en denne enheten er i direkte fysisk kontakt med hverandre, slik at væsker kan vandre ved hjelp av kapillærkrefter fra et appliseringspunkt og videre til de andre lagene.

Prøven, som dersom

denne er melk kan

være blandet med et passende volum av 1 mol/L NaCI, 0.1 mol/L EDTA, 0.5% Triton X-100 (pH 12-13), som eventuelt også inneholder et organisk løsemiddel slik som 10% acetonitril, settes på prøvefilteret (2). Prøven kan enten settes på prøvefilteret (2) ved å dryppe prøveløsning på filteroverflaten (2), eller ved å dyppe den delen av sticksen som utgjør prøvefilteret (2) ned i prøveløsningen.

Prøvefilteret bør fortrinnsvis være laget av et materiale som muliggjør gjennomstrømning av bakteriene, og ha en porestørrelse som tilbakeholder partikler som ikke skal vandre videre til de andre lagene på sticksen. Et slikt filtermateriale er fortrinnsvis laget av et hydrofobt materiale, fra den samme gruppen av materialer som er beskrevet for prefilter, og inkluderer, men er ikke begrenset til polyalkener, polyestere, polyvinylklorid, polyuretaner, polyakryler, polyakrylamider, polysulfoner, polyetersulfoner, polykarbonater og nylon.

Materialene som benyttes i dette prøvefilteret bør være en filter matriks av typen vevd eller ikke-vevd, med en gjennomsnittlig porestørrelse på > 5 pm.

Dette prøvefilteret (2) kan være sammensatt av en eller flere lag, og i slike tilfeller vil hvert lag bestå av en definert kjemisk sammensetning og/eller porestørrelse.

Prøven som settes på prøvefilteret (2) vil vandre mot filtermembranen (3) ved hjelp av kapillærkrefter, og hvor eventuelle bakterier vil bli holdt tilbake. Denne filtermembranen (3) bør ha noe direkte overlapping mot væskeabsorbenten (5). Dersom denne overlappingen er stor, vil filtermembranen (3) fungere i all hovedsak som et vertikalt filter, mens dersom denne overlappingen er liten vil filtermembranen (3) fungere vesentlig som et lateralt arbeidende filter. Filtermembranen (3) bør fortrinnsvis være fremstilt av polykarbonat, polysulfon eller derivater av disse. Porestørrelsen bør være i størrelsesorden 0.45 - 2.0 pm. Mengde prøveløsning bør være av et slikt volum at fukting av væskeabsorbenten (5) observeres på motsatt side av kontaktflaten mot filtermembranen (3). Denne filtermembranen (3) bør dessuten være delvis overlappende med væskeabsorbenten (5).

Når væsken er tydelig, som beskrevet, kan bakterier på filtermembranen visualiseres som tidligere beskrevet, ved å sette på en fargesubstans, bestående av, men ikke begrenset til, toluidin blått. Denne fargesubstans bør fortrinnsvis appliseres direkte på filtermembranen (3), og fargen må få mulighet til å vandre gjennom filtermembranen (3) og over i væskeabsorbenten (5).

Dette trinnet i prosessen kan eventuelt etterfølges av et vasketrinn, som tidligere beskrevet, hvor en detergentoppløsning slik som 0.1-5% Triton X-100, eller andre lignende ikke-ioniske eller ioniske detergenter. Videre kan filtermembranen (3) vaskes med en løsning som avfarger Gram negative bakterier, slik dette tidligere er beskrevet, dvs en løsning inneholdende en alkohol, slik som 10% etanol, justert med eddiksyre til en pH 2.8-3.0.

Det endelige resultatet kan leses som tilstedeværelse eller fravær av farge på filtermembranen (3). Tilstedeværelse av farge før avfargingsløsning tilsettes, indikerer tilstedeværelse av bakterier. Dersom dette fargen beholdes etter at avfargingsløsning er tilsatt så er disse bakteriene av en Gram positiv opprinnelse, mens dersom fargen blir borte, så er bakteriene av en Gram negativ opprinnelse. Mengde farge på filtermembranen (3), som defineres som en kombinasjon av fargeintensitet og bredde på fargebåndet, kan også anvendes for å anslå mengden av bakterier på filtermembranen (3) og derved også i den opprinnelige prøven.

