NO313687B1 - Fremgangsmåte for belegning av gjenstander med hyaluronsyre, derivater derav, og semisyntetiske polymerer - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for belegging av den ytre overflate av gjenstander med hyaluronsyre og dens derivater eller andre naturlige eller halvsyntetiske polymerer for anvendelser innenfor områdene kirurgi, helsepleie og diagnostikk. Ifølge denne fremgangsmåte er det mulig å binde polymeren på en stabil måte til overflaten av gjenstander laget av en rekke forskjellige materialer. Overflater behandlet med fremgangsmåten beskrevet i den foreliggende oppfinnelse karakteriseres ved høy av grad av fuktbarhet og glatthet i vandig miljø, og forbedrede egenskaper i vekselvirkning med biologiske faser. F.eks. vil de være i stand til å inhibere adhesjon av celler eller bakterier som er tilstede i de biologiske fluider.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Hyaluronsyre er et naturlig mukopolysakkarid som er tilstede i varierende konsentrasjoner i praktisk alle vev. Som hvilken som helst ekspert på dette området vil vite, karakteriseres vandige løsninger av hyaluronsyre eller av saltene eller derivatene derav, eller av polysakkarider generelt, ved bemerkelsesverdig viskositet, glatthet og evne til å redusere friksjon, en egenskap som er basis for tilstedeværelsen og funksjonen til polysakkarider av den samme familie som hyaluronsyre i legemene til mennesker og andre dyr (Michels R.G. al., "Sodium hyaluronate in anterior and posterior segment surgery". Physicochemical and Pharmacological Characteristics of Hyaluronic Acid, 1-15, 1989).

På grunn av disse egenskaper er det blitt utført betydelig forskning omkring polysakkarider av den samme familie som hyaluronsyre, både naturlige sakkarider og de som oppnås ved kjemisk syntese på naturlige forbindelser. Spesielt er det gjort betydelige anstrengelser for å identifisere fremgangsmåter hvorved tynne sjikt av hyaluronsyre (hyalektinfraksjon, som beskrevet i europeisk patent nr 0138572) eller derivatene derav (US patent nr4851 521) kan festes permanent til overflaten av andre materialer. Målet for denne forskning var å skape gjenstander med forbedrede overflateegenskaper, under bibehold av de generelle egenskaper til det materiale som de er laget av (nevnte materiale vil i det følgende bli referert til som substratet). På grunn av sin høye grad av hydrofili, vil spesielt hyaluronsyre og dens derivater være særlig egnet for fremstilling av gjenstander hvis anvendelse krever at deres overflate motstår adhesjon til de cellearter som er tilstede i vevene eller de biologiske fluider. Slike overflater er av spesiell interesse i anvendelser hvor adhesjon mellom materialer og celler kan forårsake skade på de biologiske vev (Kaufman, H.E. et al., Science, 189, 525, 1977).

Modifikasjon av materialenes overflater med hyaluronsyre eller derivatene derav har vist seg vanskelig for mange forskere. En av de første ting man legger merke til er at hyaluronsyreløsninger har en spesielt høy overflatespenning, den samme som eller noe lavere enn den for vann (F.H. Silver et al., Journal of Applied Biomaterials, 5, 89, 1994). Det er vel kjent at for å oppnå et homogent belegg ved påføring av en løsning, må det påførte materiale ha en overflatespenning som er lavere enn den for substratet for å oppnå et fullstendig jevnt belegg. Dessuten vil polymermaterialer som kan anvendes som substrater, ha en overflatespenning som er lavere enn den for vann, en egenskap som hindrer dannelse av et tynt sjikt av hyaluronsyre som dekker substratet jevnt (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", "Wilney, Chichester, 304, 1994).

Det skal bemerkes hyaluronsyre er vannløselig, slik at eventuelle gjenstander oppnådd ved enkel belegging av den med et sjikt av hyaluronsyreløsning umiddelbart vil miste sitt belegg ved kontakt med vandige løsninger, innbefattet biologiske fluider. Hyaluronsyrederivater, endog de som ikke er vannløselige, er i alle tilfeller ekstremt hydrofile og har sterk tendens til å svelle i nærvær av vann eller vandige løsninger (H.N. Joshi og E.M. Topp, International Journ. of Pharm. 80 (1992) 213-225). I vandig miljø vil denne egenskap føre til hurtig løsning av det - hydrofile overflatesjikt påført på substratet ved en enkel beleggingsfremgangsmåte ved anvendelse av en løsning. Av disse grunner har man studert fremgangsmåter som involverer en kjemisk binding mellom substratoverflaten og hyaluronsyren eller dens derivater.

Tilstedeværelsen av en stabil kjemisk binding vil forhindre oppløsning av overflatesjiktet og gi sterkere, mer langvarige overflateegenskaper til gjenstanden. Realiseringen av en kjemisk binding mellom substratet og overflatesjiktet vil kreve tilstedeværelse av egnede kjemiske grupper i begge. Selv om den kjemiske struktur av hyaluronsyre vil sikre tilstedeværelse av forskjellige egnede funksjoner, vil overflaten av de fleste syntetiske materialer ikke være spesielt egnet for denne type operasjon. Av denne grunn vil fremgangsmåter for å danne en kjemisk binding mellom et overflatesjikt av hyaluronsyre eller dens derivater og et syntetisk substrat vanligvis bestå av to trinn. I det første trinn innføres egnede kjemiske grupper på overflaten, deretter induseres i det andre trinn en reaksjon mellom de kjemiske grupper innført på substratoverflaten og hyaluronsyre eller dens derivater. F.eks. beskriver US-patentene 4 657 820, 4 663 233, 4 722 867, 4 801 475, 4 810 586, 4 959 074, 5 023 114 og 5 037 677 anvendelsen av et mellomsjikt mellom substratet og hyaluronsyrebelegget. Dette mellomsjikt kleber fysisk til substratet,

og inneholder kjemiske grupper som er egnet til å danne en binding med de kjemiske grupper i hyaluronsyre. For å lette spredning og sikre jevn belegging av substratet med hyaluronsyren, beskriver de foran nevnte patenter også anvendelse av albumin, som når det tilsettes til hyaluronsyre vil forbedre dens evne til å fukte mellomsjiktet jevnt.

Andre dokumenter beskriver anvendelse av plasmateknologi for innføring av reaktive grupper på substratet. Denne teknikk (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 6 1994) gjør det mulig å modifisere overflaten av polymermaterialer på en hurtig og effektiv måte. F.eks. beskriver internasjonal patentsøknad nr WO 94/06485 innføring av funksjonelle grupper på overflaten av et polymermateriale ved behandling med metanolplasma. Det behandlede materialet plasseres deretter i kontakt med en epiklorhydirnløsning som garanterer tilstedeværelse av grupper egnet til å reagere med polysakkarider.

Andre artikler (Acta Physiologica Scandinavica, 116, 201, 1982; Journal of Biomedical Materials Research, 18, 953, 1984, Elan et al.) beskriver en behandling med oksygenplasma etterfulgt av påføring av 3-glycidoksypropyltrimetoksysilan. Overflater behandlet på denne måten blir anvendt fordannelse av kovalente bindinger med polysakkarider.

Selv om fremgangsmåtene beskrevet ovenfor generelt er tilfredsstillende, vil de ikke desto mindre hver for seg presentere noen vanskeligheter. Spesielt vil anvendelse av et mellomsjikt kreve at dets sammensetning blir tilpasset til substratets karakter, for å øke adhesjonen så mye som mulig. I tilfelle fremstilling av gjenstander som består av nye materialer, eller materialer som sjelden anvendes, blir mye tid og anstrengelser brukt til å identifisere den mest egnede formulering for mellomsjiktet. Dersom de gjenstander som skal belegges er sammensatt av forskjellige materialer, er det vanskelig å påføre et egnet mellomsjikt for hver komponent og samtidig unngå overlapping og fremspring av mellomsjiktene på uegnede steder. Dessuten kan det være uønsket å anvende albumin til å øke substratets fuktbarhet, spesielt når det gjelder produkter ment for biomedisinske anvendelser.

Med hensyn til de andre gjengitte eksempler blir det foretrukket å unngå å anvende epiklorhydrin og 3-glycidoksypropyltrimetoksysilan, ettersom disse to forbindelser er kjent for å være en betydelig helserisiko. Ifølge klassifiseringen av farlige substanser utgitt av den europeiske union, er disse forbindelser i virkeligheten kodet som henholdsvis "R45" og "R40", hvilket angir en helserisiko, som rapportert i de fleste kataloger for kjemiske produkter og reagenser. Denne betegnelse angir for det første at produktet kan forårsake kreft, og for det andre at det er risiko for irreversible effekter.

