NO20190933A1

NO20190933A1 - Sammensetninger av delvis deacetylerte kitinderivater

Info

Publication number: NO20190933A1
Application number: NO20190933A
Authority: NO
Inventors: Johannes Gislason; Jon M Einarsson; Ng Chuen How; Sven Bahrke
Original assignee: Genis Ehf
Priority date: 2005-06-14
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2008-03-06
Also published as: NO20080240L; NO344086B1; DK1917218T3; AU2006257177A1; CN101248019B; SI1917218T1; HUE035956T2; US20160002360A1; RU2421467C2; CA2611453C; BRPI0612034A2; EP1917218A1; EP1917218B1; US20090281058A1; CN101248019A; CA2611453A1; WO2006134614A1; JP6293005B2; KR20080036580A; NZ565022A

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en ny fremgangsmåte for å gjenvinne polymer kitosan fra en oppløsning. Oppfinnelsen vedrører videre sammensetninger fremstilt med oppfinnelsens fremgangsmåte innbefattende biologisk aktive kitinholdige polymere og oligomere og deres anvendelse i farmasøytiske sammensetninger, biomaterielle sammensetninger, medisinske innretninger og prosesser for å fremstille de nevnte polymere og oligomere.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Kitosan er en biopolymer av naturlig opprinnelse, utvunnet fra kitin som kan fås fra krepsskjell, men som også kan fås fra andre virvelløse dyr og fra sopp. Kitosan fremstilles ved deacetylering av N-acetylglykoseaminrester fra kitinpolymeren, typisk ved hydrolyse av N-acetylforbindelsesledd med konsentrert alkali. Pr definisjon er kitosan generelt beskrevet som en kopolymer av D-glykoseamin (D) og N-acetyl-D-glykoseamin (A), som er uløselige i vann ved pH over 6,2 – det isoelektriske punkt i den frie amingruppen – men løses ved pH under ca 6,2. Typisk er 70-100 % av de monomere enheter i konvensjonell kitosankopolymer, D-glykoseamin, som kan beskrives som 70-100 % deacetylert kitosan med en deacetyleringsgrad på 70-100 %. Når deacetyleringsgraden er lavere enn ca 70 %, oppviser kitosan endrede løseslighetsegenskaper, økt bioaktivitet og generelt større biologisk nedbrytbarhet.

Kjemiske og biologiske egenskaper til kitosan er direkte påvirket av deacetyleringsgraden (DD) og polymerisasjonsgraden (DP), dvs polymerens kjedelengde. I oppløsning ved pH under 6,2, og når amingruppene til D-glykoseaminrester har protoner, er kitosan en positivt ladet polymer. Siden kitosan er en amin, er den en svak base og kan danne salter med syrer, slik som karboksylsyre og mineralsyrer. De fleste av disse salter er vannløselige. I sin naturlige form er kitin uløselig i vann. Imidlertid kan den lages vannløselig ved delvis deacetylering med alkalisk behandling. Delvis deacetylert kitin med DD på 35-50 % er løselig i vann i et bredt pH-område. Denne formen av delvis deacetylert kitin har blitt vist å være bioaktiv med potensielle anvendelser på ulike felt, slik som i biomedisin, legemidler, kosmetikk osv.

En av ulempene med kitosantilberedninger med mer enn 60-70 % DD er dets tendens til å felle ut ved pH over 6,2. Dette begrenser dets anvendelesområder der løselighet ved nøytral til høy pH er påkrevd. I denne henseende har delvis deacetylert kitin større fordeler fremfor kitosan med høyere DD, siden dets løselighetsprofil dekker et bredere pH-område. Det arver de fleste av de fysiokjemiske egenskapene til kitosan og besitter større vannholdekapasitet sammenliknet med normal kitosan, som resulterer i rask svelling når det kommer i kontakt med vann og besitter balanserte hydrofile/hydrofobe egenskaper sammenliknet med vanlig høyere DD kitosan. Disse egenskaper representerer et storartet potensial i ulike anvendelser i biomedisinsk, farmasøytisk, kosmetikk- og andre relaterte industrier.

Biologisk aktivitet til kitin og kitosan er rikelig dokumentert i litteraturen, og økende bevis indikerer at bioaktivitet øker med lavere DD. Dette går hånd i hånd med bedrede løselighetsegenskaper ved fysiologisk pH.

Rensing av kitosan innebærer vanligvis en oppløsningsprosess for å fjerne uløselige stoffer eller forurensninger fra oppløsningen. Dette følges av en gjenvinningsprosess ved utfelling av kitosan fra oppløsningen. Gjenvinningen av kitosan i form av et presipitat kan deretter vaskes til nøytral pH og fjerne salt. Denne gjenvinningen er generelt ikke et problem for kitosan med 55 % DD og høyere, siden det kan utfelles enkelt ved å øke oppløsningens pH til over 6,2. Imidlertid er ikke pH-justering effektivt for delvis deacetylert kitin, og vanligvis er et organisk løsemiddel nødvendig for å hjelpe utfellingsprosessen. Patent Nr CN 1554 267 rapporterte anvendelse av etanol for å vaske polymeren og flere eksempler på anvendelse av løsemidler kan finnes i patentene JP 10072 502, CN 1371922 osv. Alternativt, med en mindre adekvat fremgangsmåte, filtreres bare oppløsningen og tørkes, hvorved saltet vil være tilstede i produktet (JP 2022 301).

Kitosan har blitt vist å være biokompatibel og biologisk nedbrytbar, som gjør det til et attraktivt valg som ingrediens i biomaterialer for bioteknologiske anvendelser.

Biomaterialer er generelt definert som syntetiske materialer anvendt for å erstatte del av et levende system eller for å fungere i nærkontakt med levende vev, og kitosan har generelt blitt betraktet som en egnet inert komponent i biomaterielle utforminger eller som et bindemiddel for andre substanser eller ingredienser. Kitosan har vært foreslått som en medikamentavleveringsbærer, da det kan immobilisere en stor mengde biologisk aktive substanser gjennom adsorpsjon eller ved kovalent å binde slike substanser gjennom enkle kjemiske reaksjoner.

WO 2004/028 578 fremlegger en sammensetning for bendannelse og benkonsolidasjon i benforlengelse innbefattende kitosan, tripolyfosfat og benmorfogenisk protein (BMP).

Videre fremlegger US patent 2003/0124 172 en fremgangsmåte for fremstilling av kitosanbaserte filmer innbefattende en biologisk nedbrytbar polymer og BMP for å forsterke osteointegrasjonen av tannimplantater eller i sårbehandling.

Biologisk aktivitet av kitinavledede materialer har vært indikert, f. eks. i EP 1435 976 som fremlegger kitooligomersammensetninger bestående av heterooligomere av N-acetylglykoseamin og glykoseamin, som er biologisk aktive og er foreslått som aktive ingredienser i legemidler for å behandle tilstander i bindevev, i særdeleshet artritt og osteoartritt.

I en annen patentsøknad er det foreslått at kitinaseliknende proteiner (CLPs) angitt i menneskelige genomer og andre virveldyr, representerer målreseptorer involvert i bioaktiviteten til disse kitooligomerene, inkludert en signalrespons når de bindes til kitooligomerene. Disse kitinaseliknende proteinene avledes fra en familie av gener som angir Familie 18 kitinaser i de fleste former av levende organismer. Den aktive siden av Familie 18 kitinaser er godt bevart i CLPs, med unntak av at de fleste av disse proteinene har mistet sin katalytiske aktivitet gjennom nøkkelmutasjoner på den aktive siden. Imidlertid beholder minst to av disse proteinene sin kitinolytiske aktivitet i mennesker, f.eks. eddiksur pattedyr kitinase (AMCase) og kitotriosidase.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Det er et formål med den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe fremgangsmåter og sammensetninger av høyrenset delvis deacetylert kitin for terapeutiske anvendelser. Med omfattende hydrolyse av en Familie 18 kitinase, enten in vitro eller in vivo, vil den delvis deacetylerte polymere sammensetningen generere kitinholdige heteropolysakkarider med terapeutisk aktivitet. Følgelig fremskaffer oppfinnelsen to sammensetningsformer; polymere sammensetninger hovedsakelig renset for organiske forurensninger, slik som bakterielle endotoksiner, egnet som aktive ingredienser i biomaterialer for implantatanvendelser, og oligomere sammensetninger egnet for systemisk behandling. Disse polymere og oligomere sammensetningene, referert heri som “kitobiomere”, innbefatter biologisk relevante kjennetegn som er markant forskjellig fra konvensjonell kitosan og fra teknikkens stand kitinavledede materialer. Videre representerer de oligomere sammensetninger fremskaffet ved den foreliggende oppfinnelsen, optimalisering av den terapeutiske aktiviteten for alle kitobiomere sammensetninger inkluderende; biologisk tilgjengelighet, biologisk stabilitet, og bioaktivitet. Disse oligomere sammensetningene er referert heri som “Terapeutisk kitooligosakkarider” (T-ChOS). De polymere sammensetningene frembringer et ypperlig in situ avleveringssystem, der endogene Familie 18 kitinaser, spesielt uttrykt ved lokale makrofager, gradvis degraderer det polymere substratet in situ, og genererer terapeutisk aktiv T-ChOS som er i stand til å forhindre arrvevsdannelse og inkluderer vevsfornyelse i skadede brusk- og benvev. Dette involverer reduksjon eller inhibering av fibroblastaktivitet i det skadede vev med T-ChOS-sammensetninger parallelt med en aktivering av vevsspesifikke brusk- og benstamceller. De oligomere sammensetningene kan imidlertid også fremstilles in vitro på kommersiell basis med omfattende hydrolyse av de polymere kitobiomersammensetningene med en Familie 18 kitinase, og fremskaffer T-ChOS til en hvilken som helst slags systemisk avlevering, slik som oral, intramuskulær, subkutan eller intravenøs behandling, eller lokal avlevering i en implantatsammensetning.

I et første aspekt av den foreliggende oppfinnelsen fremskaffes en optimalisering av prosessen for å fremstille delvis deacetylert kitinheteropolymer (kitobiomer) med terapeutisk aktivitet. Optimaliseringen inkluderer fremgangsmåte for å rense en fullt oppløst delvis deacetylert kitinpolymer, der fremgangsmåten innbefatter trinnene a) nøytralisering av det delvis deacetylerte kitinet etter deacetylering; b) oppløsning av det delvis deacetylerte kitinet i sur oppløsning; c) fjerning av uoppløste partikler gjennom sekvensielle filtreringstrinn; d) justering av oppløsningen til pH over 8; og e) utfelling av det oppløste delvis deacetylerte kitinet som øker den katropiske faktoren av oppløsningen gjennom forhøyet temperatur og tilsats av salt. Fremgangsmåten er kjenntegnet ved gjenvinningen av presipitatet etter utfellingen ved siling eller ved sentrifugering og der temperaturen av presipitatet er over 50 °C. Denne optimaliseringen er oppnådd spesielt ved å fokusere på hydrolyseproduktene som er generert ved den omfattende hydrolysen av de polymere kitobiomere med Familie 18 kitinase. Substratet vil bli degradert til heterooligomere som besitter vesentlig motstand mot alle Familie 18 kitinaser. Ved forsiktig regulering av deacetyleringstrinnet i den frembrakte prosess, både med hensyn til homogenitet og deacetyleringsgrad, kan det relative utbyttet av T-ChOS-sammensetninger generert ved hydrolysetrinnet, reguleres. Dette fremskaffer en optimalisering av den terapeutiske aktiviteten til kitobiomersammensetningene. De definerte polymere kitobiomersammensetningene er begrenset innen området 30 – 70 % deacetyleringsgrad, og viser løselighetsegenskaper svært forskjellig fra konvensjonell kitosan. På grunn av denne definisjonen utviser alle kitobiomersammensetninger en løselighet ved fysiologisk pH.

I et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen fremskaffes en delvis deacetylert kitinpolymersammensetning som er fremstilt ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte. I en utførelsesform av denne oppfinnelsen innbefatter sammensetningen biologisk aktive kitooligomere av N-acetylglykoseamin (A) og glykoseamin (D). Sammensetningen av kitooligomere må oppfylle alle de følgende kriterier (a-d):

a) nevnte oligomere har en kjedelengde i området 5-20 monomerrester

b) hver oligomerkjede kan ha to N-acetylglykoseaminrester (AA) på enten hver eller begge ender av oligomerkjeden,

c) den gjenværende indre del av oligomeren har en maksimal mengde A rester d) sekvensen i den nevnte interne kjede er slik at en N-acetylglykoseaminrest (A) ikke er inntil en annen N-acetylglykoseaminrest (slik som AA).

I et tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelsen fremskaffes en anvendelse av oppfinnelsens sammensetninger for fremstilling av biomateriale/medikament.

I et fjerde aspekt av den foreliggende oppfinnelsen fremskaffes en farmasøytisk sammensetning innbefattende oligomere sammensetninger av kitobiomeren fremstilt ved oppfinnelsens fremgangsmåter.

I et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelsen anvendes polymersammensetninger av kitobiomere for å modulere vannaktiviteten i en kalsiumfosfatkompositt. Polymersammensetningene av kitobiomere vil begrense størrelsen av krystaller dannet under størkning og herding av kompositten, og sammen med degradering av kitobiomere med Familie 18 kitinase, uttrykt lokalt ved makrofager; dette forsterker den biologiske nedbrytningen av kompositten og hjelper migrerende celler til å penetrere strukturen, og å øke dets osteokonduktivitet.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Utførelsesformene og definisjonene nedenfor vedrører fremgangsmåtene og sammensetningene i, og anvendelser av, den foreliggende oppfinnelsen.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er deacetyleringsgraden (DD) av den delvis deacetylerte kitinpolymeren mellom 25 og 70 %, slik som mellom 30 og 65 %, slik som mellom 30 og 60 %, slik som mellom 30 og 55 %, der DD refererer seg til gjennomsnittlig DD av den løselige fraksjonen av det delvis deacetylerte kitinet og molekylvekten av denne kitobiomeren er høyere enn ca 10 kDa.

I den foreliggende kontekst refererer termen “nøytralisere” med hensyn til den delvis deacetylerte kitinblandingen etter deacetylering, seg til å redusere pH i en sterk alkalisk oppløsning i deacetyleringsprosessen enten ved vasking med vann eller ved tilsetting av sterk syre.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen innbefatter oppvarming av den delvis deacetylerte kitinoppløsningen å øke temperaturen til mellom 45-100<o>C eller til og med koking, slik som 55-90<o>C, eller slik som 60-80<o>C eller fortrinnsvis mellom 60 og 70<o>C.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen innbefatter justering av den delvis deacetylerte kitinoppløsningen å øke pH til mellom pH 8-13, slik som mellom pH 9-12 eller mellom 10-11.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen oppnås saltutfelling ved addisjon av salt eller ved nøytralisering av oppløst syre i oppløsningen, der saltet anvendt for saltutfellingen er natriumklorid eller et salt av en hvilken som helst organisk syre anvendt for å oppløse det delvis deacetylerte kitinet, slik som eddiksyre, eller fortrinnsvis di- eller trikarboksylsyre, slik som maleinsyre eller sitronsyre. Disse saltene kan dannes ved nøytralisering av oppløsningen med en egnet base. Videre refererer saltkonsentrasjonen seg til enhver konsentrasjon som kan føre til utfelling av polymeren, der saltkonsentrasjonen er mellom 2 % og metning.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen behandles kitin med mineralsyre før deacetyleringstrinnet for å oppnå et produkt med meget lave endotoksine nivåer, slik som mellom 1 og 60 EU/g eller under 30 EU/g. Syren åpner polymeren, avdekker og ødelegger endotoksinene. Enhver konsentrert syre som fører til oppløsning av kitinpolymeren HCl, fosforsyre, maursyre, salpetersyre, svovelsyre, kan anvendes. Endotoksinresultater er uttrykt som EU enheter som EU/ml, eller EU/g.

I en ytterligere utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen anvendes prosessene for fremstilling av biomateriale/medikament for å forsterke benfornyelsen og hemostasen i helbredelsen av et brukket eller skadet ben i et pattedyr. Slike legemidler forsterker bendannelsen ved endokondral forbening ved å aktivere vevsspesifikke stamceller.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen innbefatter biomaterialet en ytterligere komponent utvalgt fra gruppen bestående av kalsiumfosfater, inkludert hydroksyapatitt, kalsiumsulfat, natriumtripolyfosfat, alginat, kollagen og hyaluronsyre.

Biologisk tilgjengelighet, eller evnen for en gitt substans til å passere gjennom biologiske membraner, er relatert til den hydrofobiske evnen til molekylene. Siden alle biologiske membraner er overveiende av hydrofob natur, gjelder den generelle regel at desto mer hydrofob en substans er, jo bedre kan den penetrere slike biologiske membraner. N-acetylglykoseamin og fullt acetylerte kitinoligomere er mer hydrofobe enn de korresponderende glykoseaminmonomerene eller høyt deacetylerte kitosanoligomere, som antyder at kitinholdige heterooligomere vil besitte økt biologisk tilgjengelighet med økt acetylering. Følgelig har T-ChOS-utformingene blitt optimalisert til å inneholde en maksimal mengde N-acetylglykoseamin i sin molkylstruktur med sikte på å maksimere deres biologiske tilgjengelighet uten å bringe deres biologiske stabilitet i fare. Denne oppfinnelsen fremskaffer enestående fakta som viser forholdsvis økt biologisk tilgjengelighet av T-ChOS-sammensetninger i et frivillig menneske.

Biologisk stabilitet av en organisk forbindelse refererer seg til dens mottakelighet for endogene enzymer i en levende organisme og dens halveringstid (t1⁄2) i den organismen. Desto mer mottakelig, jo mindre biologisk stabil er forbindelsen. I mennesker kan kitinolytiske enzymer deles inn i to grupper; enzymer med høynivå kitinolytisk spesifisitet som Familie 18 kitinaser (AMCase, kitotriosidase), som besitter høy spesifikk aktivitet eller enzymer med lavere kitinolytisk spesifisitet, slik som lysozym og noen proteaser, som tilfeldvis degraderer kitin og kitosan, men ved lavere spesifikk aktivitet. Ved delvis deacetylering har T-ChOS-sammensetningene blitt optimalisert for maksimal stabilitet overfor hydrolyse av Familie 18 kitinase. Siden disse enzymene krever en sekvens på to eller flere etterfølgende N-acetylglykoseaminrester som gjenkjennelse for deling, er T-ChOS-sammensetningene spesifikt optimalisert for å ekskludere slike sekvenser i den indre del av molekylet.

Bioaktivitet av en organisk substans eller en ligand er direkte forbundet med affiniteten av liganden mot målreseptoren som trigger den biologiske responsen. Lite er fortsatt kjent om den biologiske rollen til kitinholdige forbindelser i menneskekroppen, selv om det er indikasjoner på at kitinoligomere spiller en vital rolle i embryonisk utvikling. Dette antyder at det menneskelige genomet er i stand til å uttrykke spesifikke reseptorer som er spesifikt aktivert når det bindes til kitinoligomere. De eneste kjente kitinbindende proteiner i menneskekroppen er kitinaseliknende proteiner (CLPs), som genetisk tilhører Familie 18 kitinaser, men de fleste av dem har mistet sin enzymatiske aktivitet.

De kitinbindende områder i disse proteiner er høyt preserverte og skilles fra de aktive sider av Familie 18 kitinaser bare ved en eller få aminosyrer. Bindingen av fullt aktiverte kitinoligosakkarider til det aktive punkt i et protein vil generelt indusere en konformasjonsendring i proteinstrukturen, som indikerer en signalrolle i interaksjonen. Den foreliggende oppfinnelsen fremskaffer data som viser at bindingssiden til et av de kitinaseliknende proteinene (YKL-40 eller HC gp-39) besitter nesten like sterk affinitet (90%) overfor de delvis deacetylerte T-ChOS-sammensetningene sammenliknet med fullt acetylerte kitinoligosakkarider. Familie 18 kitinaser er svært aktive på kitinholdige substrater og krever tilliggende N-acetylgrupper som et gjenkjennelsespunkt for hydrolysen, og en av acetylgruppene vil aktivt ta del i hydrolysereaksjonen som en protondonor. Dette antyder at kitinoligomere som er fullt acetylerte, raskt vil bli degradert i menneskekroppen (besitter dårlig biologisk stabilitet), spesielt siden kitinholdige strukturer sannsynligvis induserer uttrykk av korresponderende endogene Familie 18 kitinaser. Imidlertid vil en delvis deacetylering av kitinoligomeren øke den biologiske stabiliteten, spesielt hvis den delvise deacetyleringen gir en sekvens der det ikke er noen tilliggende acetylgrupper innen oligomerens struktur. Dette ville gi et molekyl som ikke vil bli delt ved spesifikke kitinholdige enzymer, som Familie 18 kitinaser, men vil bare sakte bli degradert med mindre spesialiserte enzymer, som er i stand til å dele kitin så vel som kitosan, men med betydelig lavere spesifikk aktivitet. Dette antyder at T-ChOS-sammensetningene besitter den biologiske tilgjengeligheten, den biologiske stabiliteten og den bioaktiviteten som kreves for terapeutisk aktivitet.

I et benimplantat vil de polymere kitobiomerene gradvis bli hydrolysert med en makrofagavledet Familie 18 kitinase, som genererer en stor fraksjon av T-ChOS-sammensetninger. Disse høyt løselige oligomerene vil diffundere gjennom kompositten og tilliggende vev, og fungere som kjemotaktiske faktorer eller stimuli for makrofager så vel som for brusk- og benstamceller lokalisert i benmargen, så vel som i endosteum og benhinne. Dette frembringer osteoinduktivitet til benimplantatkompositten.

Sammensetningene av den foreliggende oppfinnelsen innbefattende terapeutiske kitooligomere og deres polymere forstadier (samlet referert til som kitobiomere), fremstilles ved en prosess som er basert på mange nøkkelbearbeidingstrinn, som kritisk påvirker sammensetningen og egenskapene til de fremstilte materialene, slik som løselighet og renhet. For maksimal renhet fremskaffes et optimalt forbehandlingstrinn, der kitin fra en egnet kilde i det vesentligste løses opp i en egnet syreoppløsning, fortrinnsvis en mineralsyre, slik som saltsyre (HCl), skjønt andre syrer kan likeså godt anvendes, inkludert karboksylsyrer og/ eller mineralsyrer, slik som svovelsyre, fosforsyre eller salpetersyre. Når HCl anvendes er konsentrasjonen typisk ca 15-37 vekt%, slik som 25 % eller høyere, konsentrasjon av andre syrer justeres passende for å oppnå liknende resultater. I en utførelsesform behandles det syreoppløste kitinet med en oksidant, fortrinnsvis hydrogenperoksid, skjønt andre oksidanter kan likeså godt anvendes, f.eks. alkalimetallperoksider, alkaliske jord- og alkaliske metallperborater, perkarbonater, peroksymonosulfater, persulfater, bromater, hypohalitter og dihalotrazintrioner. Den sure oppløsningen av kitinet vil åpne dets krystallinske struktur og avdekke endotoksinmolekyler innesluttet i materialet, og muliggjøre effektiv ekstraksjon og degradering av endotoksine forurensninger. Den valgfrie oksidantbehandlingen er ment å hjelpe degraderingen av de endotoksine molekylene og dermed videre redusere det endotoksine innholdet i sluttproduktet. Noe fragmentering av polymerkjedene vil oppstå i dette prosesstrinnet. Oppløsningen av hovedsakelig oppløst kitin blir fortrinnsvis raskt fortynnet og hovedsakelig nøytralisert med tilstrekkelig rent vann eller alkalisk vandig løsning, f.eks. ved å helle oppløsningen med det hovedsakelig oppløste kitinet inn i et stort volum med den nøytrale vandige oppløsningen, slik at en signifikant del av kitinmaterialet felles ut som amorft kolloidalt kitin. Vannet er typisk ved forhøyet temperatur, slik som innenfor området 40-100 °C, f.eks. i området 50-100 °C, slik som i området 50-80 °C. Temperaturen vil påvirke komprimeringsgraden og størkning av det kolloidale kitinet. Etter vasking (fortrinnsvis en rekke vaskinger) i tilstrekkelig rent vann er det kolloidale kitinet klart for deacetylering.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen blandes det delvis deacetylerte kitinet og/ eller kitosanet med en deacetyleringsgrad fra 30-100% DD, med kalsiumfosfatkompositter med sikte på å regulere fysiokjemiske, mekaniske og biologiske egenskaper til den ferdige kompositten. Denne fremgangsmåten er fremskaffet for å regulere de mekaniske og biologiske egenskapene av en kalsiumfosfatkompositt ved å blande kitobiomere eller kitosan med forskjellig deacetyleringsgrad inn i kompositten. Dette frembringer et kraftig verktøy for å regulere avgjørende komposittegenskaper, slik som størknetid, herdetid, hardhet og styrke så vel som biologisk nedbrytbarhet og tilgjengelighet for migrerende celler fra vertsvevet. Denne muligheten til å regulere disse grunnleggende egenskapene består i den skarpe reduksjon i vannholdekapasitet til de deacetylerte kitinderivatene når deacetyleringsgraden økes fra 30 til 100 % DD, dvs desto lavere DD, jo høyere vannholdekapasitet. Siden krystalliseringen av kalsiumfosfat involverer reaksjon med vann, vil vanntilgjengeligheten i kompositten influere på krystalldannelsen. Desto mer vann som holdes i det delvis deacetylerte kitinet, jo mindre er krystallene i kompositten. Dette vil i sin tur påvirke de mekaniske egenskapene og komposittens biologiske nedbrytbarhet. Desto lavere deacetyleringsgrad (DD) av kitobiomeren, jo lettere er det for fagocyttene, slik som makrofagene, å invadere komposittblandingen, åpne nye porer for andre migrerende celler, slik som brusk- og benstamcellene så vel som vaskulære endotelceller. Dette er en avgjørende egenskap siden dette vil forsterke omdanningen av kompositten til et friskt fungerende vev. Gjennom optimalisering av kitobiomeren i deacetyleringsprosessen er det mulig å øke utbyttet av T-ChOS generert ved omdanning av kompositten, og frembringe effektiv stimulering av den endokondrale benfornyelsen i en benskade.

Det konkluderes derfor med at ved forsiktig å kontrollere deacetyleringsgraden av det delvis deacetylerte kitinet anvendt i kompositten, er det mulig å optimalisere osteokonduktiviteten så vel som osteinduktiviteten til kompositten.

Deacetylering utføres typisk med kitinråmaterialet oppløst i det alkaliske basereaksjonsmiddelet. Denne alkaliske basen er typisk natriumhydroksid skjønt andre baser er likeså godt egnet, og inkluderer KOH, LiOH, Ca(OH)2, Na3PO4og NH4OH. Forholdet mellom tørt stoff og alkali kan i noen utførelsesformer være i området fra 1:5 til 1:100. Baseoppløsningen er fortrinnsvis kjølt før blanding. Det er funnet at ved å fryse alkali-kitinblandingen og deretter å tine den opp og inkubere for deacetylering, forsterkes homogeniteten av deacetyleringen vesentlig. Inkuberingstemperaturen for deacetyleringsprosessen kan imidlertid justeres innen et relativt bredt område på 0-100 °C og inkuberingstiden justeres i henhold til dette (lavere deacetyleringstemperaturer krever lengre inkuberingstider og omvendt). I noen utførelsesformer utføres deacetyleringen ved temperaturer i området 5-50 °C, mer foretrukket i området 10-40 °C eller i området 20-50 °C, slik som i området 10-30 °C eller i området 10-25 °C, og mer foretrukket i området 12-25 °C, slik som i området 15-25 °C. Det delvis deacetylerte kitinet utfelles i tilstrekkelig rent vann, fortrinnsvis ved forhøyet temperatur, slik som i området ca 30-80 °C, og inkluderer området på ca 35-65 °C, slik som området på ca 45-60 °C eller 40-50 °C, og vaskes deretter med tilstrekkelig rent vann. Som tidligere beskrevet, kan salt tilsettes oppløsningen for å hjelpe ytterligere i å gjenvinne polymeren i presipitatet. Materialet kan deretter vaskes og kan frysetørkes eller spraytørkes, avhengig av den videre påtenkte anvendelse.

Den beskrevne prosessen gir signifikant homogen deacetylering, som betyr at N-acetyl-D-glykoseaminrester (A) og glykoseaminrester (D) i polymeren er hovedsakelig jevnt distribuert, og påvirker den derpå følgende hydrolysen av polymeren til terapeutiske kitooligomere. Dette tilbyr en mulighet til å optimalisere utbyttet av T-ChOS gjennom hydrolysen med en Familie 18 kitinase ved forsiktig å justere den gjennomsnittlige deacetyleringsgraden i det delvis deacetylerte kitinet. Slik hydrolyse kunne finne sted før anvendelse (dvs in vitro, f.eks. som beskrevet nedenfor) eller in vivo ved å anvende det oppnådde polymere forstadiet (kitobiomere) som en ingrediens i legemidler, biomateriale eller medisinske innretninger. Kitobiomeren vil bli langsomt hydrolysert ved endogene enzymer, f.eks. slik som kitotriosidase for å generere terapeutiske kitooligomere in situ.

Som anvendt heri, er termen “kaotropisk middel” et middel som forårsaker molekylstruktur til å bli brutt; særskilt de dannet ved ikke-bindende krefter, slik som hydrogenbinding, Van der Waals interaksjoner og den hydrofobe effekten. Ofte kan strukturelle kjennetegn, som detektert ved hjelp av en sirkulær dikroisme, titreres på en kaotropisk konsentrasjonsavhengig måte.

De vanligst anvendte kaotropiske midler er 6~8M urea og 6M guadinhydroklorid, med urea som uladet molekyl og guadinhydroklorid som hydrokloridsalt.

Høye generiske salter kan ha kaotropiske egenskaper, ved å skjerme ladninger og hindre stabilisering av saltbroer. Hydrogenbinding er sterkere i ikke-polare medier, så salter, som øker det dipolare moment i oppløsningen, kan også destabilisere hydrogenbinding.

I den foreliggende kontekst refererer termen “tilsats av et kaotropisk middel, slik som et salt” seg til tilsatsen av salter utvalgt fra, men ikke begrenset til NaOH, ammoniumsulfat, urea, guadinhydroklorid, ethvert salt av en syre, fortrinnsvis et salt av trikarboksylorganisk syre (for eks. sitronsyre) derpå et salt av dikarboksylsyre (maleinsyre) derpå et salt av monokarboksylsyre. Et salt av høy kaotropisitet.

De oppnådde delvis deacetylerte kitobiomerene har distinkte kjennetegn.

Foroppløsningen av kitin, dannelse av kolloidalt kitin og derpå følgende oppløsing i alkalisk base før deacetylering, åpner signifikant kitinkrystallstrukturen og tillater effektiv reduksjon av bakterielle endotoksiner i det kitinholdige materialet, som gir polymerrenhet akseptabel for anvendelse i biomaterielle utforminger og/eller medisinske innretninger som er tenkt for implantatanvendelser.

Struktursekvensen i de terapeutiske kitobiomere påvirker direkte deres biologiske aktivitet, dvs hvordan de transporteres gjennomg biologiske membraner (biologisk tilgjengelighet), hvor raskt de brytes ned i levende systemer (biologisk stabilitet) og hvordan de virker på kitinaseliknende proteiner og andre spesifikke reseptorer som binder kitinholdige sekvenser (bioaktivitet).

