NO307188B1 - Fremgangsmåte til sortering (screening) av en ekspresjons- cDNA-klonbank for oppdagelse av bestemte polynukleotider, fremgangsmåte til fremstilling av en reaktant som kan anvendes i en slik fremgangsmåte og cDNA frembrakt ved fremgangsmåten - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til sortering (screening) av en ekspresjons-cDNA-klonbank for oppdagelse av bestemte polynukleotider som i sin åpne leseramme koder for proteiner hvis biologiske aktivitet som allergener tilsvarer de i naturen forekommende planteallergener, fremgangsmåte til fremstilling av en reaktant som kan anvendes i en slik fremgangsmåte og cDNA frembrakt ved fremgangsmåten.

Minst 10 % av befolkningen lider i forskjellige perioder av livet og i forskjellig utstrekning av pollenallergi. I de perioder hvor der forekommer pollen, klager pasientene over kløe i nesen, irriterte og røde øyne, snue, øyelokkødemer og ofte også hoste og astmabesvær. Først og fremst lette pollen som overføres med vinden, trenger inn i menneskenes øyenslimhinner og åndedrettsorganer, hvor de lokalt blir delvis oppløst og hos pasienter med genetisk disposisjon, såkalte atopikere, fører til sensibilisering og dermed økt produksjon av IgE-antistoffer som er rettet mot forskjellige proteiner fra pollenet. Det dreier seg herunder om pollen fra trær såsom or, hassel og bjerk i månedene februar til april, pollen fra gress og korn i månedene mai, juni og juli og pollen fra ugress såsom burot, kjempe, syre og melde i månedene juli og august. Ved fornyet berøring forårsaker pollenproteinene (allergenene) ved forbindelse med IgE-molekyler på overflaten av mastceller i slimhinner en frigjøring av inflammasjonsstoffer som histamin, leukotriener, kjemotaktiske faktorer, plateaktiverende faktor (PAF) o.l. og fører til et typisk syk-domsbilde (høysnue, pollenastma) som betegnes som allergisk reaksjon av type I.

De ubehagelige til farlige virkninger av en pollenallergi er i flere årtier blitt behandlet med antiinflammatoriske medikamenter og/eller ved hjelp av den såkalte hyposensibilisering. Den siste behandlingsmetode består i tilførsel av sykdoms-utløsende pollenproteiner i langsomt stigende dosering i form av injeksjoner eller hos barn i form av tilførsel av dråper inntil der oppnås en tydelig reduksjon av symptomene (opptreden av en toleranse virkning). På grunn av den oppnådde suksess med denne form for immunterapi gjelder den som basis for enhver behandling av en pollenallergi med utpreget symptomatikk. En forutsetning for et godt resultat av en slik behandling er imidlertid at man kan utføre en diagnostikk omfattende hudtester, serologiske tester og lignende med nøyaktig definerte pollen-ekstrakter, og at behandlingen foretas med de proteiner som utløser pollen-allergiene, i passende konsentrasjoner som må fastlegges nøyaktig. Hittil har pollenproteinene vært oppnådd ved innsamling av pollenet gjennom omfattende fremgangsmåter. Herunder må man være klar over at det innsamlede pollen vanligvis utgjør en blanding av forskjellige plantepollen som deretter må separeres, renses og bearbeides i etterfølgende kompliserte fremgangsmåter. Videre er det med de kjente fremgangsmåter praktisk talt umulig å oppnå større mengder av et rent pollenprotein. De proteiner som frembringer en allergi, er nemlig til stede i de forskjelligste konsentrasjoner på og i pollenet, ofte avhengig av klima, årstid og vær. Ved anvendelse av ikke standardiserte ekstrakter kan man derfor i mange tilfeller ikke ta hensyn til de individuelle forhold for hver pasient, noe som gjenspeiler seg i manglende suksess av behandlingen.

Til grunn for oppfinnelsen ligger den oppgave å skaffe en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art, ved hvis hjelp det er mulig på enkel og spesifikk måte å finne frem til de allergener som skal anvendes for allergiske reaksjoner, resp. de polynukleotider som koder for disse allergener.

Denne oppgave er løst ved foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Ifølge oppfinnelsen blir denne oppgave løst ved at de i ekspresjons-cDNA-klon-banken eksprimerte proteiner blir identifisert ved hjelp av IgE-antistoffer som stammer fra sera fra allergikere. På denne måte griper man målrettet fatt i de proteiner som er ansvarlige for de allergiske reaksjoner, og de polynukleotider som koder for disse proteiner.

Den cDNA-klon som koder for hovedallergenet fra bjerk, Bet v I, som er beskrevet i det følgende, er i stor grad homolog med det gen som frembringer sykdomsresistens hos erter (55 % identitet, 70 % homologi av sekvensen uten mellomrom). Ertegenet er ikke aktivt i sunt vev, men blir eksprimert i stor mengde ved berøring med plantepatogener. Det kan derfor ventes at dette i høy grad konserverte gen kan anvendes til beskyttelse av transgene planter mot plantepatogener.

Metodikk

I) RNA- isolering ble utført fra:

1) Blader

2) Blomsterstender, røtter og kallusvev

3) Pollen av Betula verrucosa

1) RNA- ekstraksion fra blader

5 g bladmateriale oppbevart ved -70°C eller nyplukket og transportert i flytende N2ble malt til støv i en mølle som var avkjølt med N2. Støvet ble overført til en laboratoriemorter, og følgende oppløsninger ble tilsatt: 1) 8 ml tris/SDS(tris (hydroksymetyl)-aminometan/natrium-do decylsulfat)-buffer (0,1 M tris HC1, pH-verdi 8,0, 1 % w/v SDS)

2) 4 ml med fenol bufret M tris HC1, pH-verdi 8,0

3) 4 ml CHCyisoamylalkohol (CI) (24:1)

Det malte vev ble i denne blanding (1-3) rørt ut til en fin suspensjon og overført til Corex-rør, blandet kraftig og sentrifugert i en Sorvallsentrifuge i 5 min ved 6800 g„ og 4°C. Der fant sted en ytterligere PCI(fenol-CHCl3-isoamylalkohol)-ekstraksjon av den vandige fase, en faseseparasjon ved sentrifugering ved 3000 gn i 5 min og en ytterligere CHCl3-ekstraksjon av den vandige fase. 10 volumprosent 2M CH3COONa (NaAc) med en pH-verdi på 5,8 og 250 volumprosent absolutt etanol (EtOH) ble tilsatt den vandige fase, og alle nukleinsyrene ble tillatt å utfelle over natten ved -20°C.

Utfellingen ble frasentrifugert i 10 min i en Beckmann JS13-1-rotor av swingout-typen ved 3000 gn og 4°C. Supernatanten ble kastet, mens pelletten ble vasket med 70 %'s EtOH og tørket i en eksikator. Pelletten ble deretter oppløst i 2 ml H20 og overført til Eppendorfbeholdere. Deretter ble 150 mg fast NaCl pr. ml tilsatt og oppløsningen oppbevart ved 4°C i 5 timer.

Den RNA som var utfelt etter dette tidsrom, ble pellettert ved 4°C og 15 000 gn i en Eppendorfsentrifuge. Pelletten ble vasket med 0,5 ml 2,5 M NaCl, hvoretter RN A-en igjen ble pellettert som angitt ovenfor og vaskeoperasjonen gjentatt. Deretter ble pelletten vasket 3 ganger med 0,5 ml 70 %'s EtOH, tørket og oppløst i 360 ul sterilt vann. Utfellingen av RNA-en fant sted ved tilsetning av 40 ul 2 M NaAc med en pH-verdi på 5,8 og 1 ml absolutt EtOH ved -20°C over natten. RNA-en ble igjen pellettert, og pelletten ble vasket to ganger med 0,5 ml 70 %'s EtOH, tørket og oppløst i 100 p.1 sterilt vann. Oppbevaringen av RNA-en fant sted ved -20°C. 2) Blomsterstender, rotmateriale og kallusvev: CTABfcetyltrimetvlammonium-bromidVmetode 30 g plantemateriale ble malt i flytende N2 og overhelt med et tilsvarende volum kokende ekstraksjonsbuffer (2 % CTAB, 100 mM tris HC1 (pH-verdi 7,8), 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1 % beta-merkaptoetanol). Temperaturen av oppløsningen ble bragt på 50°C i vannbad under omrøring, hvoretter blandingen ble overført til SS-34-sentrifugerør, hvor den ble fortynnet og forsiktig blandet med et tilsvarende volum CHCl3:isoamylalkohol (CI) (24:1). Sentrifugeringen fant sted i 10 min ved 17 400 gn i en Sorvall SS-34-sentrifuge ved værelsetemperatur. Den vandige fase ble overført til et annet rør og et tiendedels volum 10%'s CTAB-oppløsning tilsatt.