Mer generelt vil det totale antall reaksjoner som involverer funksjonelle grupper immobilisert på en overflate og store molekyler, så som polysakkarider, være alvorlig begrenset ved den effekt som vanligvis er kjent som sterisk hindring. Den store størrelse av polysakkairdmolekylet vil forhindre eller vanskeliggjøre kontakt mellom reaktive grupper, slik at sannsynligheten for et effektivt reaktivt sammentreff så avgjort vil være lav.

Andre fremgangsmåter beskrevet i teknologien involverer reaksjonen mellom polysakkarider og aminogrupper. Japansk patent JP 04126074 (27. april 1992) beskriver anvendelse av behandling med ammoniakkplasma for innføring av aminogrupper på overflaten av polymersubstrater. Aminogruppene blir deretter omsatt med hyaluronsyre eller andre polysakkarider ved anvendelse av et kondensasjonsmiddel. I patent nr. US 4 810 784 blir overflaten av en gjenstand laget av polymermateriale, behandlet med reaktive løsninger for å innføre negative elektrostatiske ladninger på selve overflaten. Overflaten behandlet på denne måte blir plassert i kontakt med en vandig løsning av polyetylenimin (PEI), en polymer karakterisert ved tilstedeværelse av aminogrupper og en positiv elektrostatisk ladning. Vekselvirkningen mellom de forskjellige ladninger vil binde PEI til den modifiserte overflate, og gi en overflate rik på aminogrupper. Heparin og andre polysakkarider blir bundet til den aminerte overflate etter behandling med nitritløsning. Det er et kjent faktum i organisk kjemi at virkningen av nitriter forårsaker dannelsen av aldehydgrupper. Disse reagerer med den aminerte overflate, og binder polysakkaridet irreversibelt til selve overflaten. Den samme reaksjon anvendes når aldehydgrupper blir innført ved mild oksydasjon med periodat (C. Brink et al., "Colloids and Surfaces", 149, 66, 1992).

Reaksjonen mellom PEI og hvilke som helst aldehydgrupper tilstedeværende eller innført på polysakkaridet blir dessuten av og til anvendt til å binde polysakkaridet, i forskjellige konformasjoner, til gjenstandens overflate (E. Ostenberg et al., Journal of Biomedical Materials Research, 29, 741, 1995). Patent nr. 5 409 696 beskriver modifikasjon av overflaten av materialer ved behandling med plasma inneholdende vanndamp, og den påfølgende reaksjon av den behandlede overflate med PEI. Overflaten oppnådd på denne måte er rik på aminogrupper, og er i stand til å binde heparin og andre polysakkarider irreversibelt ved virkningen av kondenseringsmidler. Reaksjonen mellom karboksygrupper i polysakkaridet og aminogrupper på overflaten blir typisk befordret av etyldimetylaminopropylkarbodiimid (EDC). Anvendelse av denne fremgangsmåte til å belegge innsiden av slanger som er ment å komme i kontakt med blodet, er beskrevet av P.V. Narayanan (Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 6, 181, 1994).

Forskning har vist at fremgangsmåtene beskrevet i de gjengitte patenter og artikler ikke er fullstendig tilfredsstillende når det gjelder fremstilling av gjenstander med overflater modifisert med hyaluronsyre eller dens derivater. Innføring av funksjonelle grupper av aminotypen ved hjelp av ammoniakkplasma, som beskrevet i patent nr. JP 04126074 (27. april 1992), er i virkeligheten ikke svært praktisk som en fremstillingsfremgangsmåte. Eksperter på dette området vet at tettheten av de funksjonelle grupper innført ved denne teknikk på overflaten av substratet er heller lav, og avhenger alt for mye av den nøyaktige geometri av reaktoren som anvendes for plasmabehandling, av karakteren av substratet, av tilstedeværelsen av tilsetninger og/eller forurensninger på overflaten av og inne i substratet, og av lagringsbetingelsene for substratet før og etter behandling. Av denne grunn er teknikken vanskelig å anvende for industriell fremstilling. Dette negative aspekt blir anerkjent av dem som arbeider på dette området, og i de ovenfor angitte US patenter nr. 4 810 874 og 5 409 696 blir det motvirket ved anvendelse av PEI som gjør det mulig å oppnå en høy tetthet av aminogrupper. Selv om disse siste fremgangsmåter effektivt løser problemene involvert i fremgangsmåtens første trinn, det vil si innføringen av reaktive grupper på overflaten av materialet, er de ikke like effektive i det andre trinn, som involverer binding av hyaluronsyre eller derivatene derav til overflaten. Som vi tidligere har nevnt vil US patent nr. 4 810 874 i virkeligheten anbefale aktivering av heparin eller andre polysakkarider ved kjemisk behandling. Det er derfor ikke mulig å anvende polysakkaridet som sådant, men det er nødvendig først å modifisere det ved en kjemisk operasjon, hvilket innebærer ekstra kostnader med hensyn til tid, reagenser, arbeid og avfallsdisponering. Til forskjell fra andre polysakkarider er hyaluronsyre dessuten bare svakt følsom for de partielle oksydasjonsreaksjoner som tillater innføring av reaktive grupper av aldehydtypen på polysakkaridet (J.E. Scott og M.J. Tigwell, Biochem. J., 173, 103, 1978;L B.J. Kvam et al., Carbohydrate Research, 230, 1,1992). Når det gjelder US patent nr. 5 409 696 og utførelsen av fremgangsmåten foreslått deri, vil den ikke gi en overflatestruktur som er i stand til å utnytte hyaluronsyrens indre egenskaper i fullstendig utstrekning. Ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i US patent nr. 5 409 696 vil det, på den annen side, som vist i den komparative testing fremsatt heri, ikke være mulig å oppnå overflatestrukturer som er i stand til å inhibere celleadhesjon. Lignende resultater observeres når det i stedet for selve hyaluronsyren anvendes dens vannløselige halvsyntetiske estere (EPA 0216453). Når denne fremgangsmåte blir anvendt, vil den måte hvorpå en binding blir dannet mellom den aminerte overflate og polysakkarid åpenbart ikke tillate utnyttelse av de hydrofile egenskaper til hyaluronsyre eller dens derivater i sin fullstendige utstrekning.

Man må ikke overse at den fremgangsmåte som er gjenstand for US patent 5 409 696 kan anvendes bare til overflatemodifikasjon av polymermaterialer, som angitt ved dens tittel "Radio frequency plasma treated polymeric surfaces håving immobilized antithrombogenic agents" og ved operasjonsinstruksjonene for denne. I vanlig biomedisinsk og kirurgisk praksis anvendes ofte keramiske eller metalliske materialer, slik at det er håp om at modifiseringsfremgangsmåtene kan anvendes også på slike substrater. Denne beskrivelse viser at det må utformes en fremgangsmåte hvorved det kan dannes en kjemisk binding, enkelt og pålitelig, mellom substrater av hvilken som helst karakter og hyaluronsyre eller dens derivater, på en slik måte at de indre egenskaper derav kan utnyttes i så høy grad som mulig.

Det er derfor en hensikt å tilveiebringe nye fremgangsmåter for belegging av biomedisinske gjenstander som ikke utviser overnevnte ulemper. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Den foreliggende "oppfinnelse vedrører spesielt fremgangsmåter for belegging av biomedisinske gjenstander med et tynt sjikt av hyaluronsyre, et derivat derav, eller en halvsyntetisk polymer, hvori det tynne sjikt er bundet stabilt til et underliggende materiale. På denne måte lages en komposittstruktur hvis hoveddel er karakterisert ved egenskapene til det materiale som er anvendt til å lage gjenstanden, mens dens overflateegenskaper er dem til det tynne sjikt av hyaluronsyre, dens derivat, eller nevnte halvsyntetiske polymer. Nevnte egenskaper kan gi en høy grad av hydrofili til overflatene av materialene behandlet ifølge fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelse. F.eks. vil overflatene til gjenstandene behandlet ifølge fremgangsmåten i den foreliggende oppfinnelse være i stand til å forhindre adhesjon av celler tilstede i de biologiske fluider, og redusere bakterieadhesjonen. Belegging av en gjenstand med et materiale av naturlig opprinnelse ifølge den foreliggende oppfinnelse, vil dessuten sikre bedre egenskaper i vekselvirkning med biologiske faser.

