NO300639B1 - Fremgangsmåte for isolering og rensing av lantibiotika valgt fra gallidermin og epidermin - Google Patents
Fremgangsmåte for isolering og rensing av lantibiotika valgt fra gallidermin og epidermin Download PDFInfo
- Publication number
- NO300639B1 NO300639B1 NO921446A NO921446A NO300639B1 NO 300639 B1 NO300639 B1 NO 300639B1 NO 921446 A NO921446 A NO 921446A NO 921446 A NO921446 A NO 921446A NO 300639 B1 NO300639 B1 NO 300639B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- lantibiotic
- sepharose
- gallidermin
- epidermin
- matrix
- Prior art date
Links
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108010047651 gallidermin Proteins 0.000 title claims description 26
- AHMZTHYNOXWCBS-PCUVAHMGSA-N gallidermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CSC[C@H](C(N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]1C(N2CCC[C@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@H]1C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C\C)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]2C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](C(N/C=C/SC2)=O)CSC1)=O)=O)C1=CC=CC=C1 AHMZTHYNOXWCBS-PCUVAHMGSA-N 0.000 title claims description 26
- GDSYPXWUHMRTHT-UHFFFAOYSA-N Epidermin Natural products N#CCC(C)(C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O GDSYPXWUHMRTHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 20
- 108010064962 epidermin Proteins 0.000 title claims description 20
- CXTXHTVXPMOOSW-JUEJINBGSA-N epidermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CSC[C@H](C(N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]1C(N2CCC[C@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS[C@H]1C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)NCC(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]2C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@H](C(N\C=C/SC2)=O)CSC1)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 CXTXHTVXPMOOSW-JUEJINBGSA-N 0.000 title claims description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 69
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 35
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 19
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 16
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 14
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 12
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 11
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 10
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 10
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 10
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 claims description 9
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 claims description 8
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 6
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 3
- 108091006522 Anion exchangers Proteins 0.000 claims 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- QJDWKBINWOWJNZ-OURZNGJWSA-N cinnamycin Chemical compound CC(C)[C@@H]1NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@H](Cc3ccccc3)NC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc3ccccc3)NC(=O)[C@@H]3CNCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H]4NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CSC[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CS[C@H]4C)C(=O)N[C@@H](CS[C@H]2C)C(=O)N3)NC1=O)[C@@H](O)C(O)=O)C(O)=O QJDWKBINWOWJNZ-OURZNGJWSA-N 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- -1 sodium chloride Chemical class 0.000 description 3
- DEEOVDONDDERBX-MUDWFXPSSA-N (2S)-6-amino-2-[[(1S,4R,10S,19S,22S,25S,28S,31S,34R,37S,43S,46S,47S,50R,53S,56S,62S)-50-amino-43-(2-amino-2-oxoethyl)-56-(3-amino-3-oxopropyl)-10-benzyl-37-(carboxymethyl)-31-(hydroxymethyl)-28-(1H-indol-3-ylmethyl)-47,62-dimethyl-7-methylidene-22-(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,41,44,51,54,57-heptadecaoxo-53-propan-2-yl-48,60,63-trithia-3,6,9,12,15,21,24,27,30,33,36,39,42,45,52,55,58-heptadecazatetracyclo[32.24.3.34,25.015,19]tetrahexacontane-46-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@@H]1NC(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]2CS[C@@H](C)[C@@H](NC1=O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c3ccccc13)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1CSC[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CS[C@@H](C)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC1=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C(C)C)C(=O)N2 DEEOVDONDDERBX-MUDWFXPSSA-N 0.000 description 2
- DPEYHNFHDIXMNV-UHFFFAOYSA-N (9-amino-3-bicyclo[3.3.1]nonanyl)-(4-benzyl-5-methyl-1,4-diazepan-1-yl)methanone dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CC1CCN(CCN1Cc1ccccc1)C(=O)C1CC2CCCC(C1)C2N DPEYHNFHDIXMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 2
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 108010055869 ancovenin Proteins 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 108010063293 cinnamycin Proteins 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 108010067071 duramycin Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- SFWLDKQAUHFCBS-WWXQEMPQSA-N lancovutide Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCNC[C@H]4C(=O)N[C@@H](CC=5C=CC=CC=5)C(=O)NCC(=O)N5CCC[C@H]5C(=O)N[C@@H](CC=5C=CC=CC=5)C(=O)N[C@H]([C@@H](SC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CSC3C)CSC2)C(=O)N4)C)C(=O)N1)C(O)=O)[C@@H](O)C(O)=O)=O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 SFWLDKQAUHFCBS-WWXQEMPQSA-N 0.000 description 2
- 108010005817 lanthiopeptin Proteins 0.000 description 2
- SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N lantibiotic pep5 Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N\C(=C/C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N\C(=C(/C)S)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=O)CC SRCAXTIBNLIRHU-JJKPAIEPSA-N 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 2
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 101150099695 vps11 gene Proteins 0.000 description 2
- NSGOABPZARPCFM-UHFFFAOYSA-N (2S,3S,2'R)-beta-Methyllanthionine Chemical group OC(=O)C(N)C(C)SCC(N)C(O)=O NSGOABPZARPCFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 102000010029 Homer Scaffolding Proteins Human genes 0.000 description 1
- DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N L-lanthionine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CSC[C@H](N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 241000192085 Staphylococcus gallinarum Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000520730 Streptomyces cinnamoneus Species 0.000 description 1
- 241000970984 Streptomyces griseoverticillatus Species 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N meso-lanthionine Natural products OC(=O)C(N)CSCC(N)C(O)=O DWPCPZJAHOETAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000012799 strong cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Selective Calling Equipment (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Air Bags (AREA)
- Blow-Moulding Or Thermoforming Of Plastics Or The Like (AREA)
- Coin-Freed Apparatuses For Hiring Articles (AREA)
- Telephone Function (AREA)
- Data Exchanges In Wide-Area Networks (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Denne oppfinnelse angår rensingen av antibiotika kjent under betegnelsen lantibiotika, særlig rensing av gallidermin og epidermin. Lantibiotika er en klasse av små peptid-antibiotika som karakteriseres ved forekomst av lantionin og 3-metyl-lantionin-broer. Til denne klasse hører subtilin, nisin, epidermin, gallidermin, pep5, ancovenin, Ro 09-0198, cinnamycin og duramycin.
Lantibiotika kan fremstilles ved dyrking av forskjellige stammer av mikroorganismer, så som: pep5 (Staphylococcus edpidermis strain 5), epidermin (Staphylococcus epidermin DSM 3095) , nisin .(Streptococcus lactis, lancefield, group N) , gallidermin (Staphylococcus gallinarium DSM 4616), subtilin (Bacillus subtilus NRRL 8-543), ancovenin (Streptomyces sp. no. A647P-Z), Ro 09-0198 (Streptoverticillium griseoverticil-latum), duramycin (Streptmyces cinnamoneus forma azacoluta), cinnamycin (Streptomyces cinnamoneus).
En nyttig beskrivelse av ovennevnte lantibiotika sammen med litteraturreferanser for disse finnes i Kellner et al., Eur. J. Biochem. 177: 53 - 59 (1988).
Ved dyrking av mikroorganismestammen, f.eks. etter konvensjonelle metoder, utskilles lantibiotikumet i dyrknings-mediet. Fermentering kan foretas som beskrevet i EP-A-350810.
Kjente rensemetoder innbefatter for eksempel adsorpsjon på adsorberende resin etterfulgt av rensing ved hjelp av andre kromatografiske metoder.
Eksempelvis beskriver Kellner et al. (supra) en fremgangsmåte for isolering av gallidermin etter dyrking av Staphylococcus gallinarum (20 1) i 24 timer. Dette ble oppnådd ved først å tilsette Amberlite XAD-1180 direkte til fermenteringsbeholderen i tre satser i mengder på 2%, 1% og nok en gang 1% av volumet av fermenteringsbuljongen, som vanligvis inneholder ca. 100 mg/l gallidermin. Lantibiotikumet kan bindes til det adsorberende resin ved en batch-prosess. Resinet ble deretter frafiltrert og vasket med vann, eluert med metanol/0,01M HC1 (9:1 volumdeler) og det aktive eluat konsentrert til en tørr masse. Etter oppløsning, ble residuet påsatt på Amberlite IRC-50 (H+<->form) ved pH 5,5, ionebytteren vasket med vann og gallidermin eluert med 0,IM HC1. Etter avsalting gjennom adsorpsjon, igjen med Amberlite XAD-1180, førte lyofilisering til 1,0 g av det rå lantibiotikum. Etter avsluttende rensing ved omvendt fase HPLC med Nukleosil SC18-300 som stasjonær fase og forskjellige gradienter av acetonitril/0,1% trifluoreddiksyre i vann, ble det oppnådd 100 mg ren gallidermin. Med ca. 2000 mg gallidermin i fermenteringsbuljongen ved slutten av dyrkingen, tilsvarer dette utbytte på 100 mg ved avslutning av rensingen, et relativt totalutbytte på 5%.
Homer et al. i Appl. Microbiol. Biotechnol. 30, 219-225 (198 9), beskriver en fremgangsmåte for fermentering og isolering av epidermin. Rensing foretas i det vesentlige som beskrevet ovenfor for gallidermin; nemlig ved adsorpsjon på Amberlite XAD-1180, etterfulgt av eluering, påsetting på den svake kationbytter Amberlite IRC-50 og avsluttende rensing ved preparativ HPLC på Nucleosil 100 C-18. En renhet på 80% angis for denne kombinerte bruk av adsorpsjons- og ionebytter-kromatografi.
For kommersiell anvendelse av et lantibiotikum er det klart behov for høyere renhet, og bedre utbytter for rense-prosessen er også ønskelig.
Vanskelighetene ved rensing av lantibiotika har sammenheng med de biologiske synteser og de kjemiske strukturer for disse biologisk aktive peptidene og inkluderer følgende: masseproduksjon av opptil 1 g/l av et lantibiotikum kan kun oppnås med fermenteringsmedier som inneholder kjøtt-ekstrakt eller maltekstrakt, hvilket resulterer i komplekse blandinger for senere nedstrøms-behandling;
som følge av deres høye innhold av basiske og hydrofobe aminosyrer, kan kun noen få utvalgte isolasjonsteknikker anvendes;
ustabiliteten av produktet ved høyere pH-verdier gir vesentlige begrensninger i området for de buffersystemer som kan benyttes; og
forekomsten av biologisk aktive oligomerer og monomerer fordrer bruk av høyoppløsende separasjonsteknikker.
Et formål med foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for rensing av lantibiotika.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen angår rensing av et lantibiotikum valgt fra gallidermin og epidermin med et totalt utbytte på minst 50% og en total produktrenhet på over 99%. Fremgangsmåten består i å frembringe et lantibiotikaholdig fermenteringsmedium og underkaste mediet eller lantibiotikaholdige medier oppnådd fra dette, suksessive trinn med: adsorpsjon av lantibiotikumet fra fermenteringsbuljongen over på en styren-divinyl-kopolymerisat-matriks, så som f.eks. Amberlite XAD-1180;
eluering 'av lantibiotikumet fra en styren-divinyl-kopolymerisat-matriks ved bruk av en metanolisk oppløsning inneholdende fra 0,001M til 0,IM saltsyre;
kationbytterkromatografi av eluatet ved bruk av sterk kationbytter med matriks på polysakkaridbasis;
eluering ved bruk av en metanolholdig vandig buffer inneholdende 10 til 40 vol% metanol og 0,5 til 1,5M natriumklorid eller kaliumklorid ved en pH-verdi på 1 til 3;
hydrofob interaksjonskromatografi, bortsett fra revers fase HPLC, av dette eluat ved bruk av en matriks på polysakkaridbasis koblet med alkaner av ulik kjedelengde som ligander;
eluering ved bruk av en vandig metanolholdig oppløsning inneholdende 10 til 30 vol% metanol og opptil 0,02M natriumfosfat eller kaliumfosfat ved en pH-verdi på 5,0 til 6,0;
anionbytterkromatografi av eluatet ved bruk av svak anionbyttertype med en polysakkaridbasert matriks;
avsalting av oppløsningen som strømmer gjennom ved ultra-og/eller diafiltrering; og
eventuelt, påfølgende lyofilisering.
Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er det særlig foretrukket å benytte følgende matriks/kromatografi-medier: som styren-divinylkopolymerisat - Amberlite XAD-1180 ;
®
som sterk kationbytter -S-Sepharose FF ;
som polysakkaridbasert alkan-koblet matriks
- Octyl-Sepharose CL 4B ; og
som svak anionbytter - DEAE-Sepharose FF .
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er særlig fordelaktig ved at den gjør det mulig å oppnå følgende mål for rensing/ekstraksj on: en produktrenhet større enn 99%;
mulighet for å rense store mengder peptider i forsøks- og produksjonsskala; og
et totalutbytte på minst ca. 50%. Den muliggjør også angivelse av et første overslag over produksjonsomkostningene for kommersielt markedsført materiale.
Særlig foretrukne utførelsesformer av de enkelte prosess-trinn vil i det følgende bli mer utførlig beskrevet.
Etter fermentering, justeres buljongen til en pH på mellom 4,5 og 6,5, fortrinnsvis til pH 5,5, med 0,IM HC1. Tre satser Amberlite XAD-1180 i mengder på 2%, 1% og igjen 1% av fermenteringsbuljongens volum tilsettes under omrøring etter intervaller på mellom 3 0 og 60 minutter.
Etter adsorpsjon av lantibiotikumet, frafiltreres resinet og vaskes med vann, hvorpå det fylles over i en kolonne. Resinet vaskes deretter med metanol/vann 1:1 (volumdeler) for å fjerne uspesifikk bundne substanser fra kolonnen. Etter vasking elueres kolonnen med en blanding av 90% metanol og 10% 0,01M til IM HC1 (volumdeler) som eluent, fortrinnsvis en oppløsning av 90% metanol og 10% 0,1M.HC1 (volumdeler).
I ovennevnte XAD-1180 adsorpsjonstrinn fjernes organismer fra resinet ved grundig vask med vann. Alternativt kan de fjernes ved mikrofiltrering. De påfølgende adsorpsjons-, vaske- og desorberingstrinn foretas deretter alle via kolonne.
Kationbytterkromatografi utføres fortrinnsvis ved bruk av en sterk kationbyttertype med en polysakkaridbasert matriks for å forhindre uønskede hydrofobe matriksinteraksjoner under elueringen. Det foretrukne materialet for kationbytterkromatografi er S-Sepharose Fast Flow eller likeverdig materiale.
S-Sepharose-kolonnen bør før bruk stabiliseres med en oppløsning inneholdende for eksempel natriumfosfat, f.eks. med en 0,3 til 0,8M natriumfosfat-oppløsning. Etter påsetting av XAD-1180-eluatet på S-Sepharose-kolonnen, justeres pH til mellom 3,5 og 5,0 med natriumhydroksydoppløsning. Kolonnen vaskes deretter med en bufferoppløsning som inneholder mellom 0,4 og 1,0M natriumklorid per liter vann. Den påfølgende eluering kan foretas med en passende buffer, for eksempel med en buffer bestående av mellom 0,5 og 1,5M natrium- eller kaliumklorid, 10 til 40 vol% metanol og en pH på 1 til 3 justert med en IM saltsyreoppløsning. Fortrinnsvis benyttes en buffer bestående av 0,9M natriumklorid, inneholdende 30 vol% metanol justert til en pH på 2. Lineære strømningshastigheter på 75 cm/time for påsetting, vasking og eluering benyttes fortrinnsvis for S-Sepharose FF-trinnet.
Som følge av det høye innholdet av natrium- eller kaliumklorid i S-Sepharose-eluatet, kan det med fordel underkastes en påfølgende hydrofob interaksjonskromatografi.
Den hydrofobe interaksjonskromatografi kan utføres ved å benytte en polysakkaridbasert matriks koblet med alkaner av ulik kjedelengde som ligander. Octyl-Sepharose CL-4B er den foretrukne stasjonære fase.
I henhold til en foretrukket utførelsesform, inneholder en lantibiotikaoppløsning som underkastes hydrofob interaksjonskromatografi, et salt, så som natriumklorid, hvorunder kolonnen på forhånd likevektsinnstilles med en buffer som inneholder det samme salt.
For eksempel kan de oppsamlede lantibiotikaholdige fraksjoner fra kationbytterkromatografi-fasen justeres til å inneholde mellom 0,9 og 1,5M av et natrium- eller kaliumsalt, så som natriumklorid, per liter ved tilsetning av krystallinske natrium- eller kaliumsalter.
Et passende pH-område for hydrofob interaksjons-kromatograf i er pH 4,5 til 6,0. Justering av pH kan lett foretas ved å benytte natriumhydroksydoppløsning. Før påsetting på kolonnen må metanol-konsentrasjonen justeres ned til 10 vol% ved tilsetning av vann.
Den stasjonære fase for den hydrofobe interaksjons-kromatograf i likevektsinnstilles fortrinnsvis med en vandig buffer som for eksempel inneholder natrium- eller kaliumklorid (0,9 til 1,8M) og kaliumfosfat (0,0075 til 0,015M).. Prosess-parametere, så som strømningshastigheter, kan hensiktsmessig justeres innenfor et visst område. Et passende elueringsmiddel består av 70 til 90 vol% vann, 10 til 30 vol% metanol og inneholder 0 til 0,2M av et natrium- eller kaliumsalt, så som natriumfosfat, pH-område 5,0 til 6,0.
En buffer bestående av 0,01M natriumfosfat, 10 vol% metanol med en pH på 5,5 benyttes fortrinnsvis.
Fordelene ved hydrofob interaksjonskromatografi sammenlignet med RP-HPLC (reversed phase high performance liguid chromatography) er en høyere kapasitet og bruken av mindre organiske oppløsningsmidler. Kapasitet betyr i denne sammenheng mengden av lantibiotikum som kan bindes til en viss mengde kromatografisk materiale.
Selv om renheten av lantibiotikaene etter den hydrofobe
interaksjonskromatografi er høyere enn 99% (fastslått ved HPLC ved 210 nm) benyttes fortrinnsvis et kromatografi-trinn på en svak anionbytter, for eksempel DEAE Sepharose FF, for å fjerne svakt gulfarvede substanser.
Kolonnen bringes til likevekt med Octyl-Sepharose-elueringsbufferen justert til pH 7. Octyl-Sepharose-eluerings-midlet justeres til pH 7 med vandig IM natriumhydroksydopp-løsning. Lantibiotikaene sendes gjennom kolonnen og vaskes ut med likevektsbufferen, hvorved de farvede substanser blir igjen, bundet til anionbyttermaterialet.
Eluatene fra de kromatografiske.trinn avsaltes før videre behandling. Som følge av den lave ionstyrke, gjøres dette vanligvis etter anionbytterkromatografi-trinnet. Passende avsaltingsteknikker, så som gelkromatografi eller ultra-og/eller diafiltrering, er velkjent på området.
Når det for eksempel gjelder gallidermin, kan eluatet fra anionbytterkromatografi-trinnet konsentreres til en gallidermin-konsentrasjon på 1 til 10 mg/ml og dialyseres gjentatte ganger, for eksempel opp til 25 ganger, med destillert vann, fortrinnsvis ved bruk av en membran som har en cut-off på 1 KD (kiloDalton). En Filtron Omega 1 KD membran eller en likeverdig membran kan benyttes. Lyofiliseringen av slutt-produktet utføres etter konvensjonelle metoder.
Foretrukne utførelser av oppfinnelsen vil i det følgende bli beskrevet gjennom eksempler og med henvisning til de ledsagende tegninger, hvor: Figur 1 sammenstiller det beskrevne opprensningsskjerna for rensing av lantibiotika; og Figur 2 til 7 er kromatogrammer som antyder produkt-renheten ved ulike trinn i prosessen.
I de etterfølgende eksempler er alle forhold og prosent-angivelser uttrykt på vektbasis, om intet annet er angitt.
Eksempel 1
Et galliderminholdig dyrkningsmedium ble fremstillet ved å benytte fremgangsmåten beskrevet i avsnittet under over-skriften "Fermentation" i Eksempel 1 i EP-A-342486.
Etter akkumulering av 119,8 mg/l gallidermin i fermenteringsbuljongen (konsentrasjonen bestemmes ved periodiske HPLC-målinger) ble Amberlite XAD-1180 tilsatt direkte i to satser, hver på 2 vol% og med 4 5 minutters intervaller, til fermenteringsbuljongen etter at pH av denne var justert til 5,5 (HCl). Adsorpsjonen av antibiotikumet ble målt gjennom forsvinningen av antibiotikaet fra
fermenteringsbulj ongen.
Resinet ble deretter frafiltrert, vasket med vann og deretter fylt over i en kromatografikolonne (h=77 cm, d=10 cm, V=6050 ml) for videre behandling. Ved å benytte en lineær strømningshastighet på 385 cm/time, ble kolonnen vasket med vann/metanol (1:1 volumdeler) med totalt 5 kolonnevolumer, hvoretter elueringen ble foretatt med en buffer bestående av metanol/O,01M HCl (9:1 volumdeler) og en strømningshastighet på 231 cm/time. Fraksjoner på 1 kolonnevolum ble uttatt og slått sammen i henhold til kontinuerlig UV-deteksjon ved 254 nm, tynnskiktkromatografi og HPLC. Fraksjonene 1 til 7 ble slått sammen for å gi et totalvolum på 41 1 inneholdende 279 mg/l gallidermin. Trinn-utbyttet ble beregnet til 91%. Et HPLC-kromatogram av de samlede og homogeniserte fraksjoner er vist i Fig. 2.
Eluatet fra XAD-1180-kolonnen ble justert til pH 4,0 med 1,0M natriumhydroksyd og deretter påsatt på en kolonne inneholdende S-Sepharose Fast Flow (h=13,0 cm, d=14 cm, V=2000 ml) likevektsinnstillet med en buffer bestående av 0,3M natriumfosfat pH 4,0 (2 kolonnevolumer) ved bruk av en lineær strømningshastighet på 150 cm/time.
Etter påsetting ble kolonnen vasket med to kolonnevolumer 0,5M NaCl og eluert med en buffer bestående av 0,9M NaCl, 0,0IM HCl med 3 0 vol% metanol med en lineær
strømningshastighet på 75 cm/time.
Fraksjoner på ca. 1 kolonnevolum ble undersøkt med hen-blikk på gallidermin og slått sammen i henhold til kontinuerlig UV-deteksjon ved 254 nm og HPLC. Fraksjonene 1 til 4 ga et totalvolum på 7140 ml inneholdende 1338 mg/l gallidermin, bestemt ved HPLC, og resulterte i et trinn-utbytte på 83,4%.
Et representativt HPLC-kromatogram av de samlede og homogeniserte fraksjoner er vist i Fig. 3.
S-Sepharose-oppsamlingen ble fortynnet fra 30 til 10% metanol og deretter justert til pH 5,5 med IM natriumhydroksyd og med fast NaCl til 1,2M NaCl.
En Octyl-Sepharose-kolonne (h=ll,7 cm, d=18 cm,
V=2977 ml) ble gjort istand og likevektsinnstillet med en vandig buffer bestående av 1,2M natriumklorid og 0,01M natriumfosfat. Det ble benyttet 4 kolonnevolumer med en lineær strømningshastighet på 60 cm/time. Det justerte samlede S-Sepharose-eluat ble påsatt på den likevektsinnstillede kolonnen med en strømningshastighet på 60 cm/time og etterfulgt av vask med 2 kolonnevolumer av likevektsbufferen.
Elueringen ble foretatt med en buffer inneholdende 0,01M natriumfosfat med 10 vol% metanol ved pH 5,5. Gallidermin-holdige fraksjoner ble slått sammen til et totalvolum på
7590 ml. Ut fra gallidermin-innholdet ble det beregnet et trinn-utbytte på 78,1%.
DEAE-Sepharose-kolonnen ble likevektsinnstillet med Octyl-Sepharose-elueringsbufferen justert til pH 7,0.
Eluatet fra Octyl-Sepharose-kolonnen ble justert til pH 7,0 med en 0,1M natriumhydroksydoppløsning og deretter påsatt på DEAE-Sepharose-kolonnen. Etter påsetting ble galliderminet vasket ut med likevektsbufferen. For dette trinn ble det beregnet et utbytte på 98,7%.
DEAE-Sepharose-oppsamlingen ble konsentrert til ca.
5 mg/ml og diafiltrert 20 ganger med destillert vann ved bruk av en membran med cut-off på 1 KD. Det lyofiliserte diafiltrat ga et utbytte på 6,0 g gallidermin.
Et kromatogram av de samlede og homogeniserte fraksjoner er vist i Fig. 4.
Den tiltagende produktrenhet, fastslått ved analytisk omvendt-fase HPLC (210 nm) er vist i Figur 2 (XAD 1180-oppsamling), Figur 3 (S-Sepharose FF-oppsamling) og Figur 4 (sluttprodukt).
Renheten av det endelige galliderminprodukt ble bestemt ved omvendt-fase HPLC og kvantitative aminosyreanalyser. Gallidermin-innholdet var ifølge RP-HPLC 99,3% og ifølge kvantitativ aminosyreanalyse 99,1%.
Eksempel 2
Et epiderminholdig dyrkningsmedium ble fremstillet ved å benytte fremgangsmåten beskrevet i avsnittet med overskrift "Fermentation" i Eksempel 1 i EP-A-342486.
Etter akkumulering av 72,7 mg/l epidermin i fermenteringsbuljongen (konsentrasjonen bestemmes ved periodiske HPLC-målinger) ble Amberlite XAD-1180 tilsatt direkte i to satser, hver på 2 vol% og med 45 minutters intervaller, til fermenteringsbuljongen etter at pH av denne var justert til 5,5 (HCl). Adsorpsjonen av antibiotikumet ble målt gjennom forsvinningen av antibiotikaet fra fermenterings-bul jongen.
Resinet ble deretter frafiltrert, vasket med vann og deretter fylt over i en kromatografikolonne (h=10 cm, d=12 cm, V=1130 ml) for videre behandling. Ved å benytte en lineær strømningshastighet på 50 cm/time, ble kolonnen vasket med vann/metanol (1:1 volumdeler) med totalt 5 kolonnevolumer, hvoretter elueringen ble foretatt med en buffer bestående av metanol/0,01M HCl (9:1 volumdeler) og en strømningshastighet på 3 0 cm/time. Fraksjoner på 1 kolonnevolum ble uttatt og slått sammen i henhold til kontinuerlig UV-deteksjon ved 254 nm, tynnskiktkromatografi og HPLC. Fraksjonene 1 til 8 ble slått sammen for å gi et totalvolum på 10 1 inneholdende 200 mg/l epidermin. Trinn-utbyttet ble beregnet til 89%. Et HPLC-kromatogram av de samlede og homogeniserte fraksjoner er vist i Fig. 5.
Eluatet fra XAD-1180-kolonnen ble justert til pH 4,0 med 1,0M natriumhydroksyd og deretter påsatt på en kolonne inneholdende S-Sepharose Fast Flow (h=21,5 cm, d=2,6 cm, V=114 ml) likevektsinnstillet med en buffer bestående av 0,3M natriumfosfat pH 4,0 (2 kolonnevolumer) ved bruk av en lineær strømningshastighet på 15 0 cm/time.
Etter påsetting ble kolonnen vasket med to kolonnevolumer 0,5M NaCl og eluert med en buffer bestående av 0,9M NaCl, 0,0IM HCl med 3 0 vol% metanol med en lineær strømnings-hastighet på 75 cm/time.
Fraksjoner på ca. 1 kolonnevolum ble undersøkt med hen-blikk på epidermin og slått sammen i henhold til kontinuerlig UV-deteksjon ved 254 nm og HPLC. Fraksjonene 1 til 7 ga et totalvolum på 1150 ml inneholdende 1412 mg/l epidermin bestemt ved HPLC, og resulterte i et trinn-utbytte på 81,2%.
Et HPLC-kromatogram av de samlede og homogeniserte fraksjoner er vist i Fig. 6.
S-Sepharose-oppsamlingen ble fortynnet fra 30 til 10 vol% metanol og deretter justert til pH 5,5 med IM natriumhydroksyd og med fast NaCl til 1,2M NaCl.
En Octyl-Sepharose-kolonne (h=12,7 cm, d=5 cm, V=249 ml) ble gjort istand og likevektsinnstillet med en vandig buffer bestående av 1,2M natriumklorid og 0,01M natriumfosfat. Det ble benyttet 4 kolonnevolumer med en lineær strømnings-hastighet på 60 cm/time. Det justerte samlede S-Sepharose-eluat ble påsatt på den likevektsinnstillede kolonnen med en strømningshastighet på 60 cm/time og etterfulgt av vask med 2 kolonnevolumer av likevektsbufferen.
Elueringen ble foretatt med en buffer inneholdende 0,01M natriumfosfat med 10 vol% metanol ved pH 5,5. Epiderminholdige fraksjoner ble slått sammen til et totalvolum på 1050 ml. Ut fra epidermin-innholdet ble det beregnet et trinn-utbytte på 75,2%.
DEAE-Sepharose-kolonnen ble likevektsinnstillet med Octyl-Sepharose-elueringsbufferen justert til pH 7,0.
Eluatet fra Octyl-Sepharose-kolonnen ble justert til pH 7,0 med en 0,IM natriumhydroksydoppløsning og deretter påsatt på DEAE-Sepharose-kolonnen. Etter påsetting ble eppiderminet vasket ut med likevektsbufferen. For dette trinn ble det beregnet et utbytte på 98,7%.
Sepharose-oppsamlingen ble konsentrert til ca. 5 mg/ml og diafiltrert 20 ganger med destillert vann ved bruk av en membran med cut-off på 1 KD. Det lyofiliserte diafiltrat ga et utbytte på 1,0 g epidermin.
Et kromatogram av de samlede og homogeniserte fraksjoner er vist i Fig. 7.
Den tiltagende produktrenhet, fastslått ved analytisk omvendt-fase HPLC (210 nm) er vist i Figur 5 (XAD 1180-oppsamling), Figur 6 (S-Sepharose FF-oppsamling) og Figur 7 (sluttprodukt).
Renheten av det endelige epiderminprodukt ble bestemt ved omvendt-fase HPLC og kvantitative aminosyreanalyser. Epidermin-innholdet var ifølge RP-HPLC 99,1% og ifølge kvantitativ aminosyreanalyse 99,1%.
Tabell 1 nedenfor gir en oversikt over det totale utbytte av gallidermin og epidermin ved rensing som angitt henholdsvis i Eksempel 1 og 2. Det viser det overraskende høye totalutbytte av de rene produkter, som i begge tilfelle er ca.
50 vekt%.
Claims (4)
1. Fremgangsmåte for rensing av et lantibiotikum valgt fra gallidermin og epidermin, med et totalt utbytte på minst 50% og en total produktrenhet på over 99%, karakterisert ved at det frembringes et lantibiotikaholdig fermenteringsmedium og at mediet eller lantibiotikaholdige medier oppnådd fra dette, underkastes suksessive trinn med: adsorpsjon av lantibiotikumet fra fermenteringsbuljongen over på en styren-divinyl-kopolymerisat-matriks,- eluering av lantibiotikumet fra en styren-divinyl-kopolymerisat-matriks ved bruk av en metanolisk oppløsning inneholdende fra 0,001M til 0,1M saltsyre; kationbytterkromatografi av eluatet ved bruk av sterk kationbytter med matriks på polysakkaridbasis; eluering ved bruk av en metanolholdig vandig buffer inneholdende 10 til 40 vol% metanol og 0,5 til 1,5M natriumklorid eller kaliumklorid, ved en pH-verdi på 1 til 3; hydrofob interaksjonskromatografi, bortsett fra revers fase HPLC, av dette eluat ved bruk av en matriks på polysakkaridbasis koblet med alkaner av ulik kjedelengde som ligander; eluering ved bruk av en vandig metanolholdig oppløsning inneholdende 10 til 30 vol% metanol og opp til 0,02M natriumfosfat eller kaliumfosfat, ved en pH-verdi på 5,0 til 6,0; anionbytterkromatografi av eluatet ved bruk av svak anionbytter med matriks på polysakkaridbasis; avsalting av oppløsningen som strømmer gjennom, ved ultra- og/eller diafiltrering; og eventuelt, påfølgende lyofilisering.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det benyttes®
som styren-divmylkopolymerisat - Amberlite XAD-1180 ; som sterk kationbytter -S-Sepharose FF ;
som polysakkaridbasert alkan-koblet matriks - Octyl-Sepharose CL 4B ; og
som svak anionbytter - DEAE-Sepharose FF .
3. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1 og 2, karakterisert ved at avsaltingen foretas ved ultra- og/eller diafiltrering ved bruk av en membran med en cut-off på 1 kiloDalton.
4 Lantibiotika valgt fra gallidermin og epidermin fremstilt etter en fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved en renhet på minst 99%.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9107717A GB2254852B (en) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Lantibiotic isolation and purification by plural chromatography processes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO921446D0 NO921446D0 (no) | 1992-04-10 |
| NO921446L NO921446L (no) | 1992-10-12 |
| NO300639B1 true NO300639B1 (no) | 1997-06-30 |
Family
ID=10693100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO921446A NO300639B1 (no) | 1991-04-11 | 1992-04-10 | Fremgangsmåte for isolering og rensing av lantibiotika valgt fra gallidermin og epidermin |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0508371B1 (no) |
| JP (1) | JPH05252975A (no) |
| KR (1) | KR100241040B1 (no) |
| AT (1) | ATE163185T1 (no) |
| AU (1) | AU653394B2 (no) |
| CA (1) | CA2065748A1 (no) |
| DE (1) | DE69224402T2 (no) |
| DK (1) | DK0508371T3 (no) |
| ES (1) | ES2112872T3 (no) |
| FI (1) | FI921568A (no) |
| GB (1) | GB2254852B (no) |
| GR (1) | GR3026377T3 (no) |
| HU (1) | HU213881B (no) |
| IL (2) | IL101535A (no) |
| MX (1) | MX9201677A (no) |
| NO (1) | NO300639B1 (no) |
| NZ (1) | NZ242298A (no) |
| TW (1) | TW227567B (no) |
| ZA (1) | ZA922616B (no) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6794181B2 (en) * | 2002-10-09 | 2004-09-21 | Immucell Corporation | Method of purifying lantibiotics |
| JP2004248592A (ja) * | 2003-02-20 | 2004-09-09 | Sanpo Kk | チロシナーゼ阻害剤及びその製造方法 |
| JP5374260B2 (ja) * | 2009-07-10 | 2013-12-25 | 静岡商工会議所 | 農業用資材 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8811761D0 (en) * | 1988-05-18 | 1988-06-22 | Thomae Gmbh Dr K | Biosynthetic process for preparation of chemical compounds |
| GB8811760D0 (en) * | 1988-05-18 | 1988-06-22 | Thomae Gmbh Dr K | Antibiotic |
| ES2059645T3 (es) * | 1988-07-15 | 1994-11-16 | Thomae Gmbh Dr K | Procedimiento para la obtencion, el aislamiento y la purificacion de epidermina. |
-
1991
- 1991-04-11 GB GB9107717A patent/GB2254852B/en not_active Revoked
-
1992
- 1992-04-07 AT AT92105990T patent/ATE163185T1/de active
- 1992-04-07 DK DK92105990T patent/DK0508371T3/da active
- 1992-04-07 DE DE69224402T patent/DE69224402T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-07 EP EP92105990A patent/EP0508371B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-07 ES ES92105990T patent/ES2112872T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-08 TW TW081102675A patent/TW227567B/zh active
- 1992-04-09 IL IL10154592A patent/IL101535A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-04-09 NZ NZ242298A patent/NZ242298A/xx unknown
- 1992-04-09 FI FI921568A patent/FI921568A/fi unknown
- 1992-04-09 IL IL101535A patent/IL101535A0/xx unknown
- 1992-04-10 AU AU14813/92A patent/AU653394B2/en not_active Ceased
- 1992-04-10 ZA ZA922616A patent/ZA922616B/xx unknown
- 1992-04-10 JP JP4089173A patent/JPH05252975A/ja active Pending
- 1992-04-10 KR KR1019920005986A patent/KR100241040B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-04-10 CA CA002065748A patent/CA2065748A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-10 HU HU9201248A patent/HU213881B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-04-10 MX MX9201677A patent/MX9201677A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-04-10 NO NO921446A patent/NO300639B1/no unknown
-
1998
- 1998-03-17 GR GR980400573T patent/GR3026377T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR920019945A (ko) | 1992-11-20 |
| AU653394B2 (en) | 1994-09-29 |
| GB2254852A (en) | 1992-10-21 |
| KR100241040B1 (ko) | 2000-02-01 |
| GB2254852B (en) | 1995-04-05 |
| FI921568A0 (fi) | 1992-04-09 |
| GR3026377T3 (en) | 1998-06-30 |
| TW227567B (no) | 1994-08-01 |
| NO921446L (no) | 1992-10-12 |
| EP0508371B1 (en) | 1998-02-11 |
| NZ242298A (en) | 1993-11-25 |
| HU213881B (en) | 1997-11-28 |
| ES2112872T3 (es) | 1998-04-16 |
| DE69224402T2 (de) | 1998-07-09 |
| CA2065748A1 (en) | 1992-10-12 |
| EP0508371A1 (en) | 1992-10-14 |
| ATE163185T1 (de) | 1998-02-15 |
| HUT62943A (en) | 1993-06-28 |
| DE69224402D1 (de) | 1998-03-19 |
| FI921568A (fi) | 1992-10-12 |
| DK0508371T3 (da) | 1998-09-23 |
| IL101535A0 (en) | 1992-12-30 |
| NO921446D0 (no) | 1992-04-10 |
| GB9107717D0 (en) | 1991-05-29 |
| AU1481392A (en) | 1992-10-15 |
| JPH05252975A (ja) | 1993-10-05 |
| IL101535A (en) | 1996-07-23 |
| HU9201248D0 (en) | 1992-06-29 |
| ZA922616B (en) | 1993-10-11 |
| MX9201677A (es) | 1992-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kuipers et al. | Biosynthesis and secretion of a precursor of nisin Z by Lactococcus lactis, directed by the leader peptide of the homologous lantibiotic subtilin from Bacillus subtilis | |
| Tomita et al. | Molecular biology of the pore-forming cytolysins from Staphylococcus aureus, α-and γ-hemolysins and leukocidin | |
| Piard et al. | Purification and partial characterization of lacticin 481, a lanthionine-containing bacteriocin produced by Lactococcus lactis subsp. lactis CNRZ 481 | |
| Rollema et al. | Improvement of solubility and stability of the antimicrobial peptide nisin by protein engineering | |
| JP2017070289A (ja) | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質 | |
| Hanson et al. | Molecular cloning, partial purification, and characterization of a haemin‐binding lipoprotein from Haemophilus influenzae type b | |
| Benton et al. | The hemolytic and complement-activating properties of pneumolysin do not contribute individually to virulence in a pneumococcal bacteremia model | |
| Sahl et al. | Structural similarities of the staphylococcin-like peptide Pep-5 to the peptide antibiotic nisin | |
| Küster et al. | Immunological crossreactivity to the catabolite control protein CcpA from Bacillus megaterium is found in many Gram-positive bacteria | |
| EP0342486A1 (en) | Antibiotic | |
| Sahl | Staphylococcin 1580 is identical to the lantibiotic epidermin: implications for the nature of bacteriocins from gram-positive bacteria | |
| CA2097056A1 (en) | Vaccine against neisseria meningitidis infections | |
| JP2659388B2 (ja) | 糖ペプチド回収方法 | |
| US5231165A (en) | Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis | |
| US7238515B2 (en) | Anti-Listeria bacteriocin | |
| Kimura et al. | Purification and partial identification of bacteriocin ISK-1, a new lantibiotic produced by Pediococcus sp. ISK-1 | |
| NO300639B1 (no) | Fremgangsmåte for isolering og rensing av lantibiotika valgt fra gallidermin og epidermin | |
| US6218362B1 (en) | Lantibiotic from Streptococcus mutans and uses thereof | |
| KR930002736B1 (ko) | 에피더민의 제조방법 | |
| US5232849A (en) | Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis | |
| WO2017022672A1 (ja) | 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質 | |
| Sitrin et al. | Separation methodology | |
| WO2017022759A1 (ja) | 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質 | |
| Allgaier | Strategy for purification of lantibiotics Hermann Allgaier*, Joachim Walter, Michael Schlüter and Rolf-Günther Werner Dr. Karl Thomae GmbH, D-7950 Biberach, FRG | |
| DK175198B1 (da) | Antibioticum, betegnet gallidermin, og syreadditionssalte deraf, farmaceutiske og kosmetiske præparater indeholdende forbindelserne og fremgangsmåde til forbindelsernes fremstilling samt deres anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat |