DK172642B1 - Fremgangsmåde til påvisning af polynukleotider, der i deres åbne læseramme koder for proteiner, hvis biologiske aktivitet s - Google Patents

Description

i DK 172642 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til påvisning af polynukleotider, der i deres åbne læseramme koder for proteiner, hvis biologiske aktivitet som allergener svarer til i naturen forekommende planteallergener, 5 samt cDNA screenet ved denne fremgangsmåde.

Mindst 10% af alle mennesker lider på forskellige tidspunkter af livet og i forskellig udstrækning af pollenallergi. Patienterne klager på den tid, hvor der er pollen i luften, over irritabel kløe i næsen, kløen-10 de og røde øjne, snue, ødemer af øjenlåg og ofte hoste og astmalidelser. Overvejende lette med vinden oyerførte pollen når slimhinderne af øjnene og respirationskanalen hos mennesker, opløses delvist lokalt og fører ved patienter med genetisk disposition, såkaldte atopi-15 kere, til sensibilisering og dermed forhøjet produktion af igE-antistoffer rettet mod forskellige proteiner fra dette pollen. Det drejede sig i denne forbindelse i månederne februar til april om pollen fra træer, som f.eks. el, hassel, og birk og i månederne maj, juni 20 og juli om pollen fra græsarter og kornsorter og i månederne juli og august om pollen fra ukrudtsarter, såsom bynke, vejbred, skræppe og gåsefod. Ved fornyet kontakt forårsager pollenproteinerne (allergenerne) ved forbindelse med IgE-molekyler på overfladen af Mastcel-25 ler i slimhinderne en frigørelse af Inflammatoriske stoffer, såsom histamin, leukotriener, chemotaktiske faktorer, blodpladeaktiviverende faktor (PAF) osv, og de medfører et typisk sygdomsbillede (høsnue, pollenastma), som betegnes en allergisk reaktion af type I.

30 De uacceptable til farlige virkninger af polle nallergi har i årtier været behandlet med antiinflamma-toriske medikamenter og/eller ved den såkaldte hyposen-sibilisering. Sidstnævnte består i tilførsel af sygdomsfremkaldende pollenproteiner i langsomt stigende 35 doser i form af injektionspræparater, eller hos børn i form af dråber, til opnåelse af en tydelig aftagen af 2 DK 172642 B1 symptomerne (indtrædelse af tolerens). Denne form for immunterapi er på grund af dens resultater basis for enhver terapeutisk behandling af pollenallergi med udpræget symptomatik. Forudsætningen for et godt resultat 5 for en sådan behandling er imidlertid, at en diagnostisk undersøgelse, der omfatter hudtests, serologiske tests o.lign., kan foretages med nøjagtigt definerede pollenekstrakter, og at behandlingen udføres med de proteiner, der udløser pollenallergien i tilstrækkeli-10 ge, nøjagtigt bestemte koncentrationer. Hidtil har pollenproteinerne været opnået ved, at man ved omkostningsfulde fremgangsmåder samler pollenet, idet man skal tage i betragtning at det samlede pollen i reglen består af en blanding af forskellige plantepollen, der 15 dernæst må adskilles, renses og oparbejdes ved bekostelige fremgangsmåder. Desuden er det næsten umuligt at opnå større mængder af et rent pollenprotein ved de kendte fremgangsmåder. De allergifremkaldende proteiner er nemlig til stede i forskellige koncentration på og i 20 pollenet ofte afhængigt af klima, årstid og vejr. Derfor tages der ved anvendelse af ikke standardiserede ekstrakter i mange tilfælde for lidt hensyn til de individuelle begivenheder hos patienten, hvilket afspejler sig i mangelfulde resultater ved terapeutisk be-25 handling.

Det tilsigtes med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde af den i indledningen omtalte 'art til påvisning af ved allergiske reaktioner anvendelige allergener eller de polynukleotider, der koder for disse, 30 på en let og specifik måde.

Dette opnås ifølge opfindelsen ved, at en cDNA-klonbank fra plantevæv tilvejebringes, at proteiner ved ekspression af denne klonbank produceres, som bringes i kontakt med sera fra allergikere til opnåelse 35 af proteiner, som reagerer med IgE-antistoffer og at allergene fusionsproteiner påvises ved binding af 3 DK 172642 B1 anti-lgE til allergene fusionsproteiner/IgE-komplekse.

Herved påvises alle de proteiner, der er ansvarlige for de allergiske reaktioner, og polynukleotiderne, der koder for disse kan udledes.

5 Opfindelsen angår endvidere et cDNA screenet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket cDNA koder for den ved sekvensen fastlagte allergent virksomme epitop af proteinet, idet det i den åbne læseramme har den i figur 10 gengivne opbygning.

4 DK 172642 B1

Den cDNA-klon, der koder for det i det følgende beskrevne væsentligste birkeallergen, Bet v i, er i høj grad homolog med det gen, der fremkalder sygdomsresistens hos ærter (95%'s identitet, 70% homologi af se-5 kvensen uden løkker. Ærtegenet er ikke aktivt i sundt væv, men eksprimeres i større mængder ved kontakt med plantepatogener. Man skulle derfor forvente, at dette i høj grad bevarede gen kunne anvendes til beskyttelse af transgene planter mod plantepatogener.

10

Fremgangsmåde I) RNA-Isolation udførtes ud fra: 15 1) Blade 2) Blomsterstande, rødder og kallusvæv 3) Pollen fra Betula verrucosa 20 1) Blad-RNA-ekstraktion.

0 5 g bladmateriale, opbevaredes og ved -70 C eller friskplukket og transporteret i flydende N2, male-des til støv i en mølle afkølet med N2. Materialet 25 overførtes til en morter og følgende opløsninger tilsattes : 1) 8 ml tris(hydroxymethyl)-aminomethan/natrium-dode-cylsulfat (tris/SDS)-puffer (0,1 M tris x HC1, 30 pH 8,0, 1 vægt/vol% SDS).

2) 4 ml phenol pufret med 1 M tris x HCl, pH 8,0 3) 4 ml CHCl3/Isomylalkohol (24:1) = Cl

Det sønderdelte væv udførtes i denne blanding 35 (1-3) til en fin suspension, overførtes til Corex-Rør, blandedes kraftigt og centrifugeredes i 5 minutter ved 5 DK 172642 B1 6800 g og 4*C i en Sorvalcentrifuge. Dernæst fulgte yderligere en PCI{phenol-CHCl3-isoamylalkohol)-ekstraktion af den vandige fase, en faseadskillelse ved centrifugering ved 3000 g i 5 minutter og CHCl3-ekstrakti-5 on af den vandige fase.

Til denne sattes 10 vol% 2M CH3C00Na (NaAc) pH

5,8 og 250 vol% absolut ethanol (EtOH) og den samlede 0 mængde nukleinsyre fældedes ved 20 C natten over.

Nukleinsyren centrifugeredes fra i løbet af 10 10 minutter i en Beckmann JS13-1 "swing out" Rotor ved 3000 g og 4*C, supernatanten bortkastedes, pelleten vaskedes med 70% EtOH og tørredes i en eksicator, Pelle-ten opløstes dernæst i 2 ml H20 og overførtes til Ep- pendorf-beholdere. Dernæst tilsattes 150 mg fast 0 15 NaCl/ml, og opløsningen opbevaredes ved 4 C i 5 timer.

Det til dette tidspunkt udfældede RNA pelletere-des ved 4*C og 15000 g i en Eppendorf-centrifuge. Pel-leten vaskedes med 0,5 ml, 2,5 M NaCl, RNA’et pellete-redes igen, og vaskningen gentoges. Dernæst vaskedes 20 pelleten 3 gang emed 0,5 ml 70% EtOH, den tørredes og opløstes i 360 pi sterilt vand. Fældningen af RNA'et udførtes ved tilsætning af 40 μΐ 2M NaAc, pH 5,8, og 1 ml absolut EtoH ved -20 C natten over. RNA'et pellete-redes igen, vaskedes 2 gange med 0,5 ml 70% EtPH, tør-25 redes og opløstes i 100 μΐ sterilt vand. RNA'et opbevaredes ved -20 C.

2) Blomsterstande, romateriale, kallusvæv: Cetyltri- methylammonlumbromid (CTAB)-metode_ 30 30 g Plantemateriale fintdeltes i flydende N2 og overhældtes med det samme volumen, kogende ekstraktionspuffer (2% CTAB, 100 mM tris-HCl, pH 7,8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-Mercaptoethanol). Opløsnin-35 gens temperatur indstilledes til 50*C i vandbad under omrøring, blandingen overførtes til SS-34 centrifugerør 6 DK 172642 B1 og tilsattes til samme volumen CHCI3:isoamylalkohol, (24:1,Cl) og blandedes forsigtigt. Der udførtes centrifugering i 10 minutter ved 17.400 g i en Sorvall SS-34-centrifuge ved stuetemperatur. Den vandige fase 5 overførtes til et andet rør, og 1/10 volumen 10% CTAB-opløsning tilsattes (10% CTAB, 0,7 NaCl). Dernæst udførtes endnu en CI-ekstraktion. Et ligeså stort volumen fældningspuffer (1% CTAB, 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0) sattes til den opsamlede vandige fase, og der 10 blandedes godt. Man lod opløsningen henstå i 30 minutter ved stuetemperatur, hvorefter nukleinsyrerjie centrifugeredes fra i SS-34 rotor i 5 minutter ved,3000 g.