Væskeabsorbenten (5) bør ha tilstrekkelig sugekapasitet til å absorbere det totale væskevolum som appliseres på sticksen. Den kan være sammensatt av forskjellige materialer som kan absorbere vandige løsninger, eller vann inneholdende blant annet en detergent. Hensiktsmessige materialer kan være cellulose eller glassfiber i en porøs form, men denne oppfinnelsen er ikke begrenset til valg av slike materialer

I en spesiell utgave av oppfinnelsen, er sammensetningen av sticks bygget inn i en plastikk holder, med åpninger som eksponerer prøvefilter (2) og filtermembran (3). Påsetting av prøven utføres i dette tilfelle gjennom åpningen for prøvefilteret (2), mens det andre løsningene i analysen tilsettes gjennom åpningen for filtermembranen (3), hvor også det endelige resultatet avleses.

EKSEMPLER

Eksempel 1.

Av en melkeprøve ble 1 mL blandet med 4 mL av en oppløsning inneholdende 0.1 mol/L EDTA justert til pH 12 med NaOH-oppløsning, 1.0 mol/L NaCI, 0.5% Trition X-100, og 10 % acetonitril. Oppvarming undervarmt springvann (ca 50°C) i 2-3 minutter øker oppløsningshastigheten av melken. Blandingen ble filtrert i et poly-propylene-filter med gjennomsnittelig porestørrelse ca 10 og deretter trukket opp i en sprøyte som ble koblet på en Millex® filterenhet (Millipore Inc.). Filterenheten var utstyrt med et Supor filter (polysulfon filter fra Pall Gelman Inc.) med diameter 25 mm. Løsningen ble langsomt presset gjennom filteret ved et positivt trykk ovenfra ved bruk av sprøyten, hvoretter filteret ble vasket med 1 mL 1% Triton X-100. Deretter ble tilsatt 1 mL av en oppløsning av safranin-o (2.5 mg/L i destillert vann) som passerte filteret etterfulgt av en vask med 1% Triton X-100 oppløsning. Nærvær av bakterier i en mengde på > 5 x 10<6>/ mL i prøven fremkom som en rødlig farge på filteret, mens prøver som inneholdt mindre enn den ovennevnte mengde bakterier vistes som et ufarget, hvitt filter. Tilsetning av 1 mL av en oppløsning av 10% etanol og 0.1 mol/L eddiksyre, pH 2.9, avfarget et fra før av farget filter dersom bakteriene på filteret var Gram negative. Dersom bakteriene på filteret var Gram positive ble fargen ikke avvasket.

For å dokumentere dette ble alikvoter av melk tilsatt kultur av Staphylococcus aureus (Gram positiv) og Escherichia coli (Gram negativ) i stigende konsentrasjon fra 1 x 10<5 >til 5 x 10<8> bakterier pr. mL. Rød farge var synlig på filtrene med prøver fra og med konsentrasjon 5 x 10<6> bakterier/mL for begge bakteriestammer. Kun prøvene med E. coli ble avfarget med blanding av 10% etanol / 0.1 mol/L eddiksyre pH 2.9, mens prøvene med S. aureus beholdt fargen under de samme betingelsene.

Eksempel 2.

Metoden over ble gjentatt, men safranin-o løsningen ble erstattet med en oppløsning av toluidine blått (4.(3 mg/l i destillert vann). Staphylococcus aureus i en mengde på > 5 x 106/mL vistes som en blå farge på filteret. Fargen lot seg ikke fjerne fra denne Gram positive bakterien ved vask med 10% etanol / 0.1 mol/L eddiksyre pH 2.9, som beskrevet i eksempel 1. Eschericia coli i en mengde på > 1 x 10<6>/mL vistes som en blå farge på filteret, og fargen lot seg fjerne fra denne Gram negative bakterien ved vask med 10% etanol / 0.1 mol/L eddiksyre pH 2.9, som beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 3

Metodene i eksempel 1 og 2 ble gjentatt med melkeprøver fra kuer diagnostisert med akutt mastitt. For etablering av en referanse, ble prøvene ble sådd ut på medier til dyrkning, hvoretter bestemmelse av bakterie spesies og antall ble utført. Videre ble antall somatiske celler bestemt med Schalm test der antallet gis i en skala fra 0 (lite) til 5 (mye). De samme melkeprøvene ble behandlet som beskrevet i eksempel 1 og 2, og resultatene fra denne testen sammenlignet med resultatene fra referanse-metoden.

Resultatet ble som følger:

Fra forsøket går det fram at metoden detekterer bakterier i melk som korresponderer til dyrkningstall ned til 10<3->nivå. Dette er 2-3 log bedre enn ved tilsetning av kultur til melk der sensitiviteten nå er 5 x 10<6> for Gram positive bakterier ( S. aureus) og 1 x 10<6 >for Gram negative ( E. coli). Den økede sensitiviteten skyldes trolig at hurtigmetoden også detekterer døde bakterier som altså ikke er representert ved dyrkningen.

Eksempel 4.

Kulturer av Staphylococcus aureus og Escherichia coli ble dyrket i LB medium over natten, og vanlig melk ble blandet med hver av bakteriekulturene i forholdet 1:2. I tillegg ble som kontroll laget en blanding av den samme melken som ikke var tilsatt bakteriekultur. Fra hver av blandingene ble tatt ut 1 mL som ble blandet med 4 mL av en oppløsning inneholdende 0.2 mol/L EDTA justert til pH 13 med NaOH-oppløsning, 0.2 mol/L NaCI, 1% Trition X-100, og 10 % acetonitril. Blandingene ble fylt i sprøyter som deretter ble koblet til Millex® filtreringsenheter inneholdende polykarbonat filtere (Isopor®, Millipore Inc.) med porestørrelse 0.4-0.8 og diameter 25 mm. Blandingene ble pæsset gjennom filtrene ved hjelp av sprøytene med et positivt trykk ovenfra. Hvert av fil trene ble deretter vasket med 1 mL av en oppløsning på 0.1% Triton X-100. Filtrene ble deretter farget som følger: 1 mL av en oppløsning som inneholdt 0.5g/L metylfiolett 6B og 0.1% Triton X-100 ble presset gjennom hvert av filtrene. Filtrene ble deretter vasket ved å passere 1 mL 0.1% Triton X-100. Filtrene som var benyttet til filtrering av prøver som inneholdt bakteriekultur ble farget blå. Deretter ble tilsatt 1 mL av en oppløsning av 0.1 g/L iod - 0.2g/L kaliumjodid - 0.1% Triton X-100 som ble presset gjennom filtrene ved hjelp av sprøyter. Filtrene ble deretter vasket med 1 mL 95% etanol og vasket med 1 mL 1% Triton X-100. Filtre som var anvendt til å filtrere prøver med de Gram positive bakteriene S. aureus ble farget mørkt blå, mens filtre som var anvendt til å filtrere prøver med E. coli eller prøver som ikke inneholdt bakterier ble farget svakt rosa. Deretter ble tilsatt 1 mL av en oppløsning som inneholdt 0.1 g/L basisk fuksin - 0.04g/L fenol - 0.05% etanol - 0.1 % Triton X-100. Løsningen ble presset gjennom filtrene ved hjelp av sprøyter. Filtrene ble til slutt vasket med 1 mL 0.1% Triton X-100.

Filtre som var anvendt til filtrering av prøver med de Gram positive bakteriene S. aureus beholdt den dyp blå fargen, mens filtre som var anvendt til filtrering av prøver med de Gram negative E. coli ble farget røde. Filtre anvendt til filtrering av prøver som ikke var tilsatt bakteriekultur ble farget hvite - svakt røde, og var klart forskjellige fra filtrene med bakterieprøver.

Eksempel 5.

Metodene i eksempel 1 og 2 ble anvendt på filterenheter med sugende papir-underlag. Filtrene tile montert i en plastholder med en sirkulær åpning på toppen, hvorigjennom filteret ble eksponert. Under filteret ble plassert et sugende papir-materiale som ble klemt på plass mot filteret når plastholderen ble klemt sammen. Resultatet ble tilsvarende der væskene ble presset gjennom filtrene ved hjelp av en sprøyte, som i eksempel 1 og 2.

Eksempel 6.

Urinprøver ble behandlet ved blanding med oppløsningsmediet beskrevet i eksempel 1, bortsett fra at acetonitril ble utelatt i dette mediet, ble filtrert, behandlet og farget som beskrevet i eksempel 2. Resultatet av prøvingen er presentert i tabellen under. Som det kommer frem av resultatene, så angir metoden både riktig klassifisering og intensitet av infeksjonen.

Eksempel 7.

