HU213881B - Purification of lantibiotics - Google Patents
Purification of lantibiotics Download PDFInfo
- Publication number
- HU213881B HU213881B HU9201248A HU9201248A HU213881B HU 213881 B HU213881 B HU 213881B HU 9201248 A HU9201248 A HU 9201248A HU 9201248 A HU9201248 A HU 9201248A HU 213881 B HU213881 B HU 213881B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sepharose
- column
- lantibiotic
- methanol
- chromatography
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Selective Calling Equipment (AREA)
- Cosmetics (AREA)
- Air Bags (AREA)
- Blow-Moulding Or Thermoforming Of Plastics Or The Like (AREA)
- Coin-Freed Apparatuses For Hiring Articles (AREA)
- Telephone Function (AREA)
- Data Exchanges In Wide-Area Networks (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány eljárás lantibiőtikűmők tisztítására őlymódőn, hőgy a lantibiőtikűm-tartalmú közeget a következő műveleteknekvetik alá: sztiről-divinil-kőpőlimer mátrixőn végzett adszőrpcióval aközegből eltávőlítják a lantibiőtikűmőt; a sztiről-divinil-kőpőlimermátrixról sósavat tartalmazó metanőlős őldattal a lantibiőtikűmőtelűálják; az elűátűmőt pőliszacharid-alapú erős katiőncserélőnkatiőncserélő krőmatőgrafálásnak vetik alá; metanőlt és nátriűm-klőridőt vagy káliűm-klőridőt tartalmazó metanőlős vizes pűfferrelelűálnak; az elűátűmőt eltérő lánchősszúságú alkánőkkal ligandűmkéntkapcsőlt pőliszacharid-alapú mátrixőn hidrőfób-kölcsönhatáskrőmatőgrafálásnak vetik alá; metanőlt és nátriűm-főszfátőt vagykáliűm-főszfátőt tartalmazó vizes metanőlős őldattal elűálnak; azelűátűmőt pőliszacharid-alapú mátrixőn gyenge aniőncserélővelaniőncserélő krőmatőgrafálásnak vetik az átáramló őldatőt űltra- vagydiaszűréssel sómentesítik, és kívánt esetben liőfilizálják. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás a lantibiotikum néven ismert antibiotikumok tisztítására.
A lantibiotikumok olyan, kis peptidek csoportjába sorolható antibiotikumok, amelyek lantionin és 3-metil-lantionin hidakat tartalmaznak. Ilyen antibiotikum a subtilin, nizin, epidermin, gallidermin, pep5, ancovenin, Ro 09-0198, cinnamicin és duramicin.
A lantibiotikumok a különböző mikroorganizmus törzsek tenyésztésével állíthatók elő, így például:
Pep5 a Staphylococcus epidermis 5 törzs, epidermin a Staphylococcus epidermin DSM 3095, nizin a Streptococcus lactis, lancefield, N csoport, gallidermin a Staphylococcus gallinarium DSM
4616, subtilin a Bacillus subtilis NRRL 8-543, ancovenin a Streptomyces sp. no. A647P-Z,
Ro 09-0198 a Streptoverticillum griseoverticillatum, duramicin a Streptomyces cinnamoneus forma azacoluta, cinnamicin a Streptomyces cinnamoneus tenyésztésével állíthatók elő.
A fenti antibiotikumokat és az irodalmi hivatkozásokat a Kellner és munkatársai., Eur. J. Biochem. 177, 53-59 (1988) irodalmi helyen ismertetik.
A mikroorganizmusok például hagyományos eljárással megvalósított tenyésztésekor a lantibiotikum a tenyészközegbe választódik ki. A fermentáció az EP-A-350 810 számú európai közrebocsátási iratban leírtak szerint végezhető.
Ismert tisztítási eljárás például az adszorpciós gyantán való adszorbeáltatás, majd az ezt követő, egyéb kromatográfiás eljárással végzett tisztítás.
Kellner és munkatársai a fentiekben ismertetett irodalmi helyen például egy olyan gallidermin izolálási eljárást mutatnak be, amelyet Staphylococcus gallinarium (20 liter) 24 órás tenyésztése után végeztek. Az eljárásban közvetlenül a fermentációs edénybe először 3 adagban a tenyészközeg térfogatára számolva 2 térfogat%, 1 térfogat%, majd ismét 1 térfogat0/». Amberlite XAD-1180-t adnak. A tenyészközeg általában 100 mg/ml gallidermint tartalmaz. A lantibiotikum adszorpciós gyantához való kötődése szakaszosan történhet. A gyantát ezután leszűrik, vízzel mossák, majd 9 : 1 térfogatarányú metanol: 0,01 mólos sósav eleggyel eluálják, és az aktív eluátumot szárazra koncentrálják. A maradékot ezután feloldják, és pH = 5,5 mellett Amberlite IRC-50 (H+ -alak) gyantára adják, az ioncserélő gyantát vízzel mossák, és 0,1 mólos sósavval eluálják. Az adszorpciós sómentesítés után újra Amberlite XAD-1180 gyantás kezelést, ezután liofolizálást végeznek, és így 1,0 g nyers lantibiotikumot kapnak. Az utolsó tisztítást fordított fázisú HPLC-kromatográfiával Nucleosil SC18-300 stacioner fázissal és különböző acetonitril/0,1 térfogat%-os vizes trifluor-ecetsav gradienssel végzik, és így 100 mg tiszta gallidermint kapnak. A fermentációs közeg a tenyésztés végén 2000 mg gallidermint tartalmaz, így a tisztítás végén kapott 100 mg-os hozam 5%-os összkitermelésnek felel meg.