(10% CTAB, 0,7 M NaCl). Deretter fant enda en CI-ekstraksjon sted. Et tilsvarende volum utfellingsbuffer (1% CTAB med 50 mM tris, 10 mM EDTA, pH-verdi 8,0) ble tilsatt den hevede vandige fase og blandet godt med denne. Oppløsningen ble hensatt i 30 min ved værelsetemperatur, hvoretter nukleinsyrene ble frasentrifugert i en SS-34-rotor i 5 min ved 3 000 gn. Pelletten ble oppløst i 10 ml 1 M

bufret CsCl-oppløsning (50 mM tris, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH-verdi 8,0). Deretter ble der foretatt en sentrifugering over et bolster av 5,7 M bufret CsCl (2 ml, 50 mM tris, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH-verdi 8,0) i 18-20 timer ved 120 000 gn i en rotor av swingout-typen. RNA-en befant seg i pelletten og ble oppløst og utfelt i sterilt H20 og oppbevart ved -20°C.

3) RNA- isolering fra pollen

500 mg pollen ble malt i en atmosfære av flytende N2i en morter med finmalt glasstøv. Deretter ble 10 ml PCI, 10 ml homogeniseringsbuffer (10 mM tris, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH-verdi 9,0) og 0,5 ml 20 %'s SDS tilsatt. Man fortsatte malingen kontinuerlig inntil den til å begynne med enda frosne blanding ble flytende. Denne blanding ble så overført til et SS-34-sentrifugerør og stilt på is. Morteren ble ettervasket med 5 ml homogeniseringsbuffer og 1%'s SDS. Oppløsningen ble kraftig blandet i 10 min i sentrifugerør under stadig mellom-kjøling på is og deretter sentrifugert i 10 min ved 3 000 gn og 4°C. Deretter fulgte en to gangers PCI- og en engangs CI-ekstraksjon av den vandige fase. Utfelling av nukleinsyrene fant sted ved tilsetning av 10 volumprosent 3 M NaAc, pH-verdi 4,8, og 250 volumprosent absolutt etanol ved -20°C over natten. Etter 10 min sentrifugering ved 12 000 gn og 4°C ble pelletten vasket en gang med 70 %'s EtOH uten at den ble tatt av fra veggen av sentrifugerøret, hvoretter den ble oppløst i en liten mengde H20 og fordelt på Eppendorfbeholdere. En fornyet utfelling fant sted ved tilførsel av 10 volumprosent 3 M NaAc, pH-verdi 4,8, og 250 volumprosent absolutt EtOH.

Anrikning av poly-(A)<+>RNA fant i alle tilfeller (1,2 og 3) sted etter følgende metode: RNA-ene ble frasentrifugert fra utfellingen i 10 min i en Eppendorfsentrifuge ved 15 000 gn og 4°C. Pelletten ble tørket i en eksikator i 10 min og deretter resuspendert i 300 ul sterilt H20 på is.

Oligo-dT-cellulose ble godt suspendert i 0,1 M KOH. Denne suspensjon ble helt opp i en med kvartsull lukket plastsøyle som rommet 1 ml. Søylen ble 3/4 fyllt. Deretter ble søylen vasket med 5 ml 0,1 M KOH og spylt med vann til der ble oppnådd en nøytral pH-verdi. Søylen ble ekvilibrert med 4 ml ladebuffer (0,5 M LiCl, 10 mM tris HC1, pH-verdi 7,5, 1 mM EDTA, 0,1%'s SDS).

RNA-prøven ble innstilt på en konsentrasjon av 0,5 M LiCl ved hjelp av en 5 M LiCl-oppløsning, denaturert ved 60°C i 10 min og deretter raskt avkjølt på tørris. Prøven ble tilført søylen, ettervasket med 1 ml ladebuffer og enda en gang tilført søylen. Deretter ble søylen spylt med 5 ml "middle rinse"-buffer (10 ml tris HC1, pH-verdi 7,5, 1 mM EDTA, 0,15 mM LiCl, 0,1 %'s SDS).

Elueringen av den poly(A)<+->RNA-holdige fraksjon fant sted ved spyling av søylen med 8 porsjoner å 300 ul av en elueringsbuffer (2 mM EDTA, pH-verdi 8,0, 0,1 %'s SDS) som var oppvarmet til 60°C. RNA-en ble utfelt over natten ved tilsetning av 3 M NaAc (pH-verdi 4,8) til en konsentrasjon på 0,3 M og 300 volumprosent absolutt EtOH ved -20°C.

II RNA- karakterisering

Denne fant sted ved

a) påføring av den samlede RNA på en polyakrylamid(6 %)-urea(50 %)-gel og elektroforese under anvendelse av 5S-, 16S- og 23S-RNA-er som sammenlignings-substanser (fig. 1). b) Fastleggelse av den poly(A)<+->RNA-holdige fraksjon etter oligo-dT-søylen fant sted ved påføring av porsjoner på 1 %'s agaroseplater med 0,5 ug etidiumbromid

pr. ml og synliggjøring av flekkene på en UV-transilluminator.

III) c- DNA- svntese

1 ug poly (A)<+->RNA ble anvendt til cDNA-syntesen ved følgende reaksjon:

a) Syntese av den første tråd:

4 ul 5 x buffer for syntese av den første tråd (250 uM tris HC1, pH-verdi 8,3, 250 mM KC1, 50 mM MgCl2, 50 mM ditiotreit)

1 ul 20 mM natriumpyrofosfat

1 ul human-placental RNAse-inhibitor (20 U/ul).

2 ul desoksynukleotidtrifosfat-blanding (dATP, dGTP, dTTP: 10 mM; dCTP: 5 mM)

1 ul oligo-dT-(12-18), 1,6 mg/ml

0,5 ul alfa-<32>P-dCTP (5 uCi)

H20 til 20 ul

Etter blanding fant der sted en tilsetning av 20 U reverstranskriptase og deretter inkubering ved 42°C i 60 min. Målingen av syntesen av den første tråd viste en typisk innbygging av 100 000 cpm pr. |j.g RNA.

b) Syntese av den annen tråd

20 ul reaksjonsblanding av a)

20 ul 5x buffer for syntesen av den annen tråd (100 mM tris HC1,

pH-verdi 7,5, 0,5 M KC1, 25 mM MgCl2, 50 mM (NH4)2S04, 50 mM

ditiotreit)

5 ul alfa-<32>P-dCTP (50 u€i)

0,8 U ribonuklease H fra E. coli

23 U DNA-polymerase I fra E. coli

H2Otill00ul

Blanding og inkubering: 12°C i 60 min, 22°C i 60 min, deretter 70°C i 10 min, fulgt av avkjøling av reaksjonsblandingen på is, tilsetning av 2,0 U T4-DNA-polymerase og inkubering ved 37°C i 10 min. (som ovenfor kunne man her ta ut en porsjon til måling av den radioaktive innbygging i den annen tråd; innbyggingen viste seg å være 90 % av innbyggingen i den første tråd.)

Deretter fulgte en to gangers PCI-ekstraksjon og en en-gangs CI-ekstraksjon av den dobbelttrådede cDNA. Det ble utfelt med det samme volum av 4 M NH4-acetat og 200 volumprosent absolutt EtOH i 20 min ved -70°C. cDNA-en ble frasentrifugert i 10 min ved 15 000 gn og 4°C, hvoretter pelletten ble oppløst i 100 ul sterilt H20 og utfelt på ny som angitt ovenfor. Den igjen avsentrifugerte pellett ble vasket med 500 (il 70 %'s EtOH, sentrifugert i 5 min som ovenfor og oppløst i 20 ul sterilt H20.

IV) cDNA- kloning i lambda gt 11

1) Metvlering av cDNA- en til beskyttelse av interne Eco RIrestriksjonssteder. Reaksjonsblanding:

1 ug cDNA i 10 (il sterilt H20

4 ul 5 x Eco RI-metylasebuffer (250 mM tris HC1, pH-verdi 7,5, 5 mM

EDTA, 25 mM ditriotreit)

2 ul 100 uM S-adenosyl-L-metionin (utgangsoppløsning: 100 mM S-adenosyl-L-metionin i 10 mM CH3COONa-buffer, pH-verdi 5,0.

Fortynning: 1:10"<2>i sterilt H20 kort før bruk).

4 ul sterilt H20

20 U Eco RI-metylase

Inkubering ved 37°C i 60 min, enzyminaktivering ved 70°C i 10 min.

2) Ligering av Eco RI- linkeren: 5'd(pGGAATTCC), 500 ug/ml.

Linkerligering :

20 ul metyleringreaksjonsblanding fra 1)

3 ul 10x ligeringsbuffer (500 mM tris HCl, pH-verdi 7,5, 100 mM MgCl2, 200 mM ditiotreit, 50 mM ATP, 50 ug/ml storfe-serumalbumin)

2 ul Eco RI-linker (0,5 ug/ul)

5 ul sterilt H20

5 U T4 DNA-ligase

Inkubering ved 15°C i 16-20 timer. Ved hjelp av T4 DNA-ligasen ble Eco RI-linkeren ligert til begge ender av cDNA-en.

3) Fordøyelse av den Eco RI- koblede cDNA- en med Eco RI

På denne måte ble der skaffet en eneste Eco RI-"sticky end" ved hver ende av cDNA-en og fjernet overskytende linkermolekyler.

Reaksjon:

- 30 ul reaksjonsblanding fra 2)

- 10 [ il 10x Eco RI-buffer

- 60 ul sterilt H20

- 100 U Eco RI (IM tris HC1, pH-verdi 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1 M MgCLJ.

Inkubering ved 37°C i 5 timer, deretter enzyminaktivering ved 70°C i 10 minutter. 4) Fraskilling av cDNA- en fra overskytende linkermolekyler Før innskytingen av cDNA-en i lambda gt 11 må de overskytende linkermolekyler fraskilles for ikke å interferere med kloningen. Til fraskillingen ble der anvendt kommersielt oppnåelige søyler som ble vasket og ekvilibrert med 6 ml STE-buffer (5,84 g NaCl, 1,21 g tris, 0,37 g EDTA pr. liter, pH-verdi 8,0). 100 ul cDNA fordøyd og koblet med Eco RI ble påført søylen. 200 uTs porsjoner med STE-buffer ble eluert fra søylen og oppfanget hver for seg i Eppendorfbeholdere. Aktiviteten av de enkelte prøver ble tellet (Cerenkov), og de fraksjoner som ga de høyeste telleresultater, ble forenet. Utfellingen av cDNA-en fra disse fraksjoner fant sted ved tilsetning av 10 volumprosent 3 M NaAc og 250 volumprosent absolutt EtOH ved -20°C over natten. Den utfelte cDNA ble frasentrifugert i en Eppendorf-sentrifuge ved 15 000 gn og oppløst i sterilt H20 til en konsentrasjon på 50 ng/ul.

5) Innskvting av den med Eco RI- ender forsynte cDNA i lambda gt 11

Lambda gt 11-DNA-en var allerede utblandet med Eco RI og defosforylisert med alkalisk fosfatase (Clontech RI-lambda gt 11, Kat. nr. 6331-1), og således klar for ligeringsreaksjonen:

- 200 ng cDNA

- 1 |xg lambda gt 11 -armer

- 1 u-g 10x ligeringsbuffer (som under IV, 2)

-H20 til 10 ul

- 2,5 U T4 DNA-ligase

Inkuberingen fant sted ved 14°C over natten.

6) In vitro- pakking av ligeringsblandingen fant sted med GIGAPACK PLUS (Stratagene, Kat. nr. 200211).

Rask opptining av begge ekstrakter (sonisk ekstrakt (SE) fra den induserte "prehead donor"-BHB 2690; Freeze/Thaw-ekstrakt (FTE) fra den induserte "packaging protein donor"-BHB 2688). Hele ligeringssatsen ble tilført den opptinede FTE, og 15 ul SE ble tilført ved hjelp av en pipette og forsiktig blandet ved hjelp av denne. Inkubering i 2 timer ved værelsetemperatur. Deretter fulgte tilsetning av 500 ul fagfortynningsbuffer (500 mg NaCl, 200 mg MgS04, 5 ml 1 M tris HC1, pH-verdi 7,5). Oppbevaring av fagsuspensjonen fant sted ved 4°C.

7) Forberedelse av E. coli Y 1090- vertsceller

E. coli Y 1090 (ATCC nr. 37196 = E. coli delta lac.U.169proA<+>delta lon araD139 strA hflA150 (chr::Tnl0) (pMC9)) ble strøket ut på en LB-amp-plate (1000 ml bestående av 10 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 10 g NaCl, 15 g agar-agar, 100 mg ampicillin, pH-verdi 7,5) og inkubert over natten ved 37°C. Enkeltkolonier ble plukket ut og inkubert i 4 ml LB-amp-medium under tilsetning av 0,4% maltose over natten ved 37°C. Den oppnådde kultur ble frasentrifugert og resuspendert i 1 ml 10 mM MgS04. Disse celler var klare for fagadsorpsjon og kunne oppbevares ved 4°C.

8) Titrering av lambda gt 11- rekombinantene

Der ble fremstilt en fortynningsrekke av fagsuspensjonen (etter omslutting (packaging)) i lOer-skritt. Porsjoner på 100 (il Y 1090-celler i 10 mM MgS04 ble hver blandet med 10 ul fagsuspensjon av tilsvarende fortynning. Foradsorpsjonen av fagpartiklene på vertscellene fant sted i 20 minutter ved værelsetemperatur. Deretter ble der tilsatt:

a) 2 ul ampicillin (25 mg/ml)

b) 10 (il 100 mM IPTG (isopropyl-beta-D-tiogalaktopyranosid oppløst i sterilt H20) c) 10 ul av en 2%'s X-gal-oppløsning (20 mg 5-brom-4-klor-3- indolyl-beta-D-galaktopyranosid i 1 ml dimetylformamid) pr. ml.

d) 4 ml 0,6%'s agarose i H20 (holdt på 47°C i vannbad).

En rask gjennomblanding og uthelling av toppagarosen fant sted på forvarmede

(37°C) LB-amp-plater. Platene ble levnet i 10 minutter ved værelsetemperatur for

stivning av toppagarosen og deretter inkubert ved 43 °C over natten. Den etter-følgende dag fant opptellingen av de hvite plakker og dermed de rekombinante lambda gt 11-fager sted.

V) Ekspresjon av det rekombinante protein og immunosortering

Lambda gt 11-vektoren tillater den kontrollerte ekspresjon av det rekombinante protein i form av et fusjonsprotein med beta-galaktosidase.

1 ^ Utstrvkning av cDNA- banken

Y 1090-vertsceller ble forberedt som beskrevet ovenfor, infisert med fager og strøket ut på LB-amp-plater (diameter 145 mm), slik at der ble oppnådd en tetthet på 20 000 plakker pr. plate. Platene ble inkubert i 3-4 timer ved 43 °C inntil plakkene var synlige.

2) Induksjon av proteinekspresionen

Nitrocellulosefiltret (diameter 132 mm, impregnert i 190 mM IPTG og deretter tørket) ble lagt over platene med plakkene, som deretter ble inkubert ved 37°C i 3 timer (induksjon av ekspresjonen). Deretter ble nitrocellulosemembranene, som også fusjonsproteinet var absorbert på, forsiktig trukket av.

3) Immunosortering

a) Sortering med pasient-IgE

i) Avvasking av agarosepartiklene: nitrocellulosefiltrene ble dekket med 50 ml

GP (50 mM natriumfosfatbuffer, pH-verdi 7,5, 0,5%'s Tween 20, 0,5%'s w/v storfeserumalbumin, 0,05%'s NaN3) og svingt rundt i 5 minutter ved 200 omdr./min. på et rundskakeapparat. Bufferen ble rystet av og operasjonen

gjentatt.

ii) Metting av de frie bindingssteder fant sted med 25 ml GP i minst 30

minutter ved værelsetemperatur under lett svingning.

iii) 1. antistoff

Det utvalgte serum fra en allergiker, hvis IgE-antistoffer viser hovedallergenet fra bjerk (Bet v I), et 17,5 kD protein, ble fortynnet 1:10 i GP. Med denne serumfortynning ble blottene inkubert over natten ved 4°C

under lett svingning.

iv) Vasking av blottene

3 gangers forsiktig vasking av blottene fant sted med hver sin porsjon på 30

ml av GP ved værelsestemperatur, idet blottene ved den siste vaskeoperasjon ble svingt sammen med bufferen i minst 30 minutter. Deretter ble

bufferen helt av.

v) Radioaktivt 2. antistoff

26 ml oppløsning pr. rundfilter bestående av:

2,6 ml 125J-merket anti-human-IgE (Pharmacia Int., 300 000 cpm/ml) 23,4 ml GP (se ovenfor)

234 ul gelatin (100 ul pr. 10 ml GP)

Inkuberingen fant sted over natten ved værelsestemperatur under lett svingning.

vi) Vasking av blottene

Blottene ble vasket 3 ganger med hver sin porsjon av 30 ml GP idet bufferoppløsningen ved den siste vaskeoperasjon igjen ble svingt over

blottene i 30 minutter.

vii) Tørking av blottene og eksponering

Etter tørking av blottene foretok man autoradiografisk påvisning av lambda gt 11-klonene, med det for Bet v I kodende innskudd ved eksponering med en KODAK XR-røntgenfilm i 72 timer ved -70°C.

b) Sortering med det monoklonale antistoff BIP 1

i) Vasking av blottene fant sted med 50 ml TBS (50 mM tris HC1, pH-verdi

7,4, 150 mM NaCl, 0,5%'s Tween 20) i 5 minutter ved 200 omdr./min. på et rundskakeapparat og ved værelsetemperatur. Deretter ble bufferen helt av og

fremgangsmåten gjentatt én gang.

ii) Metting av de frie bindingssteder med 25 ml TBS/PM (=3% w/v tørrmelk-pulver i TBS), i minst 30 minutter ved værelsetemperatur og 200 omdr./min. iii) 1. antistoff 25 ml ufortynnet BIP 1-hybridomkultursupernatant pr. cellulosefilter:

Inkuberingen fant sted ved 4°C over natten under lett svingning.

iv) Vaskingen av blottene fant sted ved værelsetemperatur 3 ganger, hver gang med 30 ml rent TBS. Ved den siste vaskeoperasjon ble blottene svingt minst

30 minutter ved værelsestemperatur.

v) 2. antistoff

Blottene ble inkubert med et anti-mus-IgG-antistoff fra kaniner (Jackson Inc., Md, USA, affinitetsrenset, fortynnet 1:2000 i TBS/PM) i 1 time ved

værelsetemperatur under lett svingning.

vi) Vasking av blottene

Der fant sted en 3 gangers vasking med TBS ved værelsetemperatur, idet

den siste vaskeoperasjon ble utført i 30 minutter under lett svingning.

vii) 3. antistoff

26 ml pr. nitrocellulosefilter:

- 26 ml TBS/PM

- 13 ul<I25>J-merket anti-kanin-Ig fra geit (Kirkegaard & Perry Labs.,

London, GB, 300 000 cpm/ml).