Rene kulturer av en rekke bakteriespesies med kjent identitet ble dyrket i flytende medium og tilsatt melk (medium:melk = 1:5) til finalt antall 10<7-> 5 x IO8 bakterier/mL. Prøvene ble analysert med hurtigtestsystemet i.h.h.t. metodene i eksempel 1 og 2. Resultatet ved utprøvingen ble som følger:

Dette viser at samtlige spesies lot seg farge i henhold til hurtigmetoden, og videre at hurtigmetoden klassifiserte samtlige bakteriespesies riktig som Gram positive eller Gram negative typer.

Eksempel 8

Noen melkeprøver fra kyr med diagnosen mastitt har en slimete og partikulær konsistens, som gjør de mindre egnet for direkte applisering i filtermetoden. Slike prøver vil ofte tette til filteret og forstyrre analysens påfølgende trinn. Slike prøver utgjør anslagsvis 5-10% av feltprøver fra mastittkyr. En prefiltrering av slike prøver omgjør de til analyserbare røver i det systemet som er beskrevet i tidligere eksempler.

Prefiltrering ble utført ved å sette sammen utstyr bestående av en plastikksprøyte med en polystyren holder plassert slik at denne dekker utgangen av sprøyten. Inne i denne holderen ble plasser et polypropylen filter med en gjennomsnittlig pore-størrelse på 80 pm, og over dette filteret ble det plassert et lag med polystyrenvatt i en tykkelse på 2-10 mm.

Femten melkeprøver med en slimete og seig konsistens ble valgt ut til å analyseres direkte i henhold til metoden beskrevet i eksempel 2, eller analysert etter filtrering gjennom prefiltreringsutstyret. Resultatene fra de individuelle prøvene er vist i tabellen nedenfor. Som resultatene viser, så forbedrer dette prefiltreringstrinnet anvendelsen av metoden til nesten 100%, uten noe signifikant tap i sensitiviteten.

Eksempel 9

I et praktisk eksempel på anvendelse av testen i sticks format, ble en 5 mm bred stick laget ved å lime et 10 mm langt prøvefilter til en plastikkholder. Prøvefilteret var av typen Sefar Propyltex med porestørrelse 30-100 pm. Prøvefilteret overlappet filtermembranen (Gelman eller Pall polysulfon membran med porestørrelse 0.8 pm) med ca. 2 mm. Filtermembranen hadde en lengde på 10 mm og var plassert over en væskeabsorbent (Whatman Grade 17 CHR cellulose) med 8 mm overlapping. Filtermembranen ble holdt på plass med en tape satt på delvis over filtermembranen, slik at ca 5 mm av membranen fortsatt var åpen for tilsats av væske og til visuell inspeksjon.

Melk ble tilsatt bakterier (enten Stafylococcus aureus eller Escherichia coli, dyrket under standard betingelser i buljong) til 1 x 10<7> bakterier/mL. Denne melken ble benyttet til å undersøke sticksens funksjonalitet. Sticksene ble dyppet med prøvefilterenden ned, ca 5 mm med i melkeprøven tilsatt bakterier, eller melk uten bakterier som kontroll. Væsken fikk anledning til å vandre oppover sticksene så lenge at væskefronten rakk ca 2 mm over filtermembransonen innover væskeabsorbenten. Sticksene ble deretter tatt opp fra melkeprøvene og plassert horisontalt. En dråpe av en 1% Triton X-100 løsning ble dryppet på filtermembranen og fikk anledning til å trekke inn. En dråpe av en 0.133 mmol/L toluidinoppløsning ble deretter dryppet på filtermembranen og fikk anledning til å trekke inn. En ny dråpe av en 1% Triton X-100 oppløsning ble til slutt tilsatt.

Sticksene som ble dyppet i melk inneholdende bakterier ble farget blå på filtermembranen i en avstand 2 mm fra prøvefilteret, mens ingen farge ble observert på sticks dyppet i melk uten bakterier.

Til slutt ble en dråpe etanol justert til pH 2.9 med eddiksyre lagt på filtermembranen. Sticksene som inneholdt E. coli ble fullstendig avfarget, mens sticksene som innehold S. aureaus behold blåfargen.

Eksempel 10

Sticks ble laget på samme måte som beskrevet i eksempel 9, men med prøvefilter fremstilt i andre ma terialer. Disse sticksene ble laget med prøvefilter fremstilt av Porex Polypropylen med en porestørrelse på 70-130 pm, eller Porex Polypropylen med en porestørrelse på 40-100 pm. De nye sticksene ble testet som beskrevet i eksempel 9, med sammenfallende resultater.

