FI105344B - Menetelmä ilmentämis/ekspressio-cDNA-kloonipankin seulomiseksi polynukleotidien löytämiseksi - Google Patents

Description

105344

Menetelmä ilmentämis/ekspressio-cDNA-kloonipankin seulomiseksi polynukleotidien löytämiseksi

Johdanto 5 Keksintö koskee menetelmää polynukleotidien löytä miseksi, joiden avoin lukukehys koodittaa proteiineja, joiden biologinen aktiivisuus allergeeneina vastaa luonnossa esiintyvien kasviallergeenien aktiivisuutta. Keksintö koskee myös menetelmiä käyttökelpoisten reagenssien 10 valmistamiseksi sekä esiin seulottua polynukleotidia.

Ainakin 10 % väestöstä kärsii elämän eri vaiheissa vaihtelavassa määrässä siitepölyallergiasta. Potilaat valittavat siitepölyn esiintymisaikaan nenän kutiamista, kutiavia ja punoittavia silmiä, nuhaa, silmien turvotusta, 15 usein myös yskää ja astma-oireita. Pääasiassa kevyt, tuulen mukana siirtyvä siitepöly tunkeutuu ihmisen silmien ja hengitysteiden limakalvoille, jossa se paikallisesti osittain liukee ja aikaansaa potilailla, joilla on tähän geneettinen taipumus - niinkutsutuilla yliherkillä henki-20 löillä - herkistymistä ja sen myötä eri siitepölypro-teiineja vastaan kohdistuvien IgE-vasta-aineiden kohonnutta tuotantoa. Tällöin helmikuusta huhtikuuhun on kyseessä siitepöly, joka on peräisin puista kuten esim. lepästä, ·· pähkinäpensaasta, koivusta, touko-, kesä- ja heinäkuussa « f « · 25 siitepöly, joka on peräisin ruohoista ja viljalajeista, • : sekä heinä- ja elokuussa siitepöly, joka on peräisin rik- .···, karuohoista kuten purjo, ratamo, hierakka ja savikka. Kon- • · taktin uusiutuessa siitepölyproteiinit (allergeenit) • · · * aiheuttavat IgE-molekyyleihin sitoutumalla limakalvojen 30 syöttösolupinnoilla tulehdusaineiden kuten histamiinin, • · - ’···1 leukotrieenien, kemotaktisten tekijöiden, verihiutaleita • · · aktivoivan tekijän (PAF) mm. vapautumista, ja aikaansaavat • : tyypillisen sairauskuvan (heinänuha, siitepölyastma) , jota • · · .···. kutsutaan I-tyypin allergiseksi reaktioksi.

* · • · · « 2 2 · · • « · • · · » * » 2 105344

Siitepölyallergian epämiellyttävistä vaarallisiin vaihtelevia vaikutuksia on jo kymmeniä vuosia hoidettu tulehdusvastaisilla lääkkeillä ja/tai käyttäen niinkut-suttua herkkyyden alentamista. Viimemainittu käsittää 5 sairauden laukaisevien siitepölyproteiinien antamista hitaasti kohoavana annostuksena ruiskeen muodossa tai lapsille tippoina, kunnes päästään oireiden selvään lievit-tymiseen (toleranssin muodostuminen) . Tätä muotoa edustava immuuniterapia sopii menestyksensä johdosta perustaksi 10 mihin tahansa selväoireisen siitepölyallergian terapiaan. Edellytyksenä tämän tapaisen hoidon hyvälle onnistumiselle on kuitenkin, että tarkkaan määritellyillä siitepöly-uutteilla voidaan suorittaa ihokokeita, serologisia kokeita ym. käsittävä diagnoosi, ja että hoito siitepölyallergian 15 laukaisevilla proteiineilla suoritetaan käyttäen riittäviä, täsmällisesti määritettyjä pitoisuuksia. Tähän asti siitepölyproteiineja on saatu siten, että siitepölyä kerätään työläillä menetelmillä, jolloin on kohtalaisen selvää, että kerätty siitepöly edustaa yleensä mitä eri-20 laisimpien kasvisiitepölyjen seosta, joka sitten on erotettava, puhdistettava ja jatkotyöstettävä mutkikkailla menetelmillä. Edelleen tällä tunnetulla menetelmällä on lähes mahdotonta saada suurempia määriä puhdasta siitepö-·:. lyproteiinia. Allergiaa aiheuttavia proteiineja esiintyy «4*· .·;·. 25 nimittäin siitepölyssä hyvin vaihtelevina pitoisuuksina, .·. : usein riippuen ilmastosta, vuodenajasta ja säästä. Tällöin • · · l..m käytettäessä ei-standardoituja uutteita useissa tapauksis- • m sa potilaiden yksilöllisiin ominaisuuksiin ei kiinnitetä • · *·’ ' riittävästi huomiota, mikä heijastuu puutteellisina tera- 30 piatuloksina.

• · · ·...· Keksinnön tehtävänä on luoda alussa mainitulle * * * alalle menetelmä, jolla voidaan löytää allergisiin reak- : .·. tioihin osallistuvat allergeenit tai niitä koodittavat * · « polynukleotidit yksinkertaisesti ja spesifisesti. Tälle « · 35 keksinnön mukaiselle menetelmälle polynukleotidien löytä- • 4 · • · · • · · • · 3 105344 miseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaiselle menetelmälle käyttökelpoisen reagenssin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 2 tai 3 esitetään ja keksinnön mu- - 5 kaiselle polynukleotidille on tunnusomaista se, mitä pa tenttivaatimuksessa 5 esitetään.

Keksinnön mukaan ilmennys-cDNA-kloonipankissa ilmennetyt proteiinit tunnistetaan allergisten henkilöiden seerumista saaduilla IgE-vasta-aineilla. Tällöin saadaan 10 kohdistetusti allergisista reaktioista vastuussa olevia proteiineja ja niitä koodittavia polynukleotideja.

cDNA-klooni, joka koodittaa seuraavassa kuvattua koivun pääallergeenia, Bet v I, on suuressa määrin homologinen herneen sairausresistenssin tuottavaan geeniin 15 nähden (55 %:n yhdenmukaisuus, aukoton 70 %:n sekvenssi-homologia) . Hernegeeni ei ole aktiivinen terveessä kudoksessa, mutta se kuitenkin ilmentyy suurina määrinä kosketuksen kasvipatogeeneihin yhteydessä. Tämän vuoksi on odotettavissa, että tätä erittäin säilyvää geeniä voidaan 20 käyttää transgeenisten kasvien suojaamiseksi kasvipatogee-neja vastaan.

Metodiikka I) RNA: ta eristettiin Betula verrucosan • * 1) lehdistä « « « I · 25 2) kukinnoista, juurista ja kalluksesta • · · . 3) siitepölystä.

I ♦ · I..’ 1) RNA:n uuttaminen lehdestä • t **”* 5 g lehtimateriaalia, jota oli säilytetty • · · ’·* * -70 °C:ssa tai joka oli vastapoimittua ja sitten kuljetet- 30 tu nestetypessä, jauhettiin pölyksi typellä jäähdytetyssä ·«· - :.,,Σ myllyssä. Pöly siirrettiin huhmareeseen ja lisättiin seu- ·*": raavat liuokset: • · · ; 1) 8 ml Tris (hydroks ime tyyli) aminometaani (natrium- « · f dodesyylisulfaatti- (Tris/SDS-) puskuria (0,1 M Tris.HCl- • · 35 liuos, pH 8,0, 1 % w/v SDS) • · · • t · • · · • · 4 105344 2) 4 ml fenoliliuosta, joka on puskuroitu 1 M Tris.HCl:llä, pH 8,0 3) 4 ml CHCl3/isoamyylialkoholiliuosta (24:1) = CI- liuos 5 Rikottu kudos sekoitettiin tähän seokseen (1-3) hienojakoiseksi lietteeksi, joka siirrettiin Corex-put-kiin, sekoitettiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin Sor-vall-sentrifugissa 5 minuutin ajan 6800 g:ssä 4 °C:ssa. Tämän jälkeen vesifaasia uutettiin vielä PCI- (fenoli/-10 CHCl3/isoamyylialkoholi-) liuoksella, minkä jälkeen faasit erotettiin sentrifugoimalla 3000 g:ssä 5 minuutin ajan ja vesifaasia uutettiin toistamiseen CHCl3:lla. Siihen lisättiin 10 tilavuus-% 2 M CH3COONa- (NaAc-) liuosta, pH 5,8, ja 250 tilavuus-% vedetöntä etanolia (EtOH), minkä jälkeen 15 kokonaisnukleiinihapot saostettiin yön aikana -20 °C:ssa.

Nukleiinihapot erotettiin sentrifugoimalla 10 minuuttia käyttäen Beckmann JS13-1 "swing out" -roottoria 3000 g:ssä 4 °C:ssa, minkä jälkeen supernatantti heitettiin pois, pelletti pestiin 70-%:isella EtOH:lla ja kui-20 vattiin eksikaattorissa. Sitten pelletti liuotettiin 2 ml:aan vettä ja liuos siirrettiin Eppendorf-putkiin. Sitten lisättiin 150 mg kiinteää NaClrää millilitraa koh-den, minkä jälkeen saatua liuosta pidettiin 4 °C:ssa 5 • t •j. tunnin ajan.

* · · · 25 Tässä ajassa saostunut RNA pelletoitiin 4 °C:ssa % m m : 15 000 g:ssä Eppendorf-sentrifugissa. Pelletti pestiin • · · 0,5 ml:11a 2,5 M NaCl-liuosta, minkä jälkeen RNA pelletoi- • · ·** tiin taas kuten edellä ja pesumenettely toistettiin. Sit- « · « *·* ten pelletti pestiin kolmasti 0,5 ml:lla 70-%:ista 30 EtOH:ta, kuivattiin ja liuotettiin 360 mikrolitraan ste- • · · ·...· riiliä vettä. RNA saostettiin lisäämällä 40 mikrolitraa ··· 2 M NaAc-liuosta, pH 5,8, ja 1 ml vedetöntä EtOH:ta ; X -20 °C:ssa yöksi. RNA pelletoitiin jälleen, pelletti • · · ”!.* pestiin kahdesti 0,5 ml :11a 70-%:ista EtOH: ta, kuivattiin • · • · · • · · • · · • · · « · · · · • » 5 105344 ja liuotettiin 100 mikrolitraan steriiliä vettä. RNArta säilytettiin -20 °C:ssa.

2) Kukinnot, juurimateriaali ja kallus: setyylit-rimetyyliammoniumbromidi- (CTAB-) menetelmä 5 30 g kasvimateriaalia pilkottiin nestetyppeen ja

päälle kaadettiin sama tilavuus kiehuvaa uuttopuskuria (2 % CTAB, 100 mM Tris.HCl, pH 7,8, 20 mM EDTA, 1,4 M

NaCl, 1 % beeta-merkaptoetanolia). Liuoksen lämpötila kohotettiin vesihauteessa samalla sekoittaen 50 °C:ksi, min-10 kä jälkeen seos siirrettiin SS-34-sentrifugiputkiin, lisättiin sama tilavuus CHCl3/isoamyylialkoholia (24:1, CI) ja sekoitettiin varovaisesti. Sen jälkeen sentrifugoi-tiin Sorvali SS-34 -sentrifugissa 10 minuutin ajan 17 400 g:ssä huoneenlämpötilassa. Vesifaasi siirrettiin 15 toiseen putkeen ja lisättiin l/10-tilavuus 10-%:ista CTAB-liuosta (10 % CTAB, 0,7 M NaCl). Sen jälkeen uutettiin vielä CIrllä. Vesifaasi erotettiin, siihen lisättiin sama tilavuus saostuspuskuria (1 % CTAB, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0) ja sekoitettiin hyvin. Liuos jätettiin 30 20 minuutiksi huoneenlämpötilaan, minkä jälkeen nukleiinihapot erotettiin sentrifugoimalla SS-34-roottorissa 5 minuutin ajan 3000 g:ssä. Pelletti liuotettiin 10 ml:aan 1 M

,'\i puskuroitua CsCl-liuosta (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 50 mM

• · ·· NaCl, pH 8,0). Sitten sentrifugoitiin 5,7 M puskuroidulla

25 CsCl-tyynyllä (2 ml, 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH

.·, · 8,0) 18 - 20 tunnin ajan 120 000 g:ssä "swing out" -root- • · · torissa. Saatiin RNA-pelletti, joka liuotettiin steriiliin ”1 veteen, saostettiin ja säilytettiin -20 °C:ssa.