Med hensyn til aktivitetsmekanismer fra Familie 18 kitinaser krever en gjenkjennelse av spaltepunktet i substratmolekylet en sekvens på to eller flere N-acetyl-D-glykoseaminhalvdeler (-AA-). Spaltingen etterlater de to acetylgruppene ved den reduserende ende av det resulterende produkt, som betyr at hvis den enzymatiske hydrolysen går fullstendig, vil flesteparten av oligomerene ha to N-acetyl-D-glykoseaminhalvdeler på den reduserende ende. Dette medfører at en terapeutisk kitooligomer i oppfinnelsen med optimal biologisk tilgjengelighet, biologisk stabilitet og biologisk aktivitet, ville være en delvis acetylert kitooligomer med maksimal acetylering uten å ha to acetylgrupper inntil hverandre i det indre området av molekylet. En enkel beregning ville derfor antyde omtrent 50% acetylering, der to monomere veksler i sin molekylære sekvens i det indre området (dvs –DADADADA-). Når denne strukturen påvirker det bindende området i Familie 18 kitinaser, YKL-40 eller en hvilken som helst av dets CLP slektninger, har -DADADADA- strukturen sterkere affinitet til bindingspunktet sammenliknet med en predominerende D sekvens (dvs – DDDDDA-). Det samme er tilfellet for den biologiske tilgjengeligheten til de terapeutiske kitooligomere, siden økt acetylering også øker hydrofobisiteten i molekylet. Denne oppfinnelsen fremskaffer data som viser at den bindende affiniteten til CLP bindingsområdet øker med det relative antall A rester (FA). Imidlertid stadfester våre data også at T-ChOS-sammensetningene besitter minst 90 % av bindingsaffiniteten som målt for en fullt acetylert kitinhexamer (A6)

Med hensyn til bakteriell endotoksinforurensning behøves spesiell oppmerksomhet på kitin- og kitosanavledede materialer tiltenkt implantatanvendelser, siden skallutvunnet kitin så vel som akkar- og blekksprututvunnet kitin typisk vil inneholde vesentlige nivåer av bakterielle endotoksiner. I tillegg vil kitosan oppnå signifikant affinitet til bakterielle endotoksiner gjennom og etter deacetyleringen. Derfor trengs det å inkorporere spesifikke trinn for signifikant å ekstrahere og redusere bakterielle endotoksiner fra råmaterialsubstratet i enhver prosess tiltenkt å fremstille tilstrekkelig rent kitosan for implantatanvendelser.

De farmasøytiske sammensetningene beskrevet her innbefatter de terapeutiske kitooligomerene (T-ChOS) i oppfinnelsen. De kan behandles systemisk og bindes til endogene CLPs, hvorav mange har blitt vist eller implisert til å spille en rolle i atskillige sykdommer og tilstander. Blant sykdommene og tilstandene som er assosiert med forhøyet uttrykk av CLPs, er degenererende sykdommer, slik som degenererende leddsykdommer, inkludert artritt (f.eks. reumatoid artritt og osteoartritt). T-ChOS-sammensetningene er funnet å være nyttige for behandling og/eller lindrende for disse sykdommene så vel som forholdene relatert til benvevsdannelse og tilstander, slik som benfornyelse etter kirugiske inngrep eller traumer.

Sammensetningen kan videre innbefatte et farmasøytisk akseptabelt bindemiddel, slik som bearbeidingshjelpemiddel eller stabilitetsmidler, fortynningsmidler, smakstilsetninger, næringsstoffer eller fargestoffer eller formålstjenlige ytterligere biologisk aktive eller ikke-aktive ingredienser.

Den farmasøytiske sammensetningen skal fortrinnsvis være i en egnet form til oral behandling, slik som en tørr form, som hurtig kan oppløses, f.eks. i et glass vann. Slike former inkluderer tørt pulver, en suspensjon, en gel, en film, et skum, en sol, aerosol-, granulerte-, flak-, fiber- og pastaformer. Imidlertid kan sammensetningen også være innesluttet i piller eller kapsler. De farmasøytiske sammensetningene kan videre innbefatte et farmasøytisk akseptabelt bindemiddel.

I andre nyttige utførelsesformer er oppfinnelsens sammensetning i en form egnet for andre former av systemisk behandling, slik som intramuskulær, subkutan eller intravenøs behandling. Slike egnede former er oppløsningsformer med en farmasøytisk akseptabel bærer eller et bindemiddel ifølge standard farmasøytisk praksis. Nevnte oppløsningsformer er sterile, og pH er passende justert og bufret. For intravenøs anvendelse burde den totale konsentrasjonen av det oppløste bli kontrollert for å gjøre preparatet isotonisk.

Oppfinnelsens T-ChOS kan passende bli fremskaffet i en i det vesentligste tørr form innbefattende et pulver, flak eller fibermateriale, som kan leveres i kapsler eller tabletter, eller oppløst eller suspendert i en vandig oppløsning for inntak. En slik sammensetning kan bestå av hovedsakelig bare de forannevnte terapeutiske kitooligomerene, dvs i området på ca 80 – 100 vekt% kitooligomere. I nyttige utførelsesformer inneholder sammensetningen i området 20-100 vekt% av nevnte T-ChOS, inkludert ca 25 – 95 vekt%, slik som ca 50 – 90 vekt%.

Oral behandling av oppfinnelsens T-ChOS krever at molekylstrukturen i T-ChOS oppfyller flere krav; besitter adekvat biologisk tilgjengelighet, dvs transporteres kvantitativt gjennom biologiske membraner i magetarmkanalen; har adekvat biologisk stabilitet med sikte på å overleve initiell degradering i magetarmkanalen, og bli distribuert effektivt til kroppsvæskene før de blir degradert og eliminert fra systemet, og tilslutt må de besitte passende bioaktivitet gjennom binding til målreseptorene.

Oppfyllelse av alle disse krav krever et kompromiss der noen eller alle kriterier bare er oppfylt på et suboptimalt nivå. Dette krever et holistisk syn på produktoptimaliseringskonseptet med sikte på å oppnå den best mulige sammensetningen som er i stand til å overvinne absorpsjonshindrene og biologisk nedbrytbarhet for å sikre at T-ChOS når frem til og virker sammen med målreseptoren(e).

I den foreliggende kontekst refererer termen “medisinsk innretning” seg generelt til et instrument, apparat, redskap, maskin, mekanisme, implantat, in vitro reagens, eller andre liknende eller relaterte artikler, inkludert delkomponent, eller tilbehør, som er tiltenkt for anvendelse i diagnosen av sykdom eller andre tilstander, eller i helbredelsen, lindringen, behandlingen eller forebyggingen av sykdom, i mennesker eller andre dyr, eller tiltenkt å påvirke strukturen eller enhver funksjon av menneskekroppen eller andre dyrekropper. I konteksten her anvendes termen “biomaterialprodukt” omvekslende med termen “medisinsk innretning”.

De kitobiomere (polymere og oligomere) i denne oppfinnelsen er særlig nyttige i biomaterialer til ulike formål. I tillegg til å forklare alle fordelaktige kjennetegn av konvensjonell kitosan (biokompatibilitet, evne til å blandes med andre forbindelser for å fremstille egnede blandinger til medisinske innretninger, slik som mekaniske implantater, medikamentavleveringsinnretninger osv), besitter de signifikant økt løselighet og biologisk eller terapeutisk aktivitet på grunn av deres høye affinitet til CLPs i kroppen, som beskrevet ovenfor.

Utforming av biomaterialene kan passende inkludere andre organiske og uorganiske forbindelser, slik som forskjellige biopolymere (alginater og andre polysakkarider osv), kollagen, kalsiumfosfater, inkludert hydroksyapatitt, kalsiumsulfat, natriumtripolyfosfat, natriumdihydrogenfosfat, natriumglycerolfosfat, kalsiumoksid, kalsiumhydroksid og forskjellige organiske syrer eller karboksylsyrer osv.

Oppfinnelsens biomaterialer er nyttige i ulike medisinske innretninger som drar fordel av egenskapene til kitobiomere innbefattet i en biomateriell sammensetning.

I benfornyelsen og andre vevsfornyelser er det to hovedtyper av ben, trabekulærben og kortikalben. Trabekulærben er svampaktig og utgjør mesteparten av det indre av de fleste ben, inkludert ryggvirvler, mens kortikalben er tett og danner overflaten til ben. Trabekulært nettverk støtter bloddannende elementer i ben.

Termen “intrahinneaktig forbening” refererer seg til en prosess for ny bendannelse som har sin opprinnelse fra osteostamceller, som med det rette triggersignalet differensierer direkte til nytt ben. Denne forbeningsveien finner sted ved det embryoniske trinn, spesielt i veksten av flate ben, slik som kranieben til skallen.

Termen “endokondral forbening” refererer seg til bendanningsprosessen, der brusk utvikler seg først og utgjør rammeverket til det ferdige benet. Bruskvevet trenger mindre lokalt oksygentrykk for sin utvikling og vedlikehold enn utviklede benvev og derfor, hvorsomhelst der blodtilførselssystemet ikke har oppnådd sitt endelige utviklingstrinn, vil brusk erstatte ben. Brusk vil bare bli erstattet med nytt ben etterat kardannelsen har nådd et fremskredent trinn, for å garantere vesentlig tilførsel av oksygen til de utviklende vev. Denne bendannelsesprosessen er også typisk gjennom det embryoniske trinn, særlig i ryggvirvler, lange ben, brystbein osv.

Eksempler

Eksempel 1: Fremstilling av høyren delvis deacetylert kitinpolymer (kitobiomer)

1.1 Anvendelsen av homogen deacetyleringsbetingelse med sikte på å øke utbyttet av kitobiomersammensetninger og vesentlig redusere bakterielt endotoksinnivå ved deacetylering

Kintinpulver (1) ble tilført (2) til 50 % NaOH (3) ved 15<o>C (forhold kitin/NaOH, 1:15, vekt/vekt) og blandet ved konstant hastighet på 36 rpm (4) i 1 time (5). Deretter ble finknust 3-10 mm is (forhold alkali/is, 1:3, vekt/vekt) (6) tilført til alkalislammet for å oppløse kitinet. Etter 2 timer, når kitinet var oppløst og bakterielle endotoksiner var fullt utsatt for alkaliløsningen, ble temperaturen (7) økt og deacetyleringsreaksjonen ble utført ved 16 °C i 40 timer. Etter at deacetyleringsprosessen er fullført, er endotoksinene redusert dramatisk (<30 EU/g), og pH ble justert ytterligere til 3,8 (8). Dette ble etterfulgt av en rekke filtreringstrinn (9) for å fjerne fremmede partikler og uoppløste polymere. Polymeren ble gjenvunnet ved utfelling med en utsaltingsfremgangsmåte. Etter gjenvinningen ble polymeren vasket og homogenisert. Tilslutt ble suspensjonen spraytørket (10) for å oppnå den rensede polymeren. Denne prosessen er kommersielt anvendbar og vil øke utbyttet av fullt løselige kitobiomersammensetninger med 60 % sammenliknet med heterogen deacetyleringsprosess. Endotoksinnivåer vil bli dramatisk redusert gjennom prosessen, sannsynligvis fordi endotoksinmolekylene vil bli mer utsatt for kaustisk sodaoppløsning sammenliknet med situasjonen i en heterogen deaetylerinsprosess, der kitinråmaterialet beholder sin krystallinske struktur gjennom hele prosessen og endotoksine molekyler, som kan bli innesperret i den faste kitinstrukturen, vil sannsynligvis oppnå beskyttelse fra kaustisk soda i reaksjonsmediet.

Noter Numre i parentes representerer fremgangsmåtetrinn, som kan varieres ifølge listen nedenfor

(1) Partikkelstørrelsen av pulveret kan være 2 mm og mindre. Kitinkilder inkludert reke, krabbe, blekksprut, akkar, krill og andre er egnet.

(2) Reaktor som imøtekommer de hygieniske krav

(3) Sluttkonsentrasjonen av alkaliet kan være i området fra 5 til 90 vekt%. Det mest fordelaktige alkaliet er natriumhydroksid. Andre alkalier er like så godt egnet, disse inkluderer KOH, LiOH, Ca(OH)2, Na3PO4og NH4OH. Forholdet av tørr masse til alkali kan være i området fra 1:3 til 1:100. Temperaturen av alkaliet kan være i området fra 2 til 35<o>C.

(4) Blandehastigheten kan variere fra 0 til 80 rpm. Det mest fordelaktige området er 20-40 rpm for denne prosessen.

(5) Deacetyleringstiden kan være i området fra 0,5 til 1000 timer, hovedsakelig avhengig av temperaturen og konsentrasjonen til alkaliet.

(6) Størrelsen av knust is kan være i området fra 0,5 til 50 mm. Forholdet av alkali til is kan være i området fra 1:1 til 1:30

(7) Deacetyleringstemperaturen kan være i området fra 10 til 100<o>C, med optimum mellom 5-30<o>C og deacetyleringstiden kan være i området fra 0,1 til 1000 timer. Avhengig av kombinasjonen av temperatur og tid som er anvendt.

(8) Forskjellige syrer kan anvendes til denne surgjøringsprosessen, disse inkluderer konsentrerte karboksylsyrer og konsentrerte mineralsyrer. Den mest fordelaktige er saltsyre. Konsentrasjonen av HCl kan være i området fra 0,01 til 37 vekt%. (9) Forskjellige filtreringsteknologier kan være anvendbare, inkludert ultrafiltrering og nano-filtrering

(10) Tørking kan utføres med frysetørking eller spraytørking, eller en hvilket som helst annen hensiktsmessig tørketeknologi

1.2 Forbehandling av kitinråmaterialet med saltsyre med sikte på ytterligere å forsterke reduksjonen av bakterielle endotoksiner

Dette eksemplet fremskaffer et ekstra trinn av forbehandling av kitinråmaterialet, og involverer oppløsning av kitinpulver i et sterkt saltsyre- (HCl) medium, effektiv ekstrahering av bakterielle endotoksiner fra oppløst kitinstruktur og deretter ødelegging av utsatte endotoksiner som er i kontakt med HCl og et valgfritt oksideringsmiddel (f.eks. hydrogenperoksid). Videre, gjennom en påfølgende væskeformig deacetyleringsprosess, muliggjør det oppløste kitin i alkaliet en ytterligere ekstraksjon og destruksjon av endotoksiner som overlevde HCl-behandlingen. Denne fremgangsmåten er særlig nyttig i behandlingen av råmaterialer som har mistet sin friskhet og vært utsatt for bakteriell vekst gjennom høsting, lagring eller transport.

Eksempel på en detaljert fremstillingsprosess

Pulveraktig kitin (<150 μm) (1) ble oppløst i 30 % saltsyre (2) ved romtemperatur (forhold kitin/HCl: 1:20, vekt/vekt). Etter 10 minutter ble hydrogenperoksid tilsatt (sluttkonsentrasjon av H2O2, 2 %, vekt/vekt) (3) og ble tillatt å reagere i 15 (4) minutter, deretter ble oppløsningen helt inn i en 75 % IPA (kitinoppløsning:50 % IPA oppløsning var 1:40)(5) og vasket til nøytral pH. Deretter ble presipitatet vasket mer med endotoksinfritt vann ved 70<o>C (6). Etter å ha fjernet overskuddsvann, ble konsentrert alkalioppløsning (sluttkonsentrasjon av alkali var 25 vekt%) (7) tilsatt det kolloidale kitinet. Så ble blandingen brakt til -25 °C (8). Dette ble fulgt av tining og oppløsning av det kolloidale kitinet og deacetylering ved 60<o>C i 6 timer (9). Etter deacetyleringen ble det delvis deacetylerte kitinet gjenvunnet ved å helle det inn i varmt vann (70 °C) (10) og vaske til nøytral pH. Tilslutt overføres den nøytraliserte suspensjonen til en frysetørker/spraytørker for å oppnå tørt stoff.

Endotoksinnivået i det oppnådde kitobiomerproduktet er generelt godt under 30 EU/g delvis deacetylert kitin med LAL analytisk metode.

1.3 Rensing av delvis deacetylert kitinoppløsning og polymergjenvinning med en utsaltingsfremgangsmåte

Oppfinnelsens sammensetninger kan passende fås fra kitinholdig råmateriale, slik som rekeskall. Kitin er fortrinnsvis deacetylert med en sterk base for å oppnå en delvis deacetylert kitinpolymer. Eller deretter kan materialet være produktet ifølge 1.1 eller 1.2 i dette eksemplet med sikte på å øke utbyttet av løselige kitobiomere og redusere bakterielle endotoksin- (EU) nivåer før rensing. Reaksjonstiden og konsentrasjonen til kitin kan varieres avhengig av den ønskede deacetyleringsgraden, og kan enkelt optimaliseres for enhver spesiell bearbeidingsenhet og en spesielt ønsket deacetyleringsgrad. Deacetyleringsreaksjonen stanses med pH-nøytralisering, enten ved å vaske det oppnådde delvis deacetylerte kitinet med varmt vann eller ved å tilsette en egnet syre. Rensing kan så anvendes ved å løse opp den frembrakte polymeren i en sur oppløsning og filtrere oppløsningen med sikte på å fjerne fremmede eller uløselige materialer.

For å gjenvinne den delvis deacetylerte kitinpolymeren, økes først temperaturen av den filtrerte oppløsningen til over 55 °C. Deretter justeres pH til over 8, fortrinnsvis pH 10-11 og tilslutt tilsettes et passende salt for å initiere utfellingsprosessen. Så anvendes varmt vann for å vaske presipitatet inntil et nøytralt og saltfritt materiale oppnås. Etter vaskeprosessen kan hensiktsmessige konvensjonelle tørkemetode(r) anvendes for å tørke materialet.

Dette eksemplet lærer oss hvordan høyt løselig delvis deacetylert kitin (gjennomsnittlig deacetyleringsgrad mellom 30 og 55 %) kan gjenvinnes fra en slik filtrert polymeroppløsning uten å anvende organiske løsemidler. Den valgfrie tilsats av salt (NaCl) er for å forsterke komprimeringsgraden til presipitatet for enklere gjenvinning i en kommersiell prosess.

Utvalgte eksempler

1.3.1 Ett g av 43 % DD delvis deacetylert kitin (Serie G060307P) ble dispergert i 100 g vann. Sitronsyre (2 g) ble tilsatt for å løse opp polymeren. Temperaturen ble økt til 60 °C og NaOH (35 % løsning) ble tilsatt dråpevis for å justere pH til 11. Dette resulterte i en utfelling av polymeren som kunne bli vasket med varmt vann til nær nøytralitet.

1.3.2 I et pilotskalaeksperiment (Serie G060307P) med 1 kg kitin, ble først kitinet deacetylert, vasket og oppløst i 1 % sitronsyreoppløsning. Dette ble fulgt av flertrinnsfiltrering for å oppnå en klar oppløsning. Etter oppvarming til 65 °C, ble 350 g NaOH introdusert for å justere pH til 10,5. Derpå ble 4,5 kg NaCl tilsatt som introduserte dannelse av hvite klumper av presipitatet. Presipitatet ble vasket intensivt med 70 °C vann inntil nøytral pH ble oppnådd. Presipitatet ble så homogenisert og spraytørket for å fremstille hvitt pulveraktig delvis deacetylert kitin. Preparatet ble analysert som følger:

Gjennomsnittlig partikkelstørrelse av det tørkede pulveret var 5 μm (med en fordeling på 3-10 μm), deacetyleringsgrad var 43 %, tilsynelatende viskositet var 540 cps (1 % produkt i 1 % eddiksyre), turbiditet (1 % produkt) < 15 NTU.

Figur 1 illustrerer løseligheten av dette produktet (43 % DD) sammenliknet med 70 % deacetylert og 94 % deacetylert kitosan. Den 43 %-ige DD-polymeren var fullt løselig ved fysiologisk pH 7,4 (ingen endringer i turbiditet). Den 70 %-ige DD-polymeren var delvis løselig ved pH 7,4, men den 94 %-ige DD kitosanpolymeren var utfelt (turbiditet >1000 NTU).

Resultatene viser at ved å oppløse kitinpolymeren i alkali og is, kan en homogen deacetylering gjennomføres, slik at fordelingen av gjenværende N-acetylglykoseamin kan kontrolleres. Eksperimentene viser også at dette kan gjøres i en industriell hensiktsmessig skala og at denne deacetyleringsfremgangsmåten kan anvendes for å øke utbyttet av T-ChOS i et kitooligomert preparat oppnådd ved å anvende kitinase.

Eksempel 2 Fremstilling og karakterisering av T-ChOS

2.1 Fremstilling av serie G020418; en heterogen ChOS testserie; Kvantifisering og sekvensering av homologe

Fremstilling

Natriumhydroksid, 25 kg ble oppløst i 25 kg vann i en 80 L blander og varmet til 60 °C. Rekekitin fra P. borealis (Genis ehf.), 2,5 kg ble tilsatt og rørt (15 rpm) i 40 min.

Slurryen ble så kjølt med vann og vasket i et sileklede (200 x 40 cm) i 10-15 minutter. Kitingelen ble overført til en 200 L blander, pH ble justert til 4,0 ved tilsats av 30 % HCl, og vann ble tilsatt for å få et volum på 100 L. En Familie 18 endokitinase ble tilsatt (10.000 enheter/kg substrat) og gelen ble rørt i 22 timer ved 30 °C. Enzymet ble denaturert ved å justere pH til 5,4 og varme oppløsningen til 80 °C i 10 min. Etter kjøling ble oligomerløsningen (ChOS) helt gjennom en sil med 280 μm maskevidde. Oppløsningen ble avsaltet ved å anvende DSS LabStak M20 nanofiltreringsenhet med 0,72 cm<2>av 500 Da avskjæringsmembran ved pH 4,8. Oppløsningen ble deretter utsatt for spraytørking ved å anvende en roterende forstøvningsspraytørkeenhet med en innløpslufttemperatur på 190 °C og en utløpslufttemperatur på 80 °C. Det fine hvite ChOS-pulveret, 2,0 kg (80 %) ble samlet og oppbevart ved romtemperatur.

Deacetyleringsgraden var 37 % (eller FA0,63) som bestemt ved direkte titrering.

Analytiske metoder

BioGel P4 Gel Permeasjonskromatografianalyse (GPC)

Et kvantum på 2,16 g av ChOS-pulveret ble oppløst i 180 mL 0,05 ammoniumacetatbuffer ved pH 4,2. Den resulterende oppløsning ble filtrert sekvensielt gjennom et 0,8 µm og et 0,2 µm celluloseacetatmembran (Schleicher & Schuell), og ultrafiltrert gjennom en 3000 Da avskjæringsmembran (Amicon). Filtratet ble frysetørket. Utbyttet var 0,74 g (34 %). Det resulterende pulveret (serier på 350 mg) ble så separert ved gel permeasjonskromatografi (GPC) på Biogel P4, finkvalitet (BioRad, München, Tyskland). Kolonnedimensjon : 5 x 200 cm; mobil fase 0,05 M ammoniumacetatbuffer, justert med 0,23 M eddiksyre til pH 4,2; strømningshastighet 60 mL/time; brytningsindeksdetektor Shimadzu RID 6A. Fraksjoner på 20 ml ble samlet, passende kombinert, konsentrert til et lite volum og tilslutt frysetørket.

Fremstilling av homologe – ionebytterkromatografi

4 mg av frysetørkede fraksjoner av GPC ble oppløst i 200 µL av vandig hydroklorid ved pH 3,0. Oppløsningen ble filtrert gjennom et 0,45 µm sprøytefilter med Nylonmembran (Nalgene). De homologe ble separert ved høy ytelses ionebytterkromatografi (HP-IEC) på Resource S (Amersham Pharmacia Biotech, Sverige). Sjiktvolum: 1 ml; mobil fase: vandig hydroklorid ved pH 3,0 (A), 1 M vandig natriumkloridoppløsning ved pH 3,04 (B); elusjonsprofil: 0 – 5 min 100 % A, 5 – 45 min 100 % – 50 % A, 45 – 46 min 50 % -0 % A, 46 – 55 min 0 % A, 55 – 56 min 0 % - 100 % A, 56 – 80 min 100 % A; strømningshastighet 60 mL x h<-1>; UV-detektor Jasco UV-MD-910. Fraksjoner på 500 µL ble samlet, passende kombinert, dialysert i floatalyzers<TM>(SpectraPor) mot vann (2 L, 4 døgn), konsentrert til et lite volum og tilslutt frysetørket. Prøven ble utsatt for HP-IEC i mengder på 4 mg. For utbytter, se Resultater og diskusjon.

Reduserende aminering av ChOS med 2-aminoakridon (AMAC)

30 nmol av rent ChOS eller 60 – 80 nmol av ChOS-blandingen ble oppløst i 20 µL av en 0,1 M oppløsning av 2-aminoakridon i eddiksyre/DMSO (vol/vol 3:17) og rørt manuelt i 30 s, fulgt av tilsats av 20 µL av en 1M oppløsning av natriumcyanoborohydrid i vann og rørt ytterligere i 30 s. Blandingen ble varmet i mørket i 30 min ved 90 °C. Reaksjonsbeholderen ble kjølt til –20 °C, og reaksjonsblandingen ble frysetørket. Resten ble oppløst i 1 ml vann, dialysert mot 1 L vann i 48 timer og tilslutt frysetørket for å få et lyst gult pulver. Prøvene ble enten analysert øyeblikkelig eller lagret i mørket ved –20 °C.

Massespektrometri

De frysetørkede AMAC-oligosakkaridderivativene ble gjenoppløst i 200 – 500 µL av metanol/vann (vol/vol 50:50). En alikvot av oppløsningen (0,5 µL) ble blandet på målobjektet med 2 µL av en oppløsning av DHB som en matriks (15 mg x mL<-1>) i 30 % vandig etanol, og dråpen ble tørket med en svak luftstrøm. Krystallisering av matriksen inntraff vanligvis spontant. I noen tilfeller ble krystallisering observert etter bare å ha fortynnet den opprinnelige prøveoppløsningen ca 5 ganger med metanol/vann (vol/vol 50:50).

MALDI TOF massespektra ble registrert på en Bruker Reflex II (Bruker Daltonik, Bremen, Tyskland) i den positive ionemodus. For ionisering ble det anvendt en nitrogenlaser (337 nm, 3 ns pulsbredde, 3 Hz). Til optimalisering av massespektra ble laseren siktet enten mot det sentrale området i prøven eller på den ytterste kanten av krystallranden. Alle spektra ble målt i reflektormodus ved å anvende ekstern kalibrering (Angiotensin II).

Sekvensering av ChOS-homologe – isobarer

Alle homologe av DP3 til DP8 som viste et hensiktsmessig signal i MALDI TOF massespekteret ble sekvensert ifølge fremgangsmåten beskrevet i detalj annetsteds<1>. I korthet, 60 – 80 nmol av hver frysetørkede GPC fraksjon F3 – F10 ble reduserende aminert med 2-aminoakridon som gjør homologe merket på den reduserende ende<2>. (MALDI TOF massespektrum av GPC fraksjon F7-AMAC se under, andre ikke vist). Fraksjonene ble analysert med MALDI tandem massespektrometri. Monosodierte pseudomolekylære ioner av homologe av interesse ble utvalgt i kvadrupolen i massespektrometeret og fragmentert i kollisjonscellen som leder til A-, B- og C-type ioner, som er dannet fra den ikke-reduserende ende, og X-, Y- og Z-type ioner fra den reduserende ende. På grunn av merkingen ved den reduserende ende, kunne Y-type ioner bli identifisert av masseøkningen på 194 Da, og oligosakkaridsekvensen kunne leses ut fra den reduserende ende ved å anvende et sekvenstre.

Resultater

Tabell 1 viser DP av hver ChOS og homologe av hver fraksjon så vel som massefordelingen av fraksjonene F1 – F10. Tabell 2 viser sekvensen av isobarer, som ble funnet ved sekvensanalyse av homologe av ChOS.

For hovedforbindelsene av ChOS mellom DP5 og DP7 kunne disse resultatene ikke kvantifiseres (D2A3, D3A3, D2A4, D3A4).

For å oppnå kvantitativ informasjon om blandingen av isobarer måtte pseudo MS benyttes: Prøven fragmenteres i kilden (uten preseleksjon av et ion), et fragmention velges ut i kvadrupolen i massespektrometeret, fragmenteres i kollisjonscellen og massespekteret av den siste fragmenteringen registreres.

Siden den første fragmenteringen utføres uten noen preselektering av ioner, må prøven være en ren homolog. Spesielt skulle ingen ioner med lavere masse enn analytt være tilstede i MALDI TOF massespekteret.

Av denne grunn var det nødvendig å rense GPC-fraksjonene før kvantitativ sekvensanalyse. De homologe av GPC-fraksjonene F6 til F9 ble separert ved ladningstallet i en kationebytter HPLC kolonne for å gi ren D2A3 (F6), D3A3 (F7), D2A4 (F8) og D3A4 (F9). Tabell 3 samler resultatene fra HP-IEC separasjonene av GPC-fraksjonene F6 til F9.

De rene homologe D2A3, D3A3, D2A4 og D3A4 ble reduserende aminert med 2-aminoakridon for å gi dervater merket ved den reduserende ende (MALDI TOF massespektrum av D3A3-AMAC se under, andre ikke vist). De derivate homologe ble sekvensert som beskrevet over med pseudo MALDI MS.

De relative intensitetene [%] av de homologe fragmentionene ble bestemt med evalueringsprogramvaren. Reproduserbarheten av de relative toppintensitetene ble bevist ved gjentatt fragmentering. Det midlere standardavviket ble funnet å være 1 %. Figur 2 viser sekvenstreet for D3A3, som kvantifiserer toppintensitetene forårsaket av fragmentioner i forskjellige sekvenser. For Y2-type ioner kunne de relative mengdene av DA (7,5 %) og AA (92,5 %) leses direkte ut fra de relative toppintensitetene i D1A1-AMAC og A2-AMAC.

For Y3-type ioner kunne de relative mengdene av DDA (5,9 %) og AAA (6,5%) leses direkte ut fra de relative toppintensitetene i D2A1-AMAC og A3-AMAC. Den relative mengden av ADA (1,6 %) kunne konkluderes fra likningen [DDA] [ADA] = 7,5%, den av DAA (86,0 %) fra likning [DAA] [AAA] = 92,5 %.

For Y4-type ionene kunne den relative mengden av DDDA (0,9 %) leses direkte ut fra de relative toppintensitetene i D3A1-AMAC. Den relative mengden av ADDA (5,0 %) kunne konkluderes fra likningen [DDDA] [ADDA] = 5,9%. De relative mengdene av DAAA er 6,5 % siden bare DAAA-AMAC gir A3-AMAC, som ble bestemt med en relativ toppintensitet på 6,5 %.

Tabell 1. Sammensetning og massefordeling av ChOS-fraksjoner F1 – F10. GPC- separasjon på Biogel P4. Utbyttet er beregnet fra masser av de dialyserte og tørkede fraksjoner. Produkt G020418.

Tabell 2. Sekvenser av isobarer referert til homologe av ChOS. Produkt G020418

AA

a sekvens i parentes betyr permutasjonsposisjon: (DDA)A er ekvivalent med DDAA og DADA og ADDA. Den reduserende ende av hver sekvens er vist på høyre side.

b antall i parenteser angir det beregnede maksimumsantallet av isobarer for en homolog Tabell 3. Sammensetning og massefordeling av fraksjoner av homologe etter separasjon av fraksjoner fra GPC i en kationebytterkolonne (Resource S). Produkt G020418.

a Sum av tørrvekter av alle dialyserte HPIEC fraksjoner som er listet i tabellen b Analyse med MALDI TOF MS (MALDI TOF massespektrum av D3A3 se under, andre ikke vist)

c Utbytte som beregnet fra topparealer i UV-deteksjon (tatt hensyn til at forskjellig antall acetylgrupper i et molekyl fører til forskjellige molare absorpsjonskoeffisienter)

d Utbytte som beregnet fra fraksjonsmassene

I pseudo MS3 av D1A3-AMAC er de relative toppintensitetene i D1A1-AMAC og A2-AMAC 1,0 % og 99,0 %. I MALDI tandem massespektrum av D3A3-AMAC er den relative toppintensiteten i D1A3-AMAC 22,1 %. AADA er den eneste sekvens av D1A3 (AADA, ADAA, DAAA) som gir fragmentet D1A1-AMAC. Av denne grunn er den relative mengden av AADA 1 % av 22,1 % = 0,2 %. Den relative mengden av DADA (1,4 %) kunne beregnes fra likningen [AADA] [DADA] = 1,6 %. Den relative mengden av ADAA (15,4 %) kunne beregnes fra likningen [AADA] [ADAA] [DAAA] = 22,1 %. Tilslutt kunne den relative mengden av DDAA (70,6) beregnes fra likningen [ADAA] [DDAA] = 86,0 %. For Y5-type ionene er den relative mengden av ADDDA 0,9 % siden bare ADDDA-AMAC gir DDDA-AMAC, som ble bestemt med en relativ toppintensitet på 0,9 %. Analoge betraktninger tillater bestemmelse av DAADA (0,2 %), DADAA (15,4 %) og DDAAA (6,5 %).

I pseudo MS3 av D2A3-AMAC er de relative toppintensitetene i D2A1-AMAC, D1A2-AMAC og A3-AMAC 2,6 %, 88,0 % og 9,4 %. I MALDI tandem massespektrum av D3A3- AMAC er de relative toppintensitetene i D2A3-AMAC 82,0 %. AADDA er den eneste sekvens av D2A3 (AADDA, ADADA, DAADA, ADDAA, DADAA, DDAAA) som gir fragmentet D2A1-AMAC. Av denne grunn er den relative mengden av AADDA 2,6 % av 82,0 % = 2,1 %. Den relative mengden av DADDA (2,9 %) kunne beregnes fra likningen [DADDA] [AADDA] = 5,0 %. I pseudo MS3 av D2A3-AMAC er de relative toppintensitetene i D1A1- AMAC og A2-AMAC 3,9 % og 96,1 %. ADDAA, DADAA og DDAAA er de eneste sekvensene av D2A3 som gir A2-AMAC. Av denne grunn er den relative mengden av ADDAA DADAA DDAAA 96,1 % av 82,0 % = 78,8 %. Fra denne likningen kunne den relative mengden av ADDAA (56,9 %) beregnes. Den relative mengden av DDDAA (13,7 %) kunne beregnes fra likningen [DDDAA] [ADDAA] = 70,6 %. Den relative mengden av DDADA (0,5 %) kunne beregnes fra likningen [DDADA] [ADDDA] [DADDA] [DDDAA] = 18,0 %, og den av ADADA (0,9 %) fra likningen [DDADA] [ADADA] = 1,4 %.

Figur 3a – 3d viser de relative mengdene av isobarer av de homologe D2A3, D3A3, D2A4 og D3A4. Isobarer ble ikke inkludert i diagrammene hvis de beregnede mengdene var mindre enn 1 %, da metodens reproduserbarhet ikke tillater bestemmelse av relative toppintensiteter mindre enn 1 %.

2.2 Fremstilling av lott G050421; et forbedret utbytte av T-ChOS ved homogen deacetyleringsprosess

Fremstilling homogene kitooligosakkarider G050421

Deacetylering ble utført som beskrevet i Eksempel 1. Etterat deacetyleringsprosessen er fullført, ble pH justert ytterligere til 3,8 ved å anvende saltsyre og temperatur justert til 35 °C. En Familie 18 endokitinase (10.000 enheter/kg substrat) ble tilsatt oppløsingen og hydrolysereaksjonen ble tillatt å fortsette i 22 timer til fullstendig hydrolyse. Dette ble fulgt av en rekke filtreringstrinn for å fjerne faste partikler og et ultrafiltreringstrinn for å fjerne rester av enzymproteiner og andre polymere. Tilslutt ble oppløsningen spraytørket for å oppnå pulverformige terapeutiske kitooligosakkarider (T-ChOS) (G050421).

Analysemetoder

GPC-fraksjonering på Biogel P4 ble gjennomført som tidligere beskrevet. MALDI-TOF Massespektrometri av GPC-fraksjoner ble gjennomført som tidligere beskrevet.

Resultater

Deacetyleringsgraden av de heterogene deacetylerte ChOS var 39 % og 40 % for de homogene deacetylerte oligomerene (G050421) som bestemt ved direkte titrering.

Den oligomere toppfordelingen og homologanalyse av de heterogene deacetylerte oligomerene (G020418) er vist i Figur 4 og av de homogene deacetylerte oligomerene (G050421) i Figur 5. Den mest signifikante forskjellen i toppfordelingen observeres for de lengre oligomere. For de heterogene deacetylerte oligomerene, er DP11 til 22 (topparealet 0 i Fig.4) 35,5 % av det totale materialet og kvantiteten økes med økt DP på 11 til 22. For de homogene deacetylerte oligomerene, på den annen side, er DP 11 til 22 (topparealet 0 til -3 i Fig.5) bare 12,9 % av det totale materialet og kvantiteten reduseres med økt DP11 til 22, og levner teortetisk ingen DP18 eller høyere. Dette reflekteres også i verdien av høyaktive oligomere (DP5-10). De homogene oligomerene har 41 % DP5-10, mens de heterogene oligomerene bare har 28 % DP5-10.

Den homologe fordelingen indikeres i Figur 6 for oligomerene ved disse to deacetyleringsfremgangsmåtene. For heterogene oligomere er det mye mindre av DP4 (A2D2og A3D) og DP5 (A3D2) så vel som DP7 (A3D4) og DP8 (A4D4) enn for de homogene oligomerene (Fig.6).

Oppsummert vil fremgangsmåten for homogen deacetylering sannsynligvis gi ChOS med høyere bioaktivitet enn den heterogene deacetyleringen. En signifikant reduksjon i fremstillingen av uønskede høyere DP>15 oligomerer observeres med denne fremgangsmåten.

2.3 Økning av de relative mengdene av T-ChOS ved ultrafiltrering (serie G051128)

For å forbedre de relative mengdene av T-ChOS (DP5-15) utførtes et ekstra ultrafiltreringstrinn der T-ChOS-oppløsningen ble filtrert og konsentrert på en 1 kDa UF membran (Helicon, Millipore), der små kitooligomere (DP 2-5) er betydelig redusert og monomere eliminert. Permeatet ble kassert og det gjenværende ble samlet og spraytørket.

Til analyse av testmaterialet ble det anvendt HPLC med Beckman Gold system. TSK-oligo kolonne (TosoHaas, Japan), ble anvendt for separering av ChOS iht. molekylvekt (DP1, DP2 etc.). Oppløsningen var 5 mM ammoniumhydroksid, pH 10,0, strømningsrate var 0,5 ml/min, optisk absorbans var 205 nm, injeksjonsvolum var 20 µl og ChOS-konsentrasjon var 10 mg/ml.

Figur 7 viser den relative mengden av hver DP før og etter ultrafiltreringstrinnet.

Monomere er blitt eliminert og mindre oligomere (DP2-5) signifikant redusert.

Eksempel 3. Absorpsjon av terapeutiske kitooligosakkarider i menneskekroppen

Fremgangsmåter

Kitooligomere

Kitooligomere bestående av N-acetylglykoseamin og glykoseamin ble fremstilt av Genis, Reykjavik, Island. I korthet ble kitin delvis deacetylert i alkali, vasket og hydrolysert til oligomere ved kitinase. Oligomere ble ultrafiltrert, avsaltet og spraytørket til en fint hvitt pulver. Gjennomsnittlig deacetyleringsgrad var 47 % (FA0.53). Analyse og kvantifisering av oligomere og homologe ble gjennomført ved å anvende de samme fremgangsmåter som for blodet. Disse dataene ble anvendt for å sammenlikne absorpsjonen av forskjellige homologe inn i blodet.

Generell blodprøvebehandling

Et frivillig subjekt konsumerte daglig 1,8 g ChOS (Genis ehf; S041124-1K) i en periode på 4 uker. Blodprøver ble samlet innenfor en periode på 6 uker. Den første prøven ble tatt før konsumering av ChOS. De følgende 4 prøver ble tatt ukentlig og startet 1 uke etter det første inntaket. Prøve 6 ble tatt 2 uker etter at konsumeringen av ChOS var stanset. Volumet av hver prøve var 7,0 ml. Blodprøvene ble sentrifugert i 30 min ved 3000 rpm. Serumet ble samlet opp. Metanol og natriumklorid ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 30 % metanol og 0,1 mg / ml natriumklorid etterfulgt av enda et sentrifugeringstrinn. Prøver på 500 µl ble filtrert gjennom 3 kDa avskjæringsmembraner (ultrafiltrering). Slammet ble fyllt opp 3 ganger. Hensiktsmessige filtrater ble forenet, metanolen ble fjernet i vakuum, og prøvene ble tilslutt frysetørket.

MALDI-TOF MS

De frysetørkede prøvene (ca 100 µg) ble gjenoppløst i 100 µl metanol / vann (vol/vol 50:50). En alikvot av oppløsningen ble blandet på målobjektet med 2 µl av en oppløsning av DHB i 30 % vandig etanol (15 mg * mg<-1>). Dråpen ble tørket med en svak luftstrøm. Massespektra ble tatt opp med en Bruker Reflex II (Daltonik, Bremen, Tyskland) i det positive ionemodus. For ionisering ble en nitrogenlaser (337 nm, 3 ns pulsbredde, 3 Hz) anvendt. Alle spektra ble målt i reflektormodus ved å anvende ekstern kalibrering. Monoisotopiske topper er angitt i alle massespektra.

Homolog bestemmelse ved MALDI-TOF MS

De frysetørkede prøvene (ca 100 µg) ble gjenoppløst i 100 µl metanol / deuteriumoksid (vol/vol 50:50). Et 10-ganger molart overskudd av heksadeuteroeddiksyreanhydrid ble tilsatt så vel som 3 dråper av istetradeuteroeddiksyre. Oppløsningen ble rørt ved 30 °C i 12 timer. Reaksjonen ble stanset ved tilsats av en ekvimolar mengde ammoniakk.

Oppløsningene ble frysetørket og gjenoppløst i 100 µl ammoniakk. Konsentrasjonen av ammoniakk ble tilsatt et 10-ganger molart overskudd med hensyn til mol N-acetylglykoseaminenheter (GlcNAc eller A). Oppløsningen ble rørt ved 22 °C over natten. Ammoniakken ble fjernet i vakuum, etterfulgt av frysetørking av prøvene.

Dersom MALDI-TOF MS fremdeles viste O-acetylgrupper, ble det frysetørkede gjenoppløst i vandig natriumhydroksid (100 µl). Konsentrasjonen av kaliumhydroksid ble tilsatt 2-ganger molart overskudd med hensyn til mol GlcNAc enheter.

Oppløsningen ble rørt i 10 timer ved romtempertur, nøytralisert ved tilsats av kationebyttemasse (H<+>type) etterfulgt av filtrering og frysetørking av filtratet.

MALDI-TOF massespektra ble tatt som beskrevet i eksempel 4. Kvantifiseringen av relative signalintenisiteter fører til sammensetningen av homologe i blandingen.

Kvantitativ bestemmelse av ChOS ved MALDI-TOF MS

Prøvene fremstilles som beskrevet under Homolog bestemmelse med MALDI-TOF MS. Deretter tilsettes en standard til hver prøve. Standarden, en kitinoligomer (An), må være av samme DP /- 1 som analytten. En seriell fortynning av denne standarden ble anvendt. En sammenlikning av signalintensitetene av analytten og standarden gir konsentrasjonen av analytten.

Gel permeasjonskromatografi (GPC)

Oligomere ble separert ved å benytte GPC på Biogel P4 som beskrevet i eksempel 2. Hensiktsmessige fraksjoner ble kombinert; volumet ble redusert i vakuum etterfulgt av frysetørking inntil konstant masse for å fjerne ammoniumacetat.

Høy ytelses ionebytterkromatografi (HPIEC)

Blandinger av homologe (og oligomere) oppnådd fra GPC-separasjon, ble analysert med HPIEC. Betingelser: Stasjonær fase: Resource S (Pharmacia, Uppsala, Sverige), sjiktvolum 1 ml; mobil fase: saltsyre pH 3,5, natriumklorid gradient 0 – 1 M fra 5 – 60 min, strømningsrate 1 ml/min; utstyr: HPLC instrument (Jasco, Gross-Umstadt, Tyskland) med UV-detektor (deteksjonsbølgelengde 210 nm). HPLC-fraksjoner ble frysetørket. Av og til ble fraksjonene avsaltet ved dialyse (Floatalyzer®, SpektraPor, Tyskland).

Kvantitativ bestemmelse av homologe ved hjelp av HPIEC

Eksperimentene ble i det vesentligste gjennomført som beskrevet under Høy ytelses ionebytterkromatografi. En standard ble tilsatt hver prøve. Standarden må være innen det samme konsentrasjonsområdet som analytten. Analyttens konsentrasjon beregnes fra sammenlikningen av topparealene til standarden og analytten. Topparealene viser en lineær korrelasjon med antall acetylgrupper i analyttmolekylet.

Resultater

MALDI-TOF MS av blodprøvene samlet før konsumering av ChOS viste ikke noen signaler av ChOS.

Etter 1 uke

I blodprøven etter 1 uke med ChOS-inntak ble det bare observert spor av DP2 (A2 homologe) og DP3 (D1A2 homologe) av oligomerene (data ikke vist).

Etter 2 uker

I blodprøvene tatt etter 2 uker av ChOS-inntak vistes klare tegn på heterokitooligomere som bedømt med MALDI-TOF massespektra. Figur 8 viser homologe av DP2–DP5; Homologe av DP2 (homologe A2) opp til DP12 (homologe D7A5) ble klart oppdaget i massespektrene. Kvantitativ bestemmelse av homologe med forskjellige fremgangsmåter (se kapittel om fremgangsmåter) fremviste den totale ChOS-konsentrasjonen på 0,16 mg/ml serum etter 2 ukers inntak. Ved å anta at det totale blodvolumet er 5 L, er den totale mengden av ChOS absorbert 0,80 g eller 44 % av den daglige dosen.

Etter 3 uker

MALDI-TOF MS fremviste oligomere fra DP2 til DP12 (Figur 9). Figur 10 sammenlikner de relative massespektrometriske signalintensitetene av oligomere og homologe av den naturlige konsumerte prøven og blodprøven etter 3 uker. Et klart skifte til høyere acetylerte homologe (høyere FAverdier) i blodprøven observeres sammenliknet med den opprinnelige blandingen. Spor av homologe opp til DP15 ble funnet i blodprøvene etter 3 uker. Kvantitativ bestemmelse av homologe med forskjellige fremgangsmåter (se tabell 4 og kapittelet om fremgangsmåter) fremviste en total ChOS-konsentrasjon på 0,19 mg/ml serum etter 3 ukers inntak.

Tabell 4. Absolutte massefraksjoner, oligomere og homologe funnet i en blodprøve samlet etter 3 uker med ChOS konsumering. Massene ble beregnet i henhold til relative GPC topparealer og relative MS signalintensiteter for en total masse på 1,34 mg pr 7,0 ml blod

1: Homolog bestemmelse med MAL -D TIOF MS 2: Kvantitativ bestemmelse av ChOS med GPC og MA - TLODFI MS Konklusjoner

Inntaket av 1,8 g ChOS daglig fører til en absorpsjon av disse sukre inn i blodstrømmen. Spor av DP2 og DP3 oligomere er synlige etter 1 ukes inntak. 84 % av maksimalt opptak nås etter 2 uker og maksimalt nivå av ChOS (100 %) oppnås 3 uker etter start av inntaket. Den samlede maksimale konsentrasjonen var ca 190 µg pr ml blod, som indikerer maksimalt absorpsjonutbytte på 53 % ved daglig behandling (5 L blodvolum). Oligomere av DP2 – 7 finnes med (nokså like) konsentrasjoner på 14 – 40 µg pr ml blod. Oligomere av DP8 - 9 finnes i lavere konsentrasjoner på 3 – 10 µg/ml. Oligomere opp til DP15 ble funnet i blodet. En sammenlikning av de homologe funnet i den naturlige konsumerte prøven og i blodprøvene avdekker at fortrinnsvis homologe av høyere acetyleringsgrad penetrerer inn i blodstrømmen.

To uker etterat inntaket stanses, blir ingen kitooligomere detektert i blodstrømmen lengre.

Det konkluderes at T-ChOS-sammensetningene tenderer til å være mer biologisk tilgjengelige sammenliknet med heterooligomersammensetninger som består av forskjellige sammensetninger, slik som FAverdier. Videre støtter dette konklusjonen om at T-ChOS-sammensetningene medfører høyere terapeutisk aktvitet sammenliknet med andre heterooligomere sammensetninger.

Eksempel 4. T-ChOS-homologe som blokkerere for kitinase-A aktivitet;

En utforming for biologisk stabilitet av T-ChOS-sammensetningene

Materiale og fremgangsmåter.

Kitooligosakkarider (ChOS) (seriene Nr. G020418 og G020218) ble fraksjonert inn i homologe fraksjoner, enten ved kationebytterkromatografi eller gel permeasjonskromatografi eller ved en kombinasjon av begge fremgangsmåter.

Produktene ble frysetørket og analysert for struktur og sekvens med MALDI-TOF massespektrometri. Tre andre ufraksjonerte ChOS-serier fra Genis ble også analysert med den samme MALDI-TOF fremgangsmåten (seriene Nr. G040823, G050421 og G050421UF; der UF står for ultrafiltrert gjennom 1 kDa membran for å redusere innholdet av DP≤5).

Ultrafiltrering ble utført på serie G050421, fremstilt ved hydrolyse av en delvis deacetylert kitinserie, som var homogent deacetylert. I korthet ble 16 g av ChOS oppløst i 180 ml destillert vann og diafiltrert på en 1 kDa regenerert cellulosemembran (Millipore, USA), ved å anvende en Amiconcelle. Sluttvolumet av den tilbakeholdte oppløsning var 65 ml, som gir 0,582 g ChOS (utbytte = 33 %). Det totale permeatvolumet var 970 ml. Både totalt permeat og det sluttretentat ble analysert med P4 Biogel kromatografi og MALDI-TOF massespektrometri som beskrevet i eksempel 4. Sluttretentatet ble frysetørket og referert til som G050421UF.

En renset kitinase A fremstilling fra S. marcescens ble anvendt som en standard Familie 18 kitinase, og 4-metylumbelliferyl-beta-D-N,N'-triacetylkitotriosid (4-MU-A3), en kitintetramer (A4) analog, ble anvendt som et standard kitinasesubstrat.

Standard kitinase A oppløsingen var 0,5 nM (500 pM) i 0,1 mg/ml BSA, 50 mM fosfatbuffer pH 7,4 (Kit-A sol.) og substratoppløsningen var 40 µM 4-MU-A3 i 50 mM fosfatbuffer pH 7,4.

Forskjellig konsentrasjon for hver rene ChOS homologe (vanligvis 0, 25, 50, 100, 200, 400 og 800 µM) ble laget i substratbufferen. Til undersøkelsen ble 25 µl av Kit-A oppløsningen blandet med 25 µl av substrat/blokkingsoppløsningen, inkubert ved 37 °C i 10 min. Reaksjonen ble stanset med 1,95 ml 0,2 M natriumbikarbonatbuffer (Na2CO3). Dannelsen av produktet 4-metylumbelliferon (4-MU) ble avlest for hver reaksjon i et Perkin-Elmer LS 50B Fluorometer. Eksiteringsbølgelengden var 380 nm (5 nm regulerbar spalte) og emisjonsbølgelengden var 460 nm (4 nm regulerbar spalte). Hver reaksjon ble avlest 3 ganger. For å estimere blokking ble 50 % inhiberende konsentrasjon (IC50) beregnet for hver ChOS-homologe ved å anvende ikke-lineær tilpasning, f=y0+a*exp(-b*x), der x er lik spesifikk aktvitet av kitinase og f er lik oligosakkaridkonsentrasjon (µM). Affinitet for hver homologe ble beregnet som invertert IC50. Anvendt formel var 1/IC50*1000.

Resultater og konklusjon

Selvom kitinase A har en optimal aktivitet ved pH 5,5, ble pH justert for blokkingeksperimentene til pH 7,4. Dette ble gjort med sikte på å frigjøre aminogruppene i ChOS fra protonene, siden tidligere piloteksperimenter gjennomført ved pH 5,5 indikterte lave blokkingaktiviteter av ChOS-homologe. Denne pH likner også bedre den fysiologiske pH i blod og andre fysiologiske væsker, og reflekterer bedre oppførselen av oligosakkaridene i menneskekroppen.

Figur 11 viser typisk ChOS-blokking av kitinaseaktivitet. Den resulterende IC50 ble beregnet til 17 µM for A4D2 homologe. Tabell 5 oppsummerer DP, homologe, IC50, den beregnede affiniteten og sekvensene for alle de testede homologene. Figur 12 viser den beregnede affiniteten av hver testet homolog. Figur 13 viser det samme som Figur 12 såvel som alle sekvenser (isobarer) som utgjør hver homolog. Ved å ta blokkingaktiviteten av forskjellige homologe i betraktning kan det settes opp to hovedregler. Blokkingen er sterkere ettersom DP økes og på samme tid viser de mer acetylerte homologene (flere A enheter pr molekyl) høyere affinitet. Derfor er alle D6, D9 og D12 dårlige blokkere. A4D2, A4D3, A5D7 og A6D9 (DP 6-12) viste den sterkeste blokkingen. Disse homologene kan derfor anses å besitte den høyeste bioaktiviteten på grunn av deres tilsynelatende affinitet til den kitinaseaktive siden. DP12 (A5D7) viser den høyeste affiniteten og med DP15 (A5D7) er ikke affiniteten signifikant økt (Fig.12 og 13). Den homooligomere A6 ble delt ved kitinase A inn i A3, A2 og A1 som bedømt ved MALDI-TOF.

Imidlertid delte ikke kitinase A noen av de testede heterooligomerene ved undersøkelsesbetingelsene (pH 5,5 og pH 7,4), som bedømt ved MALDI-TOF massespektrometri, som indikerer god biologisk stabiltet av de homologe. Årsaken til denne høye biologiske stabiliteten er den fullstendige hydrolysen av substratet med en Familie 18 kitinase ved fremstillingen av ChOS.

Når de ufraksjonerte ChOS-preparatene ble testet i det samme enzymsystemet var IC50 70µg/ml for G040823 (Fig.14), 105 µg/ml for G050421 og 67 µg/ml for den ultrafiltrerte G050421UF. Dette demonstrerer at fremgangsmåten kan anvendes for å evaluere blokkingaktivitet og biologisk stabilitet av homologe i ChOS-blandinger og ikke krever fraksjonering til homologe før analysen. Derfor kan denne fremgangsmåten anvendes som en evaluering av den gjennomsnittlige blokkingaktiviteten til et ChOS-preparat som innbefatter en blanding av forskjellige homologe av heterokitooligosakkarider. En slik evaluering ville gi en indikasjon på den gjennomsnittlige bindingsaffiniteten til det aktive punktet i enzymet og den gjennomsnittlige biologiske stabilitet til de innbefattede homologe.

Tabell 5. Polymerisasjonsgrad (DP), homologe, inhiberingskonsentrasjon (IC50), beregnet affinitet (CA) og sekvenser av de testede kitooligosakkaridene.

5

*CA = beregnet affinitet, 1/IC50*1000

<35>*NB = ingen blokking funnet

A3D3<1>fra G020418

A3D3<2>fra G020218

Figurforklaringer

Figur 11. Blokkingeffekten av homologe A4D2 på kitinase A. Ikke-lineær tilpasning, f=y0+a*exp(-b*x) indikeres. Den 50 %-ige inhiberende konsentrasjonen (IC50) for A4D2 ble beregnet til 17 µM.

Figur 12. Beregnet affinitet av de homologe. Figuren viser affiniteten av hver testede homolog (basert på data i Tabell 5).

Figur 13. Bioaktvitet og biologisk stabilitet av CHOS-homologe som i Figur 12 med sekvenser, se Tabell 5 for detaljer.

Figur 14. Blokkingeffekten av ChOS serie G040823 på kitinase A. IC50 ble beregnet til 70 µg/ml.

Eksempel 5. Binding av heterooligosakkarider til 39-kDa menneskelig bruskglykoprotein (HC gp-39)

Da HC gp-39 er et kitinaseutledet protein viser kitinoligomerene (i tillegg til polymerkitinet) de sterkeste affiniteter til dette proteinet. På den annen side deles kitinoligomerene raskt ved aktiv Familie 18 kitinase som også finnes i menneskekroppen. Heterokitooligosakkarider (bestående av A og D enheter) slik som T-ChOS-sammensetninger, besitter en signifikant høyere biologisk stabilitet enn kitinoligomere (bare A enheter eller homooligosakkarider). Derfor var formålet med det foreliggende arbeidet å undersøke hvor mye affiniteten av ChOS til HC gp-39 er influert av FAog dessuten av DP i heterooligosakkaridene.

Materialer og fremgangsmåter

Kvalitative og kvantitative sekvensanalyser av heterokitooligosakkarider ble gjennomført som tidligere beskrevet (Eksempel 4).

Affinitetsstudier

Affiniteten av ikke-kovalente komplekser mellom ChOS og HC gp-39 ble analysert ved å anvende endringen av den iboende tryptofanfluorescencen av proteinet under bindingsbetingelser. Endringen av fluorescenceintensiteten er forårsaket av ligandinduserte endringer i oppløsningens løsemiddeldekking av tryptofanrester og positivt korrelert med sukkerkonsentrasjonen.

HC gp-39 ble løst opp i 25 mM Tris-HCl buffer pH 7,4 inneholdende 1 mM ditiothreitol til en sluttkonsentrasjon på 1,00 µM (proteinoppløsning). Forskjellige konsentrasjoner av homologe ble forberedt i 25 mM Tris-HCl buffer pH 7,4 inneholdende 1 mM ditiothreitol (sukkeroppløsning). For hver homologe ble 4 forskjellige konsentrasjoner forberedt: oppløsning I 1,3 – 2,0 µM, oppløsning II 6,5 – 16,0 µM, oppløsning III 52,0 – 80,0 µM og oppløsning IV 130,0 – 200,0 µM (konsentrasjonene varierte med de homologe). Til undersøkelsen ble 50 µl av proteinoppløsningen og 50 µl av hver sukkeroppløsning (oppløsningene I – IV) forinkubert separat ved 25 °C i en termorister i 15 min. Etterpå ble 50 µL av den varmeregulerte proteinoppløsningen blandet med 50 µL av sukkeroppløsningen (oppløsningene I – IV etter hverandre). Blandingen ble inkubert i 7 min ved 25 °C i en termorister. Fluorescencen ble avlest for hver reaksjon i et Perkin-Elmer LS 50B fluorescence spektrometer (Perkin-Elmer, Überlingen, Tyskland). Eksiteringsbølgelengden var 295 nm (5 nm regulerbar spalte) og emisjonsbølgelengden 340 nm (10 nm regulerbar spalte) med en avslutning ved 290 nm. Hver reaksjon ble målt 3 ganger.

Beregning av dissosiasjonskonstanter

Fra rådataene for fluorescence ble fluorescencedataene for blindprøven fratrukket. F-F0ble plottet mot konsentrasjonen av de homologe og dataene ble tilpasset med ikkelineær regresjon til en ett-punkts metningsmodell ved å benytte SigmaPlot<®>programvare for å oppnå bindende isotermer.

y = Bmax*x/(Kd+x)

Bmax: fluorescenceintensitet for et mettet bindingsområde i HC gp-39

Kd: dissosiasjonskonstant.

Korrelasjon mellom Kdog FA

Dataene for dissosiasjonskonstantene for en rekke av DP6 homologe (D6, D3A3, D2A4og A6) avhengig av antallet A enheter ble tilpasset ved ikke-lineær regresjon (SigmaPlot<®>programvare) til en to-parameter hyperbolsk senkning.

y = a*b/(b+x)

Korrelasjon mellom relative affiniteter og FA

Dataene for dissosiasjonskonstantene ble konvertert til relative affiniteter med 100 % relativ affinitet for A6og 0 % relativ affinitet for D6. De relative affinitetene av D3A3og D2A4ble beregnet i henhold til denne virtuelle skalaen og plottet mot antall A enheter. Dataene ble tilpasset til en to-parameter singel rektangulær hyperbolsk funksjon ved ikke-lineær regresjon (SigmaPlot<®>programvare).

y = a*x/(b+x)

Resultater

Før affinitetstudiene ble alle ChOS anvendt i det foreliggene arbeidet, analysert for renhet og sekvenssammensetning. Kitinoligomer A6 (Seikagaku Co., Japan) ble renset og analysert før affinitetsstudiene. Alle oligomere ble sjekket for renhet. Tabell 6 viser sekvenssammensetningene av de testede ChOS.

Affinitetene av kompleksene mellom ChOS og HC gp-39 ble analysert ved å anvende iboende tryptofanfluorescence i proteinet. Endringen av fluorescenceintensitet er avhengig av sukkerkonsentrasjonen og forklares ved en reorganisering av oppløsningsmolekylene som dekker overflaten av tryptofan ved ikke-bindende betingelser.<24>De konsentrasjonsavhengige fluorescencedataene ble tilpasset ved ikkelineær regresjon til en ett-punkts metningsmodell (SigmaPlot<®>program, se Figur 15). Dissosiasjonskonstantene som ble funnet for D6, D3A3, D2A4, A6, og D5A6var alle i det µmolare området (Figur 16).

Som ventet avtar verdiene for dissosiasjonskonstantene med økende FAhos ChOS. Reduksjonen av dissosiasjonskonstantene med økende FAfor rekkene av DP6 homologe (D6, D3A3, D2A4og A6) er ikke en lineær funksjon. Dataene passer best til en hyperbolsk senkningsfunksjon (y = a*b/(b+x); a: 419,932; b: 0,3839; R²: 0,9986; Figur 17). Det innfelte i Figur 17 viser de relative affinitetene [%] (D6= 0% og A6= 100 %) med fortsatt 90,8 % av maksimumsaffiniteten for D3A3.

Verdiene av dissosiasjonskonstantene synker også med økende DP og konstant FAsom sammenlikningen av D3A3(FA0,5; Kd51,1 µM) og D5A6(FA0,55; Kd6,9 µM) viser. Interessant nok synker Kdverdiene til og med med økende antall D enheter, men konstant antall A enheter, som sammenlikningen av A6(6 A enheter; Kd13,6 µM) og D5A6(6 A enheter; Kd6,9 µM) viser (Kdav D5A6er 14 % av Kdfor D3A3).

Tabell 6. Sekvenser / sammensetning av CHOs benyttet for bindingsstudiene med HC gp-39.

*sekvenser / sammensetning ikke bestemt

Konklusjoner

ChOS binder til HC gp-39 med affinitet i det µmolare området (dissosiasjonskonstanter). Affiniteten øker med økende FAog DP selv med økende antall D enheter, men konstant antall A enheter. For rekker av DP 6 homologe forårsaker en reduksjon på 50 % av FA(A6→ D3A3) bare 9,2 % reduksjon av affinitet. Derfor er ChOS av FA0,5 til 0,75 de optimale bindingspartnerne for HC gp-39 i menneskekroppen. De gjenvinner 90+ % av den maksimale bindingskapasiteten og inneholder nok D enheter (og dermed D-D, D-A, A-D bindinger) til å vise en signifikant økt biologisk stabilitet i menneskekroppen. Disse sammensetningene frembringer optimal terapeutisk aktivitet og er derfor referert heri som til terapeutiske kitooligosakkarider (T-ChOS).

Figurforklaringer

Figur 15. Bindingsisotermer for D6, D3A3, D2A4, A6 og D5A6 bindende til HC gp-39 med Bmax, den relative fluorescenceintensiteten for bindende punktmetning.

Figur 16. Dissosiasjonskonstanter for CHOs bindende til HC gp-39 (logaritmisk skala for Kd) i avhengighet av FA av de homologe / oligomere. Stiplede linjer forbinder datapunkter for DP6 homologe.

Figur 17. Dissosiasjonskonstanter for DP6 homologe som funksjon av FA (antall A enheter). Dataene ble tilpasset til en hyperbolsk senkning ved ikke-lineær regresjon. Det innfelte viser plottet av relative affiniteter for DP6 homologe mot antall A enheter.

Eksempel 6. Effekten av deacetyleringsgraden i kitobiomeringrediens på egenskaper i en kalsiumfosfat – kitobiomerkompositt

Kitobiomer/kalsiumfosfatkompositten ble fremstilt ved å blande en fast fraksjon (inneholdende 5 % kitobiomer eller kitosan (80 % DD), kalsiumfosfat og mineraler) med korresponderende mengde surt middel. Tabell 7 oppsummerer de testede sammensetningene i dette eksemplet. Massen etter blanding var kjennetegnet som svampaktig og elastisk og herdetiden ble signifikant redusert ettersom DD ble økt. Den mekaniske styrken økte også signifikant med økende DD (40% DD << 70 % DD < 80 % DD).

Som vist i Figur 18, er bruddoverflaten porøs og makroporer (porer med diameter større enn 50 µm) finnes i overflod i kompositten.

Forskjellige typer (eller størrelser) krystaller ble observert i komposittene fremstilt av polymere med forskjellig deacetyleringsgrad (Figur 19). Kompositten med delvis deacetylert kitin (40 % DD) ble dominert av stavliknende krystaller eller partikler (Figur 20(a)), mens kompositten med 80 % DD kitosan (Figur 20(c)) ble tettpakket med plateliknende krystaller. For fremstillingen med 70 % DD kitobiomer (Figur 20(b)), var dets krystall en mellomting av 40 % DD kitobiomer og 80 % DD kitosankompositter, som inneholder både stavliknende og plateliknende krystaller. Dette demonstrerer at deacetyleringsgraden av kitosan påvirker krystalldannelsen i kompositten og det er et åpenbart skifte fra stav- til platestrukturer ved 70 % DD. Denne forskjellen kan relatere seg til den høyere vannbindingskapasiteten til 40-70 % DD kitobiomere sammenliknet med kitosan (80 % DD). Dette påvirker vanntilgjengeligheten og dermed påvirkes krystallutviklingen i kompositten.

Forskjellen i krystalldannelsen i kompositten er særlig viktig siden dette kan påvirke styrken av kompositten og dens biologiske nedbrytbarhet.

Dette eksemplet viser hvordan styrken av kompositten kan bli styrt med deacetyleringsgraden til kitobiomer eller kitosan. Dette kan anvendes til å regulere den biologiske nedbrytbarheten av komposittens struktur og derved tilgjengeligheten for migrerende celler som makrofager og osteoklaster, til å penetrere kompositten og dermed skape porer for penetrering av brusk- og benstamceller så vel som epitelceller som skaper vaskulære forhold nødvendig for benutviklingen.

Tabell 7. Utforming av de tre testede kitosan-/kalsiumfosfatkomposittene.

Figurforklaringer

Figur 18. Bruddoverflaten av kitosan-/kalsiumfosfatkompositten inneholdende 5 % kitobiomer (40 % DD). SEM bilder ble tatt etter inkubering ved 37 °C i 7 døgn.

Forstørrelse 1000X.

Figur 19. Effekten av DD på krystalldannelse. SEM bilder ble tatt etter inkubering ved 37 °C i 7 døgn. (a) kitobiomer (40 % DD), forstørrelse 10 KX og (b) 80 % DD kitosan, forstørrelse 9,43 KX.

Figur 20. SEM analyser av kompositter inkubert ved 37 °C i 7 døgn. (a) kitobiomer 40 % DD, (b) kitobiomer 70 % DD, og (c) kitosan 80 % DD. Forstørrelse 100 KX.

Eksempel 7 – Benhelbredelse ved endokondral forbening i rottelårben

80 hunnrotter ble brukt for å sjekke effekten av en kompositt med 5 % kitobiomer med kalsiumfosfater (CAP). Hele dyregruppen ble delt i 3 undergrupper: I. Kontroll (ikkebehandlede); II behandlet med kalsiumfosfater; og III behandlet med CAP inneholdende 5 % kitobiomer. Kitobiomer og CAP ble blandet sammen i operasjonsrommet og brakt til en deigaktig konsistens.

Alle dyrene ble bedøvet og deres lårben ble flådd midt på.

En 2-mm drill med komprimert luft ble brukt med sikte på å utføre et unikortikalt borehull. Drillen penetrerte inn i margrommet og det friske hullet ble fyllt enten med CAP alene eller med CAP inneholdende 5 % kitobiomer. I en rottegruppe ble hullene forlatt slik de var, mens den lokale blødningen ble kontrollert i alle dyr. Musklene og det overliggende skinn ble sydd lagvis og dyrene ble tillatt å bevege seg fritt i sine individuelle bur. I noen dyr ble den lokale skaden utvidet bevisst ved å penetrere begge kortekser (fra ende til annen) og ved å utvide den opprinnelige diameter på penetreringspunktet opp til 5 mm. Disse tilfellene ble ansett å gjennomgå store benødeleggelser sammenliknet med de andre dyregruppene, der benhullene var godt begrenset uten ødeleggelse av det motsatte kortikalben ved skadepunktet.

De tre undergruppene nevnt ovenfor ble delt inn ytterligere og ble avlivet etter 2, 3, 4 og 5 uker etter operasjonen. Etter avlivingen ble alle prøveeksemplarer undersøkt makroskopisk og deretter behandlet for mikroskopiske undersøkelser.

Resultater

Gruppe I: Kontroll ikke-behandlede dyr (isolerte hull).

Etter 2 uker inneholdt åpningene av benhullene øyer med irregulære partikler av nytt ben, men hullet var ikke godt avsperret fra de tilliggende vev på utsiden av benet. Nytt benmargsvev var også synlig i det skadede området. Etter 3 uker observertes et tynt benlag å overbroe benhullet. Nesten intet nytt trabekulærben var synlig på skadepunktet. Etter 4 uker ble mønsteret observert ovenfor ennå mer åpenbart. Den nye benbroen syntes meget skjør så vel som det nye trabekulærbenet under dette (Fig.21). Vesentlige rifter ble observert i det opprinnelige korteks i lårbenet på det kirurgiske punkt. Etter 5 uker syntes fortsatt den nye benbroen som avsperrer benhullet å være skjørt vev, ingen benmarg var synlig, mens kortikalben avslørte flere tomme hulrom som indikerer osteocytisk ødeleggelse og død.

Gruppe II: CAP-behandlede dyr (isolerte hull)

Etter 2 uker var vevsresponsen begrenset til punktet med benskaden og uttrykte seg ved fremstilling av en stor mengde nye bentrabekulærer inni benmargsrommet under den implanterte massen av CAP. En stor masse av CAP ble observert ved dets implantasjonspunkt – inni benhullene. Ingen cellulær respons ble observert utenfor de kortikale grenser, dvs langs benhinnen. Etter 3 uker var mønsteret liknende som det ovenfor beskrevet, selvom mer benvev var involvert i å “overbroe” hullet. Etter 4 uker avsperret den nye benbroen den skadede margen fra utvendige omgivelser, syntes mer ordnet og syntes som et kontinuerlig lag og friskt ben (Fig.22). Videre var det på undersiden av det opprinnelige hullpunktet synlig nyutviklet margvev, samt spredte bentrabekulærer. På dette tidspunkt kunne ikke lenger noen rester av det implanterte CAP identifiseres. Etter 5 uker fulgte stort sett utviklingsmønsteret det som ble observert i de foregående 2 ukene. Gjenoppbyggingen av den nye benbroen syntes fullstendig og derved avsperringen av det gjenvunne margvev fra omgivende vev. Ved denne tid var et nytt margvev tydelig, mens bentrabekulærene inni margrommet viste seg å ha flere rifter.

Gruppe III: Kitobiomer CAP-behandlede dyr (isolerte hull)

Etter 2 uker åpenbarte skadepunktet klare tegn på vevsreaksjon i form av ny brusk- og bendannelse, samt nytt benmargsvev (Fig.23). Punktpenetreringen var allerede fullstendig lukket. Et unikt kjennetegn observert på det tidspunktet var den markerte responsen i det opprinnelige margvev som inneholdt et velutviklet nettverk av nye bentrabekulærer. Det siste var innesluttet i et rikt margvev som innbefattet mononukleære celler, fettceller og blodkapillærer; et ekstra unikt kjennetegn relatert til den cellulære responsen i det opprinnelige kortikalvevet. Dette ble åpenbart ved tilsynekomsten av multiple celler inni selve korteks - benceller, bindevevceller og kapillærer. Etter 3 uker var benbroingen fullført. Broen besto av et nytt trabekulært nettverk som var forbundet med det opprinnelige kortikalbenet på begge sider av borehullet. Inni det samme margrommet var de nye bentrabekulærene forbundet med den indre overflaten av den opprinnelige korteks. Et velutviklet margvev var tydelig. Etter 5 uker forseglet en fast bro av trabekulærben fullstendig penetreringspunktet, og en ny ”ring” av trabekulærben omga den opprinnelige korteks. Rester av kitobiomere såes fortsatt på punktet for den opprinnelige implantasjon. Fig.24 viser histologien av det nye og friske benvevet 4 uker etter operasjonen.

Stor benødeleggelse.

Etter 2 uker ble en større ødeleggelse (5-6 mm), påført i en korteks og behandlet med CP kitobiomer, undersøkt. Ved dette tidspunkt åpenbarte hele margrommet en stor masse av nye trabekulærben, som var kontinuerlig via penetreringshullet med den nye massen av bentrabekulærer på den ytre overflaten av korteksen. Det meste av den opprinnelige korteksen var oppslukt av et nytt lag av trabekulærben som var i direkte kontakt med den ytre overflaten av korteksen. I motsetning til det vevde benet observert i et liknende tilfelle, som ble behandlet med CAP alene, syntes de nye trabekulærene i margrommet mer ordnet og tettere. Det opprinnelige kortikallaget i lårbenet i det området, åpenbarte multiple tomrom som holdt til i osteocyttene. Kapillærene inkluderende erytrocytter ble også observert i korteksen. Et annet dyr fra den samme eksperimentelle gruppen (2 uker, kitobiomer, stor ødeleggelse) fremviste en stor masse av brusk utenfor lårbenets kontur. Dette kjennetegn kunne være resultatet av den påførte stimulans av kitobiomer på stamceller inni benhinnen. Det nydannede brusk gjennomgikk deretter en mineralisering og ble omdannet til et aktivt sted for endokondral forbening. Dannelsen av nytt ben utenfor lårbenet var i områder så omfattende at det endte opp med utvikling av benutvekster som ble forbundet til det opprinnelige lårbenet.

Etter 3 uker eksaminerte vi et tilfelle der drillen hadde gått gjennom begge korteksene. Relativt store stykker av intakte kortekser be funnet som separate enheter lenger unna det opprinnelige benet. Et av de mest fremtredende kjennetegnene som ble observert var utvilsomt de store nye massene av brusk som hadde sin opprinnelse fra og beholdt sin tilknytning til benhinnene av både de løsnede stykkene av korteks og det opprinnelige lårkortekset. Det nylig dannede brusket beholdt sin kontinuitet med det nye bruskvevet inni margrommet. Det nye brusket åpenbarte alle trinn av vevsvariasjoner karakteristisk for dette vevet. Begynte med bruskstamceller, så unge kondroblaster så modne kondrocytter så hypertrofiske kondrocytter så mineralisering av modersubstansen etterfulgt av forbeningsprosessen, så karakteristisk for den endokondrale type av forbening.

Hele prosessen beskrevet ovenfor varte bare i 3 uker, som er indikativ for det enorme potensialet til kitobiomer (5 %) for å indusere nytt brusk fra stamceller både inni benhinnen og margvevet. Det synes som om kitobiomer besitter et sterkt beninduktivt potensiale spesielt i tilfeller i mer utvidede og kompliserte skader; der de medfødte prosesser ikke er istand til å overvinne en kritisk skade via en prosess som vil gi en ekte fornyelse av det opprinnelige vev, nemlig ben; men heller bare muliggjøre en helbredelsesprosess som ender opp usammenhengende.

Dessuten feilet også CAP alene, som tjente som bærer for kitobiomeren, å oppnå det som ble observert i kitobiomer-behandlede prøveeksemplarer. CAP er et godt benledende materiale, men mangler den induktive kapasiteten som Kitobiomer besitter, først for bruskdannelse og deretter for dets senere forbening.

Oppsummert ble det funnet ved å anvende in vivo eksperimenter med voksne hunner som modell at kitobiomer besitter beninduktive egenskaper, som for en stor del likner dem til BMP. Dens mål er genetisk bestemte celler inni benhinnen, endosteum og margvev som med hensiktsmessig trigger skiller seg ut til bruskceller, som etterhvert forbenes. Konsentrasjonen anvendt i den foreliggende studie: 5 % syntes å ha stort potensiale, en dose-respons studie er viktig med sikte på å bestemme den optimale prosentandelen av kitobiomer som er nødvendig for å oppnå de ovennevnte resultater.

Ved å anvende polarisert lys ved de mikroskopiske observasjonene av en benseksjon, ble orienteringen av kollagenfibrene (Type I kollagen) analysert. I et intakt ben har disse fibrene en regelmessig orientering, mens i en mer "primitiv" embryonisk type ben mangler denne orientering. Figuren viser at fibrene har regelmessig orientering som indikerer at bendannelsen som finner sted følger den endokondrale forbeningsveien. Makrofager ble vist å invadere CAP-kitobiomerkompositten som resulterte i en gradvis degradering av kitobiomeren etterhvert som den erstattes av ny brusk og benvev.

Konklusjoner Oppsummert ble kitobiomer i in vivo eksperimenter der voksne hunnrotter ble anvendt som modell, funnet å besitte beninduktive egenskaper som for en stor del likner dem til BMP. Bendannelsen følger den endokondrale forbeningsveien som er demonstrert ved histologifigurene. Den endokondrale forbeningsprosessen er kjennetegnet ved bruskdannelse før bendannelse. Bruskdannelse krever ikke oksygen i motsetning til bendannelsestrinnet, slik at dannelse av nye blodkar er påkrevet før transformasjonen av brusk til ben kan finne sted.

Reaksjonen til kitobiomeren ble kjennetegnet ved dannelsen av nytt bruskvev inni kitobiomerimplantatet og en induksjon av en kraftig dannelse av nytt vaskulært vev inni den nye brusken, som resulterte i at det nye vevet erstattet kitobiomer og bare rester av kitobiomer ble detektert i implantatene. Videre dannes bruskceller nær restene av kitobiomer og mineralisert brusk detekteres inntil nydannet benvev, som understøtter at den nye bendannelsen følger den endokondrale forbeningsveien. Kitobiomer besitter induktive egenskaper mot knokkeldannende celler både i margvevet så vel som i benhinnen. Kondrocyttene danner brusk før bendannelse finner sted og kondrocyttene, ved osteoblast-kondrocyttgrensen, gjennomgår avsluttende differensiering til hypertrofiske kondrocytter som utrykker Type II kollagen og utskiller angiogene faktorer, som mineraliserer den forkalkede brusk.

Figurforklaringer

Figur 21. Ubehandlet dyr 4 uker etter operasjon. Bildet viser siden på implantatet, et skjørt vev overbroer benskillet og status for helbredelsen var kjennetegnet som ikkebindende.

Figur 22. Kalsiumfosfatbehandlet dyr 4 uker etter operasjon. Bildet viser siden av implantatet, rester av kalsiumfosfatkrystaller er innkapslet i det skjøre vevet som overbroer benskillet. Statusen for helbredelsen var kjennetegnet som ikke-bindende. Figur 23. Dyr behandlet med kalsiumfosfat-kitobiomerkompositt 2 uker etter operasjon. Bildet viser siden av implantatet, kortikalben dekker benskillet med tett trabekulærben under den nye korteksen. Statusen for helbredelsen var kjennetegnet som fullstendig forbinding.

Figur 24. Dyr behandlet med kalsiumfosfat-kitobiomerkompositt 4 uker etter operasjon. Bildet viser friskt nytt trabekulærben.

Eksempel 8. Effekten av T-ChOS på reumatoid artritt, ved å anvende Type II kollagen indusert artritt rottemodell

Materialer og fremgangsmåter.

Et preparat av kitooligomere bestående av ≥60 % av T-ChOS-sammensetninger ble fremstilt av Genis, ifølge eksempel 2 (serie G051128), Figur 25 viser sammensetningen. Dyreeksemplarer i denne studien var Lewis hunnrotter som veide 159-179 gram (middelverdi 171 g) på dag 0 i studien. Dyrene ble identifisert med et entydig nummer ved halens festepunkt, som beskrev gruppe og dyrenummer. Etter tilfeldig utvalg ble alle bur merket med protokollnummer, gruppe og dyrenumre med hensiktsmessig fargekoding.

Dyr (10/gruppe for artritt, 4/gruppe for normale), huset 4-5/bur, ble bedøvet med isofluran og injisert med 300 μl av Freunds ufullstendige hjelpemiddel (Freund’s Incomplete Adjuvant) bestående av 2 mg/ml hornkveg type II kollagen, ved halens festepunkt og 2 punkter på ryggen på dagene 0 og 6. T-ChOS-behandling i vann ble initiert på studiens dag 0 og fortsatte til og med dag 17 med konsentrasjonsjusteringer utført på dagene 0, 6, 9-17, (veiedager).

Eksperimentelle grupper er vist i Tabell 8

Tabell 8. Eksperimentell design. Tabellen viser gruppe nr., antall individer pr gruppe og behandlingen i hver gruppe. Forskjellige doser er indikert i mg pr kg rotte pr dag.

Hovedparameteren som ble testet var venstre og høyre ankeldiameter av de bakre poter på rottene, som ble målt daglig i betennelsesperioden. Andre parametre av interesse var histologiske verdier målt i dyrene på dag 17. Histologisk evaluering ble utført i ankel og kneledd. Leddene ble kuttet på langs i halvparter (ankler) eller i frontalplanet (knær). Prøver ble preservert og avkalket (5 % maursyre) og bearbeidet med graderte alkoholer og et klaringsmiddel, infiltrert og nedsenket i parafin, seksjonert og farget med toluidinblått. Alt vev fra dyrene ble undersøkt mikroskopisk og observasjoner ble ført inn i et data-assistert datagjenfinningssystem.

Effekt av T-ChOS på betennelse ble analysert ved å anvende ANOVA og t-tester (parametriske eller ikke-parametriske tester) på ankeldiameterdataene.

Resultater

Figur 26 viser hovedfremgangsmåten for å overvåke betennelsen (artritt verdi).

Ankeldiameteren for venstre og høyre ankel ble målt daglig fra dag 9. Figur 27 indikerer RA verdi av kollageninjiserte rotter uten noen annen behandling. Betennelsen detekteres på dag 10 og øker gradvis opp til dag 15-17.

Figur 28 viser effekten av forskjellige doser av T-ChOS på den tidlige ankelbetennelsesraten (dag 10-12). Det er en klar doseavhengig effekt fra AW gruppen (0 dose) til A 0,25 gruppen, der reduksjonen i betennelsesraten var 58 % og svært signifikant (p<0,01). For det andre forsvant effekten gradvis med høyere dose.

Figur 29 indikerer effekten av forskjellige doser av T-ChOS på den sene ankelbetennelsesraten (dag 12-17). Den doseavhengige effekten sett tidligere, har forsvunnet.

Analyser av hele den lineære fasen av ankelbetennelsen (dag 9-15) ble også utført. Den eneste gruppen som viste signifikant reduksjon av betennelsesraten i den perioden var A 0,25 gruppen, der effekten var 28 % (t-test; p<0,05, se Tabell 9).

For histologisk betennelse og ødeleggelsesverdi fra dag 17, er hovedresultatene oppsummert i Tabell 9 for de mest aktive gruppene. Disse var A 0,25. Benresorpsjon (nedbrytningen av benvev) ble redusert 48 % og dette var den sterkeste effekten av alle de histologiske parametrene. Figur 30 viser klar doseeffekt, men A 0,5 gruppen synes å være ute av fase. Det var en 28 % signifikant reduksjon i betennelsen og en 40 % reduksjon i arrvevsdannelsen (pannus) i det betente vev. Det var en 29 % reduksjon i bruskødeleggelse ved T-ChOS, men denne effekten var ikke statistisk signifikant.

Tilslutt var det en signifikant reduksjon (33 %) i histopatologisk verdi, men denne faktor var summen av betennelse, pannus, bruskødeleggelse og benresorpsjon verdier for hver rotte.

Tabell 9. Oppsummering av hovedparametrene testet i studien. Tabellen viser gjennommsnittet av A 0,25 gruppen sammenliknet med AW (Artritt og vann) gruppen, reduksjon av symptomer (%), statistisk signifikans (0 = ikke signif, * = signifikant p<0,05, ** = signifikant p<0,01).

Konklusjoner

Det var en sterk signifikant effekt av T-ChOS i den tidlige fase av kollagen type II indusert artritt i rotter. Reduksjonen i betennelsesraten i ankler var på sitt beste 58 % i den tidlige fasen. Denne effekten var doserelatert, og viser maksimal effekt i A 0,25 gruppen, som er ekvivalent med 0,5 g daglig dose i mennesker. Men med høyere doser forsvant effekten gradvis. Imidlertid viste alle histologiske verdier, unntatt en, en signifikant reduksjon av artrittbetingelser som respons på optimum T-ChOS-dose ved slutten av eksperimentet. Sterkest effekt ble observert på reduksjon av bendegenerering (48 %) og forhindring av pannus (40 %).

Det ble konkludert at oral behandling med T-ChOS-preparat signifikant reduserte vevsdegenereringen og reduserte arrvevsdannelsen i betennelsesleddene. Dette understøtter andre resultater som indikerer vevsfornyende aktivitet i T-ChOS (Eksempel 7) og reduksjon av fibroblastvekst i vevskulturen (Eksempel 9).

Figurforklaringer

Figur 25. HPLC analyse av det testede T-ChOS-materialet, serie G051128. Figuren viser de relative kvantiteter av sukre med forskjellige molekylvekter, fra DP2 til ca 15. Figur 26. Målingen av ankeldiametre som en indikasjon på betennelse (artritt verdi).

Figur 27. AD (ankeldiameter) artritt verdi. Ankeldiameter (venstre høyre ankel) i 10 individuelle rotter injisert med kollagen på dag 0 (Gruppe 2; artritt+vann).

Figur 28. Effekten av T-ChOS (alle doser) i tidlig ankelbetennelsesrate. (Tidlig betennelsesrate som gjennomsnittsøkning i venstre og høyre ankeldiameter fra dag 10, 11 og 12). Gjennomsnitt og standardavvik er indikert.

Figur 29. Effekten av T-ChOS (alle doser) i sen ankelbetennelsesrate. (Tidlig betennelsesrate som gjennomsnittsøkning i venstre og høyre ankeldiameter fra dag 12-17). Gjennomsnitt og standardavvik er indikert.

Figur 30. Effekten av T-ChOS (alle doser) i benresorpsjon som bedømt ved histologisk undersøkelse. Gjennomsnitt og standardavvik er indikert.

Eksempel 9. Inhibering av fibroblastforøkning ved immobilisert T-ChOS

Materialer og fremgangsmåte

Mikroplatebelegging:

Beleggingsoppløsninger for mikroplater ble fremstilt ved å løse opp gelatin (Bio-Rad, USA) i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) ved 37 °C til en konsentrasjon på 0,1 %. Halvparten av denne oppløsningen ble tilsatt T-ChOS til en sluttkonsentrasjon på 1000 µg/ml og den andre halvparten tjente til kontroll. Alle oppløsninger ble sterilisert med ultrafiltrering (0,22 µm Nalgenfiltre).

Mikroplaten (96 brønner Nunc, Danmark) ble belagt ved å sette til 100 µl av gelatinoppløsningene i hver brønn og inkubere ved 4° C over natten.

Overskuddsoppløsning ble kastet og platene lagret med HBSS ved 4 °C.

Fibroblastutsåing og telling

Menneskelige fibroblastere ble innhentet med trypsinering fra sammenflytende T-25 flaskekultur og sådd, med 1x10<5>celler/ml av RPMI 1640 medium med 10 % serum, inn i de belagte mikroplatebrønnene. Cellene ble holdt ved 37 °C og 5 % CO2i tre døgn og på forhånd ble antallet celler bestemt ved å telle under et lysmikroskop. Hver ekseperimentell betingelse ble repetert med åtte brønner.

Antall celler ble talt innenfor et definert område i hver av de åtte brønnene (fibroblast tetthet). Tellingen ble utført etter en, to og tre døgn i kulturen. Dataene ble analysert statistisk (ANOVA).

Resultater

Statistiske analyser viste ikke-normal fordeling av data. Derfor ble testene ANOVA på rekker, etterfulgt av Kruskal-Wallis én-veis analyse av varians på rekke (One Way Analysis of Variance on Rank) anvendt. Denne immobiliserte T-ChOS i gelatin stanset signifikant veksten av fibroblaster, som vist i Figur 31 og 32.

Konklusjon

I dette eksperimentet var vi i stand til å demonstrere at når T-ChOS ble innstøpt i et gelatinbelegg på kulturplaten, var de i stand til signifikant å redusere forøkningen av fibroblaster på gelatinoverflaten.

Sammen med vitenskapelige rapporter om effekt av kitosan på sårhelbredelse, vår tidligere erfaring med kitobiomere, både oligomere og polymere, og de foreliggende resultater; konkluderer vi at T-ChOS er i stand til å undertrykke dannelsen av fibervev ved fibroblastene, mens det fremmer fornyelsen av de autentiske vevene, slik som ben, brusk og andre harde og bløte vev. Denne mekanismen for sårhelbredelse er meget fordelaktig siden det ikke resulterer i dannelsen av arrvev og beholder integriteten og funksjonaliteten til det opprinnelige vevet.

Figurforklaringer

Figur 31. Fibroblastvekst (tetthet vs. tid) på gelatinsjikt med og uten 100 µg/ml immobilisert T-ChOS. Gjennomsnitt (n=7-8), /- Standardavvik

Figur 32. Statistisk evaluering av effekten av T-ChOS på forøkningen av fibroblaster ved inkubasjon i tre døgn (d1-d3). C symboliserer ubehandlede og O symboliserer behandlede celler.

Claims

Patentkrav

1. En fremgangsmåte for å fremstille høyrent og fullt løselig delvis deacetylert kitinpolymer, der fremgangsmåten innbefatter trinnene:

- delvis deacetylering av kitin med alkalisk behandling til en deacetyleringsgrad i området mellom 25 til 70 %;

- nøytralisering av det delvis deacetylert kitinet;

- oppløsning av det delvis deacetylerte kitinet i sur oppløsing;

- fjerning av uoppløste partikler ved sekvensielle filtreringstrinn;

- justering av oppløsningen til pH over 8;

- økning av temperaturen til en temperatur i området 40<o>-100<o>C;

- utfelling av fullt oppløst og renset delvis deacetylert kitin ved

(i) forhøyet temperatur i området 40<o>-100<o>C og

(ii) tilsats av salt eller ved nøytralisering av den oppløste syren i oppløsning,

der presipitatet gjenvinnes og vaskes etter utfelling ved siling eller ved sentrifugering og der temperaturen på vaskevannet og presipitatet er over 50 °C,

der trinnet med delvis deacetylering av kitin utføres under betingelser som favoriserer homogen deacetylering.

2. En fremgangsmåte ifølge krav 1, der graden av deacetylering (DD) av den delvis deacetylerte kitinpolymeren er mellom 30 og 60 %.

3. En fremgangsmåte ifølge krav 1, der graden av deacetylering (DD) av den delvis deacetylerte kitinpolymeren er mellom 30 og 55 %.

4. En fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der justering av den delvis deacetylerte kitinoppløsningen innbefatter økning av pH til mellom pH 8-13.

5. En fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der tilsatt salt anvendt for saltutfellingen er natriumklorid eller et salt av trikarboksyl- eller dikarboksyl- eller monokarboksyl organisk syre, slik som sitronsyre, maleinsyre eller eddiksyre eller ammoniumsulfat, urea, guadinhydroklorid.

6. En fremgangsmåte ifølge krav 5, der saltkonsentrasjonen for presipitatet er mellom 2 % og metning.

7. En fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, der kitinet behandles med uorganisk eller organisk syre før deacetyleringstrinnet.

8. En fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, som ytterligere innbefatter et trinn med omfattende behandling med en Familie 18 endokitinase.

9. Fremgangsmåten ifølge ethvert av de foregående krav, der trinnet med delvis deacetylering av kitin innbefatter kjøling av den alkaliske oppløsningen benyttet i den alkaliske behandlingen før blanding med kitin og utføring av deacetyleringen ved en temperatur i området 5<o>-50<o>C.

10. Fremgangsmåten ifølge ethvert av de foregående krav, der trinnet med delvis deacetylering av kitin innbefatter frysing av alkali-kitinblandingen og påfølgende opptining og inkubering for deacetylering.

11. En fremgangsmåte for å fremstille høyrent og fullt løselig delvis deacetylert kitinpolymer, der fremgangsmåten innbefatter trinnene:

- nøytralisering av det delvis deacetylert kitinet;

- oppløsning av det delvis deacetylerte kitinet i sur oppløsing;

- fjerning av uoppløste partikler ved sekvensielle filtreringstrinn;

- justering av oppløsningen til pH over 8;

- økning av temperaturen til en temperatur i området 40<o>-100<o>C;

- utfelling av fullt oppløst og renset delvis deacetylert kitin ved

(i) forhøyet temperatur i området 40<o>-100<o>C og

der trinnet med delvis deacetylering av kitin utføres under betingelser som favoriserer heterogen deacetylering.

12. En fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive kitooligomere som innbefatter fullstendig enzymatisk hydrolyse med et Famile 18 kitinase enzym med delvis deacetylert kitin med en deacetyleringsgrad i området mellom 25 til 70 %, og fortrinnsvis i området fra 30 til 60 %.

13. Fremgangsmåten ifølge krav 12, der det delvis deacetylerte kitinet er homogent deacetylert.

14. Fremgangsmåten ifølge krav 12, der det delvis deacetylerte kitinet er heterogent deacetylert.

15. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 12-14, som videre innbefatter et ultrafiltreringstrinnfor å redusere og fortrinnsvis i det vesentlige eliminere monomerer av glukosamin og N-acetylglukosamin, ved å samle opp retentatet, som inneholder større oligomerer.

16. Fremgangsmåten ifølge krav 15, der ultrafiltreringstrinnet reduserer mengden av dimer- til pentamer-kitooligomer.

17. Fremgangsmåten ifølge krav 15, der ultrafiltreringstrinnet innbefatter ultrafiltrering med en 1 kDa ultrafiltreringsmembran.

18. Fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 12 til 17, som videre innbefatter tørking av nevte kitooligomerer og formulering til en tørr form utvalgt fra et pulver, flak eller fibermateriale.

19. En sammensetning innbefattende terapeutisk aktive kitooligomere av

N-acetylglykosamin og glykosamin, som kan oppnås ved omfattende enzymatisk hydrolyse med et Famile 18 kitinase enzym med delvis deacetylert kitinpolymersammensetning med en deacetyleringsgrad i området mellom 25 til 70 %, og fortrinnsvis i området fra 30 til 60 %.

20. Sammensetningen ifølge krav 19, som er underkastet ultrafiltrering, der retentatet, med mindre mengde av kortere oligomerer, omfattes i sammensetningen.

21. Sammensetningen ifølge krav 19 eller 20, der nevnte delvis deacetylerte kitinpolymersammensetning er homogent deacetylert.

22. Sammensetningen ifølge krav 19 eller 20, der nevnte delvis deacetylerte kitinpolymersammensetning er heterogent deacetylert.

23. Sammensetningen ifølge ethvert av kravene 19-22, der nevnte oligomerer er i en tørr form utvalgt fra et pulver, flak eller fibermateriale.