Hömer és munkatársai az Appl. Microbiol. Biotechnoi. 30, 219-225 (1989) irodalmi helyen az epidermin fermentációs és izolációs eljárását ismertetik.
A tisztítást lényegében a gallidermin fentiekben ismertetett tisztítási eljárásához hasonlóan végzik, nevezetesen úgy, hogy először Amberlite XAD-1180 alkalmazásával adszorpciót, majd eluálást, ezt követően a gyenge kationcserélő Amberlite IRC-50 alkalmazásával újra adszorpciót, és végül Nucleosil 100 C-18 alkalmazásával preparatív HPLC tisztítást végeznek. Ezzel a kombinált adszorpciós és kromatográfiás eljárással 80%-os tisztaságot érnek el.
A lantibiotikumok széles körű alkalmazása azonban nagytisztaságú lantibiotikumot igényel, és kívánatos a tisztítási eljárásnál kapott hozam növelése is.
A lantibiotikumok tisztítási nehézségei a biológiai szintézissel és ezeknek a biológiailag aktív peptideknek a kémiai szervezetével kapcsolatosak, és a következők szerint foglalhatók össze:
- az 1 g/liter lantibiotikum koncentrációig terjedő termelés csak húskivonatot vagy malátaextraktumot tartalmazó fermentációs közegben érhető el, ami a következő feldolgozási folyamat számára nagyon komplex elegyet eredményez;
- a nagy mennyiségben jelenlévő bázikus és hidrofób aminosavak miatt csak néhány, gondosan kiválasztott izolációs eljárás alkalmazható;
- a termék nagyobb pH-értékeken mutatott instabilitása nagymértékben korlátozza az alkalmazható pufferrendszerek tartományát; és
- a biológiailag aktív oligomerek és monomerek előfordulását teszi szükségessé.
A fentieknek megfelelően a találmány tárgya javított eljárás lantibiotikumok tisztítására.
A találmány szerinti eljárás tehát lantibiotikumok tisztítása adszorpciós és kromatográfiás műveletekkel, oly módon, hogy előállítunk egy lantibiotikum-tartalmú fermentációs közeget és ezt vagy ebből származó, lantibiotikum-tartalmú közeget a következő műveleteknek vetjük alá:
sztirol-divinil-kopolimer mátrixon végzett adszorpcióval a közegből eltávolítjuk a lantibiotikumot;
a sztirol-divinil-kopolimer mátrixról 0,001-0,1 mólos sósavat tartalmazó metanolos oldattal a lantibiotikumot eluáljuk;
az eluátumot poliszacharid-alapú erős kationcserélőn kationcserélő kromatografálásnak vetjük alá;
10^10 térfogat% metanolt és 0,5-1,5 mólos nátrium-kloridot vagy kálium-kloridot tartalmazó metanolos vizes pufferrel 1-3 pH-értéken eluálunk;
az eluátumot eltérő lánchosszúságú alkánokkal ligandumként kapcsolt poliszacharid-alapú mátrixon hidrofób-kölcsönhatás kromatografálásnak vetjük alá a fordított fázisú HPLC kivételével;
10-30 térfogat% metanolt és legfeljebb 0,02 mólos nátrium-foszfátot vagy kálium-foszfátot tartalmazó vizes metanolos oldattal 5,0-6,0 pH-értéken eluálunk;
az eluátumot poliszacharid-alapú mátrixon gyenge anioncserélővei anioncserélő kromatografálásnak vetjük alá;
az átáramló oldatot ultra- vagy diaszűréssel sómentesítjük, és kívánt esetben liofilizáljuk.
HU 213 881 Β
A találmány szerinti eljárásban előnyösen sztirol-divinil-kopolimerizátumként Amberlite XAD-1180-at (Rohm & Haas GmbH, DE), erős kationcserélőként S-Sepharose FF-et (Pharmacia, SE) poliszacharid-alapú, alkánnal kapcsolt mátrixként Ostyl-Sepharose CL 4B-t (Pharmacia, SE) és gyenge anioncserélőként DEAE-Sepharose FF-et (Pharmacia, SE) használunk.
Az eljárással kapott termék tisztasága nagyobb, mint 99%, kísérleti és üzemi méretben egyaránt nagy mennyiségű termék tisztítható, és az összroham legalább 50 %.
Az alábbiakban a találmány szerinti, különösen előnyös eljárást részletesen ismertetjük.
A tápközeget a fermentálás után 0,1 mólos sósavval
4,5-6,5, előnyösen 5,5 pH-értékre savanyítjuk. A fermentációs közeghez keverés közben 3-60 perces időközönként a fermentációs közeg térfogatára vonatkoztatva 2 térfogat%, 1 térfogat%, majd ismét 1 térfogat% Amberlite XAD gyantát adunk.