• · ’·'1 3) RNA:n eristäminen siitepölystä 30 500 mg siitepölyä jauhettiin nestetypessä huhma- ··· • 1...· reessä hienoksi käyttäen pilkkovaa lasisauvaa. Sen jälkeen • · · lisättiin välittömästi 10 ml PCI:tä, 10 ml homogenointi- • : .·. puskuria (10 mM Tris, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9,0) ja • · · "···. 0,5 ml 20-%:ista SDS-liuosta. Seosta hienonnettiin ta- » i ' * · 35 saisesti edelleen, kunnes aluksi jäässä ollut seos nes- « • · · • · · • · t 6 105344 teytyi. Tämä seos siirrettiin sitten SS-34-sentrifugiput-keen, joka sijoitettiin jäihin. Huhmare pestiin 5 ml :11a homogenointipuskuria ja l-%:isella SDS-liuoksella. Liuosta sekoitettiin voimakkaasti sentrifugiputkessa samalla aika 5 ajoin jäissä jäähdyttäen 10 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 3000 g:ssä 4 °C:ssa. Sitten vesifaasia uutettiin kahdesti PCI-liuoksella ja kerran CI-liuoksella. Nukleiinihapot saostettiin lisäämällä 10 tilavuus-% 3 M NaAc-liuosta, pH 4,8, ja 250 10 tilavuus-% vedetöntä EtOH:ta -20 °C:ssa yöksi. Seosta sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 12 000 g:ssä 4 °C:ssa, minkä jälkeen pelletti pestiin kerran 70-%:isella EtOHrlla irrottamatta sitä sentrifugiputken seinämistä, liuotettiin pieneen määrään vettä ja jaettiin Eppendorfputkiin. Tämän 15 jälkeen saostettiin toistamiseen lisäämällä 10 tilavuus-% 3 M NaAc-liuosta, pH 4,8, ja 250 tilavuus-% vedetöntä EtOH:ta.

Kaikissa tapauksissa (1, 2 ja 3) poly(A)*-RNA rikastettiin seuraavaa menetelmää käyttäen: 20 RNA sentrifugoitiin eroon 10 minuutissa Eppendorf- sentrifugissa 15 000 g:ssä 4 °C:ssa. Pellettiä kuivattiin eksikaattorissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen se uudel-leenlietettiin jäissä 300 mikrolitraan steriiliä vettä.

• ·

Oligo-dT-selluloosaa lietettiin perusteellisesti * * * * 25 0,1 M KOH-liuokseen. Tämä liete kaadettiin tilavuudeltaan « i « ,·. · 1 ml:n muovikolonniin, joka oli suljettu kvartsivillalla, * · · ja kolonni täytettiin 3/4-tilavuuteen. Sitten kolonni pes- I” tiin 5 ml :11a 0,1 M KOH-liuosta ja huuhdottiin vedellä, * · · ’ kunnes pH oli neutraali. Kolonni tasapainoitettiin

30 4 ml :11a panostuspuskuria (0,5 M LiCl, 10 mM Tris.HCl, pH

7,5, 1 mM EDTA, 0,1 % SDS) .

. RNA-näytteeseen tuotettiin 0,5 M LiCl-pitoisuus, X 5 M LiCl-liuosta lisäämällä minkä jälkeen näyte denaturoi- f i t tiin 60 °C:ssa 10 minuuttia ja jäähdytettiin sitten no- • · 35 peasti kuivajäässä. Näyte siirrettiin kolonniin, jälkipes- • « t « * · t • « a • a · 7 105344 tiin 1 ml :11a panostuspuskuria ja palalutettiin vielä kerran kolonniin. Sitten kolonni huuhdottiin 5 ml :11a "keski -huuhtelu"-puskuria (10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 itiM EDTA, 0,15 mM LiCl, 0,1 % SDS).

5 Poly (A)+-RNA-pitoinen fraktio eluoitiin huuhtomalla kolonnia 8 x 300 mikrolitran erillä 60 °C:seen lämmitettyä eluointipuskuria (2 mM EDTA, pH 8,0, 0,1 % SDS) . RNA saos-tettiin lisäämällä NaAc:tä 3 M liuoksena, pH 4,8, pitoisuuteen 0,3 M, sekä 300 tilavuus-% vedetöntä EtOH:ta 10 -20 °C:ssa yöksi.

II) RNA:ta karakterisoitiin seuraavasti: a) Kokonais-RNA panostettiin polyakryyliamidi (6 %)/urea- (50 %) geeliin ja suoritettiin elektroforeesi-ajo käyttäen 5S-, 16S- ja 23S-RNA:ta verrokkiaineina (ku- 15 vio 1).

b) Oligo-dT-kolonnista saatu poly (A)+-RNA-pitoinen fraktio määritettiin panostamalla näyte-eriä l-%:isille agaroosimaljoille, jossa oli 0,5 mikrogrammaa etidiumbro-midia/ml ja tekemällä täplät näkyviksi UV-läpivalaisulait- 20 teen avulla.

III) cDNA-synteesi ·,'· 1 mikrogramma poly (A)+-RNA: ta käytettiin cDNA- i synteesiin seuraavassa reaktiossa: • · · · a) Ensimmäisen säikeen synteesi: j 25 4 mikrolitraa 5x puskuria ensimmäisen säikeen syn- .···’. teesiin (250 mM Tris.HCl, pH 8,3, 250 mM KCl, 50 mM MgCl2, • · VV. 50 mM ditiotreitoli) • · ♦ • · · * 1 mikrolitra 20 mM natriumpyrofosfaattiliuosta 1 mikrolitra ihmisen istukan RNA-aasi-inhibiittoria ··· '···’ 30 (20 U/mikrolitra) ...* 2 mikrolitraa desoksinukleotiditrifosfaattiseosta : ;·. (dATP, dGTP, dTTP: 10 mM; dCTP: 5 mM) « · · · 1 mikrolitra oligo-dT:tä (12 - 18), 1,6 mg/ml ·_ 0,5 mikrolitraa alfa-32P-dCTP-liuosta (5 mikro-Ci) '•:·· 35 vettä q. s. 20 mikrolitraa • · 105344 8

Sekoituksen jälkeen lisättiin 20 U käänteiskopioi-jaentsyymiä, minkä jälkeen inkuboitiin 42 °C:ssa 60 minuutin ajan. Mitattaessa ensimmäisen säikeen synteesiä saatiin tyypilliseksi siirtymälukemaksi 100 000 tuiket-5 ta/min/mikrogrammaa RNA:ta.

b) Toisen säikeen synteesi: 20 mikrolitraa reaktioseosta kohdasta a)

20 mikrolitraa 5x puskuria 2. säikeen synteesiin (100 mM Tris.HCl, pH 7,5, 0,5 M KCl, 25 mM MgCl2, 50 mM

10 (NH4)2S04, 50 mM ditiotreitoli) 5 mikrolitraa alfa-32P-dCTP: tä (50 mikro-Ci) 0,8 U:ta ribonukleaasi-H:ta Eh. colista 23 U:ta DNA-polymeraasi-I: tä Eh. colista vettä q. s. 100 mikrolitraa 15 Sekoitus ja inkubointi: 12 °C:ssa 60 minuuttia, 22 °C:ssa 60 minuuttia, sen jälkeen 70 °C:ssa 10 minuuttia. Sitten reaktioseos jäähdytettiin jäissä, siihen lisättiin 2,0 U:ta T4-DNA-polymeraasia ja inkuboitiin 37 °C:ssa 10 minuutin ajan (tässä voitiin kuten edellä 20 ottaa näyte radioaktiivisuuden siirtymisen 2. säikeeseen mittaamiseksi; saatu siirtyminen oli 90 % siirtymisestä « · • ensimmäiseen säikeeseen) .

• · ·;· Seuraavaksi kaksisäikeistä cDNA:ta uutettiin kah- • · a a teen kertaan PCI-liuoksella ja kerran CI-liuoksella.

I I I ·* a .·. : 25 Saostaminen suoritettiin lisäämällä sama tilavuus 4 M am- • ia .···. moniumasetaattiliuosta ja 200 tilavuus-% vedetöntä EtOH:ta I!! 20 minuutiksi -70 °C:ssa. cDNA erotettiin sentrifugoimalla a · · • aa 10 minuutin ajan 15 000 g:ssä 4 °C:ssa, minkä jälkeen pelletti liuotettiin 100 mikrolitraan steriiliä vettä ja a a a a a '«.·* 30 saostettiin toistamiseen kuten edellä kuvattu. Jälleen a a a ’...· sentrifugoimalla erotettu pelletti pestiin 500 mikrolit- a j ralla 70-%:ista EtOH:ta, sentrifugoiden 5 minuutin ajan • a · a ,··, kuten edellä, ja liuotettiin 20 mikrolitraan steriiliä • a vettä.

a «aa « a a a a a a • a a a a a a 9 105344 IV) cDNA:n kloonaaminen lambda-gt-ll:een 1) cDNA:n metylointi sisäisten EcoRI-restriktio-keskuksien suojaamiseksi. Reaktioseos: 1 mikrogramma cDNA:ta 10 mikrolitrassa steriiliä 5 vettä 4 mikrolitraa 5x EcoRI-metylaasipuskuria (250 mM Tris.HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 25 mM ditiotreitoli) 2 mikrolitraa 100 mikro-M S-adenosyyli-L-metionii-niliuosta (varastoliuos: 10 mM S-adenosyyli-L-metioniiniä 10 10 mM CHjCOONa-puskurissa, pH 5,0. Laimennus 1:10'2 ste riiliin veteen vähän ennen käyttöä) 4 mikrolitraa steriiliä vettä 20 U:ta EcoRI-metylaasia

Inkuboidaan 37 °C:ssa 60 minuutin ajan, minkä jäl-15 keen entsyymiä inaktivoidaan 70 °C:ssa 10 minuutin ajan.

2) EcoRI-liittäjän: 5'd(pGGAATTCC), 500 mikrogram-maa/ml, ligaatio: liittäjäligatointi: 20 mikrolitraa metylointireaktioseosta kohdasta 1)

3 mikrolitraa lOx ligaatiopuskuria (500 mM 20 Tris.HCl, pH 7,5, 100 mMMgCl2, 200 mM ditiotreitoli, 50 mM

ATP, 50 mikrogrammaa/ml nautaseerumialbumiinia) 2 mikrolitraa EcoRI-liittäjäliuosta (0,5 mikro- · grammaa/mikrolitra) • « · « ·"* 5 mikrolitraa steriiliä vettä • · · : 25 5 U: ta T4-DNA-ligaasia .···. Inkuboidaan 15 °C:ssa 16 - 20 tunnin ajan. T4-DNA- • · ligaasia käyttäen EcoRI-liittäjät ligatoitiin cDNA:n kum- • · » * paankin päähän.

3) EcoRI:een kytketyn cDNA:n pilkkominen EcoRI:llä • · ’···* 30 Tällä toimenpiteellä muodostettiin yksittäinen

«M

EcoRI-"sticky end" cDNA:n kumpaankin päähän ja poistettiin j ylimääräiset liittäjämolekyylit. Reaktio: o r C « 30 mikrolitraa reaktioseosta kohdasta 2) * f 10 mikrolitraa lOx EcoRI-puskuria * · V··' 35 60 mikrolitraa steriiliä vettä « • ia·· « « 10 105344

100 U: ta EcoRI: ta (1 M Tris.HCl, pH 7,5, 0,5 M

NaCl, 0,1 M MgCl2)

Inkuboidaan 37 °C:ssa 5 tunnin ajan, minkä jälkeen entsyymiä inaktivoidaan 70 °C:ssa 10 minuutin ajan.