Den foreliggende oppfinnelse vil bli mer fullstendig forstått ut fra den detaljerte beskrivelsen gitt heri nedenfor, og de ledsagende tegninger som er gitt utelukkende for illustrasjon, og således ikke er begrensende for den foreliggende oppfinnelse, og hvori:

Figur la: ESCA spektrum av prøve 1, eksempel 1

Figur lb: ESCA spektrum av prøve 2, eksempel 2

Figur 2a: Cl-toppen oppnådd ved ESCA-analyse av prøvene av stål plassert i PEI-løsning Figur 2b: Cl-toppen oppnådd ved ESCA-analyse av prøvene av stål modifisert med hyaluronsyre som beskrevet i eksempel 4 Figur 3a: Optisk mikroskopbilde som viser ikke-adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av prøve A, eksempel 6 (200x forstørret) Figur 3b: Optisk mikroskopbilde som viser adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av prøve B, eksempel 6 (200x forstørrelse) Figur 4a: Optisk mikroskopbilde som viser ikke-adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av prøve D, eksempel 6 (200x forstørrelse) Figur 4b: Optisk mikroskopbilde som viser adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av prøve F, eksempel 6 (200x forstørrelse) Figur 5a: Optisk mikroskopbilde som viser adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av titan (200x forstørrelse) Figur 5b: Optisk mikroskopbilde som viser ikke-adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av titan modifisert med hyaluronsyreester, som beskrevet i eksempel 8 (200x forstørrelse) Figur 6a: Optisk mikroskopbilde som viser ikke-adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av en intraokulær linse modifisert med hyaluronsyre som beskrevet i eksempel 10 (50x forstørrelse) Figur 6b: Optisk mikroskopbilde som viser adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av en ikke-modifisert intraokulær linse (50x forstørrelse) Figur 7a: Optisk mikroskopbilde som viser ikke-adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av en intraokulær linse modifisert med hyaluronsyre, som beskrevet i eksempel 10 (200x forstørrelse) Figur 7b: Optisk mikroskopbilde som viser adhesjon av L-929 fibroblaster på overflaten av en ikke-modifisert intraokulær linse (200x forstørrelse)

Andre formål og ytterligere ramme for anvendbarhet av den foreliggende oppfinnelse vil bli åpenbare fra den detaljerte beskrivelse gitt i det følgende.

I generelle vendinger tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse belegging av en gjenstand med et sjikt av hyaluronsyre, eller et derivat derav f.eks. så som et polysakkarid inneholdende karboksylgrupper, eller en halvsyntetisk polymer så som beskrevet nedenfor, ved dannelsen av en kjemisk binding til overflaten av substratet. Oppfinnerne har diskutert to klart adskilte oppfinnelsesfremgangsmåter som er fordelaktige, og er en del av den foreliggende oppfinnelse. Disse blir referert til nedenfor som henholdsvis "Fremgangsmåte A" og "Fremgangsmåte B".

I både Fremgangsmåte A og B ifølge den foreliggende oppfinnelse, er det mulig som et alternativ til hyaluronsyre eller dens derivater så som dens partielle derivater (EPA 0216453) eller polysakkarider inneholdende karboksygrupper, å anvende de ovenfor nevnte fremgangsmåter på forskjellige halvsyntetiske polymerer, slik som estere av flerverdige alkoholer av hyaluronsyre (EP 0265116), indre estere av sure polysakkarider (EPA 0341745), estere av karboksymetylcellulose, karboksymetylkitin og karboksymetylamid (EP 0342557), aktive estere av karboksypolysakkarider (italiensk patentsøknad nr. PD 94A000043), sulfaterte estere av hyaluronsyre (italiensk patentsøknad nr. PD 940000 54), estere av alginsyre (EP 0251905), gelanestere (EPA 0518710), indre estere av gelan (WO 94/03499), estere av kitin og kitosan (EPA 0603264), estere av pektin- og pektininsyre (EPA 0621877).

Prosess A

Fremgangsmåte A ifølge den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en ny fremgangsmåte for belegging av en gjenstand med et sjikt av hyaluronsyre, eller et derivat derav, eller et halvsyntetisk polymer, ved dannelse av en kjemisk binding med substratoverflaten. I motsetning til kjente og tidligere beskrevne fremgangsmåter, som involverte reaksjon av funksjonelle grupper på polysakkaridmakromolekyl og funksjonelle grupper tilstede på overflaten med det tidligere nevnte problem med lavt utbytte, vil den foreliggende oppfinnelse tilveiebringe en oppfinnelsesfremgangsmåte som kan gjennomføres i to trinn og unngå problemer i forbindelse med de tidligere kjente og beskrevne fremgangsmåter.

I det første trinn av oppfinnelsesfremgangsmåte A blir hyaluronsyre, et derivat derav, en halvsyntetisk polymer omsatt med en egnet forbindelse, som er et alkoksysilankoblingsmiddel, utelukkende i en løsning. Ved å eliminere i dette første trinn behovet for en reaksjon med funksjonelle grupper festet på overflaten av substratet og derfor praktisk talt immobile, er det mulig å redusere den negative effekt av sterisk hindring av polysakkairdmolekylet i det første trinn av reaksj onsfremgangsmåten.

I det andre trinn ifølge oppfinnelsesfremgangsmåte A blir reaksj onsproduktet av reaksjonen mellom hyaluronsyren, derivatet derav, eller den halvsyntetiske polymer og alkoksysilankoblingsmiddelet innført i form av en løsning til substratoverflaten, ifølge vanlige fysiske beleggingsfremgangsmåter. Det danner seg da en binding mellom alkoksysilangruppen i nevnte reaksjonsprodukt og substratet under eliminering av løsningsmiddel fra beleggingsløsningen, når beleggingsløsningen er i kontakt med substratet og sannsynligheten for at det finner sted en reaksjon er svært høy. Eksperimenter har vist at virkningen av fremgangsmåte A er overraskende høyere når den gjennomføres i de to beskrevne trinn, sammenlignet med anvendelse av tradisjonelle fremgangsmåter beskrevet i teknologien, nemlig de som involverer reaksjonen mellom funksjonelle grupper immobilisert på en overflate og funksjonelle grupper tilstede i et polysakkaridmakromolekyl.

I fremgangsmåte A ifølge den foreliggende oppfinnelse blir følgelig hyaluronsyre, et derivat derav, eller en halvsyntetisk polymer, omsatt i en vandig løsning, eller vanligvis i et egnet løsningsmiddel med et alkoksysilankoblingsmiddelmolekyl som kan binde seg til hyaluronsyren, derivatet derav, eller nevnte halvsyntetiske polymer i en ekstremitet og til substratet i den andre. Som bemerket blir, i fremgangsmåte A ifølge denne oppfinnelsen, hyaluronsyren, et derivat derav, eller en halvsyntetisk polymer, omsatt med en forbindelse tilhørende klassen av alkoksysilaner. Disse forbindelser er kjent for eksperter i den kjemiske teknologi som koblingsmidler som kan anvendes til å øke adhesjonsegenskapene mellom organiske og uorganiske materialer ("Silan Coupling Agents", E.P. Plueddemann, Plenum Press, New York, 1982). Eksempler på slike alkoksysilankoblingsmidler er molekyler inneholdende halogener så som klorpropyltrimetoksysilan, molekyler inneholdende umettede organiske grupper så som vinyltrietoksysilan og metakryloksypropyltrimetoksysilan, molekyler inneholdende hydrosulfidgrupper som merkaptopropyltirmetoksysilan, molekyler inneholdende aminogrupper så som aminopropyltirmetoksysilan og aminoetylaminopropyltrimetoksysilan. Oppfinnelsesfremgangsmåten er imidlertid ikke begrenset til slike spesifikke typer av alkoksysilankoblingsmidler.

I fremgangsmåte A ifølge denne oppfinnelse kan reaksjonen mellom hyaluronsyren, derivatet derav, eller den halvsyntetiske polymer og alkoksysilanet kreve anvendelse av ett eller flere molekyler som tillater reaksjonen mellom funksjonelle grupper av hyaluronryen, derivatet derav, eller den halvsyntetiske polymer og de funksjonelle grupper av alkoksysilan. Denne klasse av molekyl inkluderer blant andre forbindelser tilhørende diimidgruppen, som kommer under den generiske definisjon av kondenseringsmidler, så som cykloheksylkarbodiimid og etyldiaminopropylkarbodiimid, og alle de forbindelser slik som karbonyldiimidazol og dikarbonyldimidazol som er definert som bifunksjonelle midler, kjent for operatører på dette området for syntesen av proteinforbindelser. Molekyler som katalyserer eller letter omsetningen mellom funksjonelle grupper i hyaluronsyre eller et derivat derav og funksjonelle grupper på alkoksysilan kan også anvendes i oppfinnelsesfremgangsmåten. Noen illustrerende eksempler er N-hydroksysksinimid, hydroksysulfosuksinimid, 1-hydroksybenzotriazolhydrat og lignende forbindelser som tjener den samme funksjon. Det bemerkes at anvendelse av slike forbindelser også tilveiebringes i fremgangsmåte B i den foreliggende oppfinnelse, som beskrevet nedenfor.