A lantibiotikum adszorpciója után a gyantát leszűrjük, vízzel mossuk, és egy oszlopra töltjük. Az oszlopot a nemspecifikusan kötött anyagok eltávolítására 1 : 1 térfogatarányú metanol: víz eleggyel mossuk. A mosás után az oszlopot 90 : 10 térfogatarányú metanol: 0,01-1 mólos sósav-eleggyel, előnyösen 90:10 térfogatarányú metanol: 0,01 mólos sósav-eleggyel eluáljuk.
A fentiekben ismertetett XAD-1180 adszorpciós műveletben az organizmusok eltávolítását feleslegben alkalmazott vizes mosással vagy mikroszűréssel végezzük. A következő adszorpciós, mosó és deszorpciós lépcsők mindegyikét oszlop üzemmódban végezzük.
A kationcserélő kromatográfia kivitelezéséhez az oszloptöltettel való, nemkívánt hidrofób kölcsönhatás elúció alatti megakadályozására egy poliszacharid-alapú, erős kationcserélő-típusú gyantát alkalmazunk. Kationcserélő kromatográfiához előnyösen például SSepharose Fást Flow (FF) kereskedelmi nevű terméket vagy ezzel analóg mátrixot alkalmazunk.
Az S-Sepharose oszlopot használat előtt például nátrium-foszfátot, elsősorban 0,3-0,8 mólos nátrium-foszfátot tartalmazó oldattal ki kell egyensúlyozni. Az XAD-1180 eluátum S-Sepharose oszlopra való töltése után a pH-t nátrium-hidroxid oldattal 3,5-5,0 értékre állítjuk. Az oszlopot ezután egy liter vízre számolva 0,4-1,0 mólos nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal mossuk. A következő eluálást megfelelő pufferoldattal, például 0,5-1,5 mólos nátrium- vagy kálium-kloridot és 10-40 térfogat% metanolt tartalmazó, 1 mólos sósavval 1-3 pH-értékre beállított pufferrel végezzük. Előnyösen 0,9 mólos nátrium-kloridot, 30 térfogat% metanolt és 2-es pH-jú puffer oldatot alkalmazunk. Az S-Sepharose FF lépcső töltő, mosó és eluáló üzemmódjában 75 cm/óra lineáris áramlási sebességet alkalmazunk.
Az S-Sepharose töltet magas nátrium- vagy kálium-klorid-tartalma következtében előnyösen a következő hidrofób-kölcsönhatás kromatográfiás lépésben alkalmazható.
A hidrofób-kölcsönhatás kromatográfia kivitelezését ligandumként különböző hosszúságú alkánláncokkal kapcsolt poliszacharid-alapú mátrixot alkalmazásával végezzük. Stacioner fázisként Octyl-Sepharose CL-4B-t alkalmazunk.
Az eljárás egyik előnyös változatában lantibiotikum oldatot só-, például nátrium-klorid-tartalmú, és előzetesen ugyanezt a sót tartalmazó pufferoldattal egyensúlyba hozott hidrofób-kölcsönhatás kromatográfiás oszlopon kromatografáljuk.
A kationcserélő kromatográfiás fázisból összegyűjtött lantibiotikum-tartalmú frakciókat például úgy állíthatjuk be, hogy kristályos nátrium- vagy kálium-klorid hozzáadása után literenként 0,9-1,5 mól nátrium- vagy kálium-kloridot tartalmazzanak. A hidrofób-kölcsönhatás kromatográfia műveletet pH = 4,5-6,0 érték mellett végezzük. A pH-beállítást kényelmesen nátrium-hidroxid oldattal végezzük. Az oszlopra való töltés előtt a metanol-koncentráció értékét víz hozzáadásával 10 térfogat% alá kell csökkenteni.
A hidrofób-kölcsönhatás kromatográfia stacioner fázisának kiegyensúlyozására előnyösen 0,9-1,8 mólos nátrium- vagy kálium-kloridot és 0,0075-0,015 mólos nátrium-foszfátot tartalmazó vizes puffért alkalmazunk. A folyamatparaméterek, például áramlási sebesség megfelelő szabályozással bizonyos határok között tarthatók. Eluálószerként 70-90 térfogat% vizet, 10-30 térfogat% metanolt és 0—0,02 mólos nátrium- vagy kálium-sót, például kálium-foszfátot tartalmazó, 5,0-6,0 pH-jú oldatot alkalmazunk.
Előnyös a 0,01 M nátrium-foszfátot és 10 térfogat% metanolt tartalmazó, 5,5 pH-jú puffer alkalmazása.
A hidrofób-kölcsönhatás kromatográfiás eljárás előnye a fordított fázisú nagynyomatú folyadékkromatográfiás eljáráshoz (RP-HPLC) viszonyítva a nagyobb kapacitás és a kevesebb oldószerigény.
A kapacitás ebben az esetben az az mennyiségű kromatográfiás mátrixhoz kötődő lantibiotikum mennyiségét jelenti.
Annak ellenére, hogy a lantibiotikum tisztasága a hidrofób-kölcsönhatás kromatográfia tisztítási lépcső után több, mint 99% (HPLC-rel 210 nm-nél mérve), legelőnyösebben az enyhén sárga anyagok eltávolítására egy gyenge anioncserélő kromatográfiás, például egy DEAE-Sepharose FF alkalmazásával megvalósított lépést is alkalmazunk.