I en annen utgave, ble sticksene slik de er beskrevet i eksempel 9 modifisert ved å omslutte prøvemembranen med et lag av Gelman Polypropylen filter med en porestørrelse i området 30-70 pm. Dette polypropylenfilteret forhindret større partikler å nå frem til prøvemembranen, og forhindret dermed at prøvefilteret ble tett, når mastittprøver ble testet på sticksene.

Eksempel 11

Det ble laget sticks som beskrevet i eksempel 9 og 10, ved bruk av et 80 mm langt støttemateriale bestående av 0.015 Super White polystyrene med GL-187 acryl trykksensitiv adhesivt materiale laminert til den ene siden, og påsatt A74 LB Poly Coated Silicone Release Liner (Gelman).

Et 60 mm langt og 8 mm bredt Whatman Grade CD427-07 Development materiale ble limt til den ene enden av ovennevnte materiale og utgjorde væskeabsorbanten. En 15 mm lang polysulfonmembran (Gelman) med porestørrelse 0.8 pm ble plassert ved den enden av væskeabsorbanten som ikke var limt. Et 35 mm langt polypropylen prefilter med porestørrelse 10 pm (Gelman) ble plassert i den andre enden av støttematerialet slik at det overlappet omtrent 5 mm med polysulfonmembranen. Polypropylenfilteret ble også limt til støttematerialet mens polysulfonmembranen ble holdt på plass med tape som ble lagt rundt på den ene siden.

Staphylococcus aureus ATCC 25923 og Escherichia coli ble dyrket i kultur over natt og tilsatt melk slik at det finale antall bakterier var 1 x106 - 5x10<8> pr. mL. 100 pl av hver melkeprøve ble blandet med 100 pl 0.1 mol/L EDTA /1.0 mol/L NaCI / 0.5% Triton X-100 Qustert til pH 12.0 med 0.1 mol/L NaOH). Denne behandlingen letter væskestrømmen gjennom sticksen og gjør den totale funksjon av systemet bedre. Funksjonen ble ytterligere bedret når væskeblandingen over ble varmet under varmt vann fra kran i omtrent to minutter.

En sticks sammensatt som beskrevet over ble dyppet i hver av prøvene til væsken var absorbert. Deretter ble 100 pl 1% Triton X-100 tilsatt polysulfonmembranen på sticksen, etterfulgt av tilsetning av 100 ul 133 umol/L toluidine blått og 100 pl 1% Triton X-100.

Nærvær av bakterier i prøvene kunne sees som en blå farge på polysulfonmembranen i konsentrasjoner ned til 10<6> bakterier pr. mL.

Tilsetning av 100 pl 10% etanol justert til pH 2.9 med eddiksyre avfarget fargen på sticks som inneholdt E. coli, mens sticks som inneholdt S. aureus beholdt fargen. På denne måten kunne systemet skille mellom Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Claims (10)

1. En metode for påvisning av bakterier i en melkeprøve karakterisert ved- blanding av en melkeprøve med et reagens med pH > 8.0 som inneholder salter, en eller flere chelatorer som binder di- eller polyvalente kationer, en eller flere detergenter, og eventuelt et eller flere organisk løsningsmidler som er helt eller delvis blandbare med vann - filtrering av blandingen gjennom et filter med porestørrelse < 5 jam, - farging av bakterier på dette filteret med en eller flere fargesubstanser som har positiv nettoladning ved en pH der bakteriens yttervegg har negativ nettoladning, og - inspeksjon av filteret for farge som indikerer nærvær av bakterier i prøven

2. En metode for påvisning av bakterier i en prøve karakterisert ved- filtrering av blandingen på et filter med porestørrelse < 5 |xm, der filtermaterialet er laget av polysulfon eller et derivat av polysulfon - farging av bakterier med en eller flere fargesubstanser som har positiv nettoladning ved en pH der bakteriens yttervegg har negativ nettoladning - inspeksjon av filteret for farge som indikerer nærvær av bakterier i prøven

3. En metode i henhold til Kravene 1 eller 2 for klassifisering av bakterier i en prøve, karakterisert ved at denne fargingen utføres ved å kontakte det beskrevne filteret med en første fargesubstans; etterfulgt av vasking av dette filteret med en oppløsning av en alkohol og en buffer substans som er egnet til å gi løsningen en pH i intervallet 2.7 - 3.5; som derved klassifiserer eventuelle bakterier på dette filteret som Gram positive dersom fargen på filteret beholdes; eller klassifiserer eventuelle bakterier på dette filteret som Gram negative dersom filteret avfarges; og eventuelt å kontakte dette filteret med en sekundær fargesubstans egnet for å farge Gram negative bakterier