I fremgangsmåte A blir substratet som skal belegges, tilpasset ved hjelp av en plasmabehandling for bedre å reagere med det tidligere dannede reaksjonsprodukt, inneholdende hyaluronsyren, derivatet derav, eller den halvsyntetiske polymeren. Uten å ønske å være begrenset til en bestemt teori, blir det antatt at plasmabehandling av substratet vil ha som effekt å øke overflatespenningen av substratet for jevnt å øke fuktbarheten med løsningen inneholdende hyaluronsyre og alkoksysilan og andre molekyler. Den tillater dessuten at funksjonelle grupper i stand til å øke reaksjonen med alkoksysilanet, blir innført på substratet. Spesielt vil det anvendes behandlinger som innfører hydroksy, karboksygrupper, og generelt de funksjoner definert som syre i vanlig akseptert og kjemisk terminologi. Ettersom det er mange kjemiske funksjoner som er i stand til å øke reaksjonen mellom substratoverflaten og silankoblingsmiddelet, vil behandlingsbetingelsene med plasmaet være langt mindre restriktive enn i tilfelle de behandlinger som for tiden beskrives i teknologien. Eksempler på egnede behandlinger er de som anvender plasma av oksygen, luft, nitrogen, argon og andre edelgasser, vann, alkoholer og blandinger av de nevnte gasser eller damper. Karakteren av substratet er ikke begrensende, og er bare betinget av muligheten for å danne, etter plasmabehandling, overflatefunksjonelle grupper i stand til å øke reaksjonen med silan.

I en spesielt fordelaktig form av den foreliggende oppfinnelsesfremgangsmåte A, vil reaksjonen mellom hyaluronsyre eller et derivat derav og alkoksysilankoblingsmiddelet foregå i en vandig løsning, hvor hyaluronsyren eller derivatet derav har en konsentrasjon på mellom 0,01 og 2% og fortrinnsvis mellom 01, og 1,2%. Alkoksysilanet er fortrinnsvis et aminosilan tilstede i støkiometrisk mengde, beregnet ifølge reaksjonsplanen eller svakt i overskudd derav. I slike foretrukne tilfeller vil reaksjonsløsningen fortrinnsvis også inneholde etyldiaminopropylkarbodiimid, i en støkiometrisk mengde beregnet ifølge reaksjonen mellom karboksygruppene tilgjengelig på hyaluronsyren eller derivatet derav og aminogruppen i aminosilan, eller svakt i overskudd derav. Omsetningen blir hjulpet ved tilstedeværelse av N-hydroksysuksinimid i en mengde på mellom 10 og 100% sammenlignet med den molare konsentrasjon av karbodiimid. Etter flere timers reaksjon ved romtemperatur blir løsningen påført på gjenstandens overflate som nettopp er blitt behandlet med plasma, ifølge fremgangsmåtene normalt anvendt for påføring av tynne overflatesjikt av en løsning. Plasmabehandlingen gjennomføres fortrinnsvis med et oksygen- eller luftplasma, med en kraftbelastning på mellom 1 og 400 W, fortrinnsvis mellom 10 og 150 W, et trykk på mellom 10 og mtorr og 10 torr, og en behandlingstid på mellom 1 sekund og 1 time, fortrinnsvis mellom 10 sekunder og 30 minutter. Løsningsmiddelet blir fordampet med eller uten hjelp av et vakuum og med eller uten hjelp av varme. Operasjoner på dette trinn er avhengig av nødvendigheten for å skape de nødvendige betingelser for å tillate reaksjonen mellom de reaktive ender av alkoksysilankoblingsmiddelet og de funksjonelle grupper tilstede på substratoverflaten etter plasmabehandlingen. Ved slutten av operasjonene kan eventuelle reaksjonsrester og molekyler som ikke er stabilt bundet, bli fjernet ved ytterligere vasking eller anvendelse av en lignende fremgangsmåte.

Fremgangsmåte B

Ifølge en separat utførelse av den foreliggende oppfinnelsen blir et substratmateriale av hvilken som helst type behandlet med plasma av luft, oksygen, argon, nitrogen eller andre gasser eller damper i stand til å innføre oksygenerte funksjoner på overflaten og eller å utøve en rensende virkning og fjerning av organiske forurensninger. Anvendelse av et plasma inneholdende vanndamp, ifølge US patent 5 409 696, er imidlertid ikke nødvendig i slike fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelsen.

Overflaten av materialet behandlet på denne måte, blir eksponert for en vandig løsning av PEI (eller en annen polykationisk substans slik som polylysin eller lignende), slik at det dannes en høy overflatekonsentrasjon av aminogrupper. Materialet oppnådd på denne måte blir omsatt med hyaluronsyre, et derivat derav, eller en halvsyntetisk polymer f.eks. andre polysakkarider inneholdende karboksylgrupper, i nærvær av kondenseringsmidler så som EDC, i vandig løsning eller dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i organiske løsningsmidler. Et molekyl med evne til å øke omsetningen formidlet av EDC er også tilstede. Denne molekyltype inkluderer, men er ikke begrenset til, N-hydroksysuksinimid (NHS), hydroksysulfosuksinimid, hydroksybenzotrazolhydrat og lignende molekyler.

Fremgangsmåte B ifølge den foreliggende oppfinnelse er basert på den overraskende observasjon at molekyler slik som NHS er i stand til å bidra til kondensasjonsreaksjonen formidlet av EDC, også i det tilfelle hvor grupper er bundet på overflaten i fråvær av molekylære strukturer kjent av fagfolk på dette området som "spacer armer".

Når det gjelder hyaluronsyre spesielt, er det kjent at i løsning, og i fravær av NHS, blir det dannet reaksjonsmellomprodukter, generisk definert av N-acylurea, som forhindrer fullstendig reaksjon (X. Xu et al., Trans IV World Biom. Cong., 170, 1992). Når aminogruppene er bundet til overflaten, må det anvendes "spacer armer" for å gjøre dem tilstrekkelig reaktive. En "spacer arm" er en sekvens av karbonatomer som atskiller den reaktive gruppe fra overflaten, og således gjør den friere og øker dens reaktivitet. Produktet COVALINK (Nunc) er f.eks. laget av polystyren inneholdende sekundære aminogrupper adskilt fra overflaten med en "spacer arm" med ni karbonatomer (K. Gregorius et al., J. Immunol. Meth., 181, 65, 1995) og NHS viser seg å være effektiv til å øke utbyttet av reaksjonen formidlet av EDC (J.V. Staros et al., Anal. Biochem., 156, 220, 1986). Kostnaden ved å skape komplekse molekylstrukturer på overflaten, så som funksjonelle grupper understøttet av "spacer armer", er åpenbart svært høy og vil begrense fremstillingsfremgangsmåten. I fremgangsmåte B ifølge den foreliggende oppfinnelse, er aminogruppene bundet til overflaten og til innsiden av PEI-strukturen, uten å kreve anvendelse av "spacer armer" eller å delta i eventuelle andre strukturerte aspekter. Det funn at NHS er i stand til å fremme kondensasjonsreaksjonen av overflateaminogrupper kommet i stand ved EDC, endog i fravær av en "spacer arm" og uten at det rettes noen spesiell oppmerksomhet mot andre molekylære aspekter av overflaten, er overraskende og er en avgjørende faktor i fremgangsmåte B ifølge denne oppfinnelse.

Enda mer overraskende og uforutsigbart på basis av tidligere kunnskap, er det funn at tilstedeværelse av NHS i reaksjonsblandingen har en bestemmende effekt på de sekulære antiadhesjonsegenskaper til overflater belagt med hyaluronsyre eller dens derivater. Når det arbeides i fravær av NHS, som beskrevet i US patent nr. 5 409 696, er det i virkeligheten umulig å gi overflatene belagt med hyaluronsyre antiadhesive egenskaper for å forhindre adhesjon av celler. Ved på den annen side å arbeide ifølge fremgangsmåtene i den foreliggende oppfinnelse, blir det oppnådd overflater som er perfekt resistente mot cellekolonisering. Selv om oppfinnerne ikke er forpliktet til å forklare grunnene for de oppnådde resultater, og de har ikke til hensikt å begrense seg selv til noen som helst teori, blir det antatt at forskjellen i oppførsel kan tilskrives en av følgende grunner: enten, i fravær av NHS, er utbyttet" av reaksjonen alt for lav, slik at selv om hyaluronsyren binder seg til overflaten, vil den ikke gjøre dette i tilstrekkelig mengde til fullstendig å belegge det underliggende materiale; eller bindingen som er etablert i fravær av NHS vil forandre egenskapene til hyaluronsyren bundet til overflaten. Den resulterende struktur vil ikke vedlikeholde de egenskaper som normalt ville være ventet av denne type polymer på basis av vanlig kjemisk kunnskap.