Az elúciós puffer alkalmazásával kiegyensúlyozott Octyl-Sepharose oszlop pH-ját 7-re állítjuk be. Az OctylSepharose eluálószer pH = 7-re való beállítását 1 mólos vizes nátrium-hidroxid oldattal végezzük. A lantibiotikumot átvezetjük az oszlopon, kimossuk a kiegyensúlyozó pufferral, és így a színes anyagok az anioncserélő anyagon megkötve az oszlopon maradnak.
A kromatográfiás lépésekben kapott eluátumokat a továbbfeldolgozás előtt sómentesítjük.
A sómentesítést ismert eljárásokkal, például gélkromatográfiás eljárással vagy ultra- és/vagy diafiltrációval végezzük.
Gallidermin esetén például az anioncserélő kromatográfiás lépésben kapott eluátumot 1-10 mg/ml gallidermin-koncentrációra koncentráljuk, és desztillált vízzel, előnyösen 1 kD (kilodalton) visszatartású membrán alkalmazásával ismételten, például 25-ször
HU 213 881 Β dializáljuk. A késztermék liofilezését valamilyen hagyományos eljárással végezzük.
A találmány szerinti eljárás természetesen az epidermin és a gallidermin tisztításán kívül egyéb antibiotikumok, köztük a nizin, subtilin, duramicin, ancovenin, cinnamicin, Pep5 és Ro 09-0198 tisztítására is alkalmazhatók.
A következő példákat és a mellékelt ábrákat a találmány részletesebb ismertetésére mutatjuk be.
Az 1. ábrán a lantibiotikumok tisztítására alkalmas eljárás vázlatát, a 2-7. ábrákon az eljárás különböző lépéseiben kapott termékek tisztaságára jellemző kromatogrammokat mutatjuk be.
1. példa
Gallidermin-tartalmú tenyészközeget állítunk elő az EP-A 342 486 számú európai közrebocsátási irat 1. példája, „Fermentáció” című részében ismertetett eljárással.
Amikor a fermentációs közeg gallidermin-tartalma eléri a 119,8 mg/liter értéket (amelynek meghatározása időszakos HPLC-mérésekkel történik), a közeg pH-ját
5,5-re (sósav) állítjuk, majd közvetlenül a közegbe, két részletben, 45 perces időközönként 2-2 térfogat% Amberlite XAD-1180-t adunk. Az antibiotikum adszorpciót az antibiotikum fermentációs közegből való eltűnésével mérjük.
A kapott gyantát leszűrjük, vízzel mossuk, majd továbbfeldolgozásra kromatográfiás oszlopra (h = 77 cm, d = 10 cm, V = 6050 ml) töltjük. Az oszlopot 385 cm/óra lineáris áramlási sebességű, 5 teljes oszloptérfogatnyi 1 : 1 térfogatarányú víz : metanol eleggyel mossuk, majd 231 cm/óra lineáris áramlási sebességű, 9 : 1 térfogatarányú metanol: 0,01 mólos sósavelegyből álló pufferral eluáljuk. A levett 1 oszloptérfogatnyi frakciókat a 254 nm hullámhosszon mért, folyamatos ultraibolya, vékonyréteg kromatográfiás és nagynyomású folyadék kromatográfiás elemzési eredmények alapján egyesítjük. Az 1-7. frakciók egyesítésével összesen 41 liternyi 279 mg/liter gallidermin-tartalmú anyagot kapunk. Az ebben a lépcsőben elért kitermelés 91 %. Az egyesített és homogenizált frakciók HPLC kromatogrammját a 2. ábrán mutatjuk be.
Az XAD-1180 oszlopról kapott eluátum pH-ját 1,0 mólos nátrium-hidroxid oldattal 4,0-ra állítjuk, majd 150 cm/óra lineáris áramlási sebességgel egy olyan
S-Sepharose Fást Flow oszlopra (h= 13,0 cm,d= 14cm, V = 2000 ml) töltjük, amelyet egy 0,3 M nátrium-foszfát-tartalmú, 4,0 pH-jú puffer alkalmazásával előzőleg kiegyensúlyoztunk.
Az oszlopra való töltés után az oszlopot két oszloptérfogatnyi, 0,5 mólos nátrium-klorid oldattal mossuk, majd 75 cm/óra lineáris áramlási sebességű, 0,9 M nátrium-kloridot, 0,01 M sósavat és 30 térfogat% metanolt tartalmazó pufferral eluáljuk.
A körülbelül egy oszloptérfogatnyi frakciókat a folyamatos ultraibolya elemzés (254 nm) és HPLC-meghatározás alapján mért gallidermin-tartalmuk alapján egyesítjük. Az 1—4. frakciók egyesítésével összesen 7140 ml térfogatú, HPLC-meghatározással 1338 mg/1 gallidermin-tartalmú terméket kapunk. A lépcsőben elért hozam 83,4%.
Az összegyűjtött és homogenizált frakciók egy jellemző HPLC-kromatogrammját a 3. ábrán mutatjuk be.
Az S-Sepharose oszlopról nyert, egyesített frakciókat 30-10 térfogat% metanollal hígítjuk, majd 1 mólos nátrium-hidroxid oldat és szilárd nátrium-klorid vagy legfeljebb 1,2 mólos nátrium-klorid oldat alkalmazásával az oldat pH-ját 5,5-re állítjuk.
Egy Octyl-Sepharose oszlopot (h = 11,7 cm, d = 18 cm, V = 2977 ml) készítünk, és az oszlopot egy 1,2 mólos nátrium-kloridot és 0,01 mólos nátrium-foszfátot tartalmazó vizes pufferral kiegyensúlyozzuk. 60 cm/óra lineáris áramlási sebességgel négy oszloptérfogatnyi mennyiséget alkalmazunk. A beállított pH-jú S-Sepharose-elegyet 60 cm/óra sebességgel a kiegyensúlyozott oszlopra töltjük, majd két oszloptérfogatnyi kiegyensúlyozó pufferral mossuk.
Az eluálást 0,01 mólos nátrium-foszfátot és 10 térfogat% metanolt tartalmazó 5,5 pH-jú pufferral végezzük. A gallidermin-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, és így 7590 ml összes térfogatú elegyet kapunk. Az elegy gallidermin-tartalma alapján a lépcsőben elérhető hozam 78,1%.
A DEAE-Sepharose oszlopot a 7,0 pH-júra beállított Octyl-Sepharose eluáló pufferral hozzuk egyensúlyba.
Az Octyl-Sepharose oszlopról nyert eluátum pH-ját 0,1 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 7,0 értékre állítjuk, majd a DEAE-Sepharose oszlopra töltjük. A gallidermint a betörés után a kiegyensúlyozó pufferral kimossuk. Ebben a lépcsőben 98,7% kitermelést kapunk.
A DEAE-Sepharose-elegyet körülbelül 5 mg/ml koncentrációjúra koncentráljuk, majd 1 kD levágású membrán alkalmazásával, desztillált vízzel, 20-szor diafiltráljuk. A liofilezett diafiltrátum 6,0 g gallidermint tartalmaz.
Az összegyűjtött és homogenizált frakciók kromatogrammját a 4. ábrán mutatjuk be.
Az analitikai fordított fázisú HPLC (210 nm) eljárással mért terméktisztaság-növekedést a 2. ábrán (XAD 1180 elegy), a 3. ábrán (S-Sepharose FF elegy) és a 4. ábrán (végtermék) mutatjuk be.
A kész gallidermin termék tisztaságát fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás és kvantitatív aminosav-elemzéssel mérjük.
Az RP-HPLC eljárással mért terméktisztaság 99,3%, a kvantitatív aminosav-elemzéssel mért terméktisztaság pedig 99,1%.
2. példa
Epidermin-tartalmú tenyészközeget állítunk elő az EP-A 342 486 számú európai közrebocsátási irat 1. példája, „Fermentáció” című részében ismertetett eljárással.
Amikor a fermentációs közeg epidermin-tartalma eléri a 72,7 mg/liter értéket (amelynek meghatározása időszakos HPLC-mérésekkel történik), a közeg pH-ját
5,5-re állítjuk, majd közvetlenül a közegbe, 45 perces időközönként, két részletben 2-2 térfogat% Amberlite XAD-1180-t adunk. Az antibiotikum adszorpciót az antibiotikum fermentációs közegből való eltűnésével méijük.
HU 213 881 Β
A kapott gyantát leszüljük, vízzel mossuk, majd tovább feldolgozásra kromatográfiás oszlopra (h = 10 cm, d = 12 cm, V = 1130 ml) töltjük. Az oszlopot 50 cm/óra lineáris áramlási sebességű, 5 teljes oszlop térfogat (CV), 1 : 1 térfogatarányú víz : metanol eleggyel mossuk, majd 30 cm/óra lineáris áramlási sebességű, 9 : 1 térfogatarányú metanol: 0,01 mólos sósavelegyből álló pufferral eluáljuk. A levett 1 oszloptérfogatnyi frakciókat 254 nm hullámhosszon mért ultraibolya, vékonyréteg kromatográfiás és nagynyomású folyadék kromatográfiás elemzési eredmények alapján egyesítjük. Az 1-8. frakciók egyesítésével összesen 10 liternyi 200 mg/liter epidermin-tartalmú anyagot kapunk. Az ebben a lépcsőben elért kitermelés 89%. Az egyesített és homogenizált frakciók HPLC-kromatogrammját az 5. ábrán mutatjuk be.
Az XAD-1180 oszlopról kapott eluátum pH-ját 1,0 mólos nátrium-hidroxid oldattal 4,0-re állítjuk, majd 150 cm/óra lineáris áramlási sebességgel egy olyan S-Sepharose Fást Flow oszlopra (h = 21,5 cm, d = 2,6 cm,
V = 114 ml) töltjük, amelyet 0,3 mólos nátrium-foszfáttartalmú, 4,0 pH-jú puffer alkalmazásával előzőleg kiegyensúlyoztunk.
Az oszlopra való töltés után az oszlopot két oszloptérfogatnyi 0,5 mólos nátrium-klorid oldattal mossuk, majd 75 cm/óra lineáris áramlási sebességű, 0,9 M nátrium-kloridot, 0,01 M sósavat és 30 térfogat% metanolt tartalmazó pufferral eluáljuk.