4. En metode i hemhold til Krav 1 hvor det beskrevne filteret er et polykarbonat, et polysulfonat eller et polyetersulfonat filter, med en porestørrelse < 5.0 pm

5. En metode i henhold til Kravene -1,2 eller 3 hvor den nevnte fargesubstans er hentet fra gruppen av kjemiske forbindelser bestående av aminsubstituerte derivater av en fenothiazin, fenazin, fenyl-dicyclohexadien, hemocyanin eller kolloidale metaller dekket av aminsubstituerte oligomerer eller polymerer.

6. En metode i henhold til Kravene 1 eller 2 hvor den beskrevne prøve eller prøve fortynnet i nevnte reagens prefiltreres gjennom en porøs matriks fremstilt av hydrofobisk ull-lignende materiale, eller et prefilter fremstilt av et hydrofobisk materiale hvor filteret har en porestørrelse > 5 pm, eller en kombinasjon av et hydrofobisk ull-lignende materiale og et hydrofobisk filter, før applisering på det beskrevne filter.

7. En metode i henhold til Krav 3 for klassifisering av bakterier i en prøve, karakterisert ved at den beskrevne fargingen utføres trinnvis ved - å kontakte det beskrevne filter med en første fargesubstans, etterfulgt av - å vaske dette filteret med en løsning som inneholder en alkohol - å klassifisere bakterier på dette filteret som Gram positive dersom fargen på filteret beholdes - å klassifisere bakterier på dette filteret som Gram negative dersom filteret avfarges og - eventuelt kontakte det nevnte filter med en sekundær fargesubstans som er egnet for farging av Gram negative bakterier, hvorved bakterier på dette filteret klassifiseres som Gram negative dersom filteret farges med denne sekundære fargesubstans.

8. Et kit for klassifisering av bakterier i melkeprøver, hvor dette kitet består av - en enhet inneholdende et filter med porestørrelser < 5 pm, og eventuelt et absorberende materiale i direkte fysisk kontakt med dette filteret - en reagens sammensatt av en eller flere chelatorer, et eller flere salter, minimum en detergent, og eventuelt et eller flere organiske løsemidler som er helt eller delvis blandbare med vann, hvor denne reagensen har en pH > 8.0 - en løsning inneholdende en eller flere fargesubstanser som uttrykker positiv nettoladning ved pH < 4, og som er egnet for farging av bakterier eller bakteriefragmenter - en vaskeløsning inneholdende en alkohol og en buffersubstans, hvor denne vaskeløsningen har en pH i området 2.6 - 3-5 - og eventuelt en vaskeløsning inneholdende en eller flere detergenter

9. Et kit for klassifisering av bakterier i prøver, hvor dette kitet består av - en enhet inneholdende et filter fremstilt av polysulfon eller et derivat av polysulfon hvor porestørrelsen i dette filteret er < 5 pm, og eventuelt et væskeabsorberende materiale i direkte fysisk kontakt med dette filteret, og - en reagens sammensatt av en eller flere chelatorer, et eller flere salter, minimum en detergent, et eller flere organiske løsemidler som er helt eller delvis blandbare med vann, hvor denne reagensen har en pH > 8.0, og - en løsning inneholdende en eller flere fargesubstanser som uttrykker positiv nettoladning ved en pH < 4, egnet for farging av bakterier eller bakteriefragmenter, og - en vaskeløsning inneholdende en alkohol og en buffersubstans egnet til å gi denne vaskeløsningen en pH i området 2.6 - 3-5 - og eventuelt en vaskeløsning inneholdende en eller flere detergenter

10. Et kit i henhold til Kravene 8 og 9, hvor dette kitet i tillegg inneholder utstyr eller metoder for å fjerne større, uløselige materialer fra prøven, forut for kontakt med det beskrevne filter, karakterisert ved å være en enhet inneholdende et prefilter med en porestørrelse på > 5 pm, eller inneholdende et ull-lignende materiale, eller inneholdende en kombinasjon av et prefilter og et ull-lignende materiale , hvor dette prefilter og/eller ull-lignende materiale er fremstilt av et hydrofobisk materiale.