Inkuberingen fant sted ved værelsetemperatur under lett svingning i 1 time.

viii) Vasking og tørking av blottene

Der fulgte en 4 gangers vasking, hver gang med 30 ml TBS (siste vaskeoperasjon ble utført i 30 minutter ved værelsetemperatur og 200 omdr./min. på rundskakeapparatet). Blottene ble tørket og eksponert i 72

timer som beskrevet ovenfor.

Den optiske detektering av de positive kloner, hvis fusjonsprotein er i stand til å binde human IgE (fig. 2) resp. det monoklonale antistoff BIP 1, fant sted ved sverting på røntgenfilmen.

VP Rekloning og analyse av de rekombinante lambda gt 11- fager på DNA- nivå

1) Rekloning

Som følge av de høye plakktettheter måtte der gjennomføres 2 rekloningsskritt til anrikning av de positive kloner. Der ble stanset ut fager fra de positive plakker og fremstilt fagsuspensjoner av disse. Disse ble igjen filtrert for konsentrasjonen av fagene. Ved hjelp av immunosorteringer ble de positive kloner bestemt på ny. Der kunne oppnås en anrikning på opptil 95% (fig. 2).

2) DNA- analvse

a) Fremstilling av et væskelysat (liquid ly sate).

En eneste plakk ble utlutet i 500 ul 10 mM MgS04i minst 2 timer ved 4°C. 100 ul

av dette fageluat ble blandet med 100 ul E. coli Y 1090-celler i 10 mM MgS04og levnet i 20 minutter ved værelsetemperatur for adsorpsjon av fagene på vertscellene. Denne blanding ble overført til 50 ml LB-medium. Bakteriecellene ble hensatt for å vokse ved 32°C inntil en OD 600 på 0,5-0,6. Deretter ble temperaturen av celle-kulturen raskt bragt opp på 42°C i vannbad og holdt på 42°C i ytterligere 20 minutter i et luftbadrysteapparat. Deretter ble kulturen inkubert så lenge ved 37°C at lysen av bakteriecellene var avsluttet. Eventuelt ennå intakte bakterieceller ble lysert ved tilsetning av 10 ul CHC13. Lysatet ble frasentrifugert i 10 minutter ved 10 000 omdr./min. i en SS-34 rotor. Supernatanten som inneholdt fagpartiklene, kunne oppbevares ved 4°C.

Til faglysatet på 50 ml ble 10 ul DNAse (5 mg pr. ml) og 25 ul RNAse (10 mg/ml) tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Fagene ble deretter pelletert i 1,5 time ved 30 000 omdr./min. i en Beckmann SW-27-rotor. Pelleten ble resuspendert i 200 ul 50 mM tris HC1, pH-verdi 8,0. Fenolekstraksjonen fant sted ved tilsetning av det

samme volum bufret fenol. Suspensjonen måtte rystes kraftig i 20 minutter og deretter frasentrifugeres i 2 minutter. Fenolekstraktsjonen måtte gjentas. 200 ul

CHCljble tilsatt den vandige fase, blandet godt og sentrifugert i kort tid. Denne operasjon måtte også gjentas. Ved tilsetning av 20 ul 3 M NaAc og 600 volumprosent absolut EtOH til den vandige fase ble fag-DNA-en utfelt ved værelsetemperatur. Etter 10 minutters sentrifugering ble pelleten vasket med 1 ml 70%'s etanol, deretter tørket og så resuspendert i 200 ul sterilt H20.

b) Restriksjonsanalyse

I ug lambda gt 11-DNA ble fordøyet med Eco RI. Da innskuddsfragmentet ikke

kunne skjæres ut av vektoren, måtte man velge de to restriksjonsgjenkjehnelses-steder som lå nærmest innskuddsstedet: Kpnl og SacI (se lambda gt 11-restriksjonskartet på fig. 3). Derved lyktes det å skjære ut fra vektoren et 2,8 kb stort DNA-fragment (fig. 4A, bane 1; fig. 4B) som i tillegg til innskuddsfragmentet på høyre og venstre side inneholdt 1000 bp opprinnelige lambda-sekvens (fig. 4B). En dobbeltfordøyelse med Kpnl/Eco RI resp. Sacl/Eco RI, viste at faktiskt bare en av de to Eco RI-gjenkjennelsessekvenser var forandret, nærmere bestemt den som ligger nærmest Sacl-kappestedet. På denne måte oppnådde man et 1,75 kbp stort Eco RI-SacI-fragment (fig. 4A, bane 3, markert med dobbeltrombe). Til subkloning i Bluescript-plasmidet anvendte man 2,8 kb Kpnl-SacI-fragmentet (fig. 4A, bane 1, markert med rombe).

VID Fusjonsprotein og westernblot

Til påvisning av den biologiske aktivitet (IgE-bindingskapasitet) av det i lambda gt II fremstilte fusjonsprotein tjente følgende metoder:

1) Fremstilling av den lysogene E. coli Y 1089

Enkeltkolonier av Y 1089 (ATCC nr. 37196 = E. coli delta lac Ul69 proA<+>delta lon araD139 strA hflA 150 (chr::TnlO)(pMC9)) ble podet med 0,4% maltose i 10 ml LB amp-medium og tillatt å vokse over natten ved 37°C. 1 ml av den oppnådde kultur ble overført i 50 ml LB amp-maltosemedium oppvarmet til 37°C og trukket opp til en OD 600 på 0,5. Deretter fant der sted en tilsetning av 1 volumprosent 1 M MgS04til kulturen og en oppdeling i 100 ul's porsjoner. Til disse ble 50 ul av en fagfortynning (1,25 x 10<8>plakkdannende enheter pr ml) tilsatt med pipette. Adsorpsjonen av fagene på Y 1089-cellene fant sted i 20 minutter ved værelsetemperatur. De således infiserte E. coli-celler ble strøket ut på LB amp-plater med en tetthet på ca. 5 celler pr cm<2>. Platene ble inkubert over natten ved 32°C. Enkeltkolonier ble plukket ut og strøket ut på to separate LB amp-plater. En plate ble inkubert ved 32°C og én ved 43°C. Lysogene Y 1089-celler vokste ved 32°C, men ikke ved 43°C.

2) Fremstilling av et proteinekstrakt av de lysogene celler

100 ml LB-medium ble podet med en enkeltkoloni av en rekombinant lysogen E. coli Y 1089. Man lot kulturen vokse til en OD 600 på 0,5 og økte så temperaturen raskt til 42°C. Kulturen ble holdt på 43°C i 20 minutter. Tilsetning av IPTG til en konsentrasjon på 10 mM førte til eksprimering av fusjonsproteinet. Kulturen ble inkubert i 60 minutter ved 37°C, og cellene ble deretter innhøstet ved værelsetemperatur. Cellepelleten ble resuspendert i 1/30 av det opprinnelige kulturvolum i fosfatbuffer (50 mM natriumfosfatbuffer, pH-verdi 7,5) og straks nedfryst i flytende N2. Opptining i et vannbad på 37°C førte til en komplett lyse av de induserte lysogene bakterieceller.

3 ) Polvakrvlamidgelelektroforese ( TAGE1 og immunoblot

Den biologiske aktivitet (IgE-binding) av fusjonsproteinet ble påvist ved hjelp av westernblot/immunoblot (fig. 5A, B). Proteiner (500 (ig samlet proteinekstrakt fra rekombinante lysogene E. coli-celler pr. bane) som var separert ved hjelp av SDS-PAGE (12%'s homogen polyakrylamidgel, 5%'s stabelgel), ble overført til en nitro-cellulosemembran (overføringsbuffer: 25 mM trisHCl, 192 mM glycin, 20%'s metanol, pH-verdi 8,3) i et elektrisk felt på 150 mA i løpet av 4 timer. Nitro-cellulosen ble skåret i strimler, og frie bindingssteder ble mettet i 30 minutter ved værelsetemperatur med følgende buffer: 50 mM natriumfosfat, pH-verdi 7,5, 0,5%'s Tween 20, 0,5%'s BSA, 0,05%'s NaN3.

Nitrocellulosebæreren ble dekket med allergikerserum som var fortynnet i den buffer som svarte til den som ble anvendt til metting av de frie bindingssteder. Til bestemmelse av allergenspesifikk IgE ble allergikerserumet fortynnet 1:4 i denne buffer. Til bestemmelse av det allergenspesifikke monoklonale antistoff (BIP 1) ble vevkultursupernatanter av hybridomceller anvendt ufortynnet.