A körülbelül egy oszloptérfogatnyi frakciókat a folyamatos ultraibolya elemzés (254 nm) és HPLC-meghatározás alapján mért epidermin-tartalmuk alapján egyesítjük. Az 1-7. frakciók egyesítésével egy összesen 1150 ml térfogatú, 1412 mg/liter (HPLC-méréssel) epidermin-tartalmú terméket kapunk. A lépcsőben elért hozam 81,2%. Az összegyűjtött és homogenizált frakciók egy kromatogrammját a 6. ábrán mutatjuk be.
A S-Sepharose oszlopról nyert, egyesített frakciókat 30-10 térfogat% metanollal hígítjuk, majd 1 mólos nátrium-hidroxid oldat és szilárd nátrium-klorid vagy legfeljebb 1,2 mólos nátrium-klorid oldat alkalmazásával az oldat pH-ját 5,5-re állítjuk.
Egy Octyl-Sepharose oszlopot (h = 12,7 cm, d = 5 cm,
V = 249 ml) készítünk, és az oszlopot egy 1,2 mólos nátrium-kloridot és 0,01 mólos nátrium-foszfátot tartalmazó, vizes pufferral kiegyensúlyozzuk. 60 cm/óra lineáris áramlási sebességgel négy oszloptérfogatnyi mennyiséget alkalmazunk. A beállított pH-jú SSepharose-elegyet 60 cm/óra sebességgel a kiegyensúlyozott oszlopra töltjük, majd két oszloptérfogatnyi kiegyensúlyozó pufferral mossuk.
Az eluálást 0,01 mólos nátrium-foszfátot és 10 térfogat% metanolt tartalmazó, 5,5 pH-jú pufferral végezzük. Az epidermin-tartalmú frakciókat összegyűjtjük, és így összesen 1050 ml térfogatú elegyet kapunk. Az elegy epidermin-tartalma alapján a lépcsőben elérhető hozam 75,2%.
A DEAE-Sepharose oszlopot a 7,0 pH-júra beállított Octyl-Sepharose eluáló pufferral hozzuk egyensúlyba.
Az Octyl-Sepharose oszlopról nyert eluátum pH-ját 0,1 mólos nátrium-hidroxid oldattal 7,0 értékre állítjuk, majd a DEAE-Sepharose oszlopra töltjük. Az epidermint a betöltés után a kiegyensúlyozó pufferral kimossuk. Ebben a lépcsőben 98,7% kitermelést kapunk.
A DEAE-Sepharose-elegyet körülbelül 5 mg/ml koncentrációjúra töményítjük, majd 1 kD levágású membrán alkalmazásával, desztillált vízzel 20-szor diafíltráljuk. A liofolizett diafíltrátum 1,0 g epidermint tartalmaz.
Az összegyűjtött és homogenizált frakciók kromatogrammját a 7. ábrán mutatjuk be.
Az analitikai fordított fázisú HPLC (210 nm) eljárással mért terméktisztaság-növekedést az 5. ábrán (XAD 1180 elegy), a 6. ábrán (S-Sepharose-FF elegy) és a 7. ábrán (végtermék) mutatjuk be.
A kész epidermin tisztaságát fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás és kvantitatív aminosavelemzéssel méljük.
Az RP-HPLC eljárással mért terméktisztaság 99,1 %, a kvantitatív aminosav-elemzéssel mért terméktisztaság is 99,1%.
Az 1. és 2. példák szerinti eljárással tisztított gallidermin és epidermin hozamokat az 1. táblázatban foglaljuk össze. Az adatokból látható, hogy a tiszta termékre vonatkozó hozam meglepően nagy, mindegyik esetben körülbelül 50 tömeg%.
1. táblázat
A gallidermin és epidermin tisztítási eljárásban elérhető hozamok
| Lépcső | térfogat 0) | Gallidermin koncentráció (mg/1) | Gallidermin mennyiség (mg) | Lépcső hozama (%) | Lépcsők összesített hozama (%) |
| fermentálás | 105 | 119,8 | 12580 | 100 | 100 |
| XAD 1180 elegy | 41 | 279,2 | 11448 | 91 | 91 |
| S-Sepharose elegy | 7,14 | 1337,9 | 9552,6 | 83,4 | 75,9 |
| Octyl-Sepharose elegy | 7,59 | 983,1 | 7462 | 78,1 | 59,3 |
| DEAE-Sepharose elegy | 7,61 | 967,8 | 7367 | 98,7 | 58,6 |
| 1 kD UF/DF elegy | 1,45 | 4235,0 | 6141 | 83 | 48,8 |
| végtermék | - | - | 6014 | 97,5 | 47,8 |
| térfogat (1) | Epidermin | Epidermin | Lépcső | Lépcsők | |
| Lépcső | koncentráció | mennyiség | hozama | összesített | |
| (mg/1) | (mg) | (%) | hozama (%) | ||
| fermentálás | 31 | 72,7 | 2254 | 100 | 100 |
| XAD 1180 elegy | 10 | 200,6 | 2006 | 89 | 89 |
| S-Sepharose elegy | 1,15 | 1412,0 | 1628,9 | 81,2 | 72,3 |
HU213 881 Β
1. táblázat folytatása
| Lépcső | térfogat (1) | Epidermin koncentráció (mg/1) | Epidermin mennyiség (mg) | Lépcső hozama (%) | Lépcsők ! összesített hozama (%) |
| Octyl-Sepharose elegy | 1,05 | 1166,6 | 1224,9 | 75,2 | 54,3 |
| DEAE-Sepharose elegy | 1,07 | 1127,6 | 1206,5 | 98,5 | 53,5 |
| 1 kD UF/DF elegy | 1,07 | 3904,0 | 1026,8 | 85,1 | 45,6 |
| végtermék | - | - | 1007,3 | 98,1 | 44,7 |
UF/DF = ultra és diafiltrált elegy