I en spesielt fordelaktig form av den foreliggende oppfinnelse blir et polymert, metallisk eller keramisk materiale behandlet med plasma av luft eller oksygen, med en kraftbelastning på mellom 1 og 400 W, fortrinnsvis mellom 10 og 150 W, et trykk på mellom 10 mtorr og 10 torr, og en behandlingstid på mellom 1 sekund og 1 time, fortrinnsvis mellom 10 sekunder og 30 minutter. Behandlingsbetingelsene er imidlertid ikke begrenset, og vil avhenge av produktets form. Behandlingen tar lenger tid dersom den involverer modifisering av innsiden av slanger eller andre utilgjengelige deler, mens flate eller eksponerte overflater krever kortere tider.

Det behandlede materiale plasseres i en vandig løsning av PEI, ved en konsentrasjon på mellom 0,01% og 10%, og fortrinnsvis mellom 0,5% og 2%. Reaksjonstiden er ikke begrensende og varer mellom 10 minutter og 10 timer. Ved slutten av dette trinn blir materialet vasket og plassert i en løsning av hyaluronsyre eller et derivat derav eller et annet polysakkarid inneholdende karboksygrupper. Konsentrasjonen av polysakkaridet er mellom 0,005 og 5%, fortrinnsvis mellom 0,05 og 1 %. Løsningen supplementeres med NHS og EDC, ved en konsentrasjon på mellom 0,001 og 1%. Reaksjonen oppnås ved romtemperatur eller kanskje noe oppvarmet, og kan vare mellom 10 minutter og 48 timer. Dersom typen av polysakkarid og substratet er egnet, kan reaksjonen oppnås i et organisk løsningsmiddel, ved anvendelse av DCC og NHS ved de tidligere angitte konsentrasj oner.

Viktigheten av denne oppfinnelse (Fremgangsmåte A og B) vil være åpenbar for hvilken som helst ekspert på dette området. Ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er det i virkeligheten mulig å oppnå gjenstander med fordelaktige overflateegenskaper på grunn av tilstedeværelsen av et belegg av hyaluronsyre eller et derivat derav, som holder seg stabilt i tid på grunn av tilstedeværelsen av kjemiske bindinger mellom belegget og substratet. Overflatene av disse gjenstander har dessuten markerte resistensegenskaper mot adhesjon av celler og bakterier som er tilstede i biologiske fluider.

Vi siterer i det følgende noen illustrerende eksempler.

Fremstillingseksempler

Eksempel 1

Det tas en prøve av polystyren fra en petriskål av bakteriologisk kvalitet (Corning) og behandles med plasma i en parallellplatereaktor (Gambetti Kenologia). Behandlingen gjennomføres ved et trykk på 100 mtorr av oksygen, en kraftbelastning på 50W, en strømningshastighet på 20 cm<3> (Std)/min og en behandlingstid på 30 sekunder. De behandlede prøver blir neddykket i 2 timer i en 0,5% løsning av PEI (Aldrich) i vann. De blir deretter ekstrahert, vasket med vann og neddykket i prøverør inneholdende 5 ml av følgende løsninger:

1) 1 vekt% av hyaluronsyre (Fidia Advanced Biopolymers, Brindisi)

2) 1 vekt% av hyaluronsyre, 0,02 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (Sigma), 0,02 g av N-hydroksysuksinimid

(Sigma)

3) 1 vekt% av hyaluronsyre 25% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers) 4) 1 vekt% av hyalyronsyre 25% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers), 0,02 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3 g av N-hydroksysuksinimid (Sigma) 5) 1 vekt% av hyaluronsyre 50% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers) 6) 1 vekt% av hyaluronsyre 50 foresteret med benzylalkohol, 0,02 g av 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (Sigma), 0,02 g av N-hydroksysuksinimid

(Sigma)

Prøvene etterlates ved henstand i prøverørene ved romtemperatur i 12 timer, hvoretter de blir vasket i vann over natten. Virkningen av behandlingen blir vurdert ved ESCA-analyse (elektronspektroskopi for kjemisk analyse). Som allerede kjent (Garbassi F. et al., "Polymer Surfaces, from Physics to Technology", Wiley, Chichester, 3, 1994)," er det ved denne teknikk mulig å bestemme den kjemiske sammensetning av overflaten av materialer. Analysen gjennomføres med et Perkin Eimer PHI 5500 ESCA-system. I tillegg til de tidligere beskrevne prøver blir en annen prøve behandlet med plasma, anvendt som referanse ved å plassere den i kontakt med PEI alene.

Disse data viser en markert økning i mengden av oksygen tilstede på overflaten etter modifikasjonsfremgangsmåten, som ventet etter innføring av hyaluronsyre eller estere derav. På den annen side, i fravær av EDC og NHS, vil overflatesammensetningen holde seg lik referansens overflatesammensetning. Detaljert analyse av Cl-toppen viser dessuten en overflod av CO-bindinger ifølge den forventede molekylstruktur. ESCA-spektra av prøvene 1 og 2 er gjengitt i figurene la og lb.

Eksempel 2

Andre prøver fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 blir neddykket i vann i 2 måneder. ESCA-analysen blir gjentatt. Ingen nedsettelser eller forandringer i overflatekonsentrasjonen av oksygen blir observert, hvilket således bekrefter stabiliteten av bindingen mellom polysakkarid og overflate.

Eksempel 3

En film av polyetylen som anvendt for emballasje, blir behandlet med plasma og neddykket i PEi som beskrevet i eksempel 1. Det fremstilles to prøver som neddykkes i følgende løsninger av dimetylsulfoksid (Fluka): 1) 1% av hyaluronsyre 75% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers) 2) 1% av hyaluronsyre 57%foresteret med benzylalkkohol, 0,02 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid, 0,02 g av N-hydroksysuksinimid.

Etter vasking i dimetylsulfoksid i 24 timer, blir prøvene analysert med ESCA. Følgende resultater oppnås:

Eksempel 4

En prøve av 316 stål, av en type som vanligvis brukes for biomedisinske anvendelser, blir behandlet med luftplasma i 15 minutter, og deretter plassert i kontakt med en løsning av 0,5% PEI i 2 timer. Hyaluronsyre blir bundet til overflaten av materialet ved anvendelse av løsning 2 beskrevet i eksempel 1. Materialet analyseres deretter ved ESCA-analyse. Den oppnådde Cl-topp er rapportert i figur 2, figur 2a referer til prøven etter eksponering for en løsning av PEI, figur 2b illustrerer Cl-toppen av prøven som undergikk fullstendig modifikasjon. I dette tilfellet kan man observere den typisk brede, flerkomponentform, karakteristisk for Cl-toppen av polysakkarider (se f.eks. den tidligere siterte artikkel av E. Ostenberg et al., Journal of Biomedical Materials Research, 29 741, 1995), som bekrefter tilstedeværelsen av hyaluronsyre på overflaten.

Eksempel 5

Petriskåler for cellekultur (Corning) blir modifisert som beskrevet i eksempel 1 (3 skåler pr behandling). De således preparerte skåler blir fylt med 5 ml av cellesuspensjon (fibroblastceller av musbindevev, L-929 i Minimum Essential Eagle's medium, supplementert med 10% fetalt kalveserum, antibiotikatypene penicillin, streptomycin og amfotericin B og L-glutamin - SPA, Milano), plassert i en inkubator (Forma) ved 37°C ved en atmosfære av 5% CO2 og 98% fuktighet. Celle-til-celle vekselvirkningene og polystyrenbasis, behandlet som rapportert i eksempel 1, blir bestemt ved regulære mellomrom ved optisk fasekontrastmikroskopi (Leica). Spesielt ble det vurdert hvorvidt cellene var i stand til å klebe til forskjellig behandlede bærere, og i hvilken utstrekning, ved å anvende som kontroll en petriskål som var behandlet med plasma alene slik at den hadde fått maksimale klebeegenskaper. I dette eksempel (avledet fra gjennomsnittet av de gjennomførte observasjoner i løpet av et tidsrom på 24 timer), skal et poengtall på 5 referere til maksimum klebing mens et poengtall på 0 angir fravær av klebing.

Eksperimentet bekrefter tilstedeværelsen av et hydrofilt sjikt, fast bundet og i stand til å forhindre celleadhesjon.

Eksempel 6

Fire polystyren petriskåler blir behandlet ifølge modifikasjonsfremgangsmåten beskrevet i eksempel 1, ved anvendelse av løsning 2 av hyaluronsyre (disse prøver vil bli referert til som A). Et like stort antall skåler blir behandlet ifølge hyaluronsyrebeleggingsfremgangsmåten i beskrevet i eksempel lii US patent 5 409 696 (disse prøver vil bli referert til som B). De modifiserte skåler plasseres i kontakt med en suspensjon av L-929-celler, som beskrevet i det tidligere eksempelet. Celleadhesjonen blir bestemt som i det tidligere eksempel, og resultatene er som følger:

Figurene 3a og 3b er bildene oppnådd ved et optisk mikroskop, og viser overflatenes tilstand ved slutten av testen. Figur 3a refererer til prøve A, 3b til prøve B. Den forskjellige grad av motstand mot celleadhesjon oppnådd ved de to fremgangsmåter, er klart synlige.

Eksempel 7

Fire polystyren petriskåler blir behandlet ifølge modifikasjonsfremgangsmåten

beskrevet i eksempel 1, ved anvendelse av løsningene av hyaluronsyreestere 4 og 6 (disse prøver vil bli referert til som henholdsvis C og D). Et like stort antall skåler blir behandlet ifølge hyaluronsyrebeleggingsfremgangsmåten beskrevet i US patent 5 409 696 ved anvendelse av de samme hyaluronsyreestere (disse prøver vil bli referert til som E og F). De modifiserte skåler plasseres i kontakt med en suspensjon av L-929-celler, som beskrevet i det tidligere eksempel. Celleadhesjonen blir bestemt som i det tidligere eksempel, og resultatene er som følger:

Figurene 4a og 4b er bildene oppnådd med et optisk mikroskop, og viser overflatenes tilstand ved slutten av testen. Figur 4a refererer til prøve D, 4b til prøve F. Den forskjellige grad av motstand mot celleadhesjon oppnådd ved de to fremgangsmåter, er klart synlig.

Eksempel 8

En liten folie av titan (Aldrich) blir modifisert med plasma og behandlet med PEI som beskrevet i eksempel 4. Den således behandlede overflate blir reagert med løsning 6 som i eksempel 1. Fire prøver av ikke-modifisert titan og fire titanprøver som har undergått modifikasjonsfremgangsmåten, blir plassert i kontakt med en suspensjon av L-929-celler, som i det tidligere eksempel. Celleadhesjonen blir bestemt 24 timer senere, ved farging av cellene med toluidinblått og observasjon av de dyrkede prøver med et metallografisk mikroskop. Resultatene av disse observasjoner er vist i figurene 5a og 5b. Figur 5a refererer til det umodifiserte titan, figur 5b til titan modifisert med hyaluronsyreester ifølge den foreliggende fremgangsmåte. Det er åpenbart at cellene oppfører seg forskjellig på de to overflater. I tilfelle det modifiserte materialet beholder cellene en avrundet form, og antar ikke det flatere spredte utseende som er typisk for celler som har klebet fast til substratet og som observert på det ikke-modifiserte materialet.

Eksempel 9

Modifikasjonsfremgangsmåten ifølge eksempel 8 blir gjennomført på et objektglass. Det modifiserte glass, en prøve av ikke-modifisert glass og en plasmamodifisert polystyrenskål (anvendt som kontroll for maksimum adhesjon) blir plassert i kontakt med L-929-celler. Celleadhesjonen blir bestemt 24 timer senere. Følgende resultater blir oppnådd:

Eksempel 10

Modifikasjonsfremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 blir gjennomført på to intraokulære linser (Sanitaria Scaligera), ved anvendelse av en løsning av 0,5% hyaluronsyre av oftalmisk kvalitet (Fidia Advanced Biopolymers), 0,4% av EDC og 0,4% av NHS. De modifiserte linser og et like stort antall ikke-modifiserte linser plasseres i petriskåler og plasseres i kontakt med suspensjonen av L-929-celler som i de tidligere eksempler. Prøvenes motstand mot celleadhesjon illustreres i figurene 6 og 7. Disse er fotografier av overflatene av linsene modifisert ifølge foreliggende fremgangsmåte (6a og 7a) og ikke-modifisert (6b og 7b). Disse figurer viser klart den forskjellige kapasitet for celleadhesjonsinhibering av de to overflater.

Eksempel 11

En prøve av polystyren blir tatt fra en petriskål av bakteriologisk kvalitet (Corning) og behandlet med plasma i en parallellplatereaktor (Gambetti Kenologia). Behandlingen gjennomføres ved et trykk på 100 mtorr av oksygen, en kreftbelastning på 100 W, en strømningshastighet på 20 cm<3> (Std)/min og en behandlingstid på 1 minutt. De behandlede prøver blir dyppet ned i og tatt ut fem ganger i følgende vandige løsninger, fremstilt 6 timer tidligere, og etterlatt for å reagere ved romtemperatur:

1) 1% hyaluronsyre (Fidia Advanced Biopolymers)

2) 1 vekt% av hyaluronsyre, 0,4 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3 g av N-hydroksysuksinimid (Sigma), 1 volum% av 3-aminopropyltrimetoksysilan (Sigma) 3) 1 vekt% av hyaluronsyre 25% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers), 0,35 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3 g av N-hydroksysuksinimid (Sigma), 1 volum% av 3-aminopropyltrimetoksysilan (Sigma) 4) 1 vekt% av hyaluronsyre 50% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers), 0,35 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3 g av N-hydroksysuksinimid (Sigma), 1 volum% av 3-aminopropyltrimetoksysilan (Sigma)

Prøvene tørkes ved 60°C i en ovn over natten og vaskes deretter i vann og tørkes med en stråle av komprimert luft. For å kontrollere integriteten av belegget blir prøvene neddykket i 1% løsning av toluidinblått i vann (Aldrich). Dette farger umiddelbart hyaluronsyren og andre polysakkarider med en klar fiolettblå farge. Virkningen av fremgangsmåten blir bestemt ved å gi poeng fra en skala på 0 til 5, hvor 5 tilsvarer en perfekt jevn farging hvilket indikerer integriteten av belegget av hyaluronsyre eller derivater derav og 0 tilsvarer fravær av farging. Prøvene fremstilt ifølge det beskrevne eksempel (identifisert ved nummeret på løsningen som de blir neddykket i) for poeng som følger:

Eksempel 12

Noen prøver fremstilles ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11. Prøvene neddykkes i vann i 20 dager ved romtemperatur, hvoretter fargingstesten gjennomføres. Følgende resultater blir oppnådd:

Eksempel 13

Følgende eksempel tillater bestemmelse av virkningen av den beskrevne fremgangsmåte, det vil si: reaksjonen mellom et polysakkarid og funksjonelle grupper i løsning, i motsetning til den konvensjonelle fremgangsmåte som involverer en reaksjon mellom grupper befestet til overflaten og grupper tilstede i polysakkaridet. Et silikonkateter blir kappet opp for å få 3 cm lange prøver. En serie av prøver blir behandlet ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 11, med løsningene 2, 3 og 4. En andre serie av prøver undergår plasmabehandling og påføring av 3-aminopropyltrimetoksysilan (Sigma), i en 1 volum% vandig løsning. Når de er tørre, blir prøvene plassert i kontakt med følgende løsninger: 2a) 1 vekt% av hyaluronsyre, 0,4 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3 g av N-hydroksysuksinimid (Sigma)

3a) 1 vekt% av hyaluronsyre 25% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers), 0,351 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3 g av N-hydroksysuksinimid (Sigma), 1 volum%

4a) 1 vekt% av hyaluronsyre 50% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers), 0,35 g av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (Sigma), 0,3

g av N-hydroksysuksinimid (Sigma).

Prøvene tørkes ved 60°C i en ovn over natten og vaskes deretter i vann og tørkes med en stråle av komprimert luft. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 14

Petriskåler av polystyren (Corning) av bakteriologisk kvalitet blir behandlet som i eksempel 11 (3 skåler pr behandling), ved anvendelse av løsningene 1, 2 og 3. Skålene fremstilt på denne måte blir fylt med 5 ml av cellesuspensjon (fibroblastceller av mus bindevev, L-929 i Minimum Eagle's Medium, som er blitt tilsatt 10% fetalt kalveserum, de antibiotiske midler penicillin, streptomycin og amfotericin B og L-glutamin-SPA), plassert i inkubator (Forma) ved 37°C og en atmosfære av 5% CO2 og 95% fuktighet. Celle-til-celle-veksel virkningen og polystyrenbasis, behandlet som rapportert i eksempel 11, blir vurdert med regulære mellomrom ved optisk kontrastfasemikroskopi (Leica). Spesielt bestemte vi hvorvidt cellene var i stand til å klebe til forskjellige behandlede underlag og i hvilken utstrekning, ved å anvende som kontroll en petriskål som var blitt behandlet med plasma alene, og som derved hadde maksimum klebeegenskaper. I dette eksempel avledet fra avsnittet av observasjonene gjennomført i et tidsrom på 24 timer, skal et poengtall på 5 referere til maksimum adhesjon, mens poengtallet 0 - angir fravær av adhesjon.

Eksperimentet bekrefter tilstedeværelsen av et hydrofilt sjikt, fast bundet og i stand til å forhindre celleadhesjon. Dette hydrofile sjikt blir fjernet fra prøven behandlet med løsning 1, som ikke tillater dannelse av en kjemisk binding.

Eksempel 15

Et silikonkateter (Silkomed) blir oppdelt i seksjoner av 7 centimeters lengde. Fire prøver blir behandlet under betingelsene beskrevet i eksempel 11, ved anvendelse av løsningene 1, 2, 3 og 4. Glattheten av katetrene i et vandig miljø blir bestemt ved følgende fremgangsmåte: et prøverør blir fylt med Agar (Sigma) ved en konsentrasjon på 0,7%. Prøverøret blir festet i horisontal stilling, og et 7 cm stykke av kateteret plasseres inne i det slik at en ende stikker noe ut av agaren. En vekt blir festet til denne ekstremitet ved hjelp av en tråd som deretter vikles omkring et hjul slik at virkningen av vekten trekker kateteret ut av agaren som det er neddykket i. På grunn av agarens spesielle egenskaper er det således mulig å bestemme glatthetsegenskapene av kateteret i et vandig miljø. Den tid det tar for kateteret å bli trukket ut fra agaren, er omvendt proporsjonal med kateterets glatthet. Testen gir følende resultat:

Eksempel 16

Følgende eksempel verifiserer en fremgangsmåte som anvender virkningen av plasma på sammensetningen av overflaten, og som viser seg å være virksom også på materialer med forskjellig kjemisk sammensetning. Eksempelet viser dessuten at fremgangsmåten også er effektiv når gjenstanden som skal belegges, er sammensatt av flere forskjellige materialer.

3 centimeters lengder av kateter blir fremstilt som prøver. De er sammensatt av a) silikon, b) polyuretan, c) polyvinylklorid, d) gummi lateks. Det anvendes også et objektglass for mikroskopisk observasjon. Prøvene behandles med plasma som beskrevet i eksempel 1, og behandles deretter med løsning 3 fra det samme eksempel, som beskrevet. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 17

En 1% løsning av hyaluronsyre, 75% foresteret med benzylalkohol. (Fidia Advanced Biopolymers) blir fremstilt i dimetylsulfoksid (Aldrich). Det blir tatt en alikvot av løsningen, og til denne blir tilsatt 1,1 volum% av aminoetylaminopropyltrimetoksysilan og 0,5 g av dicykloheksylkarbodiimid (Aldrich). Etter reaksjon i 6 timer, blir to av de tidligere beskrevne prøver av kateter behandlet med plasma som beskrevet i eksempel 14. En av prøvene blir neddykket i en esterløsning, den andre i en esterløsning med aminosilan, og trukket ut langsomt. Prøvene blir plassert i en vakuumovn satt på 60°C og 100 torr og etterlatt der i 48 timer. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 18

En 1% løsning av hyaluronsyre, 50% foresteret med etylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers) i dimetylsulfoksyd (Aldrich) blir fremstilt. Det blir tatt en porsjon av løsningen, og til denne blir tilsatt 1 volum% av aminoetylaminopropylmetoksysilan og 0,5 g av dicykloheksylkarbodiimid (Aldrich). Etter omsetning i 6 timer blir to prøver av foran nevnte kateter behandlet med plasma ifølge betingelsene beskrevet i eksempel 14. En av prøvene blir neddykket i en esteroppløsning, den andre i en løsning av ester og aminosilan, og de blir trukket ut langsomt. Prøvene plasseres i en vakuumovn satt på 60°C og 100 torr og etterlatt der i 48 timer. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 19

Det fremstilles en 1% løsning av hyaluronsyre, 100% foresteret med benzylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers) i dimetylsulfoksyd (Aldrich). Det blir tatt en alikvot av løsningen, og til denne blir tilsatt 1 volum% av aminoetylaminopropyltrimetoksysilan og 0,5 g av karbonyldiimidazol (Aldrich). Etter omsetning i 6 timer blir to prøver av det tidligere beskrevne kateter behandlet med plasma ifølge betingelsene i eksempel 14. En av prøvene blir neddykket i esteroppløsningen, den andre i løsningen av ester og aminosilan, og de blir langsomt trukket ut. Prøvene plasseres i en vakuumovn satt på 60°C og 100 torr og etterlatt der i 48 timer. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 20

Det fremstilles en 1% løsning av hyaluronsyre, 100% foresteret med etylalkohol (Fidia Advanced Biopolymers) i dimetylsulfoksyd (Aldrich). Det blir tatt en alikvot av løsningen, og til denne blir tilsatt 1 volum% av aminoetylaminopropyltrimetoksysilan og 0,5 g av karbonyldiimidazol (Aldrich). Etter omsetning i 6 timer blir to prøver av det tidligere beskrevne kateter behandlet med plasma ifølge betingelsene i eksempel 14. En av prøvene blir neddykket i esterløsningen, den andre i løsningen av ester og aminosilan, og de blir langsomt trukket ut. Prøvene plasseres i en vakuumovn satt på 60°C og 100 torr og etterlatt der i 48 timer. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 21

Det fremstilles en 1% løsning av tverrbundet hyaluronsyre (10% av karboksygruppene involvert i indre forestering - 90% av karboksygruppene omdannet til natriumsalt) i dimetylsulfoksyd (Aldrich). Det blir tatt en alikvot av løsningen, og til denne blir tilsatt 1 volum% av aminoetylaminopropyltrimetoksysilan og 0,5 g av dicykloheksylkarbodiimid (Aldrich). Etter omsetning i 6 timer blir to prøver av det tidligere beskrevne kateter behandlet med plasma ifølge betingelsene i eksempel 4. En av prøvene blir neddykket i esterløsningen, den andre i løsningen av ester og aminosilan, og de blir langsomt trukket ut. Prøvene plasseres i en vakuumovn satt på 60°C og 100 torr og etterlatt der i 48 timer. Fargingstesten gir følgende resultater:

Eksempel 22

Det fremstilles en 1 % løsning av alginsyre (50% av karboksygruppene forestert med benzylalkohol - 50% av karboksygruppene omdannet til salt) i dimetylsulfoksyd (Aldrich). Det blir tatt en porsjon av løsningen, og til denne blir tilsatt 1 volum% av aminoetylaminopropyltrimetoksysilan og 0,5 g av dicykloheksylkarbodiimid (Aldrich). Etter omsetning i 6 timer blir to prøver av det tidligere beskrevne kateter behandlet med plasma ifølge betingelsene i eksempel 14. En av prøvene blir neddykket i esterløsningen, den andre i løsningen av ester og aminosilan, og de blir langsomt trukket ut. Prøvene plasseres i en vakuumovn satt på 60°C og 100 torr og etterlatt der i 48 timer. Fargingstesten gir følgende resultater:

Formålet med den foreliggende oppfinnelsen er derfor å tilveiebringe nye og innovative fremgangsmåter for fremstilling av gjenstander belagt med et tynt sjikt av hyaluronsyre eller derivater derav eller andre halvsyntetiske polymerer kjemisk bundet til substratet. Nevnte fremgangsmåter kan anvendes til fremstilling av materialer og anordninger med forbedrede overflateegenskaper, og spesielt materialer og anordninger karakterisert ved hydrofile overflater. Nærmere bestemt kan fremgangsmåten anvendes til fremstilling av materialer for biomedisinske og kirurgiske applikasjoner, i urologi, ortopedi, otorinolaryngologi, gastroenterologi, oftalmolgi, og det kardiovaskulære området og i diagnostikken. For biomedisinske anvendelser, anordninger for para- eller ekstrakorporal anvendelse, så som katetere, blodposer, føringskanaler, prober, sprøyter, kirurgiske instrumenter, beholdere, filtreringssystemer; for protese- eller kirurgiske formål, eller implantater, er det mulig å belegge kunstige sener, ledd, pinner, hjerteventiler, ben og kardiovaskulære erstatninger, transplantater, venekatetere, intraokulære linser, substitutter for bløtt vev, osv. Eksempler på halvpermanente anordninger som kan belegges er kontaktlinser. Komplekse anordninger som simulerer fysiologiske fremgangsmåter slik som kunstige nyrer, blodoksygenatorer, kunstige hjerter, bukspyttkjertler og levere. Endelig, i diagnostikken, kan man belegge laboratoireutstyr, skåler for celle- eller vevskulturer og/eller regenerering og bærere for aktive prinsipper så som peptider, proteiner og antistoffer.

Hver av publikasjonene og patentdokumentene gjengitt og/eller referert til i den foreliggende beskrivelse er inkorporert heri ved referanse i sin helhet.

Claims (20)

1. Fremgangsmåte for belegging av en overflate av en gjenstand med hyaluronsyre eller et derivat derav, karakterisert ved og omfatter følgende trinn: å omsette hyaluronsyre, eller et derivat derav, med et alkoksysilankoblingsmiddel i en vandig løsning eller et organisk løsningsmiddel, i nærvær av et kondenserings-eller bifunksjonelt middel, eller dannelse av en løsning inneholdende reaksjonsproduktet av hyaluronsyren, eller derivatet derav, og alkoksysilankoblingsmiddelet; å behandle en overflate av en gjenstand med et plasma; å belegge den behandlede overflaten av nevnte gjenstand med løsningen inneholdende reaksjonsproduktet av hyaluronsyren, eller derivatet derav, og alkoksysilankoblingsmiddelet; å fjerne løsningen fra overflaten av nevnte gjenstand mens man lar nevnte reaksjonsprodukt av hyaluronsyren, eller derivatet derav, og alkoksysilankoblingsmiddelet reagere med nevnte overflate av gjenstanden.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at alkoksysilankoblingsmiddelet inneholder sulfhydrylgrupper eller aminogrupper.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at alkoksysilankoblingsmiddelet er gamme-aminopropyl-trietoksysilan eller N-beta-(amino-etyl)-gamma-aminopropyltirmetoksysilan.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å la reaksjonen mellom alkoksysilankoblingsmiddelet og hyaluronsyren, eller derivatet derav, foregå: (i) i en vandig løsning i nærvær av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid som nevnte kondenseringsmiddel; eller (ii) i et organisk løsningsmiddel i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid som nevnte kondenseringsmiddel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved å la reaksjonen mellom alkoksysilankoblingsmiddelet og hyaluronsyren, eller derivatet derav, dessuten foregå i nærvær av N-hydroksysuksinimid, hydroksysulfosuksinimid, hydroksybenzotriazolhydrat, eller en lignende forbindelse som tjener samme funksjon.

6. Fremgangsmåte for belegging av en overflate av en gjenstand med en halvsyntetisk polymer, karakterisert ved å omfatte følgende trinn: å omsette en halvsyntetisk polymer med et alkoksysilankoblingsmiddel i en vandig løsning eller et organisk løsningsmiddel, i nærvær av et kondenserings- eller bifunksjonelt middel, under dannelse av en løsning inneholdende reaksjonsproduktet av den halvsyntetiske polymer og alkoksysilankoblingsmiddelet; å behandle en overflate av en gjenstand med et plasma; å belegge den behandlede overflate av nevnte gjenstand med løsningen inneholdende reaksjonsproduktet av den halvsyntetiske polymer og alkoksysilankoblingsmiddelet; å fjerne løsningen fra overflaten av nevnte gjenstand mens man lar nevnte reaksj onsprodukt av den halvsyntetiske polymer og alkoksysilankoblingsmiddelet reagere med nevnte overflate av gjenstanden.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 6, karakterisert ved at nevnte plasma er et oksygenplasma, et luftplasma, et vannplasma, et alkoholplasma, et acetonplasma, et oksygeninert forbindelseplasma, et nitrogenplasma, et argonplasma, eller en blanding av to eller flere av nevnte plasma.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved å la reaksjonen mellom den halvsyntetiske polymer og alkoksysilankoblingsmiddelet foregå: (i) i en vandig løsning i nærvær av l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)-karbodiimid som nevnte kondenseringsmiddel; eller (ii) i et organisk løsningsmiddel i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid som nevnte kondenseringsmiddel.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved å la reaksjonen mellom den halvsyntetiske polymer og alkoksysilankoblingsmiddelet foregå i nærvær av N-hydroksysuksinimid, hydroksysulfosuksinimid, hydroksybenzotriazolhydrat, eller en lignende forbindelse som tjener samme funksjon.

10. Fremgangsmåte for belegging av overflaten av en gjenstand med hyaluronsyre eller et derivat derav, karakterisert ved å omfatte følgende trinn: å behandle en overflate av en gjenstand med et plasma; å neddykke den behandlede overflate av gjenstanden i en løsning inneholdende polyetylenimin; å omsette den tidligere neddykkede og behandlede overflate av gjenstanden med hyaluronsyre, eller et derivat derav, i nærvær av et karbodiimid og en substans valgt fra gruppen bestående av N-hydroksysuksinimid, hydroksysulfosuksinimid, hydroksybenzotriazolhydrat, og lignende.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 10, karakterisert ved at hyaluronsyrederivatet er: (i) en total eller partiell benzylester av hyaluronsyre; eller (ii) en total eller partiell etyl ester av hyaluronsyre.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at reaksjonen mellom den behandlede overflate og hyaluronsyren, eller derivatet derav, blir oppnådd i: (i) en vandig løsning i nærvær av hydroksysuksinimid og l-etyl-3-(3-dimetylamino-propylkarbodiimid); eller (ii) et organisk løsningsmiddel i nærvær av hydroksysuksinimid og dicykloheksylkarbodiimid.

13. Fremgangsmåte for belegging av overflaten av en gjenstand med en halvsyntetisk polymer, karakterisert ved å omfatte følgende trinn: å behandle en overflate av en gjenstand med et plasma; å neddykke den behandlede overflate av gjenstanden i en løsning inneholdende polyetylenimin; å omsette den tidligere neddykkede og behandlede overflate av gjenstanden med en halvsyntetisk polymer, i nærvær av et karbodiimid og en substans valgt fra gruppen bestående av N-hydroksysuksinimid, hydroksysulfosuksinimid, hydroksybenzotriazolhydrat, og lignende.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 13, karakterisert ved at den halvsyntetiske polymer er valgt fra gruppen bestående av: en ester av en flerverdig alkohol av hyaluronsyre, en indre ester av et surt polysakkarid, en ester av karboksymetylcellulose, en ester av karboksymetylkitin, en ester av karboksymetylamid, en aktiv ester av et karboksylisk polysakkarid, en sulfatert ester av hyaluronsyre, en ester av alginsyre, en ester av kitin, en ester av kitosan, en ester av pektinsyre og en ester av pektininsyre.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at reaksjonen mellom den behandlede overflate og den - halvsyntetiske polymer blir oppnådd i: (i) en vandig løsning i nærvær av hydroksysuksinimid og l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl-karbodiimid); eller (ii) en vandig løsning i nærvær av hydroksysuksinimid og dicykloheksylkarbodiimid.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, 6, 10 eller 13, karakterisert ved at gjenstanden som skal belegges omfatter et materiale som er forlikelig med fysiologiske fluider.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 13, karakterisert ved at gjenstanden som blir belagt, omfatter et polymermateriale, et keramisk materiale eller et metallisk materiale.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 13, karakterisert ved at gjenstanden som blir belagt omfatter metallisk materiale valgt fra gruppen bestående av titan, en titanlegering, stål, og en krom-kobolt-legering.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 1,6, 10 eller 13, karakterisert ved at gjenstanden som blir belagt er valgt fra gruppen bestående av: katetere, blodposer, føringskanaler, prober, sprøyter, kirurgiske instrumenter, beholdere, filtreringssystemer, kunstige sener, ledd, pinner, hjerteventiler, ben og kardiovaskulære erstatninger, implantater, venekatetere, intraokulære linser, kontaktlinser, erstatninger for mykt vev, kunstige nyrer, blodoksygenatorer, kunstige hjerter, bukspyttkjertler og levere.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1,6, 10 eller 13, karakterisert" ved at gjenstanden som blir belagt er valgt fra gruppen bestående av: deler av laboratorieutstyr, skåler for celle- og vevskultur, skåler for celle- og vevsregenerering, og bærere for aktive prinsipper som er peptider, proteiner og antistoffer.