Nitrocellulosestrimlene ble inkubert med det fortynnede serum eller ufortynnet supernatant over natten ved 4°C ved vuggende bevegelse. De således inkuberte strimler ble så vasket tre ganger i den buffer som ble anvendt til metting av de frie bindingssteder. For bestemmelse av det allergenspesifikke IgE ble strimlene inkubert med<125>J anti-human-IgE i 12 timer ved værelsetemperatur. Dette anti-IgE ble fortynnet 1:4 i den ovenfor angitte buffer, som i tillegg inneholdt 20 mM natriumazid og 0,4% gelatin.

Påvisning av det monoklonale antilegeme BIP 1: Man tilsatte de tilsvarende anti-globulin-reagenser (antimus-IgG fra kaniner) fortynnet 1:3 000 i den ovenfor angitte prøvebuffer. Inkubasjonstiden utgjorde 1 time ved værelsetemperatur. Deretter fant der sted vasking tre ganger i metningsbuffer. Deretter ble nitrocellulosestrimmelen tørket og klebet opp på papir. Mengden av de bundne 125 J-merket antistoffer ble bestemt ved at strimlene ble lagt inn i en KODAK-kassett med forsterkerfolie sammen med en røntgenfilm (Amersham RPN 6). Eksponering fant sted ved -70°C i 76 timer. Fremkallingen ble utført med i handelen tilgjenge-lige fremkallere for røntgenfilmer. De proteinbånd som er markert over de radioaktive antilegemer, ble gjort synlige ved tilsvarende filmsverting (fig. 5A, B).

Vill ) Subklonine av 2. 8 kb- fragmentet Sacl- Kpnl

De to kappesteder som lå nærmest de to Eco RI-kappesteder, nemlig SaCI og Kpnl, ble så valgt for den elektroforetiske isolasjon av innskuddsfragmentet. Avstandene mellom innskudds-(Eco RI)-enden og de to restriksjonsendonukleaser SacI og Kpnl utgjør på Kpnl-siden 1020 basepar og på Sacl-siden 1060 basepar (se fig. 4).

11 Isolering av et DNA- fragment fra en agarosegel

a) I to<g>jennomløp ble følgende fordøyelsesprodukter oppspaltet på 1%'s agarosegeler: 20 jig rekombinant lambda gt 11-DNA (pluss 2,8 kb-innskuddsfragment) i 20 ul H20: 20 ul 10 x buffer (low salt-P: 10 mM tris, pH-verdi 7,5, 10 mM MgCl2, 100 jig BSA pr. ml)

60 U Kpnl

160ulH2O

Totalvolum: 200 (il

Blandingen ble inkubert i 3 timer ved 37°C. For den umiddelbart etterfølgende Sacl-fordøyelse ble NaCl-konsentrasjonen innstilt på 40 mM ved tilsetning av 2 (il 4 M NaCl i H20. Dette tilsvarer tilnærmet det for SacI optimale "Medium Salt Buffer"-miljø. Deretter ble 60 U SacI tilsatt og fordøyelsesproduktet inkubert i ytterligere 3 timer ved 37°C.

Størrelsen på 750 bp av cDNA-fragmentet fremkom fra differansen mellom lengden av det virkelige fragment på 2830 basepar og lengden på 2080 basepar av det Kpnl-SacI-avsnitt som kan beregnes fra lambda gt 11-restriksjonskartet. Det oppnådde fragment ble så for nærmere karakterisering av den klonede cDNA ligert i et egnet flerbruksplasmid, nærmere bestemt Bluescript-plasmid (fig. 6) for sekvensering av sirkulær dobbelttråd- og enkelttråd-DNA.

b) Eluering av fragmentet

DNA-båndene på 2,8 kb-nivået som var godt synlige i UV-lys pga. etidium-bromidinnlemmelsen, ble påført DE81 Whatman-filtre som ved slisser var koblet foran gelfragmentene på anodesiden. Hvert filterstykke ble vasket med 2 x 300 fil "low salt"-vaskebuffer (0,2 M NaCl, 10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-verdi 8,0), og DNA-en ble deretter eluert fra filterstykkene med 2 x 300 ul "high salt"-elueringsbuffer (1 M NaCl, ellers som vaskebufferen). Etter to gangers fenol- og eterekstraksjon av den vandige fase med etterfølgende etanolutfelling over natten ved -20°C ble DNA-en pelletert (15 000 gn i 20 minutter), vasket med 70%'s etanol, igjen pelletert (15 000 gn i 10 minutter) og tørket i vakuum. Den samlede mengde av de eluerte 2,8 kb-fragmenter fra begge geler ble oppløst i tilsammen 10 ul vann og forenet. For kvantitativ bedømmelse ble en porsjon (0,7 (il) påført en 1%'s agarosegel. De oppnådde bånd på 2,8 kb indikerte en samlet mengde på 200-300 ng for begge fragmenter ved en konsentrasjon på 20-30 ug/ml. Derfor ble ligeringen utført i Bluescript som forutsetning for alle ytterligere karakteriseringsskritt.

2) Forberedelse av plasmidet for ligeringen

a) Bluescriptplasmid-subvariantene Ml3 SK<+>og Ml3 SK- (fig. 6) ble fordøyet med Kpnl og SacI.

For hvert 2 |ig pr. 2 ul plasmid (SK<+>resp. SK-) ble der fordøyet med 30 U Kpnl og SacI (som beskrevet under VIII 1 a).

b) Ligering i Ml3 SK<+>og Ml3 SK-.

Den fordøyde plasmid-DNA ble (som beskrevet under VIII 1 b) vasket, pelletert,

tørket og oppløst i porsjoner på 5 (il H20. For ligering i Bluescript-plasmidet ble der til hver 4,8 uTs porsjon av eluert og renset 2,8 kb-fragment ved hjelp av en pipette tilsatt:

5 ul plasmid (SK<+>resp. SK-)

2 ul dATP (100 mM)

2 (il 10x ligasebuffer (500 mM tris, pH-verdi 7,4, 100 mM MgCl2, 10 mM

spermidin)

0,5 ul T4 DNA-ligase (5 U/ul)

6 ul H20

og ligeringssatsen inkubert i 3 timer ved værelsetemperatur.

c) Fremstilling av kompetente celler og transformasjon

For transformasjonen ble der valgt en for Bluescript-plasmidet egnet E. coli-stamme, XLI-Blue (recAI, endAI, gyrA96, thi, hsdR17 (rk-mk<+>) supE44, relAI, lambda-, lac-, (F'proAB, lac IqZ delM15, TN 10)), som tillater en utvelgelse av innskuddsbærende Bluescript-plasmider ved hjelp av beta-galaktosidase-blå/hvit-fargeindikatorsystemet (se IV 8).

E. coli XLI Blue ble gjort "kompetent" med 100 mM CaCl2 ved 0°C: 50 ml av en eksponentiell kultur (XLI Blue i LB-tet (tetracyklin: 20 mg/l)) ble pelletert ved en OD-verdi på 460-600 nm. E. coli-pelleten ble først suspendert i 50 ml iskaldt 100 mM CaCl2 og etter en ytterligere inkubering (20 minutter ved 0°C) frasentrifugert og resuspendert i 5 ml 100 mM CaCl2. Etter 4 timer ved 0°C ble transformasjonen gjennomført som følger: 1/5 av hver av de to under VIII 2 b beskrevne ligasesatser ble inkubert med 100 ul kompetente XLI-Blue-celler og de resterende 4/5 inkubert med 200 ul kompetente celler ved 0°C i 1 time. Ved utsettelse av E. coli-bakteriene for et etterfølgende 2 minutters varmesjokk ved 42°C finner der sted en opptagelse av plasmid-DNA gjennom bakterieveggen.

Etter utstrykning av transformasjonsblandingene på LB tet-plater og 18-24 timers inkubering ved 37°C ble en serie hvite kolonier av SK<+->og SK"-transformanter bragt i forkultur. I et plasmid-"mini"-preparat etter metoden med alkalisk lyse ble plasmid-DNA-en isolert fra disse forkulturer og tilstedeværelsen av 2,8 kb-innskuddsfragmentet så fastslått ved Kpnl/SacI-kontrollfordøyelse. To positive kloner - henholdsvis en SK<+->og en SK'-variant (2,8 SK<+>resp. 2,8 SK') - ble utvalgt for å gi grunnlag for fremstilling av et plasmid-"maksi"-preparat.

d) Plasmid-"maksi"-preparat av 2,8 SK<+>og 2,8 SK"

Plasmidpreparatene etter fremgangsmåten med alkalisk lyse ble fremstilt fra 300

ml XLI-Blue-transformantpodet LB-medium. En separasjon av plasmid-DNA-en fra RNA-en ble foretatt ved hjelp av differensiell polyetenglykol(PEG)-utfelling med etterfølgende fenoleterekstraksjon og isopropanolutfelling.

IX Sekvensering av 2. 8 kb fragmentet med sekvenase

For sekvenseringen ble to innkjøpte lambda gt 11-primere anvendt som utgangspunkt for den enzymatiske syntese av komplementærtrådfragmenter:

1) Et 15 baser langt enkelttrådnukleotid med sekvensen

5'.... GACTCCTGGAGCCCG .... 3',

betegnet av produsenten som lambda gt 11-primer, som på en avstand av 12 baser fra Eco RI-innskuddsstedet slutter seg til den lambda gt 11-arm som vender mot Sacl-kappestedet (fig. 7).

2) Et 15 baser langt enkelttrådnukleotid med sekvensen

5<*>.... GGTAGCCACCGGCGC .... 3',

betegnet som lambda gt 11-reversprimer, som på en avstand på 7 baser fra

Eco RI-kappestedet slutter seg til den lambda gt 11 -arm som vender mot Kpnl-kappestedet (fig. 7).

Dermed var det mulig å sekvensere innskuddsfragmentet komplementært fra begge sider og dermed oppnå den fulle nukleotidsekvens for fragmentet. Den rensede plasmid-DNA på 2,8 SK<+>og 2,8 SK" ble oppløst i 10 ul vann etter pelletering, vasking i 75%'s etanol og repelletering, og en porsjon på 1 ul ble for mengde-bestemmelse påført en gel. Den påviste DNA-konsentrasjon var 1-2 fig pr. ul.

S ekvenseringsprotokoll:

1) Sammenføvingsreaksion

Sammenføyingssats: samlet volum 10 fil

2 ul plasmid-DNA (1-2 ug/ul)

2 fil H20

2 fil sekvenseringsbuffer (200 mM tris, pH-verdi 7,5, 100 mM MgCl2, 250 mM NaCl)

1 ul primer (0,67 pMol/ul)

Sammenføyingsblandingen ble opptatt i et gasskapillarrør som ble tilsmeltet i begge ender. Dette ble behandlet 5 minutter i kokende vann, deretter raskt neddykket i kaldt (-70°C) alkohol, levnet i denne i 5 minutter, deretter bragt opp på 65°C og så langsomt avkjølt til 35°C. Denne prosess bevirker en separering av dobbelttrådene og tilleiring av primeren.

Der ble fremstilt 4 sammenføyingssatser, 2 med primer og 2 med reversprimer.

2) Merkereaksion

For merkereaksjonen ble merkelageroppløsningen såvel for primer- som for reversprimer-sekvenseringen fortynnet 1:2 resp. 1:10. 1:2- og l:10-satsene refererer seg til den relative mengde desoksy(d)nukleotider i blandingen. 1:10-fortynningen ble anvendt for korte trådstykker for bedre oppløsning av begynnelsesekvensene, mens l:2-fortynnelsen ble anvendt for lengre trådstykker.

Merkelageroppløsning: 7,5fiM dGTP

7,5 fiM dCTP

7,5 fiM dTTP

Merkesats:

De 4 sammenføyingssatser ble ført fra kapillarene til reaksjonsbeholdere.

Til hver porsjon å 10 fil sammenføyingsblanding ble

1 fil 0,1 M ditiotreit (DTT)

2 ul dnukleotidfortynning (henholdsvis 1:2 og 1:10 både for primer og

reversprimer)

0,5 [ il<32>P-alfa-dATP (1 mCi/ml)

2 ul sekvenase (fortynnet 1:8 i TE) tilsatt og godt blandet, og de 4 satser ble inkubert ved værelsetemperatur i 5 minutter.

3) Avslutningsreaksion

For hver sats ble 4 reagensrør (A, G, C, T), hvert med 2,5 ul avslutningsblanding (8 uM av hvert didesoksy(dd)-nukleotid) bragt på 37°C. 3,5 ul av den tilsvarende merkereaksjonssats ble ved hjelp av pipette tilsatt hvert av disse reagensrør, noe som førte til en innbygging av ddnukleotidene, og dermed avsluttet tråd-forleng-elsen. Etter 5 minutters inkubasjon ved 37°C ble reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 4 [ il av en stoppoppløsning (98,5% formamid, 0,05% bromfenolblått, 0,05% xylencyanol, 0,5x TE, pH-verdi 8) til hvert reagensrør. Prøvene ble oppbevart ved - 20°C inntil de skulle påføres gelen, og før det ble prøvene oppvarmet i 2 minutter til 75-85°C for tråddenaturering.

4) Sekvenserinesgelen

97,5 ml 6%'s akrylamid(AA)-stamoppløsning

2,5 ml 20x TBE-buffer (1 M tris, pH-verdi 7,5, 1 M borat, 20 mM EDTA) 220 [ il ammoniumpersulfat (APDS), 25%'s i H20

50 tetrametyletendiamin (TEMED)

(6%'s AA-stamoppløsning:

57 g akrylamid

3 g bisakrylamid

481 g urean)

Før uthellingen av gelen ble glassplatene renset tre ganger med H20 og tre ganger med alkohol, og en av platene ble gnidd to ganger (5 ml pr. gang) med silaniser-ingsoppløsning (2%'s diklormetylsilan i kloroform). Gelen polymeriserte over natten ved værelsetemperatur.

Gelen ble 1 time før påføringen av prøven satt under en spenning på 2000 V, for oppnåelse av en temperatur på minst 50°C som er nødvendig for DNA-naturer-ingen. Prøvene ble oppvarmet i 2 minutter til 80°C, og gellommene ble godt utspylt for å sikre fjerning av ureapolymerisater. Hver av satsene med den 1:2-fortynnede dnukleotidmerkeblanding ble separert i 2 firebaners gjennomløp (AGCT). Mellom disse gjennomløp lå et tidsrom svarende til tiden mellom påføringen og utløpet av blåmarkøren pluss en ytterligere time. Etter ytterligere 2 gangers utløp av blåmarkøren ble l:10-fortynningen påført på 4 baner som angitt ovenfor og tillatt å renne inntil blåmarkøren hadde nådd den nedre kant av gelen. Pr. lomme ble 2 ul påført, og spenningen var 1500-2000 V. Etter avsluttet elektroforese ble gelen bragt over på Whatman DEAE-papir, tørket ved 80°C i vakuum og eksponert uten forsterkningsfolie.

51 Analyse av sekvensdata

Den innskuddssekvens som gav seg fra den første sekvenasereaksjonen, var allerede nesten fullstendig med hensyn til lengden, da overlappingen i det midtre parti av innskuddsfragmentet kunne leses fra begge sider (fig. 8). Etter en restriksjonsanalyse av de allerede foreliggende sekvenseringsdata ble enkelte viktige singulære 6-base-kappesteder utvalgt for utførelse av en subkloning av de motsvarende fragmenter med etterfølgende subsekvensering. Dette var nødvendig fordi den foreliggende sekvens fortsatt oppviste uklarheter, motsetninger mellom komplementære trådbiter og mellomrom i begynnelsesområdet for begge innskuddsender. De utvalgte kappesteder var:

1) Bel I: T GATCA

2) Bgl II: A GATCA

3) BamH I: G GATCC

Disse tre steder oppviser det praktiske innbyrdes forhold at de har den samme midtre basefølge GATC og etter restriksjon danner et 4-baseoverheng. Derfor er fragmenter kappet med disse enzymer innbyrdes ligerbare.

6) Verifisering av de foreliggende data

Ved kontrollfordøyelse ble riktigheten av sekvensen av Bgl II- og BamH I-snitt-stedet bekreftet ved gelelektroforese (1% agarose). Både 2,8 SK<+->og 2,8 SK"-fragmentene ble fordøyd med enzymkombinasjonen Kpnl/Bgl II, Eco RI/Bgl II resp. BamH I/Eco RI. De oppnådde fragmenter på ca. 1400 bp, 380 bp resp. 350 bp var kompatible med de båndlengder som ble beregnet fra genkartet for SK-resp. 2,8 kb-fragmentet. Avvik på + 30 basepar var fortsatt mulig på grunn av sekvensens ufullstendighet.

Til bekreftigelse av de oppnådde sekvenseringsdata resp. korrektur av uklarhetene ble så følgende forsøk utført: X. Sekvensering av subfra<g>menter av 2. 8 kb- fragmentet i henhold til Maxam & Gilbert

1} 32 P av subfragmenter fra Bgl H- fordøvelsen

Prinsipp: Ved Bgl II-fordøyelse oppstår to 5'-overhengende ender, 5'..A..GATCT..3'. Disse anvendes av reverstranskriptasen (RT) som utgangspunkt for en<32>P-alfa-dATP-markering fra 5' til 3'. Etterfølgende etterfordøyelse med SacI gir to radioaktivt markerte fragmenter:

1) Et kort Bgl II/SacI-fragment på ca. 1400 bp.

2) Et langt fragment på ca. 4300 bp som går ut fra Bgl II og omfatter restplasmidet.

Bgl II-fordøyelse av 2,8 SK<+>: samlet volum 200 ul: 10 ug DNA ble fordøyd over natten med "high salt"-buffer (10 mM tris, pH-verdi 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 100 ug storfeserumalbumin pr. ml) og 60 U Bgl II ved 37°C. Fordøyelses-produktet ble fenolisert (mettet med 1/4 volum fenol/tris), ekstrahert to ganger med eter og utfelt med isopropanol. Etter pelletering, vasking av pelletene i 70%'s etanol og repelletering ble DNA-en oppløst i 20 ul H20.<32>P-markering av de to Bgl II-ender: samlet volum 50 ul.

- 20 ul DNA (1 ug/ul)

- 5 ul 10x RT-buffer

- 3 ul<32>P-alfa-dATP (1 mCi/ml)

- 5 ul dGTP (10 mM)

- 1 ul BSA (50 mg/ml)

- 2 ul RT (20 U/ul)

- 14 ul H20

Blandingen ble inkubert i 1 time ved 25°C.

Deretter ble der etterfordøyd med SacI. I tillegg ble RT-satsen innstilt på en konsentrasjon av 10 mM tris og 10 mM MgCl2og således gjort Sacl-kompatibel. Fordøyelsesproduktet ble inkubert i 1 time ved 37°C.

Elueringen av de to fragmenter ble gjennomført fra en agarosegel med den fremgangsmåte som er beskrevet under VIII 1. Etter fenolisering og 2 gangers eterekstraksjon av den vandige fase ble hvert av de to eluater delt opp i fem reaksjonsbeholdere med etterfølgende etanolutfelling av de markerte fragmenter ved -70°C.

2) Sekvensering i henhold til Maxam & Gilbert

a) Sekvenseringsprotokoll

DNA-fragmentene (lite fragment ca. 1400 bp, stort fragment ca. 4300 bp) ble

vasket med 70%'s etanol og pelletert (5 pelleter pr. fragment) og sekvensert i henhold til Maxam & Gilbert. Etter avsluttet sekvenseringsoperasjon ble de pelleter som ble oppnådd fra de fem satser (G, G+A, C+T, C, A+C), målt hver for

seg i henhold til Cerenkov og deretter oppløst i forskjellige volumer (dog minst 12 ul) formamidstoppebuffer, slik at hver blanding oppviste like meget radioaktivitet pr. ul. De ferdige prøver ble oppbevart ved -20°C.

b) Sekvensgeler

Ved påføring på polyakrylamid(PAA)/urea-geler med forskjellig AA-konsentrasjon

(henholdsvis 6%'s og 20%'s) ble der oppnådd en bedre oppløsning av begynnelses-sekvensene.

20 %'s gel for 60 ml:

- 1,5 ml 20x TBE-buffer,

- 58,5 ml 20%'s AA-lageroppløsning,

- 90 ul 25%'s APDS (ammoniumperoksodisulfat)

- 40 ul TEMED (N,N,N',N'-tetrametyletendiamin)

20%'s AA-lageroppløsning:

- 197 g AA

- 3 g BisAA

- 481 g urea.

Av hver sats ble 2 ul pr. bane oppvarmet i 2 min til 80°C og deretter påført gelene. På 6%'s-gelen ble prøvene separert i tre fembaners (G, G+A, C+T, C, C+A) gjennomløp ved 2000 V, idet det lille og store fregment ble ført ved siden av hverandre. Mellom gjennomløpene lå begge ganger et tidsrom frem til utløpet av blåmarkøren pluss 1 time. På hver 20%'s gel ble der bare separert i ett fembaners gjennomløp inntil blåmarkøren var nådd til midten av gelen. c) Bedømmelse av de data som fåes ved Maxam & Gilbert-sekvenseringen.

Ved dette annet sekvenseringsforløp kunne mellomrommene på innskuddsendene

kompletteres og en vesentlig del av uklarhetene ryddes av veien.

XI. Videre subkloning som ytterligere kontroll

1) Isolering av et BamHI/ HincII- fragment med subkloning og enkelttrådsekvensering ved sekvenase

Målet var nøyaktig å beskrive endringen av det ikke kappbare Eco RI-kappested. Derfor ble der utvalgt ett enkelt HincII-kappested som ligger på en avstand av 126 baser utenfor dette Eco RI-kappested på den lambda-gtl 1-arm som vender mot Sacl-kappestedet.

a) BamHI/HincII-fordøyelse

i) av 2,8 SK<+>: 3 ug DNA ble fordøyd med henholdsvis 15 U BamHI og

Hindi i "high salt" (HS)-buffer,

ii) av SK<+>og SK': 2 \ ig SK<+>og 2 ug SK' ble hver fordøyd med 10 U BamHI

og HincII i HS-buffer. Inkuberingen fant sted ved 37°C over natten.

Etter gelelektroforese ble BamHI/HincII-fragmentet eluert (se under VIII 1 b). En halvpart av eluatet ble forenet med SK<+->fordøyelsesproduktet og den andre halvpart med SK"-fordøyelsesproduktet, og begge DNA-blandinger ble utfelt med etanol. b) Etter pelletering av de to DNA-utfellinger fant der sted ligering og transformasjon i XLI-Blue (som beskrevet under VIII 2 b og c).

2.) Isolering av et Eco RI/ Bgl II- fragment med subkloning oe enkelttrådsekvensering ved sekvenase

a) Eco RI/Bgl II-fordøyelsesprodukt

i) av 2,8 SK<+>: 12 |xg 2,8 SK<+->DNA ble fordøyd med 60 U Eco og 60 U Bgl

II i HS-buffer.

ii) av SK<+>og SK': 2 ug SK<+>og 2 \ ag SK' ble fordøyd med 10 U BamHI og 10 U Bgl II i HS-buffer. Inkubasjonene ble utført i 3 timer ved 37°C.

Den til i) korresponderende fordøyelse av SK<+>og SK" ble gjennomført med Eco RI og BamHI (Bluescriptplasmidet har intet Bgl II-kappested på polylinkeren). Herunder ble ligerbarheten av de to palindromiske kappesteder utnyttet.

Etter gelelektroforese ble Eco RI/Bgl II-fragmentet eluert (som under VIII 1 b) og utfelt med etanol sammen med Eco RI/BamHI-fordøyde SK<+->og SK'-plasmider (som beskrevet under XI 1 a). b) Ligering og transformering fant sted som beskrevet under VIII 2 b og c.

Verifiserin<g>av de i XI 1 og XI 2 beskrevne transformasjoner

Ved plasmidfremstilling i henhold til metoden med alkalisk lyse ble de subfragmentbærende SK<+->og SK"-Bluescriptplasmider isolert fra transformantene av begge legeringer.

Kontrollfordøyelse av rekombinantene:

1) BamHI/HincII til bekreftelse av BamHI/HincII-innskuddet

2) Eco RI/XbaI til bekreftelse av Eco RI/Bgl II-innskuddet (Bgl II-stedet kunne ikke lenger kappes ved ligering med BamHI-kappestedet.

Begge fordøyelsesprodukter ble separert på agarosegeler. Derved kunne legeringen og transformasjonen av begge subfragmentene i SK<+>og SK" påvises. Samtidig kunne utgangsklonene for enkelttrådsekvenseringen velges ut etter kvalitative og kvantitative kriterier.

3) Enkelttrådsekvensering av Bluescript- DNA- subfragmenter

a) Fremstilling av enkelttråd-DNA ved hjelp av hjelpefager.

Et SK<+->og SK'-subklon ble hvert formert med BamHI/HincII- resp. Eco

RI/BglII-fragmentet i 2,5 ml forkultur (LB/amp/tet) over natten ved 37°C. Fire porsjoner på 2,5 ml LB ble så igjen podet med 50 ul av hver sin av disse fire kulturer. Hver av de fire kulturer fikk etter 30 min ved 37°C tilsatt 10 ul av Bluescript-hjelpefagen R408 med en titer på 5,5 x 10(10) plakkdannende enheter pr. ml og ble ristet 8 timer ved 37°C. Deretter ble 1,2 ml av hver kultur overført i reagensrør og sentrifugert 15 min ved 15.000 gn. Enkelttrådvariantene av de innskuddsbærende plasmider

Eco RI/BamHI SK<+>ligert med Eco RI/Bgl II-fragment

Eco RI/BamHI SK" ligert med Eco RI/Bgl II-fragment

HincII/BamHI SK<+>ligert med HincII/BamHI-fragment

HincII/BamHI SK'ligert med HincII/BamHI-fragment

forelå nå i supernatanten og ble utfelt med 300 (il polyetenglykol (20%'s PEG 6000 i 3,5 M ammonacetat). Etter 15 min ved værelsestemperatur fant pelleteringen og oppløsningen av enkelttråd-DNA-en i 300 (il TE-buffer sted. Etter fenolekstraksjon og to gangers eterekstraksjon av den vandige fase fant der sted etanolutfelling under tilsetning av 50 volumprosent 7,5 M ammonacetat ved -70°C.

Som primer for enkelttrådsekvenseringen med sekvenase ble der innkjøpt to oligonukleotider som motsvarer avsnittene av Bluescript-LacZ-genet på begge sider av polylinkeren.

1) T3-primer: et 17 baser langt oligonukleotid med sekvensen

koblet foran polylinkeren på Sacl-siden av SK LacZ-genet for

primingreaksjonen med SK"-rekombinantene (fig. 9).

2) T7-primer: et 17 baser langt oligonukleotid med sekvensen

forbundet med polylinkeren på Kpnl-siden for primingreaksjonen med SK<+->rekombinantene (fig. 9).

c) Sekvenseringsprotokoll

Enkelttråd-DNA-en ble etter PEG-behandlingen vasket med 70%'s etanol, pelletert

og oppløst i 10 ul H20. Etter gelkontroll av porsjoner (1 (al) ble porsjoner på 7,5 ul DNA med ca. 400-600 ng pr. sats anvendt ved sammenføyingsreaksjonen. dnukleotidfortynningen for merkereaksjonen ble begynt med 1,5 (dnukleotidstam-oppløsning i H20), og markeringen fant sted med<32>P-alfa-dATP. Alle de ytterligere skritt var lik dem som allerede er beskrevet for den første sekvenasesekvensering. Hver avslutningsblanding ble separert i to firebaners (ACGT) gjennomløp med en tidsavstand svarende til to gangers utløp av blåmarkøren. Man anvendte en 6%'s gel.

d) Bedømmelse av de dataer som ble oppnådd etter denne tredje sekvenseringsgj ennomgang

Nukleotidsekvensen av hovedallergenet fra bjerk, Bet v I, som nå er fullstendig som følge av enkelttrådsekvensering ved sekvenase og kontrollert tre ganger, fremgår av fig. 10.

Lengden av cDNA-innskuddsfragmentet utgjør 727 baser (fig. 10).

Basene 1-11, dvs. basene inntil kappestedet for det (T-slettede) Eco RI-sted i posisjonene 11-15, og basene 739-744, dvs. basene fra kappestedet for det (intakte) Eco RI-sted til enden av sekvensen, stammer fra fagen lambda gtl 1.

1) Det kodende fragment

Den for Bet v I kodende sekvens er på fig. 10karakterisert vedbegynnelsen og enden av den med nukleotidsekvensen parallelt forløpende aminosyresekvens. Det kodede protein oppviser en beregnet MG på 17 570. Sekvensen begynner med den basetriplett ATG (posisjon 65-67) som koder for aminosyren (AS) metionin, og ender med basetripletten TAA (posisjon 545-547). Disse to tripletter er av den genetiske kode definert som begynnelses- og endekodoner. Fra ATG til TAA er leserammen åpen.

Den fra denne nuklotidsekvens oppnådde proteinsekvens stemmer overens med AS-sekvensen for proteinet Bet v I, som ble sekvensert til AS 35 fra N-terminus.

Basetripletten fra posisjon 311 til posisjon 319 koder for AS-en Asn-Tyr-Ser. Ved denne AS-triplett dreier det seg om et potensielt glykosyleringssted.

DNA-sekvensen av Bet v I oppviser høy homologi med et ertegen som frembringer sykdomsresistens, slik det allerede er nevnt innledningsvis.

2) Ikke-kodende fragmenter

a) Det ikke-kodende fragment fra base 12 til base 64

Forandringen av Eco RI-stedet ved posisjon 11 ble frembragt ved en sletting av et

tymidin.

Ved de baser GCC, ATC og ATG som ligger umiddelbart foran startkodonet, dreier det seg om en i litteraturen beskrevet signalsekvens, og den i minus-3-stillingen stående A er konstant, mens de andre baser kan variere (Lutcke et al., EMBO J. 6, 43-48, 1987).

b) Det ikke-kodende fragment fra base 548 til 744.

Enden av CDNA-en erkarakterisert veden polyadenylsekvens på 29 A.

Basesekvensen fra posisjon 693 til 696 AAT AAA er beskrevet i litteraturen (M. Birnstiel et al., Cell 41, 349) som en konsensus-signalsekvens som er vesentlig for polyadenyleringen.

Fra de ovenstående data fremgår det:

Den samlede mRNA ble klonet via cDNA. Leserammen er åpen. Det dreier seg ved den ovenfor anførte sekvens om det fullstendige gen for proteinet Bet v I.

Figurbeskrivelse:

Fig. 1.

RNA-karakterisering på 6% polyakrylamid/50% urea-gel. M: markør.

1-5: uavhengige RNA-isoleringer fra hannblomsterstender.

Fig. 2.

Deteksjon av kloner som bærer positive innskudd, ved hjelp av IgE-antistoffer fra sera fra allergikere.

1) Første deteksjonsskritt: 2 positive kloner (pil) trukket videre.

2) Rekloning av de positive kloner.

Fig. 3.

Restriksjonskart for fagen lambda gtll. Pilen (merket med stjerne) markerer innskuddsstedet for cDNA-en.

Fig. 4 A.

1) lambda gtl 1-DNA med innskudd (Kpnl/SacI-fordøyd): 2,8 kbp

Kpnl/SacI-fragment (merket med en enkeltrombe).

2) lambda gtl 1 -DNA uten innskudd (Kpnl/SacI-fordøyd): 2,08 kbp

Kpnl/SacI-fragment (merket med en enkeltrombe).

3) lambda gtl 1-DNA med innskudd (Sacl/Eco RI-fordøyd): 1,06 kbp

Sacl/Eco RI-fragment (merket med dobbeltrombe).

4) lambda gtl 1 -DNA uten innskudd (Sacl/Eco RI-fordøyd): 1,8 kbp

Sacl/Eco RI-fragment (merket med dobbeltrombe).

5) lambda villtype-DNA Pstl-fordøyd.

Fig. 4B.

Utsnitt av lambda gtl 1-genomet med cDNA-innskuddet, de to Eco RI-kappestedene (det som ligger nærmest Sacl-stedet er slettet) og de flankerende Kpnl- og Sacl-kappestedene. Andelen av lac Z-genet er antydet ved punkter.

Fig. 5. Western-/Immunoblot

A) Immunoblot med allergikerserum: Deteksjon med<125>J-anti-IgE.

1) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089

2) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089 infisert med lambda gtl 1 uten innskudd 3) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089 infisert med lambda gtl 1 med innskudd (Klon HB 6) 4) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089 infisert med lambda gtl 1 med innskudd (Klon HB8)

5) Bjerkepollenekstrakt BP VIII D.

B) Immunoblot med monoklonalt antilegeme Bip 1; deteksjon med antimus-IgG (kaniner) ogI2<5>J-antikanin-Ig.

1) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089

2) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089 infisert med lambda gtl 1 uten innskudd 3) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089 infisert med lambda gtl 1 med innskudd (Klon HB 6) 4) Proteinekstrakt av E. coli Y 1089 infisert med lambda gtl 1 med innskudd (Klon HB 8)

5) Bjerkepollenekstrakt BP VIII D.

Fig. 6. Restriksjonskart for plasmidet med betegnelsen pBluescript SK(+/').

Fig. 7. Utsnitt av 2,8 kb-fragmentet for anskueliggjøring av cDNA-innskuddet med lambda gtl 1-sekvenseringsprimere; pilene viser i synteseretningen. Fig. 8. Autoradiografi av sekvenseringsdelen etter den første sekvensering av cDNA-innskuddet ved hjelp av lambda-gt 11-primeren og sekvenase; radioaktiv isotop:32P. Fig. 9. Utsnitt av lacZ-genet i Bluescriptplasmidet. Området fra T7-promotoren til T3-promotoren er vist. Mellom disse ligger polylinkeren. Begynnelsen og slutten av de to primere er antydet ved piler.

Fig. 10. Fremstilling av den endelige sekvens av cDNA-innskuddet.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte til å identifisere et cDNA som koder for et allergent planteprotein, karakterisert vedat den omfatter trinnene; a) å fremstille cDNA-klonbank fra plantevev som er mistenkt for å produsere et allergent protein til hvilket IgE-antistoffer i serum til et allergisk individ er i stand til å bindes; b) å uttrykke nevnte cDNA-klonbank i et bakterielt ekspresjonssystem for å fremstille proteiner; c) å bringe proteinene fremstilt fra nevnte cDNA-klonbank i kontakt med serum til nevnte allergiske individ for å danne IgE-antistoff-proteinkomplekser; d) å bestemme hvilke cDNA-kloner som uttrykker et protein som er i stand til å bindes til nevnte antistoff-proteinkomplekser med anti- IgE-antistoffer.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat allergene proteiner er et pollenprotein

3. Fremgangsmåte til fremstilling av en reaktant som kan anvendes i fremgangsmåten i henhold til krav 1, karakterisert vedat de polynukleotid som koder for det identifiserte protein, innskytes i lambda-gtl 1-farger.

4. Fremgangsmåte til fremstilling av en reaktant som kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert vedat det polynukleotid som koder for det identifiserte protein, innskytes i plasmidet "Bluescript SK (V")".

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3 eller 4, karakterisert vedat den frembragte vektor uttrykkes i en encellet mikroorganisme, spesielt E. coli.

6. cDNA frembragt ved fremgangsmåten i henhold til krav 1,karakterisert vedat de koder for den allergifremkallende epitop av proteinet som er fastlagt av sekvensen, som motsvarer den åpne leserammen av sekvensen gjengitt i fig. 10.

7. cDNA som angitt i krav 5, karakterisert vedat de utviser den i fig. 10 gjengitte sekvens eller delsekvenser av denne.

8. cDNA som angitt i krav 6 eller 7, karakterisert vedat de utviser en sekvens som under stringente betingelser hybridiserer med sekvensen ifølge fig. 10, og som koder for det protein som er identifisert ved fremgangsmåten ifølge krav 1.

9. cDNA som angitt i krav 6 eller 7, karakterisert vedat de utviser en sekvens som er avledet ved degenerasjon av sekvensen i fig. 10, og som koder for det protein som er identifisert ved fremgangsmåten ifølge krav 1.