Pelleten opløstes i 10 ml 1 M puffret CsCl-opløsning (50 mM tris, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 8,0) i 18-20 ti-15 mer ved 120.000 g i en "swlngout"-rotor. RNA'et fandtes i pelleten. Det opløstes i sterilt H20, fældedes og opbevaredes ved -20 C.

3) RNA-Isolation fra pollen 20 500 mg pollen maledes i en morter med fintdelt glasstøv under flydende N2· Der tilsattes øjeblikkeligt 10 ml PCI, 10 ml homogeniseringspuffer (10 mM tris, 200 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 9,0) og 0,5 ml 20% SDS. Der 25 formaledes videre til smeltning af den indledningsvist stadig frostne blanding. Blandingen overførtes dernæst til et SS-34 centrifugetør og anbragtes på is. Morteren eftervaskedes med 5 ml homogeniseringspuffer og 1% SDS. Opløsningen blandedes kraftigt i 10 minutter under sta-30 dig mellemkøling på is og centrifugeredes dernæst i 10 minutter ved 3000 g og 4°C. Der udførtes PCI-ekstrak-tion 2 gange og CI-ekstraktion én gang af den vandige fase. Nukleinsyrerne fældedes ved 20°C natten over ved tilsætning af 10 vol% 3 M NaAc, pH 4,8 og 250 vol% ab-35 solut EtOH. Efter 10 minutters centrifugering ved 12000 g og 4 C vaskedes pelleten én gang med 70% EtOH uden at 7 DK 172642 B1 den løsnedes fra centrifugerørenes væg, og den opløstes i en ringe mængde H20 og fordeltes på Eppendorfbeholde-re. Fældning udførtes igen ved tilsætning af 10 mol% 3 M NaAC, pH 4,8 og 250 vol% absolut EtOH.

5 Berigelse af poly (A)+RNA udførtes i alle til fælde (1, 2 og 3) ved følgende fremgangsmåde: RNA'et centrifugeredes fra det fældede materiale i løbet af 10 minutter i en Eppendorf-centrifuge ved 15000 g og 4#C. Pelleten tørredes i en Exsicator i 10 10 minutter og resuspenderedes dernæst i 300 μΐ sterilt H20 på is.

Oligo dT-cellulose suspenderedes i 0,1. Μ KOH.

Denne suspension fyldtes til 3/4 volumen i en 1 ml's plastsøjle pakket med kvartsuld. Dernæst vaskedes 15 søjlen med 5 ml 0,1 M KOH, og den skyldedes med vand til opnåelse af en neutral pH-værdi. Søjlen ækvilibre-redes med 4 ml ladepuffer (0,5 M LiCl, 10 mM trisxHCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS).

RNA-proben indstilledes til en LiCl-koncentra- 20 tion på 0,5 M med en 5 M LiCl-opløsning, denatureredes 0 ved 60 C i 10 minutter og afkøledes hurtigt på tøris.

Proben overførtes til søjlen, eftervaskedes med l ml ladepuffer og overførtes endnu en gang til søjlen. Dernæst skylledes søjlen med 5 ml "middle rinse puffer" 25 (10 mM trisxHCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,15 mM LiCl, 0,1% SDS) .

Eluering af den poly(A)+ RNA-holdige fraktion udførtes ved vaskning af søjlen med 8 x 300 μΐ portioner af 60 C varm elueringspuffer (2 mM EDTA, pH 8,0, 30 0,1% SDS). RNA'et fældedes ved tilsætning af 3 M NaAc, pH 4,8, til en koncentration på 4,8, til en koncentration på 0,3 M og 300 vol% absolut EtOH ved -20 *C natten over.

35 8 DK 172642 B1 II) RNA-karakterlserlng udførtes ved: a) påføring af total-RNA'et på en polyacrylamid 5 (6%)-urinstof(50%)gel og elektroforese under anvendelse af 5S-, 16S- og 23S-RNA-molekyler som sammenligningsmaterialer (fig 1).

b) påvisning af poly(A)+ RNA-holdige fraktioner efter oligo-dT-søjle udførtes ved påføring af del- 10 mængder på 1% agaroseplader med 0,5 yg ethidiumbromid/ ml og synliggørelse af pletterne på en uv-transillumi-nator.

ill) cDNA-syntese 15 1 yg poly(A)+ RNA anvendtes til cDNA-syntese i følgende reaktionsblanding, a) syntese af den første streng: 4 yl 5 x puffer til syntese af den første streng 20 (250 mM trisxHCl, pH 8,3, 250 mM KC1, 50 mM MgCl2, 50 mM Dithiothreit) 1 yl 20 mM natriumpyrophsphat 1 yl human placenta-RNAse-inhibitor (20 U/yl) 2 yl Desoxynukleotidtriphosphat-Mix (dATP, dGTP, 25 dTTP: 10 mM; dCTP: 5 mM) 1 yl oligo dT (12-18) 1,6 mg/ml 0,5 yl alpha 32P-dCTP (5 yCi) H20 ad 20 yl 30 Efter blandingen tilsattes 20 U revers tran scriptase, hvorefter der inkuberedes ved 42 C I 60 minutter. Analyse af den syntetiserede første streng viste en typisk inkorporering af 100.000 cpm/yg RNA.

35 9 DK 172642 B1 b) syntese af den anden streng: 20 yl reaktionsblanding fra a) 20 yl 5 x puffer til syntese af den 2. streng (100 mM triSXHCl, pH 7,5, 0,5 M KC1, 25 mM MgCl2, 5 50 mM (NH4)2S04, 50 mM Dithiothreit) 5 yl alpha-32P-dCTP (50 yCI) (NH4)2S04, 50 mM Dithiothreit) 5 yl alpha 32P-dCTP (50 yCi) 0,8 U Ribonuclease H fra E. coli 10 23 U DNA Polymerase I fra E. coli H20 til 100 yl

Blanding og inkubation: 12°C i 60 minutter, 22°C i 60 minutter og dernæst 70 C i 10 minutter. Dernæst 15 afkøledes reaktionsblandingen på is, der tilsattes 2,0 U T4 DNA-polymerase og inkuberedes ved 37 C i 10 minutter (her kunne som ovenfor udtages en delmængde til analyse af den indkorporerede radioaktivitet i den anden streng; Man fandt inkorporering på 90% af inkorpo-20 reringen 1 den første streng).

Deræst ekstraheredes det det dobbeltstrengede cDNA to gange med PCI og en gang med Cl. Der fældedes med lige så stort volumen 4 M NH4-Acetat og 200 vol% absolut EtOH i 20 minutter ved -70°C. cDNA'et.centri-25 fugeredes fra i løbet af 10 minutter ved 15000 g og 4*C, pelleten opløstes i 100 yl sterilt H20 og fældedes en gang til som angivet ovenfor. Den atter atter fracentrifugerede pellet vaskedes med 500 yl 70% EtOH, centrifugeredes som ovenfor i 5 minutter og opløstes i 30 20 yl sterilt H20.

IV) cDNA-klonlnq i lambda qt 11 1) Methylerlnq af cDNA1et til bestyttelse af interne 35 Eco Ri-restriktionssteder.

10 DK 172642 B1 1 μΐ cDNA i 10 μΐ sterilt H20 4 μΐ 5 x Eco RI-Methylase-puffer (250 mM trisx HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 25 mM Dithiothreit) 2 μΐ 100 uM s-adenosyl-L-methionin (Stamopløs-

5 ning: 10 mM S-adenosyl-L-methionin i 10 mM

CH3COONa-puffer, pH 5,0.

Fortynding l:10~2 i sterilt H20 kort tid inden brug).

4 μΐ sterilt H20 10 20 U Eco RI methylase

Inkubation ved 37°C i 60 minutter, enzymaktivering ved 70*C i 10 minutter.

15 2) Ligation af Eco RIO-Linkeren: 5'd(pGGAATTCC), 500 ug/ml. Linkerliganden.

20 pi methylleringsreaktionsblanding fra 1) 3 μΐ 10 x ligationspuffer (500 mM trisxHCl, pH 7,5 20 100 mM MgCl2, 200 mM Dithiothreit, 50 mM ATP, 50 pg/ ml bovint serumalbumin) 2 μΐ Eco Rl-Linker (0,5 ug/μΐ) 5 μΐ sterilt H20 5 U T4 DNA-Ligase 25 inkubation ved 15 C i 16-20 timer. Eco RI-linker-en ligeredes til begge ender af cDNA'et ved hjælp af T4 DNA-ligase.

« D

30 Blanding og inkubation: 12 C i 60 minutter, 22 C

i 60 minutter og dernæst 7o”c i 10 minutter. Dernæst afkøledes reaktionsblandingen på is, der tilsattes 2,0 0 U T4 DNA-polymerase og inkuberedes ved 37 C i 10 minutter (her kunne som ovenfor udtages en delmængde til 35 analyse af den indkorporerede radioaktivitet i den anden streng; Man fandt inkorporering på 90% af inkorporeringen I den første streng).

11 DK 172642 B1

Deræst ekstraheredes det dobbeltstrengede cDNA ved ekstraktion to gange med PCI og en gang med Cl. Der fældedes med lige så stort volumen 4 M NH4-acetat og 200 vol% absolut EtOH i 20 minutter ved 5 -70°C. cDNA'et centrifugeredes fra i løbet af 10 minut ter ved 15000 g og 4 C, pelleten opløstes i 100 yl sterilt H20 og fældedes en gang til som angivet ovenfor.

Den atter fracentrifugerede pellet vaskedes med 500 yl 70% EtOH, centrifugeredes som ovenfor i 5 minutter og 10 opløstes i 20 yl sterilt H20.

IV) cDNA-klonlng 1 lambda qt 11 1) Methylerlng af cDNA'et til bestyttelse af interne 15 Eco Rl-restriktionssteder.

I yl cDNA i 10 yl sterilt H20 4 yl 5 x Eco Ri-Methylase-puffer (250 mM Tris x HC1, pH 7,5, 5 mM EDTA, 25 mM Dithiothreit) 20 2 yl 100 uM S-adenosyl-L-methionin (Stamopløs- ning: 10 mM S-adenosyl-L-methionin i 10 mM CH3COONa-puffer, pH 5,0.

Fortynding l:10-2 i sterilt H20 kort tid inden brug).

25 4 yl sterilt H20 20 U Eco RI methylase

Inkubation ved 37*C i 60 minutter, enzymaktivering ved 70°C i 10 minutter.

30 2) Ligation af Eco RI-Linkeren: 5'd(pGGAATTCC), 500 ug/ml. Linkerligation.

35 12 DK 172642 B1 20 μΐ methylieringsreaktionsblanding fra 1) 3 μΐ 10 x ligationspuffer (500 mM TrisxHCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 200 mM Dithiothreit, 50 mM ATP, 50 pg/ ml bovint serumalbumin) 5 2 pi Eco RI-Linker (0,5 pg/pl) 5 pi sterilt H20 5 U T4 DNA-Ligase

Inkubation ved 15°C 1 16-20 timer. Eco RI-linker-10 en ligeredes til begge ender af cDNA'et ved hjælp af T4 DNA-ligase.

3) Digestion af Eco RI-linket cDNA med Eco RI

15 Derved tilvejebragtes en enkelt klæbrig Eco Ri ende ved hver terminus af cDNA-molekylet og overskydende linkermolekyler fjernedes. Reaktionsblanding: 30 pi reaktionsblanding fra 2) 10 pi 10 x Eco RI puffer 20 60 pi sterilt H20 100 U Eco RI (1M Tris x HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1 M MgCl2)

Inkubation ved 37°c i 5 timer og efterfølgende 25 enzyminaktivering ved 70°C i 10 minutter.

4) Adskillelse af cDNA fra overskydende linkermolekyler

Inden indføjelsen af cDNA-molekylet i lambda gt 30 li må de overskydende linkermolekyler skilles fra for ikke at vekselvirke med kloningen. Til adskillelsen anvendtes kommercielt tilgængelige søjler, der var vasket og ækvilibreret med 6 ml STE-puffer (5,84 g NaCl 1,21 Tris, 0,37 g EDTA/1, pH 8,0). 100 pi cDNA digesteret 35 med og linket til Eco RI anbragtes på søjlen. 200 pi portioner elueredes fra søjlen med STE-puffer og op- 13 DK 172642 B1 samledes separat i Eppendorfbeholdere. Aktiviteten af de enkelte prøver måltes (Cerenkov), og fraktionerne med den højeste aktivitet forenedes. cDNA fra disse fraktioner fældedes natten over ved -20 C ved tilsæt- 5 ning af 10 vol* 3 M NaAc og 250 vol% absolut EtOH. Det fældede cDNA centrifugeredes fra i løbet af 30 minutter i en Eppendorfcentrlfuge ved 15.000 g og opløstes i sterilt H20 til en koncentration på 50 ng/μΐ.

10 5) Indføjelse af cDNA molekylet forsynet med Eco RI- ender 1 lambda gt 11_„_

Lambda gt 11 DNA-molekylerne var i forvejen overskåret med Eco RI og dephosphoryleret med alkalisk 15 phosphatase (Clontech RI-lambda, Cat. No. 6331-1) og således klart til ligationsreaktionsreaktionen: 200 ng cDNA 1 vig lambda gt ll-Arme 20 1 |jg 10 x ligationspuffer {som under IV, 2) H20 til 10 μΐ 2,5 U T4 DNA-ligase 9

Inkubationen udførtes ved 14 C natten over.

25 6) In vitro-pakning af Ligationsblandingen: udførtes ved hjælp af Gigapak Plus (Strategene, Catalog nr.

200211)._ 30 Hurtig optøning af de to ekstrakter (lydbehand let ekstrakt = SE, fra Induceret "prehead donor" BHB 2690; Fryse/tø-ekstrakt - FTE, fra induceret paknings proteindonor" BHB 2688). Den samlede ligationsprøve tilsattes FTE til optøning, og 15 μΐ SE pipeteredes og 35 dertil, og der blandedes forsigtigt med pipetten. Der inkuberedes i 2 timer ved stuetemperatur. Dernæst til- 14 DK 172642 B1 sattes 500 μΐ fagfortyndingspuffer (500 mg NaCl, 200 mg MgS04, 5 ml 1 M tris x HC1, pH 7,5). Fagsuspensionen opbevaredes ved 4°C.

5 7) Forberedelse af E. coli Y 1090-værtscellerne

E. coli Y 1090 (ATCC nr. 37196 - E.coli delta lac.U.169proA+ delta Ion araD139 strA hflA150 (chr::TnlO) (pMC9)) blev udstrøget på en LB-amp-10 plade (1000 ml bestående af 10 g Trypton, 5 g gærekstrakt, 10 g NaCl, 15 g Agar-Agar, 100 mg Ampicillin, pH

7,5) og inkuberet natten over ved 37°C inkuberet. Enkeltkolonier opsamledes og inkuberedes i 4 ml LB-amp-Medium under tilsætning af 0,4% maltose natten over ved 15 37°C. Den overnattede kultur centrifugeredes fra og re-suspenderedes i 10 mM MgS04. Disse celler var klar til fagadsorption og kunne opbevares ved 4 C.

8) Titrering af lambda qt 11-rekomblnaterne 20

Der fremstilledes en fortyndingsrække på 10 trin af fagsuspensionen (efter pakningen). I hvert tilfælde blandede 100 μΐ Y 1090 celler i 10 mM MgS04 med 10 μΐ fagsuspension med den pågældende fortynding. Præadsorb-25 tionen af fagpartiklerne på værtscellerne skete i 20 minutter ved stuetemperatur. Dernæst tilsattes: a) 2 μΐ ampicillin (25 mg/ml) b) 10 μΐ 100 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalaktopyra-30 nosid, opløst i steril H20) c) 10 μΐ 2%·s X-gal-opløsning (20 mg 5-brom-4-chlor- 3-indolyl-beta-D-galaktopyranosid i 1 ml Dimethyl-formamid) pr. ml d) 4 ml 0,6 % Agarose i H20 (holdt på vandbad ved 35 47*C).

15 DK 172642 B1

Hurtig gennemblanding og udhældning af top-agarosen udførtes på forvarmede 37*0 LB-amp-plader.

Man lod pladerne henstå i 10 minutter ved stuetemperatur til størkning af topagarosen og inkuberede dernæst 5 natten over ved 43 C. Den følgende dag taltes de hvide plagues og dermed de rekombinerede lambda gt 11 fager.

V) Ekspression af rekombinantproteinerne og immunscreening_ 10

Lambda gt 11-vektoren muliggjorde kontrolleret ekspression af rekombinantproteinet i form af et fusionsprotein med beta-Galaktosidase.

15 1) Udpladning af cDNA-banken Y 1090-værtsceller præpareredes som beskrevet ovenfor, inficeredes med fager og udpladedes således på LB-amp-plader (diameter 145 mm), at der opnåedes en tæthed på 20000 plagues/plade. Pladerne inkuberedes i 0 20 3-4 timer ved 43 C til fremkomst af plaques.

2) Fremkaldelse af proteinekspression

Nitrocellulosefiltre (diameter 132 mm, vædet i 10 mM IPTG og tørret) blev lagt over pladerne med 0 ' 25 plaques, og der inkuberedes i 3 timer ved 37 C (fremkaldelse af ekspression). Dernæst fjernede man forsigtigt nitrocellulosemembranerne, til hvilke fusionsproteinerne var adsorberet.

16 DK 172642 B1 3) Immunoscreening

a) Screening med patient IgE

5 i) Vask af agarosepartiklen: nitrocellulosefil tret blev overhældt med 50 ml GP (50 mM natriumphos-phatpuffer, pH 7,5, 0,5% Tween 20, 0,5 vægt/vol% bovint serumalbumin, 0,5% NaN3) og skyllet i 5 minutter ved 200 omdrejninger pr. minut på en rotationsryster. Puf-10 feren fjernedes ved udrystning og processen blev gentaget .

ii) Afmætning af de frie bindingssteder udførtes 25 ml GP i mindst 30 minutter ved stuetemperation ved stuetemperatur under let omrystning.

15 iii) 1. antistof.

Den udvalgte serum fra en allergiker, hvis igE-anti-stoffer genkender det væsentligste birkeallergen (Bet v I), et 17,5 kD protein, fortyndedes i forholdet 1:10 i GP. Blottene inkuberedes natten over ved 4 c under let 20 rystning med denne fortyndede serum.

iv) Vask af blottene.

Blottene vaskedes forsigtigt 3 gange med 30 ml GP hver gang ved stuetemperatur, i det blottene under den sidste vask rystedes i mindst 30 minutter med pufferen.

25 Dernæst hældtes pufferen fra.

v) Radioaktivt 2. antistof.

26 ml opløsning pr. rundfilter bestående af: 2,6 ml 125I-mærket anti-human IgE (Pharmacia Int., 300.000 cpm/ml) 30 23,4 ml GP (s.o.) 234 ul gelatine (100 μΐ/io ml GP)

Der inkuberedes natten over ved stuetemperatur under let omrystning.

17 DK 172642 B1 vi) Vask af blottene.

Blottene vaskedes 3 gange med 30 ml GP, idet pufferopløsningen ved den sidste vask rystedes videre i 30 minutter over blottene.

5 vii) Tørring af blottene og eksposition.

Efter tørring af blottene udførtes autoradiografisk påvisning af lambda gt 11-klonen med insertet, der koder for Bet v I. ved eksposition med en Kodak XR Rdntgen-film i 72 timer ved -70*C.

10 b) Screening med det monoklonale antistof bip i i) Vask af blottene udførtes med 50 ml 'TBS (50 mM Tris. HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Tween 20)) i 5 15 minutter ved 200 omdrejninger pr. minut på en rotationsryster ved stuetemperatur. Dernæst hældtes pufferen fra, og proceduren gentoges.

ii) Afmatning af de frie bindingssteder hver gang med 25 ml TBS/PM (« 3 vægt/vol% tørmælkspulver i 20 TBS) I mindst 30 minutter ved stuetemperatur og 200 omdrejninger pr. minut.

iii) 1. antistof.

25 ml ufortyndet BIP 1-hybridomkultursupernatant pr. nitrocellulosefilter. Inkubationen udførtes ved 4*C 25 natten over under let omrystning.

lv) Vaskningen af blottene udførtes ved stuetemperatur 3 x med hver 30 ml rent TBS, idet der ved den sidste vaskning omrystedes i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.

30 v) Andet antistof.

Blottene inkuberedes med et anti-muse-IgG-antistof fra kaniner (Jackson Inc., Md, USA, affinitetsrenset, i fortyndet til 1:2.000 i TBS/PM) i en time ved stuetemperatur under let omrystning.

35 18 DK 172642 B1 vi) Vask af blottene. Der vaskedes 3 x med TBS ved stuetemperatur, den sidste vaskning i 30 minutter under let omrystning.

vii) 3. antistof.

5 26 ml pr. nitrocellulosefilter:

26 ml TBS/PM

13 μΐ *^I-mærket anti-kanin-Ig fra geder (Kirkegaard &

Perry Labs., London, GB, 300.000 cpm/ml)).

Der inkuberedes ved stuetemperatur under let om-10 rystning i en time.

viii) vask og tørring af blottene.

Dernæst vaskedes. 4 gange, hver gang med 30. ml TBS (under den sidste vask i 30 minutter ved stuetemperatur og 200 omdrejninger pr. minut på en rotationsryster).

15 Blottene tørredes og eksponeredes i 72 timer, som beskrevet ovenfor.

Den optiske påvisning af positive kloner, hvis fusionsproteiner er i stand til at binde humant IgE (Fig. 2) eller det monoklonale antistof BIP 1, opnåedes 20 ved hjælp af sortfarvning på røntgenfilmen.

VI) Rekloning og analyse af rekombinant-lambda-gt-11-fagerne på DNA-niveau_ 25 1) Rekloning På grund af den høje plaquetæthed må der· udføres 2 rekloningstrin til berigelse med positive kloner. Der fremstilledes udstandsede fagstykker fra de positive 30 plaques, og deraf opnåedes fagsuspensioner. Disse ti-treredes igen til fagkoncentrationen, ved hjælp af immunscreening bestemtes de positive kloner igen. Der kunne opnås en berigelse på indtil 95%. Figur 2.

35 19 DK 172642 B1 2) DNA-analyse

Fremstilling af et "flydende lysat".

En enkelt plaque udludedes i 500 μΐ 10 mM MgS04 5 i mindst 2 timer ved 4*C. 100 μΐ af dette fageluat blandedes med 100 μΐ E. coli Y 1090-celler i 10 mM MgS04/ og man lod blandingen henstå i 20 minutter ved stuetemperatur til adsorption af fagene på værtscellerne. Blandingen overføres til 50 ml LB-Medium. Bakterie-10 cellerne dyrkedes ved 32*C til en OD 600 på 0,5-0,6.

Dernæst indstilledes cellekulturens temperatur „hurtigt til 42’c i et vandbad, og den holdtes i endnu 20 minutter i en luftbadsomryster ved 42°C. Dernæst inkuberedes kulturen ved 37 C indtil lyseringen af bakteriecellerne 15 var afsluttet. Eventuelt stadig intakte bakterieceller lyseredes ved tilsætning af 10 μΐ CHC13. Lysatet centrifugeredes i 10 minutter ved 10.000 omdrejninger pr. minut i en SS-34 rotor. Supernatanten, der indeholdt fagpartiklerne, kunne opbevares ved 4 C. 10 μΐ DNAse (5 20 mg/ml) og 25 μΐ RNAse (10 mg/ml) sattes til 50 ml fag- ft lysat, og der indkuberedes i en time ved 37 C. Fagene pelleteredes dernæst i løbet af 1,5 timer ved 30.000 omdrejninger pr. minut i en Beckmann SW-27 Rotor. Pel-leten resuspenderedes i 200 μΐ 50 mM Tris x HCl, pH 25 8,0. Der.udførtes phenolekstration ved tilsætning af et lige så stort volumen puffret phenol. Suspensionen måtte omrystet kraftigt i 20 minutter og centrifugeredes dernæst i 2 minutter. Phenolekstraktionen gentoges. Til den vandige fase sattes 200 μΐ CHCl3, der blandedes 30 godt og centrifugeredes i kort tid. Denne procedure gentoges ligeledes. Fag-DNA'et fælledes ved stuetemperatur ved tilsætning af 20 μΐ 3 M NaAc og 600 vol% absolut EtOH til den vandige fase. Efter 10 minutters centrifugering vaskedes pelleten med 1 ml 70% EtOH, 35 hvorefter den tørredes og resuspenderes i 200 μΐ sterilt H20.

20 DK 172642 B1 b) Restriktionsanalyse 1 yg lambda gt ll-DNA digesteredes med Eco RI.

Da insertet ikke kunne skæres ud fra vektoren, måtte de 5 to restriktionsgenkendelsessteder, der lå nærmest in-sertstedet vælges: Kpnl og SacI (se lambda gt 11's restriktionskort, figur 3). Herved opnåedes udskæring af et 2,8 kb DNA-fragment fra vektoren (figur 4A, bane 1:

Figur 4B), der foruden insertet såvel til venstre som 10 til højre indeholder en sekvens på 1000 bp af den oprindelige lambda-sekvens (Fig. 4B). En dobbeltdigestion med Kpnl/Eco RI eller Sacl/Eco RI viste, at kun et af de to Eco Rl-genkendelsessekvenser faktisk var ændret, og at dette var det, der lå nærmest Sacl-15 overskæringsstedet. På denne måde opnåedes et 1,75 kbp Eco RI - Sacl fragment (Fig. 4A, bane 3, markeret med dobbeltruder). Til subkloning ind i Bluescript-plasmi-det anvendtes det 2,8 kb Kpnl-Sacl-fragment.

(Figur 4 a, bane l, markeret med en rude) 20 VII) Fusionsprotein og Westernblot

Til påvisning af den biologiske aktivitet (IgE-bindingskapacitet) af det i lambda gt 11 fremstil-25 lede fusionsprotein anvendtes følgende fremgangsmåder: 1) Fremstilling af lysoqent E. coli Y 1089

Enkeltkolonier af Y 1089 (ATCC nr. 37196 = E.

30 coli delta lac U169 proA+ delta Ion araD139 strA hflA 150 (chr: :Tnl0) (pMC9)) inokuleredes i 10 ml LB amp-medium med 0,4% Maltose og dyrkedes natten over ved 37 °c. 1 ml af denne overnattede kultur overførtes til 50 ml LB amp-maltose-medium forvarmet til 37 C og dyr-35 kedes til en OD 600 på 0,5. Dernæst tilsattes 1 vol% 1M MgS04 til kulturen, som dernæst deltes i 100 yl 21 DK 172642 B1 portioner. Dertil pipetteredes 50 pi af en fortyndet fagblanding (1,25 x 10® plaquedannende enheder/ml). Adsorptionen af fagerne til Y 1089-cellerne skete i løbet af 20 minutter ved stuetemperatur. De således inficere-5 de E. coli-celler udpladedes på LB-amp-plader til en tæthed på ca. 5 celler/cm2. Pladerne inkuberedes natten over ved 32°C. Enkeltkolonier opsamledes og blev udstrøget på to separate LB-amp-plader. En plade inkuberedes ved 32°C og en ved 4 3 C. Lysogene Y 1089-celler 9 0 10 vokser ved 32 C, men ikke ved 43 C.

2) Fremstilling af et proteinekstrakt ud fra de lysoqe-ne celler * 15 100 ml LB-medium inokuleredes med en enkeltkolo ni af en lysogen rekombinant E. coli Y 1089. Man lod kulturen vokse til en OD 600 på 0,5 og øgede dernæst hurtigt temperaturen til 42*0. Kulturen holdtes i 20 minutter ved 42 C. Tilsætning af IPTG til en koncentra-20 tion på 10 mM meførte ekspression af fusionsproteinet.

O

Kulturen inkuberedes i 60 minutter ved 37 C, hvorefter cellerne høstedes ved stuetemperatur. Cellepelleten re-suspenderedes i 1/30 af det oprindelige kulturvolumen i phosphatpuffer (50 mM natriumphosphatpuffer, pH 7,5) og 25 blev øjeblikkeligt indfrosset i flydende N2· Optøning på 37 C vandbad førte til en fuldstændig lysering af de Inducerede, lysogene bakterieceller.

3) Polyacrylamldgelelektroforese (PAGE) og lmmunblot-30 ting

Fysionsproteinets biologiske aktivitet (IgE-bin-dlng) bestemtes ved hjælp af Westernblotting/immunblot-ting (figur 5A, B). Ved SDS-PAGE (12%'s homogent polya-35 crylamidgel, 5%'s stabelgel) overførtes adskilte proteiner (500 pg totalproteinekstrakt fra lysogene 22 DK 172642 B1

rekombinant-E. coli-celler pr. bane) i et elektrisk felt ved 150 mA i løbet af 4 timer til en nitrocellulosemembran (overføringspuffer: 25 mM TrisxHCl, 192 mM

glycin, 20% methanol, pH 8,3). Nitrocellulosen blev 5 skåret i strimler, og frie bindingssteder blev afmættet i 30 minutter ved stuetemperatur med den følgende puffer: 50 mM natriumphosphat, pH 7,5, 0,5% Tween 20, 0,5% BSA, 0,05% NaN3.

10 Nitrocellulosebæreren blev belagt med allergi kerserum, som var fortyndet i pufferen, svarende til den, der anvendtes til afmætning af de frie bindingssteder. Allergikerserumen fortyndedes i denne puffer i forholdet 1:4 til påvisning af allergenspecifikt igE, 15 mens vævskultursupernatanter fra hybridomceller anvendtes ufortyndet på påvisning af det allergenspecifikke monoklonale antistof (BIPI) Nitrocellulosestrimlerne inkuberedes hver gang med den fortyndede serum eller den ufortyndede supernatant natten over ved 4 C under 20 en vippende bevægelse. De således inkuberede strimler vaskedes dernæst tre gange i den til afmætning af de frie bindingssteder anvendte puffer. Til påvisning af det allergenspecifikke IgE inkuberedes strimlerne i 12 timer ved stuetemperatur med ^^I-anti-humant-IgE. Det-25 te anti-IgE fortyndedes i den ovennævnte puffer I forholdet 1:4, idet pufferen desuden en koncentration på 20 mM af natriumazid og indeholdt 0,4% gelatine.

Påvisning af det monoklonale antistof BIP l: denne udførtes ved tilsætning af det tilsvarende 30 antiglobulin-reagens (anti-muse-IgG fra kaniner) fortyndet i den ovennævnte prøvepuffer i forholdet 1:3.000. Inkubationstiden var 1 time ved stuetemperatur, hvorefter der vaskedes tre gange i afmætningspuf-feren. Dernæst tørredes nitrocellulosestrimlerne, og de 35 opklæbedes på papir. Mængden af bundet 125I-mærket antistof bestemtes dernæst ved, at strimlerne sammen med 23 DK 172642 B1 en røntgenfilm (Amersham RPN 6) blev lagt ind i en Ko- . dakkassette med forstærkerfolie. Eksponering udførtes 0 ved -70 C i 76 timer. Fremkaldelsen udførtes med kommercielt tilgængelige fremkaldere for røntgenfilm. De 5 ved hjælp af de radioaktive antistoffer mærkede proteinbånd kunne ses ved passende filmsværtning (fig. 5A, B).

VIII Subklonlnq af det 2,8 kb SacI-Kpnl-fragment 10

Dernæst udvalgtes de nærmest liggende overskæringssteder til de to Eco-RI-overskæringssteder, nemlig SacI og Kpnl, til elektroforetisk isolering af insertfragmentet. Afstandene mellem insert-(Eco RI-)-15 ende og de to restriktionsendonukleaser SacI og Kpnl er ved KpnI-stedet 1020, og ved Sacl-stedet 1060 basepar (se figur 4).

I) Isolering af et DNA-fragment fra en agaroseqel 20 a) De følgende digestionsblandinger skiltes i 2 trin på 1%'s agarosegeler: 20 pg rekombinant lambda gtll-DNA (plus 2,8 kb insert) i 20 pi H20 hver gang 25 20 pi 10 x puffer ("low salt P.n: 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 pg/ml BSA) 60 U Kpnl 160 pi H20 30 Totalvolumen: 200 pi

Blandingen inkuberedes i 3 timer ved 37°C. NaCl-koncentrationen indstilledes til 40 mM ved tilsætning af 2 pi 4 M NaCl i H20 med henblik på den umiddelbart 35 efterfølgende Sacl-digestion. Denne koncentration svarer omtrent til det for SacI optimale "medium salt- 24 DK 172642 B1 puffer-miljø". Herpå tilsattes 60 U SacI, og digestionsblandingen inkuberedes videre i 3 timer ved 37 °C.

cDNA-insertets størrelse på 750 bp opnåedes som differensen mellem længden af det faktiske fragment på 5 2830 basepar og længden af det ud fra lambda gtll-re- striktionskortet beregnede KpnI-Sacl-afsnit på 2080 basepar. Det opnåede fragment ligeredes dernæst til nøjagtig karakterisering af det klonede cDNA ind i et egnet "Multipurpose-Plasmid", nemlig Bluescript-plasmidet 10 (fig. 6), med henblik på sekvensering af cirkulært dobbeltstrenget- og enkeltstrenget DNA.

b) Eluering af fragmentet.

DNA-båndet ved en størrelse på 2,8 kb, der var 15 let synligt i UV-lys på grund af ethidiumbromidindlej-ringen, anbragtes på DE81 whatman-filter, som ved hjælp af slidser var forkoblet gelfragmenterne på anodesiden. Filterstykkerne vaskedes med 2 x 300 μΐ low salt-vaskepuffer (0,2 NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) 20 og dernæst med 2 x 300 μΐ højsalt-elueringspuffer (1 M NaCl, og ellers som vaskepuffer), hvorefter DNAet elueredes. Efter 2 ganges phenol- og etherekstraktion af den vandige fase og efterfølgende ethanolfældning natten over ved -20 C pelleteredes DNAet (15.000 g, 20 25 minutter), det vaskedes med 70%'s ethanol, pelleteredes igen (15.000 g, 10 minutter) og tørredes i vakuum. Den samlede mængde af eluerede 2,8 kb fragmenter fra de to geler opløstes i ialt 10 μΐ vand og rensedes. En delmængde (0,7 μΐ) overførtes til kvantitativ bestemmelse 30 til en 1%’s agarosegel. Ud fra det opnåede 2,8 kb-bånd kunne man slutte en totalmængde på 200-300 ng for begge fragmenter ved en koncentration på 20-30 yg/ml. Derfor udførtes ligation i Bluescript som forudsætning for alle yderligere karakteriseringstrin.

35 25 DK 172642 B1 2) Forberedelse af plasmldet til llgationen a) Bluescript-plasmid-undervarianterne Ml3 SK+ og Ml3 SK~ (figur 6) digesteredes med Kpnl og Sacl.

5 i begge tilfælde digesteredes 2 yg/2 μΐ plasmid (SK+ eller SK-) med hver af 30 U Kpnl og Sacl (som beskrevet under VIII l a).

b) Ligation i Ml3 SK+ og Ml3 SK-.

10 Det digesterede plasmid-DNA vaskedes (som be skrevet under Vin l b), pelleteredes, tørredes og opløstes i 5 yl H2Q. Til ligation i Bluescript-plasmidet pipetteredes der hver gang 5 yl plasmid (SK+ eller SK-) 15 2 yl dATP (100 mM) 2 yl 10 x ligasepuffer (500 mM Tris, pH 7,4, 100 mM MgCl2, 10 mM Spermidin) 0,5 yl T4 DNA-ligase (5 U/yl) 20 6 yl H20 til 4,8 yl elueret og renset 2,8 kb-fragment, og ligetionsblandingen inkuberedes i 3 timer ved stuetemperatur .

25 c) Fremstilling af kompetente celler og transforma tion.

Til transformationen valgtes en for Bluescript-plasmidet egnet E. coli-stamme, XLI-Blue (recAI, endAI, gyrA96, thi, hsdRl7 (rk-mk+) supE44, relAI, lambda-, 30 lac-, (F’proAB, lac IgZ delM15, TN10)), der muliggjorde en selektion af insertbærende Bluescript-plasmider ved hjælp af beta-galaktosidase-blå-hvid-farveindikator-systemet (se IV 8).

E. coll XLI Blue gjordes kompetent med 100 mM 35 CaCl2 ved 0°C: 50 ml af en kultur i den eksponentielle vækstfase (XLI Blue i LB-tet (Tetracyklin: 20 mg/1)) 26 DK 172642 B1 pelleteredes ved en OD på 460 ved 600 nm. E. coll-pelleten suspenderedes først I 50 ml iskoldt 100 mM CaCl2, centrifugeredes efter en yderligere inkubation (20 minutter ved 0*C) fra og resuspenderedes i 5 ml 100 5 mM CaCl2. Efter 4 timer ved 0°C gennemførtes transformationen som følger: 1/5 af hver af de to under vin 2 b beskrevne ligaseblandinger inkuberedes med 100 μΐ kompetente XLI-Blue-celler og de øvrige 4/5 med 200 μΐ kompetente cello ler ved 0*C. Ved et efterfølgende tominutters varmechok på EJ_coli-bakterierne ved 42°c skete der en optagelse af plasmid-DNAet gennem bakterievæggen.

Efter udpladning af transformationsblandingen på LB-tet-plader og 18-24 timers inkubation ved 37*C brag-15 tes en serie af hvide kolonier af SK+- og SK--trans-formanter i forkultur. Plasmid-DNAet isoleredes i et plasmid-"mini"-præparat efter den alkaliske lysemetode fra disse forkulturer og testedes dernæst ved KpnI/Sacl-kontroldigestion for tilstedeværelse af det 20 2,8 kb insert. To positive kloner, en SK+- og en SK--variant (henholdsvis 2,8 SK+ og 2,8 SK-) udvalgtes til fremstilling af et plasmid-"Maxi"-præparat.

d) Plasmid-"maxi"-pr*parat af 2,8 SK+ og 2,8 SK-.

25 Plasmidpræparatet fremstilledes efter den alka liske lysemetode ud fra 300 ml LB-medium podet med XLI-Blue-transformanter. Adskillelse af plasmid-DNA'et fra RNA'et opnåedes ved differentieret polyethylengly-col (PEG)-fældning med efterfølgende phenolethereks-30 traktion og isopropanolfældning.

IX. Sekvensering af det 2,8 kb fragment med sequenase

Til sekvensering anvendtes 2 kommercielt erhver-35 vede lambda gtll-Primere som udgangspunkt for den enzymatiske syntese af stykker af komplementærstrenge.

27 DK 172642 B1 1. ) Et 15 baser langt enkeltstrenget nukleotid med sekvensen 5’.... GACTCCTGGAGCCCG----3’ 5 der af producenten var betegnet lambda gtll-Primer, der ligger 12 baser fra EcoRI-insertsstedet, ved hvilket den lambda gtll-Arm, der vender mod Sacl-overskæringsstedet, er bundet (figur 7).

10 2. ) Et 15 baser langt enkeltstrenget nukleotid med se kvensen 15 5'----GGTAGCCACCGGCGC____3', der betegnedes lambda gtll revers-primer, og som havde en afstand på 7 baser til Eco Rl-overskæ-ringsstedet, til hvilket lambda gtll-armen, der 20 vendte mod KpnI-overskæringsstedet, var bundet (figur 7).

Dette muliggjorde, at insertet herefter hver gang kunne sekvenseres komplementært fra begge sider, 25 hvorved hele nukleotidsekvensen af fragmentet kunne opnås. Det rensede plasmid-DNA af 2,8 SK+ og 2,8 SK~ opløstes i 10 μΐ vand efter pelletering, vask i 75%'s ethanol og genpelletering, og en delmængde på l μΐ udtoges til mængdebestemmelse. Ifølge denne var DNA-kon-30 centrationen 1-2 μg/μl.

28 DK 172642 B1

Selcvenserlnqsmetode: 1.) AnnealingsreaktIon.

Annealingsblanding: samlet volumen 10 yl 5 2 pi plasmid-DNA (1-2 yg/yl) 2 yl H20 2 yl sekvenseringspuffer (200 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 250 mM NaCl) 10 i yl Primer (0,67 pMol/yl)

Annealingsblandingen fyldtes i et glaskapillar-rør, der tilsmeltedes i begge ender. Dette behandledes i 5 minutter i kogende vand, dykkedes dernæst hurtigt 15 ned i -70 °C kold alkohol, holdtes der i 5 minutter, bragtes dernæst til 65 C og afkøledes langsomt til 35 C. Denne procedure bevirkede en adskillelse af de to strenge og indlejring af primeren.

Der fremstilledes samtidig 4 annealingsblandin-20 ger, 2 og 2 med primer og revers-primer.

2) Mærkninqsreaktlon

Til mærkningsreaktionen fortyndedes "mærk-25 ningsstamopløsnlngen" såvel til primersekvenseringen som til revers-primer-sekvenseringen i forholdet 1:2 eller 1:10. l:2-og 1:10-blandingerne er angivet på basis af den relative mængde desoxy(d)nukleotid i blandingen. 1:10-fortyndingen anvendtes for korte 30 strengstykker til bedre opløsning af startsekvensen, og l:2-fortyndingen for længere strengstykker.

Mærkningsstamopløsning: 7,5 yM dGTP

7.5 yM dCTP

7.5 yM dTTP 35 Mærkningsblanding: 29 DK 172642 B1

De 4 annealingsblandinger overførtes fra kapillarrørene til reaktionsbeholdere.

Til hver 10 μΐ annealingsblanding sattes 5 1 pi 0,1 M dithiothreit (DTT) 2 pi dNukelotidfortynding (hver gang 1:2 og i:io for primer og reversprimer) 0,5 pi 32P-alpha-dATP (1 mCi/ml) 10 2 pi sequenase (fortyndet i forholdet 1:8 i TE), der blandedes godt, og de 4 blandinger inkuberedes ved stuetemperatur i .5 minutter.

3) Terminerlnqsreaktion 15

Pr. prøve indstilledes 4 reaktionsrør (A,G,C,T) med hver 2,5 pi "termineringsblanding" 8 pM af hvert dideoxy (DD) (nukleotid) til 37 C. 3,5 pi af den relevante mærkningsreaktionsblanding pipetteredes i hvert 20 af disse, hvilket medførte en inkorporering af dd-nu-kleotider og således afsluttede forlængelsen af strengene. Reaktionen afsluttedes efter en 5 minutters inkubation ved 37 C hver gang ved tilsætning af 4 pi af en stopopløsning (98,5% formamid, 0,05% bromphenolblåt, 25 0,05% xylencyanol, 0,05 x TE, pH 8). Prøverne opbevaredes ved -2o’c, indtil de efter 2 minutters opvarmning af prøverne ved 75-85*C til denaturering af strengene påførtes gelen.

30 DK 172642 B1 4) Sekventerlnqsqelen 97,5 ml 6% acrylamid (AA)-stamopløsning 2,5 ml 20 x TBE puffer (1 M tris, pH 7,5, 1 M borat, 5 20 rnM EDTA) 220 μΐ 25% amoniumpersulfat (APDS), i H20 50 pi tetramethylendiamin (TEMED) (6% AA-stamopløsning: 57 g acrylamid, 10 3 g bisacrylamid og 481 g urinstof)

Inden udhældning af gelen var glaspladen renset 3 x med H20 og 3 x med ethanol, og en af pladerne var 15 afgnedet 2 x med 5 ml silaniseringsopløsning (2% di-chlormethylsilan i chloroform). Gelen polymeriserede natten over ved stuetemperatur. En time inden påføring af prøven sattes gelen under spænding med 2000 volt, til opnåelse af den til DNA-natureringen nødven- 0 20 dige temperatur på mindst 50 C. Prøven opvarmedes i 2 minutter ved 80°C, og gellommerne skyldedes godt til fjernelse af urinstofpolymerisater. Blandingerne med den 1:2 fortyndede dnukleotid-"mærkningsblanding opdeltes hver gang på 2 4-bånds gennemløb. Mellem disse gen-25 nemløb var tidsrummet mellem påføring og udløb af blåmarkøren og yderligere 1 time. Efter yderligere 2 x gennemløb af blåmarkøren påførtes 1:10 fortyndingen som ovenfor på 4 baner, og man lod dem løbe gennem, indtil blåmarkøren havde nået underkanten af gelen. 2 μΐ på-30 førtes pr. lomme, spændingen var 1500-2000 volt. Efter afslutningen af elektroforesen overførtes gelen til Whatman DEAE-papier, den tørredes ved 80#C i vakuum og eksponeredes uden forstærkerfolie.

35 DK 172642 B1 3 1 5) Analyse af sekvensdata

Den ved denne første sekvenasereaktion opnåede sekvens af insertet var allerede med hensyn til 5 længden næsten fuldstændig, idet overlapningen i det midterste afsnit af insertet jo kunne læses fra begge sider (Fig. 8). Efter en restriktionsanalyse af de sekvenseringsdata, man allerede var i besidelse af, udvalgtes nogle vigtige unikke 6-baseoverskæringssteder 10 til subklonlng af passende fragmenter til udførelses af en efterfølgende undersekvensering. Denne var nødvendig, idet den sekvens, man var i bestillelse af, endnu indeholdt uklarheder, den udviste gentagelsesenheder mellem komplementære strengafsnit eller huller i initi-15 eringsområdet af begge insertsender. De udvalgte restriktionssteder var:

1) Bel I: T G A T C A

2) Bgl II: A G A T C A

20 3) BamH I: G G A T C C

Disse 3 steder har bl.a. de praktiske fordele, at de indeholder den samme midterbasesekvens...GATC..., og at de efter restriktion danner 4 basers udhæng. Der-25 for kan fragmenter, overskåret med disse enzymer ligeres med hinanden.

6) verificering af de forhåndenværende data 30 Rigtigheden af sekvensen for Bgl II- og BamH I- restriktionsstederne bekræftedes ved kontroldigestion ved hjælp af gelelektroforese (1% agarose), såvel 2,8 SK+- som 2,8 SK_-fragmenter digesteredes med enzymblandingen kpnl/Bgl II, Eco RI/Bgl II eller BamH Ι/Eco RI.

35 De opnåede fragmenter på ca. 1400 bp, 380 bp eller 350 bp var kompatible med de ud fra genkortet for SK

32 DK 172642 B1 eller for det 2,8 kb fragment beregnede båndlængder.

Afvigelser på ±30 basepar var mulige på grund af ufuldstændigheden af sekvensen.

Til bekræftelse af de opnåede sekvensdata eller 5 korrigering af uklarheder gennemførtes dernæst følgende forsøgsprocedurer: X. Sekvensering af underfragmenter af det 2,8 kb frag-ment efter Maxam & Gilbert ______ 10 1) 32P fra underfraqmenter efter Bql Il-digestion.

Princip: Ved Bgl il-digestion dannes to 5'-udhængene ender. 51..A..GATCT..3'. Disse anvendes af den 15 reverse transcriptase (RT) som udgangspunkt for en 32P-alpha-dATP-mærkning fra 5' mod 3'. Efterfølgende digestion med SacI giver 2 radioaktive mærkede fragmen ter.

20 1) Et kort Bgl il/Sacl-fragment på ca. 1400 bp.

2) Et lang fra Bgl II udgående fragment på ca. 4300 bp omfattende restplasmidet.

Bgl II digestion af 2,8 SK+: samlet volumen 200 25 yl: 10 yg DNA digesteredes med højtsalt-puffer 10 mM

Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl og 100 yg/ml bovint serumalbumin) og 60 U Bgl II ved 37 C natten over. Digestionsblandingen phenolbehandledes (1/4 vol phenol/mættet tris), behandledes 2 x med ether og fæl-30 dedes med Isopropanol. Efter pelletering, vask af pel-leterne i 70% ethanol og genpelletering opløstes DNA i 20 yl H20.

35 33 DK 172642 B1 32P-mærkning af de 2 Bgl Il-ender: samlet volumen 50 μΐ 20 μΐ DNA (1 μg/μl) 5 μΐ 10 x RT-puffer 3 μΐ 32 P-alpha-dATP (l mCi/ml) 5 5 μΐ dGTP (10 mM) 1 μΐ BSA (50 mg/ml) 2 yl RT (20 U/μΙ) 14 μΐ H20 10 Blandingen inkuberedes i en time ved 25*0.

Der digesteredes dernæst med Sacl. Dernæst indstilledes RT-blandingen til en koncentration på 10 mM Tris og 10 mM MgCl2, hvorved den gjordes Sacl-kompati-bel. Digestionsblandingen inkuberedes i en time ved 15 37°C.

Elueringen af de to fragmenter udførtes som beskrevet under VIII l ud fra en agasoregel. Efter phe-nolbehandling og 2 x ekstraktion af den vandige fase opdeltes de to eluater på hver 5 reaktionsbeholdere, 20 hvorefter der udførtes ethanolfældning af de mærkede fragmenter ved -70*C.

2) sekvensering ifølge Maxam & Gilbert 25 a) Sekvenseringsprocedure.

DNA-fragmenterne (lille fragment: ca. 1400 bp, stort fragment: ca. 4300 bp) vaskedes med 70%'s ethanol, pelleteredes (hver gang 5 pellets/fragment) og se-30 kvenseredes efter fremgangsmåden ifølge Maxam &

Gilbert. Efter afslutning af sekvenseringen analyseredes de ud fra de 5 blandinger (G, G+A, C+T, C, A+C) opnåede pellets separat efter fremgangsmåden ifølge Cerenkov, hvorefter de opløstes i forskellige voluminer 35 (dog mindst 12 μΐ) formamid-stop-puffer, således at hver blanding udviste den samme radioaktivitet/μΐ. De 34 DK 172642 B1 færdige prøver opbevaredes ved -20 C.

b) Sekvenseringsgeler.

5 Under påføring på polyacrylamid (PAA)/urinstof geler med forskellig AA-koncentration (6 eller 20%'s) opnåedes en bedre opløsning i startsekvenserne.

20%'s gel 20% AA-stamblanding:

10 til 60 ml: 197 g AA

1.5 ml 20 x TBE puffer, 3 g BisAA

58.5 ml 20%'s AA-stamopløsning. 481 g urinstof.

9 0 yl 25%'s APDS (Ammoniumper- oxodisulfat) 15 40 yl TEMED (Ν,Ν,Ν',Ν'-tetra- methylethylendiamin) 2 yl pr. bane af hver blanding opvarmedes i 2 minutter til 80*C og påførtes dernæst gelerne. På den 20 6%'s gel opdeltes prøverne (lille og stort fragment tilført ved siden af hinanden) i 3 fembaners (G, G+A, C+T, C, C+A) gennemløb ved 2000 volt. Mellem gennemløbene lå begge gange tidsrummet indtil udløb af blåmarkøren plus en time. På den 20%'s gel deltes der hver 25 gang kun på et fembaners gennemløb indtil blåmarkøren havde nået midten af gelen.

c) Udnyttelse af de ved Maxam 6 Gilbert-sekvenseringen opnåede data.

30 ved denne anden sekvenseringsproces kunne hullerne hos insertenderne kompletteres og en stor del af uklarhederne belystes.

35 35 DK 172642 B1 XI. Videre underkloning som yderligere kontrol.

1) Isolering af et BamHI/HlncIl-fraqment med underklo-nlnq og enkeltstrenqssekvenserlng ved hjælp af se-5 kvenase.

Målet var at beskrive ændringen af det ikke overskærlige Eco RI-restriktionssted. Hertil udvalgtes et unikt HincII-restriktionssted, der lå 126 baser fra 10 dette Eco RI-restriktionssted på den lambda-gtll-Arm, der var bundet til Sacl-restriktionsstedet.

a) BamHl/HincIl-digestion.

i) af 2,8 SK+: 3 yg DNA digesteredes med 15 U af 15 hver af BamHl og Hindi I højsalt-puffer (HS), il) af SK+ og SK": 2 yg af henholdsvis SK+ og SK" digesteredes med 10 U af hver af BamHl og Hindi.

0 inkubationen udførtes ved 37 C natten over.

20 Efter gelelektroforese elueredes BamHI/HincIl- fragmentet (se under VIII l b). Halvdelen af eluatet forenedes med SX+-digestionsblandingen, og den anden halvdel forenedes med SK“-digestionsblandingen, og de to DNA-blandinger fældedes med ethanol.

25 b) Efter pelletering af de to DNA-bundfald udførts ligation og transformation i XLI blue (som beskrevet under VIII 2 b og c).

36 DK 172642 B1 2) isolering af et Eco RI/Bql ΙΙ-fraqment med underklo-ning og enkeltstrengssekvensering ved hjalp af se-kvenase 5 a.) Eco RI/Bgl Il-digestion i) af 2,8 SK+: 12 pg 2,8 SK+-DNA digesteredes med 60 U Eco og 60 U Bgl II I HS-puffer.

li) af SK+ og SK-: 2 yg af henholdsvis SK+ og SK-10 digesteredes med 10 U BamHI og 10 U Bgl II i HS-puffer. Der udførtes inkubation i 3 timer ved 37 *C.

Den til i) svarende digestion af SK+ og SK-15 gennemførtes med Eco RI og BamHI (Bluescriptplasmidet har intet Bgl Il-restriktionssted på polylinkeren).

Hertil udnyttedes ligeringsevnen af de to palindrom-re-striktionssteder.

Efter gelelektroforese elueredes Eco RI/Bgl II-20 fragmentet (som under VIII l b), og det fældedes med ethanol sammen med de Eco Rl/BamHI-digesterede SK+- og SK--plasmlder (som beskrevet under XI 1 a).

b.) Ligation og transformation udførtes som beskre-25 vet under VIII 2 b og c.

verificering af de i XI 1 og XI 2 udførte transformationer.

30 Ved plasmidpræparation efter den alkaliske lyse metode isoleredes de underfragmentbærende SK+- og SK--Bluescript-plasmlder ud fra transformanterne af begge ligationer.

35 37 DK 172642 B1

Kontroldigestion af rekombinanterne: 1. ) BamHl/HincIl til bekræftelse af BamHI/HinclI-ind føj el sen.

2. ) Eco RI/Xbal til bekræftelse af Eco Rl/Bgl II-ind- 5 føjeisen.

(Bgl Il-stedet kunne på grund af ligering med BamHI-restriktionsstedet ikke mere overskæres).

Begge digestionsblandinger adskiltes på agarose-10 geler. Herved kunne ligation og transformation af begge underfragmenter i henholdsvis SK+ og SK” dokumenteres.

Samtidig kunne udgangsklonen udvælges til enkeltstrengssekvenseringen efter kvalitative og kvantitative kriterier.

15 3) Enkeltstrenqssekvenserinq af Bluescript-DNA-under-fragmenter a) Fremstilling af enkeltstrenget DNA ved hjælp af 20 hjælpefager.

En SK+- og en SK”-subklon med BamHI/HinclI- eller Eco RI/BglII-fragmentet opformeredes i en 2,5 ml forkultur (LB/amp/tet) natten over ved 37 °C. Herefter podedes 2,5 ml LB videre med 50 μΐ. Efter 30 minutter 25 ved 37#C tilsattes 10 yl af Bluescript-hjælpefagen R408 med en titer på 5,5 x 10(10) plaquedannende enheder/ml til hver prøve, og de fire kulturer omrystedes .i 8 timer ved 37 C. Dernæst overførtes 1,2 ml fra hver til reaktionsrør, og der centrifugeredes i 15 minutter ved 30 15.000 g. Enkeltstrengsvarianterne af de insertsbærende plasmider

Eco RI/BamHI SK+ ligeret med Eco Rl/Bgl Il-fragment Eco RI/BamHI SK” ligeret med Eco Rl/Bgl Il-fragment HincII/BamHI SK+ ligeret med HincII/BamHI-fragment 35 HincII/BamlH SK” ligeret med HincIl/BamHI-fragment 38 DK 172642 B1 befandt sig nu i supernatanten og fældedes med 300 μΐ polyethylenglycol (20%'s PEG 6000 i 3,5 M ammoniumacetat). Efter 15 minutter ved stuetemperatur pelleteredes det enkeltstrengede DNA, som dernæst opløstes i 300 pi 5 TE-puffer. Efter ekstraktion af den vandige fase med phenol og 2 gange med ether udførtes ethanolfældning under tilsætning af 50 vol% 7,5 M ammoniumacetat ved -70cC.

Som primer til enkeltstrengssekvenseringen med 10 sekvenase anvendtes to kommercielt tilgængelige oligo-nukleotider, som svarede til segmenter af Bluescript-LacZ-genet til begge sider for polylinkeren.

1. ) T3-Prlmer: et 17 basers langt oligonukleotid med 15 sekvensen 5'.....ATTAACCCTCACTAAAG.....3' koblet til polylinkeren på Sacl-siden af SK LacZ- 20 genet, til primlngsreaktion med SK"-rekombinaterne (figur 9).

2. ) T7-Primer: et 17 basers langt oligonukleotid med sekvensen 25 5'.....A ATACGACTCACTATA G.....3' koblet til KpnI-siden af polylinkeren, til pri-mingsreaktionen med SK+-rekombinanterne (figur 9).

30 c) Sekvenseringsprocedure

Det enkeltstrengede DNA vaskedes efter PEG-be-handlingen med 70%'s ethanol, det pelleteredes og oplø-35 stes i 10 μΐ H20. Efter gelkontrol af delmængder (1 μΐ) anvendtes 7,5 μΐ af hvert DNA med ca. 400-600 39 DK 172642 B1 ng/blanding til annealingsreaktionen. Den fortyndede dNukleotidblanding til mærkningsreaktionen tilsattes med 1,5 (dNukleotid-stammeopløsning i H20), og mærkningen udførtes med 32P-alpha-dATP. Alle yderligere trin 5 var identiske med trinnene, der allerede er beskrevet ved den første sequenasesekvensering. Termineringsblan-dingen opdeltes hver gang på 2 firebaners (ACGT) gennemløb, mellem hvilke der hver gik den tid, som to ganges udløb af blåmarkøren tog. Der anvendtes en 6%*s 10 gel.

d) Udnyttelse af de ved denne tredie sekvenseringsmetode opnåede data.

15 Den ved enkeltstrengssekvenseringingen med se- quenase nu tre gange fuldstændigt kontrollerede nukleo-tidsekvens af det væsentligste birkeallergen Bet v I kan ses i figur 10.

Længden af cDNA-insertet er 727 baser (figur 20 10). Baserne 1-11, dvs. baserne indtil det (T-delete-rede) Eco RI-restriktionssted ved positionerne 11-15, og baserne 739-744, dvs. baserne fra det (intakte) Eco RI-restriktionssted til sekvensenden, stammer fra fra fag-lambda-gt-11.

25 1) Det kodende segment.

Den for Bet v I kodende sekvens er i figur 10 kendetegnet ved den fra begyndelsen til enden af nu-30 kleotidsekvensen parallelt løbende aminosyresekvens.

Det kodede protein har en beregnet MG på 17.570. Sekvensen begynder med den for aminosyren (AS) methionin kodende basetriplet ATG (position 65-67) og ender med basetripletten TAA (position 545-547). Disse to tri-35 pletter er ved den genetiske kode defineret som startog stopkodoner. Fra ATG til TAA er læserammen åben.

40 DK 172642 B1

Den ud fra denne nukelotidsekvens opnåede proteinsekvens stemmer overens med AS-sekvensen af proteinet Bet v I, der sekvenseredes indtil AS 35 fra N-termi-nusen.

5 Basetripletterne fra position 311 til position 319 koder for aminosyrerne: Asn-Tyr-Ser. Med hensyn til denne aminosyretriplet er der tale om et potentielt glykosyleringssted.

DNA-sekvensen af Bet v 1 udviser stor homologi 10 med et sygdomsresistensfremkaldende gen hos ærter, som allerede diskuteret i indledningen.

2) Ikke-kodende segmenter.

15 a) Det ikke-kodende segment fra base 12 til base 64.

Ændringen af Eco Ri-stedet ved position 11 fremkaldtes ved en deletion af et thymidin.

Men hensyn til baserne umiddelbart inden start-20 kodonet, GCC ATC ATG, er der tale om en i litteraturen beskrevet signalsekvens, i hvilken det i minus-3-posi-tionen stående A er konstant, mens de andre baser kan variere (Lutcke et al., EMBO J. 6, 43-48, 1987).

25 b) Det ikke-kodende segment fra base 548 til 744.

Enden af cDNAet er karakteriseret ved en poly-adenylsekvens på 29 A'er.

Basesekvensen ved position 693-698, AAT AAA, er en for polyadenyleringen væsentlig konsensus-signalse-30 kvens, der er beskrevet i litteraturen (M. Birnstiel et al., Cell 41, 349, 19..). Af de ovenstående data fremgår : det totale mRNA klonedes via cDNA. Læserammen er åben.

Med hensyn til den ovenfor anførte sekvens er der tale 35 om det fuldstændige gen for proteinet Bet v I.

41 DK 172642 B1

Sammenfattende beskrivelse af de vedlagte figurer.

Fig. i. RNA-karakterisering på 6% polyacrylamid - 50% urinstofgel. M: marker. 1-5: uafhængige RNA-isolater 5 fra hanblomsterstande.

Fig. 2. Påvisning af positive insertsbærende kloner ved hjælp af IgE-antistoffer fra allergikere.

1) l. Påvisningstrin: 2 positive kloner (pil) videre- 10 førtes.

2) Rekloning af de positive kloner.

Fig. 3. Restriktionskort for fagen lambda-gtll. Pil (med stjerne) markerer insertstedet for cDNAet.

15

Fig. 4 A.

1) λ gtll-DNA med insert (KpnI/SacI-digesteret): 2,8 kbp XpnI/SacI-fragment (Rude).

2) λ gt ll-DNA uden insert (KpnI/SacI-digesteret): 2,08 20 kbp KpnI/SacI-fragment (Ruder).

3) X gtll-DNA med insert (Sacl/Eco Rl-digesteret): 1,06 kbp Sacl/Eco Ri-fragment (Dobbeltruder).

4) X gtll-DNA uden insert (Sacl/Eco Rl-digesteret): 1,8 kbp Sacl/Eco Ri-fragment (Dobbeltruder).

25 5) X-vildtype-DNA, Pstl-digesteret.

Fig. 4 B. Udsnit af lambda gt ll-genomet me.d cDNA-insertet, de to Eco RI-restriktionssteder (det der ligger nærmest Sacl-stedet er deleteret) og de flankerende 30 Kpnl- og Sacl-restriktionssteder. Lac Z-gendelen er underpunkteret .

42 DK 172642 B1

Fig. 5. Western-/Immunblot.

A) Immunblot med allergikerserum; Detektion med 125I-anti IgE.

5 1) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089.

2) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089 inficeret med λ gt li uden insert.

3) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089 inficeret med insertbærende λ gt 11 (klon HB6).

10 4) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089 inficeret med insertbærende λ gt 11 (klon HB8).

5) Birkepollenekstrakt BP VIII D.

B. Immunblot med monoklonalt antistof Bip 1; Detektion 15 med anti-muse-lgG (kaniner) og 125I-anti-kanin-lg.

1) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089.

2) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089 inficeret med λ gt il uden insert.

20 3) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089 inficeret med insertbærende λ gt 11, (klon HB6).

4) Proteinekstrakt fra E. coli Y 1089 inficeret med insertbærende λ gt 11 (klon HB8).

5) Birkepollenekstrakt BP VIII D.

25

Flq. 6. Restriktionskort for plasmidet pBluescrlpt SK(+/-).

Fig. 7. Udsnit af det 2,8 kb-fragment til angivelse af 30 cDNA-Insertet med lambda gtll-sekvenseringsprimere; pilene peger i synteseretningen.

43 DK 172642 B1

Fig, β. Autoradiografi af sekvenseringsgelen efter den første sekvensering af cDNA-insertet ved hjalp af lambda-gtil-primeren og sequenase; radioaktiv isotop: 32P.

5

Fig. 9. Udsnit af lacz-genet af Bluescriptplasmidet.

Der vises området fra T7-promotoren til T3-promotoren.

Der imellem ligger polylinkeren. Start og slut af de to prlmere er antydet med pile.

10

Fig. 10. viser den endelige sekvens af cDNA-insertet.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til påvisning af polynukleoti-der, der i deres åbne læseramme koder for proteiner, hvis biologiske aktivitet som allergener svarer til i naturen forekommende planteallergener, kende- 5 tegnet ved, at en cDNA-klonbank fra plantevæv tilvejebringes, at proteiner ved ekspression af denne klonbank produceres, som bringes i kontakt med sera fra allergikere til opnåelse af proteiner, som reagerer med IgE-antistoffer og at allergene fusionsproteiner påvi- 10 ses ved binding af anti-IgE til allergene fusionspro-teiner/IgE-komplekse.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en reaktant, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det polynukleotid, 15 der koder for det identificerede protein, indføres i lambda-gtll-fager.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af en reaktant, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polynukleotidet, der 20 koder for det identificerede protein, indføjes i plas-midet "Bluescript SK (+/-)".

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at den frembragte vektor bringes til ekspression i en encellet mikroorganisme, fortrins- 25 vis E. coli. 5. cDNA screenet ved fremgangsmåden ifølge krav l, kendetegnet ved, at det koder for den ved sekvensen fastlagte allergent virksomme epitop af proteinet, idet det i den åbne læseramme har den i figur 30 10 gengivne opbygning. 6. cDNA ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det har den i figur 10 gengivne sekvens eller delsekvenser deraf. DK 172642 B1 7. cDNA ifølge krav 5 eller 6, kendetegne t ved, at det har en sekvens, der hybridiserer med sekvensen ifølge figur 10 under stringente betingelser og koder for det efter fremgangsmåden ifølge krav l 5 identificerede protein.

8. CDNA ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at det har en sekvens, der er afledt af sekvensen ifølge figur 10 ved degeneration, og at det koder for et efter fremgangsmåden ifølge krav 1 identi- 10 flceret protein.