Claims (5)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás lantibiotikumok tisztítására adszorpciós és kromatográfiás eljárással, azzal jellemezve, hogy előállítunk egy lantibiotikum-tartalmú fermentációs közeget és ezt a következő műveleteknek vetjük alá:sztirol-divinil-kopolimer mátrixon végzett adszorpcióval a közegből eltávolítjuk a lantibiotikumot;a sztirol-divinil-kopolimer mátrixról 0,001-0,1 mólos sósavat tartalmazó metanolos oldattal a lantibiotikumot eluáljuk;az eluátumot poliszacharid-alapú erős kationcserélön kationcserélő kromatografálásnak vetjük alá;10—40 térfogat % metanolt és 0,5-1,5 mólos nátrium-kloridot vagy kálium-kloridot tartalmazó metanolos vizes pufferrel 1-3 pH-értéken eluálunk;az eluátumot eltérő lánchosszúságú alkánokkal ligandumként kapcsolt poliszacharid-alapú mátrixon hidrofób-kölcsönhatás kromatografálásnak vetjük alá a fordított fázisú HPLC kivételével;10-30 térfogat% metanolt és legfeljebb 0,02 mólos nátrium-foszfátot vagy kálium-foszfátot tartalmazó vizes metanolos oldattal 5,0-6,0 pH-értéken eluálunk;az eluátumot poliszacharid-alapú mátrixon gyenge anioncserélővei anioncserélő kromatografálásnak vetjük alá;az átáramló oldatot ultra- vagy diaszüréssel sómentesítjük, és kívánt esetben liofilizáljuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sztirol-divinil-kopolimerizátumként Amberlite XAD-1180-at, erős kationcserélőként S-Sepharose FF-et, poliszacharid-alapú, alkánnal kapcsolt mátrixként Octyl-Sepharose CL 4B-t és gyenge anioncserélőként DEAE-Sepharose FF-et használunk.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sómentesítést 1 kD elválasztású membránon ultra- és/vagy diaszűréssel végezzük.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy epidermint, gallidermint, nisint, subtilint, duramicint, ancovenint, cinnamicint, Pep5-öt vagy Ro-09-0198-at tartalmazó fermentációs közeget tisztítunk.
- 5. Az 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gallidermint vagy epiderimint tartalmazó fermentációs közeget tisztítunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9107717A GB2254852B (en) | 1991-04-11 | 1991-04-11 | Lantibiotic isolation and purification by plural chromatography processes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9201248D0 HU9201248D0 (en) | 1992-06-29 |
| HUT62943A HUT62943A (en) | 1993-06-28 |
| HU213881B true HU213881B (en) | 1997-11-28 |
Family
ID=10693100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9201248A HU213881B (en) | 1991-04-11 | 1992-04-10 | Purification of lantibiotics |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0508371B1 (hu) |
| JP (1) | JPH05252975A (hu) |
| KR (1) | KR100241040B1 (hu) |
| AT (1) | ATE163185T1 (hu) |
| AU (1) | AU653394B2 (hu) |
| CA (1) | CA2065748A1 (hu) |
| DE (1) | DE69224402T2 (hu) |
| DK (1) | DK0508371T3 (hu) |
| ES (1) | ES2112872T3 (hu) |
| FI (1) | FI921568A (hu) |
| GB (1) | GB2254852B (hu) |
| GR (1) | GR3026377T3 (hu) |
| HU (1) | HU213881B (hu) |
| IL (2) | IL101535A (hu) |
| MX (1) | MX9201677A (hu) |
| NO (1) | NO300639B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ242298A (hu) |
| TW (1) | TW227567B (hu) |
| ZA (1) | ZA922616B (hu) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6794181B2 (en) * | 2002-10-09 | 2004-09-21 | Immucell Corporation | Method of purifying lantibiotics |
| JP2004248592A (ja) * | 2003-02-20 | 2004-09-09 | Sanpo Kk | チロシナーゼ阻害剤及びその製造方法 |
| JP5374260B2 (ja) * | 2009-07-10 | 2013-12-25 | 静岡商工会議所 | 農業用資材 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8811761D0 (en) * | 1988-05-18 | 1988-06-22 | Thomae Gmbh Dr K | Biosynthetic process for preparation of chemical compounds |
| GB8811760D0 (en) * | 1988-05-18 | 1988-06-22 | Thomae Gmbh Dr K | Antibiotic |
| ES2059645T3 (es) * | 1988-07-15 | 1994-11-16 | Thomae Gmbh Dr K | Procedimiento para la obtencion, el aislamiento y la purificacion de epidermina. |
-
1991
- 1991-04-11 GB GB9107717A patent/GB2254852B/en not_active Revoked
-
1992
- 1992-04-07 AT AT92105990T patent/ATE163185T1/de active
- 1992-04-07 DK DK92105990T patent/DK0508371T3/da active
- 1992-04-07 DE DE69224402T patent/DE69224402T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-04-07 EP EP92105990A patent/EP0508371B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-07 ES ES92105990T patent/ES2112872T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-08 TW TW081102675A patent/TW227567B/zh active