5 4) cDNA:n erottaminen ylimääräisistä liittäjämole- kyyleistä

Ennen cDNA:n insertoimista lambda-gt-11:een ylimääräiset liittäjämolekyylit oli erotettava, jotteivät ne häiritsisi kloonausta. Erotuksessa käytettiin kaupalli-10 sesti saatavia kolonneja, jotka pestiin ja tasapainotettiin 6 ml:lla STE-puskuria (5,84 g NaCl, 1,21 g Tris, 0,37 g EDTA/litra, pH 8,0). 100 mikrolitraa EcoRI:llä pilkottua, kytkettyä cDNA:ta panostettiin kolonniin. STE-puskurilla kolonnista eluoitiin 200 mikrolitran eriä, 15 jotka kerättiin erikseen Eppendorf-putkiin. Yksittäisten näytteiden aktiivisuudet laskettiin (Cerenkov) ja fraktiot, joista saatiin korkeimmat laskentatulokset, yhdistettiin. Näiden fraktioiden käsittämä cDNA saostettiin lisäämällä 10 tilavuus-% 3 M NaAc-liuosta ja 250 tilavuus-20 % vedetöntä EtOHrta -20 °C:ssa yöksi. Saostettu cDNA ero tettiin sentrifugoimalla 30 minuuttia Eppendorf-sentrifu-gissa 15 000 g:ssä, minkä jälkeen se liuotettiin sterii-·· liin veteen pitoisuudeksi 15 ng/mikrolitra.

f · · · 5) EcoRI-päillä varustetun cDNA: n insertointi : 25 lambda-gt-11: een « «· **

Lambda-gt-11-DNA pilkottiin ensin EcoRI :llä ja de- : i · VV. fosforyloitiin sitten alkalisella fosfataasilla (Clontech • · · RI-lambda-gtll, katalogin:o 6331-1), minkä jälkeen se oli valmis ligaatioreaktioon: • « t 3 0 200 ng cDNA:ta f«· 1 mikrogramma lambda-gt-11-käsivarsia : .·. 1 mikrogramma lOx ligaatiopuskuria (kuten kohdassa - IV, 2)) '·’ vettä q. s. 10 mikrolitraa 35 2,5 U:ta T4-DNA-1 igaasia * * U 105344

Inkuboitiin 14 °C:ssa yön yli.

6) Ligatointiseos pakattiin in vitro käyttäen Giga-pack Plus -pakkausta (Stratagene, katalogin:o 200211).

Kumpikin uute sulatettiin nopeasti (ultraääniuute 5 "sonic extract"= SE, indusoitu "prehead donor" BHB 2690; jäädytys/sulatus-uute = FTE, indusoitu "packaging protein donor" BHB 2688). Ligaatioseos kokonaisuudessaan lisättiin sulatettuun FTE:hen, minkä jälkeen seokseen pipetoitiin 15 mikrolitraa SE:ta ja sekoitettiin varovaisesti pipetillä.

10 Seosta inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen siihen lisättiin 500 mikrolitraa fagilaimennus-puskuria (500 mg NaCl, 200 mg MgS04, 5 ml 1 M Tris.HCl, pH

7,5). Fagisuspensiota säilytettiin 4 °C:ssa.

7) Ej_ coli Y 1090 -isäntäsolujen esivalmistelu 15 L coli -kantaa Y 1090 (ATCC n:o 37196 = Ej. coli delta lac.U.169proA+ delta lon araD139 strA hflA150 (chr::Tnl0) (pMC9)) maljattiin LB-amp-maljalle (1000 ml käsitti 10 g tryptonia, 5 g hiivauutetta, 10 g natriumklo-ridia, 15 g agar-agaria, 100 mg ampisilliiniä, pH 7,5) ja 20 inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Poimittiin yksittäisiä pesäkkeitä ja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa 4 ml:ssa LB-amp-kasvualustaa, johon oli lisätty 0,4 % maltoosia. Solut • · erotettiin sentrifugoimalla yön yli kasvaneesta viljel- »tn mästä ja uudelleenlietettiin 1 ml:aan 10 mM MgS04-liuosta.

· · · 25 Nämä solut olivat valmiita fagiadsorptiossa käytettäviksi • · · I,.* ja niitä voitiin säilyttää 4 °C:ssa.

• · 8) Lambda-gt-ll-yhdistelmäfagien titraaminen • · · ’·* * Fagisuspensiosta valmistettiin (pakkaamisen jäl keen) laimennussarja käyttäen laimennuskerrointa 10. 100 • « « 3 0 mikrolitraan Y 1090 -soluja 10 mM MgS04-liuoksessa sekoi- • · · *>t<: tettiin kulloinkin 10 mikrolitraa fagisuspensiota kysei- ; [·4 senä laimennoksena. Fagipartikkeleita esiadsorboitiin isäntäsoluihin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen lisättiin: 35 a) 2 mikrolitraa ampisilliiniliuosta (25 mg/ml) 105344 12 b) 10 mikrolitraa 100 mM IPTG-liuosta (isopropyyli-beeta-D-tiogalaktopyranosidia liuotettuna steriiliin veteen) c) 10 mikrolitraa 2-%:ista X-gal-liuosta (20 mg 5-5 bromi-4-kloori-3-indolyyli-beeta-D-galaktopyranosidia 1 ml:ssa dimetyyliformamidia) millilitraa kohden d) 4 ml 0,6-%:ista agaroosiliuosta vedessä (pidetään 47 °C:ssa vesihauteessa).

Seos sekoitettiin nopeasti ja esilämmitettyjen 10 (37 °c) LB-amp-maljojen päälle kaadettiin pinta-agaroosi.

Maljat jätettiin 10 minuutiksi huoneenlämpötilaan pinta-agaroosin kiinteyttämiseksi, minkä jälkeen niitä in-kuboitiin 43 °C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä laskettiin valkeina plakkeina yhdistelmä-lambda-gt-ll-fagit.

15 V) Yhdistelmäproteiinien ilmennys ja immuuniseu- lonta

Lambda-gt-11-vektori mahdollistaa yhdistelmäpro-teiinin kontrolloidun ilmennyksen fuusioproteiinina beeta-galaktosidaasin kanssa.

20 1) cDNA-pankin maljoitus Y 1090 -isäntäsoluja valmistettiin kuten edellä on kuvattu, minkä jälkeen niihin tartutettiin fageja ja ne « · maljattiin LB-amp-mal joihin (halkaisija 145 mm) siten, • * * * että tiheydeksi tuli 20 000 plakkia/malja. Maljoja inku- i · < ; 25 boitiin 3-4 tunnin ajan 43 °C:ssa, kunnes plakkeja il- « ·« maantui.

2) Proteiini-ilmennyksen indusointi • ’·' * Plakkimaljojen pinnalle asetettiin nitroselluloo- sasuodattimet (halkaisija 132 mm, kastettu 10 mM IPTG- • · 30 liuokseen ja kuivattu sen . jälkeen) ja inkuboitiin • · · *t#>! 37 °C:ssa 3 tunnin ajan (ilmennyksen indusointi) . Sitten : X nitroselluloosakalvot, joihin siis fuusioproteiini oli • · · adsorboitunut, poistettiin varovaisesti.

w 3) Immuuniseulonta 35 a) Seulonta potilaista saadulla IgE:llä • · 13 105344 i) Agaroosipartikkelien pesu: nitroselluloosasuo- dattimien päälle kaadettiin kerrokseksi 50 ml GP-liuosta (50 mM natriumfosfaattipuskuri, pH 7,5, 0,5 % Tween 20, 0,5 % w/v nautaseerumialbumiinia, 0,05 % NaN3) ja ravis- 5 teltiin 5 minuutin ajan 200 kierr./min kierrosnopeudella kiertoravistelijassa. Puskuri ravistettiin pois ja menettely toistettiin.

ii) Vapaat sitoutumiskeskukset kyllästettiin käsittelemällä 25 ml :11a GP-liuosta vähintään 30 minuutin 10 ajan huoneenlämpötilassa kevyesti ravistellen.

iii) 1. Vasta-aineet

Valittu seerumi oli peräisin eräästä yliherkästä henkilöstä, jonka IgE-vasta-aineet tunnistivat koivun pääallergeenin (Bet v I), joka on 17,5 kD:n proteiini, ja 15 seerumi laimennettiin 1:10 GP-liuokseen; siirtopesäkkeitä inkuboitiin tällä seerumilaimennoksella yön yli 4 °C:ssa kevyesti ravistellen.

iv) Siirtopesäkkeiden pesu

Siirtotäplät pestiin kolmeen kertaan varovaisesti 20 kulloinkin 30 ml :11a GP-liuosta huoneenlämpötilassa, jolloin viimeisen pesun yhteydessä siirtotäpliä heiluteltiin puskurissa vähintään 30 minuutin ajan. Sen jälkeen puskuri • j· kaadettiin pois.

« « · » v) Radioaktiiviset 2. vasta-aineet f · · : 2 5 26 ml liuosta pyöreää suodatinliuskaa kohden, joi- • «· loin liuos koostuu seuraavista: • · • · ’** 2,6 ml 125J-leimattua anti-ihmis-IgE:tä (Pharmacia * · · ’·’1 Int., 300 000 tuiketta/min/ml) 23,4 ml GP-liuosta (ks. ed.) ·· · 30 234 mikrolitraa gelatiiniliuosta (100 mikrolit- ··· raa/10 ml GP-liuosta) : ’·. Inkuboitiin yön yli huoneenlämpötilassa kevyesti • · · ravistellen.

• · *11 vi) Siirtotäplien pesu « · · ·

4M

105344 14

Siirtotäpliä pestiin 3 kertaan 30 ml :11a GP-liuos-ta, jolloin viimeisen pesun yhteydessä puskuriliuosta heiluteltiin jälleen siirtopesäkkeiden päällä 30 minuutin ajan.

5 vii) Siirtopesäkkeiden kuivaaminen ja esiinkehit- täminen

Siirtotäplien kuivaamisen jälkeen osoitettiin au-toradiografisesti lambda-gt-11-kloonit, jotka sisälsivät Bet v I -allergeenia koodittavan insertin, valottamalla 10 Kodak XR -röntgenfilmille 72 tunnin ajan -70 °C:ssa.

b) Seulonta monoklonaalisella vasta-aineella BIP-1 i) Siirtopesäkkeitä pestiin 50 ml :11a TBS-liuosta (50 mM Tris.HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 % Tween 20) 5 15 minuutin ajan 200 kierr./min kierrosnopeudella kiertora-vistelijassa huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen puskuri kaadettiin pois ja menettely toistettiin kerran.

ii) Vapaita sitoutumiskeskuksia kyllästettiin 25 ml :11a TBS/PM-liuosta (= 3 % w/v kuivamaitojauhetta 20 TBS-liuoksessa) vähintään 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 200 kierr./min kierrosnopeudella.

iii) 1. vasta-aineet f « Käytettiin 25 ml laimentamatonta BIP-1-hybridooma- • « e m vil jelmäsupernatanttia nitroselluloosasuodatinta kohden: «Il t!t . 25 inkuboitiin 4 °C:ssa yön yli kevyesti ravistellen.

* · · *./ iv) Siirtotäplät pestiin huoneenlämpötilassa koi- • · ***** meen kertaan 30 ml :11a puhdasta TBS:ää, jolloin viimeisen • · · ’·* * pesun yhteydessä siirtopesäkkeitä ravisteltiin liuoksessa vähintään 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

• · · 3 0 v) 2. vasta-aineet *>##i Siirtopesäkkeitä inkuboitiin kaniinin anti-hiiri- • ]·. IgG-vasta-aineella (Jackson Inc., Md, USA, affiniteetti- * · · ”!.* puhdistettu, laimennettu suhteessa 1:2000 TBS/PM-liuok- "* seen) tunnin ajan huoneenlämpötilassa kevyesti ravistel- \i!: 35 Ien.

V

« · 15 105344 vi) Siirtopesäkkeiden pesu

Siirtopesäkkeet pestiin 3 kertaan TBS-liuoksella huoneenlämpötilassa, jolloin viimeisen pesun yhteydessä siirtopesäkkeitä ravisteltiin kevyesti liuoksessa 30 mi-5 nuutin ajan.

vii) 3. vasta-aineet 26 ml nitroselluloosasuodatinta kohden 26 ml TBS/PM-liuosta 13 mikrolitraa 125J-leimattua vuohen antikani-Ig:ta 10 (Kirkegaard & Perry Labs., Lontoo, GB, 300 000 tuiket-ta/min/ml).

Inkuboitiin huoneenlämpötilassa kevyesti ravistellen tunnin ajan.

viii) Siirtopesäkkeiden pesu ja kuivaus 15 Siirtotäplät pestiin 4 kertaan kulloinkin 30 ml :11a TBS-liuosta (viimeinen pesuvaihe 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, 200 kierr./min kiertoravistelijassa). Täplät kuivattiin ja niitä valotettiin 72 tunnin ajan kuten edellä kuvattu.

20 Positiiviset kloonit, joiden sisältämä fuusiopro- teiini kykenee sitoutumaan humaani-IgE:hen (kuvio 2) tai monoklonaaliseen vasta-aineeseen BIP-1, todettiin opti- I f sesti röntgenfilmin mustumisena.

t « · · VI) Yhdistelmä-lambda-gt-ll-fagien uudelleenkloo- • · · t'# . 2 5 naus ja analyysi DNA-tasolla • « « I..* 1) Uudelleenkloonaus • ·

Korkeiden plakkitiheyksien johdosta jouduttiin • · · ’·* * suorittamaan 2 uudelleenkloonausvaihetta positiivisten kloonien rikastamiseksi. Positiivisista plakeista valmis- «·· ·...· 30 tettiin fagistansseja ja niistä fagisuspensioita. Näistä · · Γ,..: titrattiin edelleen fagipitoisuus. Immuuniseulontaa käyt- : I*. täen määritettiin toistamiseen positiiviset kloonit. Voi- • · · -"·] tiin päästä aina 95 %:n rikastumiseen (kuvio 2) .

2) DNA-analyysi 35 a) "Nestelysaatin" valmistus m 105344 16

Yksittäistä plakkia uutettiin 500 mikrolitrassa 10 mM MgS04-liuosta vähintään 2 tunnin ajan 4 °C:ssa. 100 mikrolitraan tätä fagieluaattia sekoitettiin 100 mikro-litraa Eh. coli Y 1090 -soluja 10 mM MgS04-liuoksessa, minkä 5 jälkeen seos jätettiin 20 minuutiksi huoneenlämpötilaan fagien adsorboimiseksi isäntäsoluihin. Tämä seos siirrettiin 50 ml:aan LB-kasvualustaa. Bakteerisolujen annettiin kasvaa 32 °C:ssa OD600-arvoon (optisen tiheyden arvoon 600 nm:n aallonpituudella) 0,5 - 0,6. Sitten soluviljelmän 10 lämpötila nostettiin vesihauteessa nopeasti 42 °C:seen ja sitä pidettiin edelleen 20 minuutin ajan ilma-hauderavistelijassa 42 °C:ssa. Sen jälkeen viljelmää in-kuboitiin 37 °C:ssa, kunnes bakteerisolujen lyysi oli päättynyt. Mahdollisesti vielä ehyisiin bakteerisoluihin 15 tuotettiin lyysi lisäämällä 10 mikrolitraa CHCl3:ea. Ly-saatti erotettiin sentrifugoimalla 10 minuuttia 10 000 kierr./min kierrosnopeudella SS-34-roottorissa. Fagipar-tikkelit sisältävää supernatanttia voitiin säilyttää 4 °C:ssa.

20 50 ml .-aan fagilysaattia lisättiin 10 mikrolitraa DNA-aasi-liuosta (5 mg/ml) ja 25 mikrolitraa RNA-aasi- /',· liuosta (10 mg/ml) ja inkuboitiin 37 °C:ssa tunnin ajan.

< ·

Sitten fageja pelletoitiin 1,5 tunnin ajan 30 000

Mil kierr./min kierrosnopeudella Beckmann SW-27 -roottorissa.

* * *

,·, ; 25 Pelletti uudelleenlietettiin 200 mikrolitraan 50 mM

f M

I..' Tris.HCl-liuosta, pH 8,0. Fenoliuutto suoritettiin lisää- • · ·*; mällä sama tilavuus puskuroitua fenoliliuosta. Suspensiota • · · *·* * oli ravistettava 20 minuutin ajan voimakkaasti, minkä jäl keen sitä sentrifugoitiin 2 minuutin ajan. Fenoliuutto • · · ·...· 30 jouduttiin toistamaan. Vesifaasiin lisättiin 200 mikro- t · · ’i(i! litraa CHCl3:ea, sekoitettiin hyvin ja sentrifugoitiin : ]·. pikaisesti. Myös tämä menettely jouduttiin toistamaan.

f · ·

Fagi-DNA saostettiin huoneenlämpötilassa lisäämällä vesi- it faasiin 20 mikrolitraa 3 M NaAc-liuosta ja 600 tilavuus-% 35 vedetöntä EtOH:ta. 10 minuutin sentrifugoinnin jälkeen • · 105344 pelletti pestiin 1 ml :11a 70-%:ista EtOH:ta, kuivattiin sitten ja uudelleenlietettiin 200 mikrolitraan steriiliä vettä.

b) Restriktioanalyysi 5 1 mikrogramma lambda-gt-ll-DNA:ta pilkottiin

EcoRI:llä. Koska inserttiä ei saatu leikatuksi irti vektorista, oli valittava kaksi insertointikohtaa lähinnä sijaitsevaa restriktiotunnistuskeskusta: Kpnl ja Sacl (katso lambda-gt-11:n restriktiokartta, kuvio 3). Täten 10 vektorista onnistuttiin leikkaamaan 2,8 ke: n suuruinen DNA-fragmentti (kuvio 4A, nauha 1; kuvio 4B), joka inser-tin lisäksi sisälsi sekä sen oikealla että vasemmalla puolella 1000 ep:tä alkuperäistä lambdasekvenssiä (kuvio 4B). Kaksoispilkkominen Kpnl/EcoRI:llä tai SacI/EcoRI:llä 15 osoitti, että tosiasiallisesti vain toinen kahdesta EcoRI-tunnistussekvenssistä oli muuttunut: se, joka oli lähempänä Sacl-pilkkomiskohtaa. Näin saatiin 1,75 kep:n suuruinen EcoRI-Sacl-fragmentti (kuvio 4A, nauha vyöhykkeellä 3, merkitty kaksoisneliöllä). Alakloonauksessa Bluescript-20 plasmidiin käytettiin 2,8 ke:n Kpnl-Sacl-fragmenttia (kuvio 4A, nauha vyöhykkeellä 1, merkitty neliöllä).

VII) Fuusioproteiini ja Western blot -määritys • · • j· Lambda-gt-11:een valmistetun fuusioproteiinin bio-

MM

logisen aktiivisuuden (IgE-sitoutumiskapasiteetin) osoit- • · · .·. ; 2 5 tamiseksi käytettiin seuraavia menetelmiä: • · t I./ 1) Lysogeenisen EL. coli Y 1089 -kannan valmistus "* Yksittäispesäkkeitä kannasta Y 1089 (ATCC n:o 37196 • ·

*·* = EL. coli delta lac U169 proA+ delta lon araD139 strA hflA

150 (chr::Tnl0)(pMC9)) siirrostettiin 10 ml:aan LB-amp- • · · ·...· 30 kasvualustaa, joka sisälsi 0,4 % maltoosia, ja pesäkkeet ·*· *...! jätettiin kasvamaan yöksi 37 °C:seen. 1 ml tätä yön yli « : .·, kasvanutta viljelmää siirrettiin 50 ml:aan 37 °C:seen esi- f · · /··[ lämmitettyä LB-amp-maltoosikasvualustaa ja kasvatettiin • · OD600-lukemaan 0,5. Sen jälkeen viljelmään lisättiin 1 tila-35 vuus-% 1 M MgS04-liuosta ja se jaettiin 100 mikrolitran « 14««· « · 1β 105344 eriin. Sitten mukaan pipetoitiin 50 mikrolitraa fagilai-mennosta (1,25 x 108 plakin muodostavaa yksikköä/ml). Fa-geja adsorboitiin Y 1089 -soluihin 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Näin tartutetut EL. coli -solut maljoi-5 tettiin LB-amp-maljoihin noin 5 solun/cm2: lie tiheydeksi.

Maljoja inkuboitiin yön yli 32 °C:ssa. Yksittäispesäkkeitä / noukittiin talteen ja ne maljoitettiin 2 erilliseen LB-amp-mal jaan. Yhtä maljaa inkuboitiin 32 °C:ssa ja toista 43 °C:ssa. Lysogeeniset Y 1089 -solut kasvoivat 32 °C:ssa 10 mutta eivät 43 °C:ssa.

2) Proteiiniuutteen valmistus lysogeenisista soluista 100 ml:aan LB-kasvualustaa siirrostettiin lysogee-nisen EL. coli yhdistelmäkannan Y 1089 yksittäinen pesäke.

15 Viljelmän annettiin kasvaa OD600-lukemaan 0,5, minkä jälkeen lämpötila nostettiin nopeasti 42 °C:seen. Viljelmää pidettiin 20 minuutin ajan 42 °C:ssa. IPTG:n lisääminen pitoisuuteen 10 mM johti fuusioproteiinin ilmentymiseen. Viljelmää inkuboitiin 60 minuutin ajan 37 °C:ssa, minkä 20 jälkeen solut otettiin huoneenlämpötilassa talteen. Solu-pelletti uudelleenlietettiin fosfaattipuskuriin (50 mM ,*.· natriumfosfaattipuskuri, pH 7,5) tilavuuteen, joka oli t « ... 1/3 0 alkuperäisestä viljelmätilavuudesta, minkä jälkeen • » · · liete jäädytettiin välittömästi nestetypessä. Sulatus • » · ,·, : 25 37 °C:ssa vesihauteessa johti indusoitujen lysogeenisten « 9 · bakteerisolujen täydelliseen lyysiin.

3) Polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) ja 9 9· ’·* ’ immuunisiirrostusmääritys

Fuusioproteiinin biologinen aktiivisuus (IgE-si- • · · ·...· 30 toutuminen) määritettiin Western blot -/immuunisiirros- 9 · 9 *,,,! tusmäärityksellä (kuvio 5A, B) . Proteiinit (500 mikrogram- 9 : ,·. maa kokonaisproteiiniuutetta lysogeenisista EL. coli -yh- • 9 9 [V distelmäsoluista vyöhykettä kohden) erotettiin SDS-PAGE:n 9 "* avulla (12-%:inen homogeeninen polyakryyliamidigeeli, 5- 9 35 %:inen panostusgeeli) , minkä jälkeen erotustuotteita siir- 9 · · · 9 9 9 19 105344 rostettiin sähkökentässä 150 mA:n virralla 4 tunnin ajan nitroselluloosakalvolle (siirtopuskuri: 25 mM Tris.HCl, 192 mM glysiini, 20 % metanoli, pH 8,3) . Nitroselluloosa leikeltiin liuskoiksi ja vapaita sitoutumiskeskuksia kyl-5 lästettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa seuraa-valla puskurilla: 50 mM natriumfosfaatti, pH 7,5, 0,5 %

Tween 20, 0,5 % BSA, 0,05 % NaN3.

Nitroselluloosakantaja päällystettiin allergisesta henkilöstä saadulla seerumilla, joka oli laimennettu pus-10 kuriin, joka vastasi vapaiden sitoutumiskeskuksien kyllästyksessä käytettyä puskuria. Allergeenispesifisen IgE:n määrittämiseksi allergiaseerumia laimennettiin tähän puskuriin 1:4, tällöin allergeenispesifisen monoklonaalisen vasta-aineen (BIP-1) määrityksessä käytettiin hybridooma-15 soluista saatuja kudosviljelmäsupernatantteja laimentamat-tornina.

Nitroselluloosaliuskoja inkuboitiin laimennetulla seerumilla tai laimentamattomalla supernatantilla yön yli 4 °C:ssa kiertoliikkeessä ravistellen. Seuraavaksi näin 20 inkuboidut liuskat pestiin kolmasti vapaiden sitoutumiskeskuksien kyllästämiseksi käytetyllä puskurilla. Aller-geenispesifisen IgE:n määrittämiseksi liuskoja inkuboitiin

( I

12 tunnin ajan huoneenlämpötilassa 125J-leimatulla I « t · ihmisvastaisella IgErllä. Tämä anti-IgE laimennettiin • · « . 25 edellä mainittuun puskuriin 1:4, joka sisälsi lisäksi pi- • ·« toisuuden 20 mM natriumatsidia ja 0,4 % gelatiinia.

• · ’···* Monoklonaalisen vasta-aineen BIP-1 osoittaminen: ··· • · · vastaavia antiglobuliinireagensseja (kaniinin anti-hiiri IgG) lisättiin suhteessa 1:3000 laimennettuna edellä mai-

• M

30 nittuun näytepuskuriin. Inkubointi kesti 1 tunnin huoneen-lämpötilassa, minkä jälkeen pestiin kolmeen kertaan kyl-: lästyspuskurilla. Sitten nitroselluloosaliuskät kuivattiin t · "!/ ja liimattiin paperille. Sitoutuneen 125J-leimatun vasta-ai- i · '*,· neen määrä määritettiin sijoittamalla liuskat, röntgenfil- 35 min (Amersham RPN 6) kanssa vahvistinsuotimen käsittävään « · 105344 20

Kodak-kasettiin. Valotus kesti 76 tuntia -70 °C:ssa. Kehityksessä käytettiin kaupallisesti saatavia rontgen-filmikehitteitä. Radioaktiivisella vasta-aineella leimatut proteiininauhat näkyivät filmin vastaavana mustumisena 5 (kuvio 5A, B).

VIII) 2,8 ke:n Sad-Kpnl-fragmentin alakloonaus Seuraavassa inserttifragmentin elektroforeettista eristystä silmälläpitäen valittiin molempia EcoRI-pilkko-miskohtia lähinnä sijaitsevat pilkkomiskeskukset, nimit-10 täin Sacl ja Kpnl. Välimatkat insertin (EcoRI-) päästä restriktioendonukleaasi(keskuksi)in Sacl ja Kpnl olivat Kpnl-keskuksen osalta 1020 ja Sacl-keskuksen osalta 1060 emäsparia (katso kuvio 4).

1) DNA-fragmentin eristys agaroosigeelistä 15 a) Kahdessa vaiheessa l-%:isissä agaroosigeeleissä erotettiin seuraavat pilkkomisseokset: kulloinkin 20 mikrogrammaa yhdistelmä-lambda-gt-11-DNArta (+ 2,8 ke:n insertti) 20 mikrolitrassa vettä 20 mikrolitraa lOx puskuria ("alhaisen suolapitoi-20 suuden P.": 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mikro- grammaa/ml BSA:ta) /.J 60 U:ta Kpnl:tä i t 160 mikrolitraa vettä kokonaistilavuus: 200 mikrolitraa i i «

I I I

. 25 Seosta inkuboitiin 3 tunnin ajan 37 °C:ssa. Välit- * # · * tomästi tämän jälkeen suoritettavaa Sacl-pilkkomista sil- • *···' mälläpitäen seoksen NaCl-pitoisuus säädettiin 40 millimo- V * laariseksi lisäämällä 2 mikrolitraa 4 M NaCl-liuosta ve dessä; tämä vastasi likipitäen Sacl:lie optimaalista "kes-30 kimääräisen suolapitoisuuden puskurin" muodostamaa väli- ·***: ainetta. Tämän jälkeen lisättiin 60 U:ta Sacl:tä ja #»· . *. pilkkomisseosta inkuboitiin edelleen 3 tunnin ajan • · · * 37 °C : ssa .

c · '·;·* cDNA-insertin koko 750 ep selvisi todellisen 2830 : : 35 ep:n fragmentin ja 2080 ep:n lambda-gt-ll-restriktiokar- i « 21 105344 tästä lasketun Kpnl-Sacl-palan erotuksesta. Saatu fragmentti ligoitiin sitten kloonatun cDNA:n tarkemmaksi karakterisoimiseksi sopivaan "monikäyttöplasmidiin", nimittäin Bluescript-plasmidiin (kuvio 6) rengasmuotoisen 5 kaksisäikeisen ja yksisäikeisen DNA:n sekventointia silmälläpitäen.

b) Fragmentin eluointi UV-valossa etidiumbromidipitoisuuden ansiosta selvästi näkyvät DNA-nauhat lukemassa 2,8 ke:tä siirrettiin 10 Whatman DE81 -suodattimille, jotka oli geelifragmentti-viiltojen avulla asetettu anodin puolelle. Suodatinpalat pestiin 2 x 300 mikrolitralla alhaisen suolapitoisuuden käsittävää pesupuskuria (0,2 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM ED-TA, pH 8,0), minkä jälkeen DNA eluoitiin niistä 2 x 300 15 mikrolitralla korkean suolapitoisuuden käsittävää eluoin-tipuskuria (1 M NaCl, muuten kuten pesupuskuri). Vesifaa-sia uutettiin kahdesti fenoliliuoksella ja eetterillä ja DNA saostettiin etanolilla yön aikana -20 °C:ssa, minkä jälkeen se pelletoitiin (15 000 g, 20 minuuttia), pestiin 20 70-%:isella etanolilla, pelletoitiin toistamiseen (15 000 g, 10 minuuttia) ja kuiva.ttiin tyhjiössä. Kummastakin gee- «. : listä yhteensä eluoitu saalis 2,8 ke:n fragmenttia liuo- • «· tettiin kaikkiaan 10 mikrolitraan vettä ja puhdistettiin. Näyte-erä (0,7 mikrolitraa) siirrettiin kvantitatiivista # · · '·' * 25 määritystä silmälläpitäen l-%:iseen agaroosigeeliin. Saa- • · · *· *· duista 2,8 ke:n nauhoista voitiin kokonaismääräksi kum- • · · paakin fragmenttia päätellä 200 - 300 ng pitoisuutena 20 - ··· V: 30 mikrogrammaa/ml. Tämän vuoksi ligaatio Bluescript-plas midiin suoritettiin edellytyksenä kaikille myöhemmille ka-30 rakterisointivaiheille.

« · , .·*·. 2) Plasmidin valmistelu ligaatiota varten a) Bluescript-plasmidi-alavariantteja M13 SK+ ja M13 . '·’ · SK' (kuvio 6) pilkottiin Kpnl:llä ja Sacl:llä.

• · • · • · · « · · • · · • · · • · 105344 22

Kulloinkin 2 mikrogrammaa/2 mikrolitraa plasmidia (SK* tai SK ) pilkottiin 30 U:lla Kpnl:tä tai Sacl:tä (kuten kuvattu kohdassa VIII 1 a)).

b) Ligointi M13 SK* - ja M13 SK' -plasmidiin 5 Pilkottu plasmidi-DNA pestiin, pelletoitiin, kui vattiin ja liuotettiin kulloinkin 5 raikrolitraan vettä (kuten kuvattu kohdassa VIII 1 b)).

Ligointia Bluescript-plasmidiin silmälläpitäen kutakin 4,8 mikrolitraa eluoitua ja puhdistettua 2,8 ke:n 10 fragmentti -liuosta kohden pipetoitiin: 5 mikrolitraa plasmidiliuosta (SK* tai SK ) 2 mikrolitraa dATP:tä (100 mM)

2 mikrolitraa lOx ligaatiopuskuria (500 mM Tris, pH

7,4, 100 mM MgCl2, 10 mM spermidiini) 15 0,5 mikrolitraa T4-DNA-ligaasia (5 U:ta/mikrolitra) 6 mikrolitraa vettä ja ligaatioseosta inkuboitiin 3 tunnin ajan huoneenlämpö-tilassa .

c) Transformoitumiskykyisten solujen valmistus ja 20 transformointi

Transformointia silmälläpitäen valittiin Blue-: script-plasmidin kanssa käytettäväksi sopiva Ελ_ coli -kan- ta XLI-Blue (recAI, endAI, gyrA96, thi, hsdR17 (rk'mk*) su-pE44, relAI, lambda-, lac-, (F'proAB, lac IqZ delM15, • * · ; . 25 TN10)), jossa insertin sisältävät Bluescript-plasmidit • · · voidaan valikoida beeta-galaktosidaasi-sininen/valkoinen- • · indikaattorijärjestelmää käyttäen (katso IV 8)).

• · * V : EL. coli -kannasta XLI-Blue tehtiin "transformoitu- miskykyinen" käsittelemällä 100 mM CaCl2:lla 0 °C:ssa: 30 50 ml eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa olevaa viljelmää ·“*: (XLI-Blue LB-tet-kasvualustassa (20 mg/litra tetrasyk-

IM

. *. liiniä)), jonka optinen tiheys oli 460 600 nm:ssä, pelle- ”*.,* toitiin. E. coli -pelletti lietettiin ensin 50 ml:aan jää- • » ’··/’ kylmää 100 mM CaCl2-liuosta, inkuboitiin (2.0 minuuttia ::: 35 0 °C:ssa), erotettiin sentrifugoimalla ja uudelleen- « · 23 105344 lietettiin 5 ml:aan 100 mM CaCl2-liuosta. 4 tunnin 0 °C:ssa kuluttua suoritettiin transformointi.

1/5:aa kummastakin kohdassa VIII 2 b) kuvatusta li-gaatioseoksesta inkuboitiin 100 mikrolitrassa trans-5 formoitumiskykyisiä XLI-Blue-soluja ja loppua 4/5:aa 200 mikrolitrassa transformoitumiskykyisiä soluja 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Kun Ej_ coli -bakteereihin vielä kohdistetaan 2 minuutin lämpöshokki 42 °C:ssa, plasmidi-DNA siirtyy bakteerisoluseinämän läpi.

10 Transformointiseokset maljoitettiin LB-tet-maljoi- hin ja inkuboitiin 18 - 24 tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen sarja SK+- ja SK"-transformanteista saatuja valkeita pesäkkeitä siirrettiin esiviljelmään. Plasmidi-"mini"-valmistetta käyttäen näistä esiviljelmistä eris- 15 tettiin plasmidi-DNA alkalinen lyysi -menetelmän mukaan, minkä jälkeen Kpnl/SacI-verrokkipilkkomisella osoitettiin 2.8 ke:n insertin läsnäolo. Valittiin kaksi positiivista kloonia, yksi SK+- ja yksi SK'-variantti (2,8 SK* ja 2.8 SK") plasmidi-"maksi"-valmisteen valmistamiseksi niis- 20 tä.

b) 2,8 SK* - ja 2,8 SK" -plasmidi-"maksi"-valmiste ·. : Plasmidivalmiste valmistettiin alkalinen lyysi- • · · menetelmän mukaan 300 ml:sta XLI-Blue-transformantteja « käsittävää LB-kasvualustaa. Plasmidi-DNA erotettiin «Il l m 25 RNArsta saostamalla differentiaalisesti polyetyleenigly- *’ kolilla (PEG) , mitä seurasi fenoli/eetteri-uutto ja saos- :...· taminen isopropanolilla.

• · · · IX) 2,8 ke:n fragmentin sekvensointi sekvenaasilla

Sekvensointia silmälläpitäen kahta kaupallisesti 30 saatavana olevaa lambda-gt-ll-aluketta käytettiin lähtöma- • · · . .***j teriaalina komplementtisäiepalasten entsymaattisessa syn- • · · * teesissä.

• · • · · - :;j · 1) 15 emäsparin pituinen yksisäienukleotidi, jonka sekvenssi on: 35 5'____GACTCCTGGAGCCCG 3' • · ♦ • · 105344 24 joka valmistajan mukaan on lambda-gt-ll-aluke, ja jossa EcoRI-insertiokeskuksesta puuttuu 12 emästä ja johon Sacl-pilkkomiskeskukseen kiinnittynyt lambda-gt-ll-käsivarsi liittyy (kuvio 7).

5 2) 15 emäsparin pituinen yksisäienukleotidi, jonka sekvenssi on: 5'.... GGTAGCCACCGGCGC ....3' joka valmistajan mukaan on lambda-gt-ll-käänteisaluke, ja jossa EcoRI-insertiokeskuksesta puuttuu 7 emästä ja johon 10 Kpnl-pilkkomiskeskukseen kiinnittynyt lambda-gt-ll-käsi- varsi liittyy (kuvio 7), Tässä oli mahdollista sekvensoida inserttiä kummaltakin puolelta komplementoivasti ja näin saada fragmentin kokonaisnukleotidisekvenssi. Puhdistettu plasmidi-15 DNA varianteista 2,8 SK+ ja 2,8 SK‘ pelletoitiin, pestiin 75 %:isella etanolilla ja uudelleenpelletoitiin, minkä jälkeen se liuotettiin 10 mikrolitraan vettä ja siitä otettiin 1 mikrolitran näyte pitoisuusmääritykseen geelissä. Määrityksen mukaan DNA-pitoisuus oli 1-2 mikro-20 grammaa/mikrolitra.

Sekventointijärj estely: 1) Liittämisreaktio tl ' • Il

Liittämisseos: kokonaistilavuus 10 mikrolitraa • > « ·;;; 2 mikrolitraa plasmidi-DNA: ta (1-2 mikrogram- « · · '·1 ' 25 maa/mikrolitra) • *. ” 2 mikrolitraa vettä

Ml

·,,, 2 mikrolitraa sekvensointipuskuria (200 mM Tris, pH

7,5, lOO mM MgCl2, 250 mM NaCl) 1 mikrolitra alukeliuosta (0,67 pmol/mikrolitra).

;1'1· 30 Liittämisseos vietiin lasikapillaariin, jonka mo- • · · .·**. lemmat päät sulatettiin kiinni. Kapillaarin sisältöä pi- • ti •# dettiin 5 minuutin ajan kiehuvassa vedessä, minkä jälkeen • · · !'· : se upotettiin nopeasti -70 °C:seen kylmään alkoholiin, • · jätettiin siihen 5 minuutiksi, lämmitettiin 65 °C:seen ja ; 35 jäähdytettiin sitten hitaasti 35 °C:seen. Tällä menette- f · · 25 1 0 5 3 4 4 lyllä kaksoissäie saadaan erkanemaan kahdeksi säikeeksi ja aluke liittymään siihen.

Valmistettiin 4 liittämisseosta, kaksi sekä aluk-keella että käänteisalukkeella.

5 2) Leimausreaktio

Leimausreaktiota silmälläpitäen "leimausvarasto-liuosta" laimennettiin sekä aluke- että käänteisalukesek-ventointia varten 1:2 ja vastaavasti 1:10. Suhteet 1:2 ja 1:10 perustuvat deoksi- (d-) nukleotidien suhteelliseen 10 määrään seoksessa. 1:10-laimennosta käytettiin lyhyille säiepalasille ja 1:2-laimennosta pitemmille säiepalasille lähtösekvenssin paremmaksi selvittämiseksi.

Leimausvarastoliuos: 7,5 mikro-M dGTP

7,5 mikro-M dCTP

15 7,5 mikro-M dTTP

Leimausseos:

Edeltävät neljä liittämisseosta siirrettiin kapillaareista reaktioastioihin.

Kutakin 10 mikrolitraa liittämisseosta kohden li-20 sättiin: 1 mikrolitra 0,1 M ditiotreitolia (DTT) ·.: 2 mikrolitraa d-nukleotidilaimennosta (suhde 1:2 « · a alukkeelle ja 1:10 käänteisalukkeelle) M· ^ "" 0,5 mikrolitraa 32P-alfa-dATP-liuosta (1 mCi/ml)

» · I

*·' ' 25 2 mikrolitraa sekvenaasiliuosta (laimennettuna f a V'i TE : hen 1:8) , a a a ja sekoitettiin hyvin, minkä jälkeen kyseisiä 4 seosta a · · ·/· · inkuboitiin 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.

3) Lopetusreaktio 30 Seoserää kohden 4 reaktioputkea. (A, G, C, T) , • aa . joista kukin sisälsi 2,5 mikrolitraa "lopetusseosta" (8 • a a mikro-M kutakin dideoksi- (dd-) nukleotidia), lämmitettiin a a a • *·” : 37 °C:seen. Putkiin pipetoitiin kuhunkin 3,5 mikrolitraa • · a • a ·...' vastaavaa leimausreaktioseosta, mikä johtaa dd-nukleotidin ; 35 siirtymiseen rakenteeseen ja päättää siten säikeen pitene- • a a a • a 105344 26 misen. Reaktio päätettiin 5 minuutin inkuboinnin 37 °C:ssa jälkeen lisäämällä 4 mikrolitraa pysäytysliuosta (98,5 % formamidia, 0,05 % bromifenolisinistä, 0,05 % ksyleenisy-anolia, 0,5x TE, pH 8). Näytteitä säilytettiin -20 °C:ssa, 5 kunnes ne panostettiin geeliin, jolloin ennen tätä niitä kuumennettiin 2 minuutin ajan 75 - 85 °C:ssa säikeiden de-naturoimiseksi.

4) Sekvensointigeeli 97,5 ml 6-%:ista akryyliamidi- (AA-) varastoliuosta 10 2,5 ml 20x TBE-puskuria (1 M Tris, pH 7,5, IM bo- raatti, 20 mM EDTA) 220 mikrolitraa ammoniumpersulfaattia (APDS), 25- %:inen vesiliuos 50 mikrolitraa tetrametyylietyleenidiamiinia 15 (TEMED) (6-%:inen AA-varastoliuos: 57 g akryyliamidia 3 g bisakryyliamidia 481 g ureaa) 20 Ennen geelin kaatamista lasilevyille ne oli puh distettu pesemällä 3x vedellä, 3x alkoholilla, ja yhtä · levyistä oli käsitelty kahteen kertaan kummallakin ker- • · · * ralla 5 ml:lla silylointiliuosta (2-%:inen dikloorimetyy- • t « ·;;; lisilaaniliuos kloroformissa) . Geeli jätettiin yöksi huo- • · · ‘ 25 neenlämpötilaan polymeroitumaan.

• t *.*·: Geeliin tuotettiin tunniksi ennen näytteiden li- • · · säämistä 2000 V:n jännite, jotta saatiin DNA:n naturoin-: nille edellytyksenä oleva ainakin 50 °C:n lämpötila.

Näytteitä kuumennettiin 2 minuutin ajan 80 °C:ssa ja gee- .*··. 30 likaivot huuhdottiin perusteellisesti ureapolymerisaattien • « · .···. poistamiseksi. Seokset, jotka sisälsivät 1:2-laimennetun *·* d-nukleotidin käsittävää "leimausseosta", erotettiin kukin • · : kahdessa 4 vyöhykkeen ajossa (AGCT) . Näiden ajojen aikavä- * * * ·...· liin sisältyi sinimerkin panostuksen ja liikkeelle lähte- . .·. 35 misen välisen ajan lisäksi 1 tunti. Sinimerkin vielä kah- • · · • · · « • · 105344 27 den lähdön jälkeen 1:10-laimennos panostettiin kuten edellä 4 vyöhykkeelle, joilla sen annettiin liikkua, kunnes sinimerkki oli ehtinyt geelin toiseen laitaan. Kaivoa kohden panostettiin 2 mikrolitraa ja jännite oli 1500 - 2000 5 volttia. Elektroforeesiajon päätyttyä geeli siirrettiin Whatman DEAE-paperilie, se kuivattiin 80 °C:ssa tyhjössä ja valotettiin vahvistinsuodinta käyttämättä.

5) Sekvensointitietojen analysointi Tästä ensimmäisestä sekvenaasireaktiosta saatu in-10 serttisekvenssi oli pituudeltaan likipitäen täydellinen, koska limittyminen insertin keskiosassa voitiin todeta insertin päistä lukien (kuvio 8). Käsillä olevien sekvensointitietojen restriktioanalyysin perusteella valittiin muutamia tärkeitä yksittäisiä 6 emäksen pilkkomiskeskuk-15 siä, minkä jälkeen suoritettiin vastaavien fragmenttien alakloonaus siihen liittyvine alasekvensointeineen. Tämä oli välttämätöntä, koska saadussa sekvenssissä ilmeni edelleen epäselvyyksiä, ristiriitaisuuksia komplementoivi-en säiepalasten välillä tai aukkoja kummankin inserttipään 20 alkualueella. Valitut pilkkomiskeskukset olivat:

1) Bell: T G A T C A

. 2) Bglll: A G A T C A

' / 3) BamHI: G G A T C C

• · Näiden kolmen keskuksen keskinäinen suhde on käytännölli- < « f ' 25 nen, sillä ne sisältävät saman keskiemässekvenssin • · . .GATC. . ja muodostavat pilkkomisen jälkeen 4 emäksen yli- • · · jäämäpään. Tämän lisäksi kyseisillä entsyymeillä pilkotut : fragmentit voidaan ligoida keskenään.

6) Saaduista tiedoista varmistuminen 30 Verrokkipilkkomisissa varmistuttiin Bglll- ja • · · • .···. BamHI-pilkkomiskeskuksien sekvenssien oikeellisuudesta ’·’ geelielektroforeettisesti (l-%: inen agaroosi) . Sekä 2,8 SK+ • « · • ··· : - että 2,8 SK' -fragmentteja pilkottiin entsyymiyhdis- • · · telmillä Kpnl/Bglll, EcoRl/Bglll tai BamHl/EcoRI. Saadut . 35 fragmentit, jotka olivat kooltaan 1400 ep, 380 ep tai 350 • · · • · 105344 28 ep, sopivat SK:n tai 2,8 ke:n fragmentin geenikartasta laskettuihin nauhapituuksiin. +/- 30 emäsparin poikkeamat olivat edelleen mahdollisia sekvenssi(tietoje)n epätäydellisyyden johdosta.

5 Saatujen sekvensointitietojen varmistamiseksi tai epäselvyyksien korjaamiseksi toteutettiin tämän jälkeen seuraavat koejärjestelyt: X) 2,8 ke:n fragmentin alafragmenttien sekvensointi Maxam & Gilbertin mukaan 10 1) 32P-määritys alafragmenteista BglII:lla pilkko misen jälkeen

Periaate: BglII:lla pilkkomalla muodostuu kaksi 5'-ylijäämäpäätä, 51..A..GATCT..3'. Näitä käytettiin lähtökohtana leimattaessa käänteiskopioijaentsyymillä (RT) 15 (sekvenssin) 51-päästä 3'-päähän 32P-alfa-dATP:llä. Jälki-pilkkomalla Sacl:llä saadaan kaksi radioaktiivisesti leimattua fragmenttia: 1) lyhyt Bglll/Sacl-fragmentti, kooltaan noin 1400 ep: tä 20 2) pitkä, BglII:sta lähtevä ja loput plasmidista käsittävä fragmentti, jonka koko on noin 4300 ep:a.

2,8 SK1 -fragmentin pilkkominen Bglll: 11a: kokonais-

t I

"· tilavuus 200 mikrolitraa; 10 mikrogrammaa DNA:ta « pilkottiin korkean suolapitoisuuden käsittävässä puskuri · 25 rissa (10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl ja 100 mikrogrammaa/ml nautaseerumialbumiinia) 60 U:lla BglII:ta • · ;'2· 37 °C:ssa yön yli. Pilkkomisseos käsiteltiin fenolilla v · · (l/4-tilavuus Tris-kyllästettyä fenoliliuosta) , sitä uutettiin kahdesti eetterillä ja DNA saostettiin .... 30 isopropanolilla. Pelletoinnin, pelletin pesun 70-%:isella • · etanolilla ja uudelleenpelletoinnin jälkeen DNA liuotet- • · ·;· tiin 20 mikrolitraan vettä.

jtj ; Kummankin Bglll-pään 32P-leimaus: kokonaistilavuus 50 mikrolitraa

Ml ♦ · f · · 2

III

• • 1 29 1 0 5 3 4 4 20 mikrolitraa DNA-liuosta (1 mikrogramma/mikro- litra) 5 mikrolitraa lOx RT-puskuria 3 mikrolitraa 32P-alfa-dATP-liuosta (1 mCi/ml) 5 5 mikrolitraa dGTP:tä (10 mM) 1 mikrolitra BSA-liuosta (50 mg/ml) 2 mikrolitraa RT-liuosta (20 U:ta/mikrolitra) 14 mikrolitraa vettä

Seosta inkuboitiin 1 tunnin ajan 25 °C:ssa.

10 Sitten sitä pilkottiin Sacl:llä. Lisäksi RT-seok- seen säädettiin pitoisuudet 10 mM Tris ja 10 mM MgCl2, jolloin siitä tehtiin Sacl:lle sopiva. Pilkkomisseosta inkuboitiin tunnin ajan 37 °C:ssa.

Molemmat fragmentit eluoitiin agaroosigeelistä me-15 nettelyn mukaan, jota kuvataan kohdassa VIII 1. Vesifaasin fenolikäsittelyn ja 2x eetteri-uuton jälkeen kumpikin elu-aatti jaettiin viiteen reaktioastiaan ja leimatut fragmentit saostettiin etanolilla -70 °C:ssa.

2) Sekvensointi Maxam & Gilbertin mukaan 20 a) Sekvensointijärjestely DNA-fragmentit (pieni fragmentti: noin 1400 ep:tä, suuri fragmentti: noin 4300 ep:tä) pestiin 70-%:isella « < ' etanolilla ja pelletoitiin (5 pellettiä/fragmentti) sekä I i < sekvensoitiin Maxamin ja Gilbertin mukaan. Sekvensointi- i * · V : 25 menettelyn valmistuttua näistä 5 seoksesta (G, G+A, C+T, « · ·/·· C, A+C) saadut pelletit mitattiin yksittäin Cerenkovin mukaan ja liuotettiin sen jälkeen eri tilavuuksiin • · · ;*·*; vähintään kuitenkin 12 mikrolitraa - formamidipysäytys- puskuria siten, että kukin seos tuli käsittämään yhtä pal- .···. 30 jon radioaktiivisuutta mikrolitraa kohden. Valmiita näyt- • · . teitä säilytettiin -20 °C:ssa.

b) Sekvensointigeeli • · - ·.: · Panostamalla näytteet polyakryyliamidi - (PAA-) /urea- »Il geeleihin, joissa AA-pitoisuus vaihteli (6- 20 %) pääs- 35 tiin lähtösekvenssien parempaan selvittämiseen.

• · · • · « « · 30 1 0 5 3 4 4 20-%:inen geeli, 60 ml:n tilavuudelle: 1.5 ml 2Ox TBE-puskuria 58.5 ml 20-%:ista AA-varastoliuosta 90 mikrolitraa 25-%:ista APDS- (ammoniumperoksodi-5 sulfaatti-) liuosta 40 mikrolitraa TEMED- (Ν,Ν,Ν1,N'-tetrametyyliety-leenidiamiini-) liuosta 20-%:inen AA-varastoliuos: 197 g AA:ta 10 3 g BisAA:ta 481 g ureaa

Kustakin seoksesta kahta mikrolitraa vyöhykettä kohden kuumennettiin 2 minuutin ajan 80 °C:ssa, minkä jälkeen erät panostettiin geeleihin. 6-%:isessa geelissä 15 näytteet - pieni ja suuri fragmentti vierekkäin eroteltiin kolmessa viiden vyöhykkeen (G, G+A, C+T, C, C+A) ajossa 2000 V:n jännitettä käyttäen. Ajojen väliin jäävä aika oli kummallakin kerralla aika sinimerkin liikkeelle lähtöön lisättynä yhdellä tunnilla. 20-%:isessa 20 geelissä eroteltiin kulloinkin vain yhdessä viiden vyöhykkeen ajossa, kunnes sinimerkki oli ehtinyt geelin keskiosaan.

; 1 < c) Maxam & Gilbert -sekvensoinnista saatujen tie- c « « tojen arviointi I < < V · 25 Tämän toisen sekvensointimenettelyn perusteella « # !/·· aukot inserttipäissä voitiin täydentää sekä valtaosa epäs- :***: elvyyksistä selvittää.

• · · ·1·1; XI) Jatkoalakloonauksia lisäkontrollina * 1) BamHl/HincII-fragmentin eristys alakloonaamalla ,···. 30 ja yksisäiesekvensointi sekvenaasilla • · Päämääränä oli kuvata tarkalleen ei-leikkauskel- • · *i1 poisen EcoRI-pilkkomiskeskuksen muutosta. Tässä tarkoi- • · ;.· · tuksessa valittiin yksittäinen Hindi-pilkkomiskeskus, • · · 3<t>'· joka on 126 emäksen päässä kyseisestä EcoRI-pilkkomiskes- « • « · « · « « · · 105344 31 kuksesta ja johon Sacl-pilkkomiskeskuksen puoleinen lamb-da-gt-ll-käsivarsi liittyy.

a) Pilkkominen BamHI/HincII:11a 1) 2,8 SK1 -fragmentista: 3 mikrogrammaa DNA:ta pil-5 kottiin 15 U:lla sekä BamHI:tä että Hindi:ta korkean suolapitoisuuden käsittävässä puskurissa (HS), ii) SK+:sta ja SK': sta: 2 mikrogrammaa sekä SK1: aa että SK’: sta pilkottiin 10 U:lla sekä BamHI:tä että Hindi:ta HS-puskurissa. Inkubointi kesti yhden yön 10 37 °C:ssa.

Geelielektroforeesin jälkeen BamHl/HincII-frag-mentti eluoitiin (katso kohta VIII 1 b) . Puolet eluaatista yhdistettiin SK1-pilkkomisseokseen ja toinen puoli SK-pilkkomisseokseen ja molemmat DNA-seokset saostettiin 15 etanolilla.

b) Kummankin DNA-sakan pelletoinnin jälkeen suoritettiin ligaatio ja transformointi XLI-Blue-kantaan (kuten kuvattu kohdissa VIII 2b) ja c)).

2) EcoRI/Bglll-fragmentin eristys alakloonaamalla 20 ja yksisäiesekvensointi sekvenaasilla a) Pilkkominen EcoRI/Bglll:11a i) 2,8 SK1 -fragmentista: 12 mikrogrammaa 2,8 SK1 I t '· '· -DNA: ta pilkottiin 60 U:lla sekä EcoRI: tä että BglII:ta HS-puskurissa I » · \1 · 25 ii) SK1:sta ja SK":sta: 2 mikrogrammaa sekä SK1:aa !/·· että SK': sta pilkottiin 10 U:lla BamHI:tä ja 10 U:lla

Bglll-.ta HS-puskurissa. Inkuboinnit kestivät 3 tunnin ajan M· 37 °C:ssa.

SK1:n ja SK':n kohtaa i) vastaavat pilkkomiset suo- ,···. 3 0 ritettiin EcoRI :llä ja BamHI:llä (Bluescript-plasmidissa • · IV.m ei ole Bglll-pilkkomiskeskusta polylinkkerialueelle) . Tä- ten hyödynnettiin kummankin arvoituksellisen pilkkomiskes- • · • · kuksen ligointikelpoisuus.

• · · :<t/. Geelielektroforeesin jälkeen EcoRI/Bglll-fragmentti .35 eluoitiin (kuten kohdassa VIII Ib)) ja saostettiin Eco-• 1 · • m m « 105344 32

Rl/BamHI-pilkottujen SK*- ja SK -plasmidien kanssa etanolilla (kuten kuvattu kohdassa XI 1 a) ) .

b) Ligaatio ja transformointi suoritettiin kuten kuvattu kohdissa VIII 2 b) ja c) .

5 Kohdissa XI 1) ja XI 2) suoritettujen transfor- raointien todentaminen

Valmistamalla plasmidivalmiste alkaalisen lyysin menetelmällä kummankin ligaation transformanteista eristettiin alafragmentin käsittävät SK*- ja SK'-Bluescript-10 plasmidit.

Yhdistelmäplasmidien verrokkipilkkominen: 1) BamHl/HincII: 11a BamHI/Hindi-insertion varmistamiseksi 2) EcoRI/Xbal:llä EcoRI/Bglll-insertion varmista- 15 miseksi (BglII-keskus ei BamHI-pilkkomiskeskukseen ligoi-tuneena enää ollut pilkottavissa).

Kumpikin pilkkomisseos eroteltiin agaroosigeeleis-sä. Tällöin saatiin varmistettua kummankin alafragmentin 20 ligaatio ja transformointi SK+:aan tai SK":een. Samalla voitiin valita lähtökloonit yksisäiesekvensointiin kvalitatiivisten ja kvantitatiivisten kriteerien nojalla.

• I

'· " 3) Bluescript-DNA-alafragmenttien yksisäiesekven- sointi • · · V : 25 a) Yksisäie-DNA:n valmistus apufageja käyttäen :\j Yhtä sekä SK*- että SK'-alakloonia, jotka sisälsivät

BamHl/HincII- tai EcoRl/BglII-fragmentin, lisäännytettiin ··· 2,5 ml:ssa esiviljelmää (LB/amp/tet) yön yli 37 °C:ssa.

9 Tästä kulloinkin 50 mikrolitraa siirrostettiin edelleen ,···. 30 2,5 ml:aan LB-kasvualustaa. 30 minuutin 37 °C:ssa kuluttua • · ΪΛ' lisättiin kulloinkin 10 mikrolitraa Bluescript-apufagi *** R408 -liuosta, jonka tiitteri oli 5,5 x 1010 plakin muodos- • * : tavaa yksikköä/ml, minkä jälkeen kyseisiä 4 viljelmää ra- visteltiin 8 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sen jälkeen 1,2 ml 35 siirrettiin reaktioputkiin ja sentrifugoitiin 15 minuutin • * · • « · · · · · • · 105344 33 ajan 15 000 g:ssä. Insertin sisältävien plasmidien yksi-säievariantit

EcoRI/BamHI SK+ ligoituna EcoRI/Bglll-fragmenttiin EcoRI/BamHI SK' ligoituna EcoRI/Bglll-fragmenttiin 5 HincII/BamHI SK+ ligoituna HincII/BamHI-fragmenttiin

HincII/BamHI SK' ligoituna HincII/BamHI-fragmenttiin olivat nyt supernatantissa ja ne saostettiin lisäämällä 300 mikrolitraa polyetyleeniglykolia (20-%:inen PEG 6000 -liuos 3,5 M ammoniumasetaattiliuoksessa) . 15 minuutin huo-10 neenlämpötilassa kuluttua suoritettiin pelletointi ja yk- sisäie-DNA liuotettiin 300 mikrolitraan TE-puskuria. Vesi-faasia uutettiin fenoliliuoksella sekä kahdesti eetterillä, minkä jälkeen DNA saostettiin etanolilla lisäten 50 tilavuus-% 7,5 M ammoniumasetaattiliuosta -70 °C:ssa.

15 Alukkeena yksisäiesekvensoinnissa sekvenaasilla käytettiin kahta kaupallisesti saatavaa oligonukleotidia, jotka vastaavat Bluescript-LacZ-geenin polylinkkerialueen molemmin puolin sijaitsevia palasia.

1) T3-aluke: 17 emäksen pituinen oligonukleotidi, 20 jonka sekvenssi on 5'.....AT TAA C C C T CA C TAAAG____3' SK LacZ-geenin Sacl-keskuksen puolella polylinkkerialueen

I I

·. vieressä, ja jota käytettiin SK'-yhdistelmäsekvenssien alu- kereaktioissa (kuvio 9) .

\\ : 25 2) T7-aluke: 17 emäksen pituinen oligonukleotidi, jonka sekvenssi on: a a 5'____AATACGACT CACTATAG.....3' • · • · ·

Kpnl-sivustalla polylinkkerialueen vieressä, ja jota käy- • · · tettiin SK+-yhdistelmäsekvenssien alukereaktioissa (kuvio ... 30 9) .

f J

·** c) Sekvensointi järjestely • · ···’ Yksisäie-DNA pestiin PEG-käsittelyn jälkeen 70- • %:isella etanolilla, pelletoitiin ja liuotettiin 10 mik- ·”*: rolitraan vettä. Näyte-erien (1 mikrolitra). geelikont- • · *. 35 rollin jälkeen liittämisreaktioseokseen lisättiin kul- • · · • a • * a a a a 105344 34 loinkin 7,5 mikrolitraa DNA:ta, noin 400 - 600 ng/seoserä. Leimausreaktiossa käytettiin d-nukleotidilaimennosta 1,5 (d-nukleotidivarastoliuos vedessä) ja leimaus suoritettiin käyttäen 32P-alfa-dATP: tä. Kaikki myöhemmät vaiheet olivat 5 identtisiä ensimmäisen sekvenaasisekvensoinnin yhteydessä kuvattuihin nähden. Lopulliset seokset erotettiin kukin kahdessa neljän vyöhykkeen (ACGT) ajossa, joiden välinen aika oli aina sinimerkin kahden lähdön edellyttämä aika. Käytettiin 6-%:ista geeliä.

10 d) Tämän kolmannen sekvensointimenettelyn mukaan saatujen tietojen arviointi

Koivun pääallergeenin Bet I v nyt yksisäiesekven-soinnin sekvenaasilla ansiosta täydellinen, kolminkertaisesti kontrolloitu nukleotidisekvenssi on esitetty ku-15 viossa 10.

cDNA-insertin pituus on 727 emästä (kuvio 10) . Emäkset 1-11, eli emäkset (T-deletoituun) EcoRI-pilkko-miskeskukseen asemissa 11 - 15, ja emäkset 739 - 744, eli emäkset (ehyestä) EcoRI-pilkkomiskeskuksesta sekvenssin 20 päähän asti, ovat peräisin lambda-gt-ll-fagista.

1) Koodittava osuus

Bet v I -allergeenia koodittava sekvenssi on esi-tetty kuviossa 10 tunnistettavasti asettamalla nukleoti- « « disekvenssin rinnalle alusta loppuun vastaava aminohappo-

MM

25 sekvenssi. Kooditetun proteiinin laskettu molekyylipaino « · c ; on 17 570. Sekvenssi alkaa aminohappoa (ah) metioniini * · · !..* koodittavalla emäskolmikolla ATG (asemat 65 - 67) ja • · • · **; päättyy emäskolmikkoon TAA (asemat 545 - 547) . Nämä kaksi • · · *·* * kolmikkoa määritellään geneettisen koodin mukaan alku- ja 30 loppukodoneiksi. ATGrstä TAA:hän lukukehys on avoin.

« · · ·...· Tästä nukleotidisekvenssistä saatu proteiinisek-

IM

\mmi venssi on yhteneväinen proteiinin Bet v I ah-sekvenssiin : .·. nähden, joka proteiini sekvensoitiin aminohappoon 35 asti I I « N-päästä lukien.

· * « « · · « · « • · • * 105344 35

Emäskolmikot asemasta 311 asemaan 319 koodittavat ah-jäännöksiä Asn-Tyr-Ser. Tämä ah-kolmikko on mahdollisesti glykosylaatiokeskus.

Proteiinin Bet v I DNA-sekvenssi on hyvin homolo-5 ginen erääseen herneen sairausresistenssin tuottavaan geeniin nähden, kuten mainitsimme jo johdannossa.

2) Ei-koodittavat osuudet a) Ei-koodiosuus emäksestä 12 emäkseen 64

EcoRI-keskuksen asemassa 11 muutoksen aiheutti yh-10 den tymidiinin deleetio.

Aloituskodonia välittömästi edeltävät emäkset: GCC ATC ATG edustavat kirjallisuudessa kuvattua signaalisek-venssiä, jolloin A asemassa -3 on pysyvä, kun taas kyseiset muut emäkset voivat vaihdella (Lutcke et ai., EMBO 15 jL. 6 (1987) 43 - 48).

b) Ei-koodiosuus emäksestä 548 emäkseen 744 cDNA:n loppupäälle on tunnusomainen 29 A:n poly- adenyylisekvenssi.

Emäsekvenssi asemissa 693 - 698 AAT AAA edustaa 20 kirjallisuudessa kuvattua (M. Birnstiel et ai. . Cell 41 (19..) 349) polyadenylaatiolle välttämätöntä konsensus- signaalisekvenssiä .

: Edeltävistä tiedoista ilmenee: • M « ·

Kokonais-mRNA kloonattiin cDNA:n perusteella. Luku- t "j·, 25 kehys on avoin. Edellä esitetty sekvenssi on täydellinen I . proteiini Bet v I -geeni.

• · · • · *,,· Selitysyhteenveto oheisista kuvioista • · *···’ KUVIO 1. RNA:n karakterisointi 6 % polyakryyliamidi • · · *·* ’ - 50 % urea -geelissä. M: merkki. 1-5: toisistaan riip- 30 pumattornia RNA-eristeitä urospuolisista kukinnoista.

* · · : · KUVIO 2. Positiivisten, insertin sisältävien kloo- • * · * nien toteaminen allergisen henkilön seerumista saaduilla • · · • . IgE-vasta-aineilla.

1) 1. Toteamisvaihe: 2 posiitiivista kloonia (nuo-35 li) valitaan.

« » · • · · m m m 105344 36 2) Positiivisten kloonien uudelleenkloonaus.

KUVIO 3. Lambda-gt-ll-fagin restriktiokartta. Nuoli (tähdellä varustettu) osoittaa cDNA:n insertiokohdan.

KUVIO 4A.

5 1) Lambda-gt-11-DNA + insertti (pilkottu Kpnl/-

Saclrllä): 2,8 kep:n Kpnl/Sacl-fragmentti (neliö).

2) Lambda-gt-ll-DNA - insertti (pilkottu Kpnl/-

Sacl:llä): 2,08 kep:n Kpnl/Sacl-fragmentti (neliö).

3) Lambda-gt-ll-DNA + insertti (pilkottu Sacl/- 10 EcoRI:llä): 1,06 kep:n SacI/EcoRI-fragmentti (kaksoisne- liö) .

4) Lambda-gt-ll-DNA - insertti (pilkottu Sacl/-

EcoRI:llä): 1,8 kep:n Sacl/EcoRI-fragmentti (kaksoisne- liö) .

15 5) Lambda-villityyppi-DNA, pilkottu Pstl:llä.

KUVIO 4B. cDNA-insertin sisältävä leikkaus lambda- gt-ll-genomista, molemmat EcoRI-pilkkomiskeskukset (Sacl- keskusta lähempänä sijaitseva on deletoitunut) ja sivuavat

Kpnl- ja Sacl-pilkkomiskeskukset. LacZ-geenin osuus on 20 alleviivattu pisteillä.

KUVIO 5. Western-/immuunisiirrostusmääritys A) Immuunisiirrostusmääritys allergisen henkilön ·. : seerumilla: toteaminen 125J-anti-IgE: llä.

• · · 1) Proteiiniuute Ej. coli -kannasta Y 1089.

25 2) Proteiiniuute E^. coli -kannasta Y 1089, johon on • · · *** ] tartutettu vailla inserttiä oleva lambda-gt-11.

♦ · · ’· ]· 3) Proteiiniuute JL. coli -kannasta Y 1089, johon on tartutettu insertin sisältävä lambda-gt-11 (klooni HB6) .

• · · · 4) Proteiiniuute £Lt. coli -kannasta Y 1089, johon on 30 tartutettu insertin sisältävä lambda-gt-11 (klooni HB8).

5) Koivusiitepöly-uute BP VIII D.

* · · ·*'*; B) Immuunisiirrostusmääritys monoklonaalisella vas- • · · , ta-aineella BIP-1: toteaminen anti-hiiri-IgG:llä (ka- • · ·;;· niinistä) ja 1Z5J-anti-kaniini-Ig:llä.

• · *···' 35 1) Proteiiniuute Ej_ coli -kannasta Y 1089.

i » I • · »

f M

• * 105344 37 2) Proteiiniuute E^. coli -kannasta Y 1089, johon on tartutettu vailla inserttiä oleva lambda-gt-11.

3) Proteiiniuute IL. coli -kannasta Y 1089, johon on tartutettu insertin sisältävä lambda-gt-11 (klooni HB6).

5 4) Proteiiniuute EL. coli -kannasta Y 1089, johon on tartutettu insertin sisältävä lambda-gt-11 (klooni HB8).

5) Koivusiitepöly-uute BP VIII D.

Kuvio 6. Plasmidin pBluescript SK(+/-) restriktio- kartta.

10 Kuvio 7. Leikkaus 2,8 ke:n fragmentista cDNA-in sertin ja lambda-gt-ll-sekvensointialukkeiden esittämiseksi; nuolet osoittavat synteesin suunnan.

Kuvio 8. Autoradiografiakuva sekvensointigeelistä cDNA-insertin ensimmäisen sekvensoinnin jälkeen, jossa 15 käytettiin lambda-gt-ll-alukkeita ja sekvenaasia; radioaktiivinen isotooppi: 32P.

Kuvio 9. Leikkaus Bluescript-plasmidin lacZ-geenis-tä. Esitetään alue T7-promoottorista T3-promoottoriin, jolla sijaitsee polylinkkerialue. Kummankin alukkeen alku 20 ja loppu on merkitty nuolella.

Kuvio 10. Esitetään cDNA-insertin lopullinen sekvenssi .

I I < «

• «I

f < I

• < « • < • · • a a • a a • a a • · · a a • · · • · • a • · • · · • · · a a a «aa * a «aa a a a a a a

«M

f ·

l I I

• · 1 « • · · • « « « * I · · f « · f « a • · · · a a a

Claims (8)

105344

1. Menetelmä polynukleotidien löytämiseksi, joiden avoin lukukehys koodittaa proteiineja, joiden biologinen 5 aktiivisuus allergeeneina vastaa luonnossa esiintyvien kasviallergeenien aktiivisuutta, tunnettu siitä, että kasvikudoksesta tehdään cDNA-kloonipankki, että ilmentämällä tämä kloonipankki saadaan aikaan proteiineja, jotka saatetaan kosketukseen allergisen henkilön seerumin 10 kanssa IgE-vasta-aineiden kanssa reagoivien proteiinien analyysiä varten, ja että osoitetaan saadun fuusioproteii-nin IgE-sidos esimerkiksi sitomalla anti-IgE-konjugaatteja allergeeni-IgE-kompleksiin.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisessa mene- 15 telmässä käyttökelpoisen reagenssin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tunnistettua proteiinia koodattava polynukleotidi insertoidaan lambda-gt-ll-fagiin.

3. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisessa menetelmässä käyttökelpoisen reagenssin valmistamiseksi, 20 tunnettu siitä, että tunnistettua proteiinia koo dattava polynukleotidi insertoidaan plasmidiin "Bluescript SK (+/-)".

, , 4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, t t ' '· tunnettu siitä, että saatu vektori ilmennetään 25 yksisoluisessa mikro-organismissa, erityisesti Eh_ solissa. ·.1 1

5. Polynukleotidi, joka seulottiin esiin patentti- • 1 s.1·; vaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä, tunnettu siitä, että se koodittaa proteiinin sekvenssin mukaista ·1;1; allergeenina vaikuttavaa epitooppia, jolloin se vastaa 30 kuviossa 10 esitetyn sekvenssin avointa lukukehystä.

.···. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen polynukleotidi, • · I” tunnettu siitä, että se käsittää kuviossa 10 esi- • · tetyn sekvenssin tai sen osasekvenssejä. r

• 7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen polynukleo- J 35 tidi, tunnettu siitä, että se käsittää kuvion 10 j (tl € « 105344 mukaiseen sekvenssiin ankarissa olosuhteissa hybridisoitu-van sekvenssin ja koodittaa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnistettua proteiinia.

8. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen polynukleo-5 tidi, tunnettu siitä, että se käsittää kuvion 10 mukaisesta sekvenssistä degeneraation seurauksena saadun sekvenssin ja koodittaa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä tunnistettua proteiinia. « C ' « « t · • · · • · · • • « · • · • · • · · • · · • · · • · · t • · · • · • · IM 1 · · • · * ’ < c f I « · « < · I < · 105344