- 1992-04-09 IL IL10154592A patent/IL101535A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-04-09 NZ NZ242298A patent/NZ242298A/xx unknown
- 1992-04-09 FI FI921568A patent/FI921568A/fi unknown
- 1992-04-09 IL IL101535A patent/IL101535A0/xx unknown
- 1992-04-10 AU AU14813/92A patent/AU653394B2/en not_active Ceased
- 1992-04-10 ZA ZA922616A patent/ZA922616B/xx unknown
- 1992-04-10 JP JP4089173A patent/JPH05252975A/ja active Pending
- 1992-04-10 KR KR1019920005986A patent/KR100241040B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-04-10 CA CA002065748A patent/CA2065748A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-10 HU HU9201248A patent/HU213881B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-04-10 MX MX9201677A patent/MX9201677A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-04-10 NO NO921446A patent/NO300639B1/no unknown
-
1998
- 1998-03-17 GR GR980400573T patent/GR3026377T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR920019945A (ko) | 1992-11-20 |
| AU653394B2 (en) | 1994-09-29 |
| GB2254852A (en) | 1992-10-21 |
| KR100241040B1 (ko) | 2000-02-01 |
| GB2254852B (en) | 1995-04-05 |
| NO300639B1 (no) | 1997-06-30 |
| FI921568A0 (fi) | 1992-04-09 |
| GR3026377T3 (en) | 1998-06-30 |
| TW227567B (hu) | 1994-08-01 |
| NO921446L (no) | 1992-10-12 |
| EP0508371B1 (en) | 1998-02-11 |
| NZ242298A (en) | 1993-11-25 |
| ES2112872T3 (es) | 1998-04-16 |
| DE69224402T2 (de) | 1998-07-09 |
| CA2065748A1 (en) | 1992-10-12 |
| EP0508371A1 (en) | 1992-10-14 |
| ATE163185T1 (de) | 1998-02-15 |
| HUT62943A (en) | 1993-06-28 |
| DE69224402D1 (de) | 1998-03-19 |
| FI921568A (fi) | 1992-10-12 |
| DK0508371T3 (da) | 1998-09-23 |
| IL101535A0 (en) | 1992-12-30 |
| NO921446D0 (no) | 1992-04-10 |
| GB9107717D0 (en) | 1991-05-29 |
| AU1481392A (en) | 1992-10-15 |
| JPH05252975A (ja) | 1993-10-05 |
| IL101535A (en) | 1996-07-23 |
| HU9201248D0 (en) | 1992-06-29 |
| ZA922616B (en) | 1993-10-11 |
| MX9201677A (es) | 1992-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Perkins | Vancomycin and related antibiotics | |
| US5231013A (en) | Polycyclic peptide antibiotic gallidermin | |
| EP0241758B1 (en) | A process for recovery of glycopeptidic antibiotics | |
| JP2659388B2 (ja) | 糖ペプチド回収方法 | |
| Folena-Wasserman et al. | Affinity chromatography of glycopeptide antibiotics | |
| US6699839B1 (en) | Lantibiotic from Streptococcus mutans, method of production and use thereof | |
| EP0321696B1 (en) | Novel hydrogenated derivatives of antibiotic A/16686 | |
| CA2020346C (en) | Antibiotic ge 2270 factors a1, a2, a3 and h | |
| HU213881B (en) | Purification of lantibiotics | |
| US5491128A (en) | Aglycons of A/16686 antibiotics | |
| KR930002736B1 (ko) | 에피더민의 제조방법 | |
| US5338834A (en) | Ultrapure human interleukin-6 | |
| Sitrin et al. | Separation methodology | |
| VÉRTESY et al. | New 4-oxovancosamine-containing glycopeptide antibiotics from Amycolatopsis sp. Y-86, 21022 | |
| EP0339982A1 (en) | Antibiotic compounds | |
| Strickler et al. | Rapid purification of staphylococcal enterotoxin B by high-pressure liquid chromatography | |
| DK175198B1 (da) | Antibioticum, betegnet gallidermin, og syreadditionssalte deraf, farmaceutiske og kosmetiske præparater indeholdende forbindelserne og fremgangsmåde til forbindelsernes fremstilling samt deres anvendelse til fremstilling af et farmaceutisk præparat | |
| SITRIN et al. | Smith Kline and French Laboratories, Philadelphia, PA, 1910 | |
| US20040176300A1 (en) | Indolicidin analogs with anti-microbial activity | |
| Scheme | V. GENERAL GLYCOPEPTIDE ANTIBIOTIC ISOLATION SCHEME | |
| Allgaier | Strategy for purification of lantibiotics Hermann Allgaier*, Joachim Walter, Michael Schlüter and Rolf-Günther Werner Dr. Karl Thomae GmbH, D-7950 Biberach, FRG | |
| HU195522B (en) | Process for cleaning raw insulin by exclusion chromatography | |
| Frey¹ et al. | Frequency of lantibiotic production among | |
| CA2004781A1 (en) | Products |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |