NO177522B - Anvendelse av trimetylaminoksid i fremstilling av for til marine arter, fisk og krepsdyr - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører trimetylaminoksid (TMAO) i fremstilling av for til marine arter, fisk og krepsdyr.

Den rikholdige tilgang til marine råstoffer i form av fiskemel, har ført til at den norske aquakulturindustri i stor utstrekning har benyttet slike råmaterialer i forblandinger.

I tillegg har fiskemel vist seg å være spesielt velegnét som proteinkilde i foret. Analyser av kommersielle fiskemelprodukter viser store variasjoner i jerninnholdet, normalt fra 140 - 300 mg jern pr. kg mel. Dette er hovedgrunnen til det relativt høye og varierende innhold av jern i kommersielle fiskeforprodukter, hvor det er normale variasjoner fra 200 - 400 mg jern pr. kg for. På grunn av at jern i vegetabilske råstoffer generelt er mindre tilgjengelig, bl.a. på grunn av innholdet av fosfater, fytater og oksalater, enn jern fra animalske råstoffer, har bruk av de marine råstoffene ført til at det forekommer et høyt innhold av biotilgjengelig jern i for som benyttes av aquakulturindustrien. Dette har imidlertid vært ansett som en ytterligere fordel når man benytter slike råstoffer for fremstilling av fiskefor.

I vår tidligere norske patentsøknad nr. 902274 ble det vist at nivået av jern i eksisterende for for oppdrettslaks er vesentlig for høyt og at dette vil redusere veksten og i tillegg øke risikoen for sykdommer.

Det ble vist at for å oppnå en optimal synergi mellom jern og omega-3 fettsyrer var til og med det laveste innholdet på 120 mg jern pr. kg for for høyt, til tross for at dette jerninnholdet er vesentlig lavere enn det som generelt sett er blitt betraktet som nødvendig. Det vises i denne forbindelse til Watanabe Nutrient Requirements of Cold Water Fishes, No. 16, National Academy Press, Washington DC, 1981, hvor det anbefales jerninnhold på fra 250 - 400 mg jern pr. kg for.

Ved å gjennomføre ytterligere forsøk har vi nå funnet at det er omtrent 3 ganger så mye oppsamlet jern i leveren til oppdrettslaks som i leveren til vill-laks. Overskytende jern blir lagret i leveren istedenfor å bli benyttet i hemoglobinsyntesen. Dette bekrefter at det foreligger et vesentlig misforhold ved jernbalansen i dagens fiskefor.

Det er derfor oppfinnelsens formål å tilveiebringe et for og etablere betingelser for foring som fører til en reduksjon i tilgjengeligheten av mineralet jern, i foret sammenlignet med et standardfor.

For å forbedre jernbalansen er det nødvendig å redusere mengden jern i foret. En reduksjon av jerninnholdet i foret til omtrent 100 mg pr. kg kan utføres ved å utvelge og utnytte kommersielle fiskemelprodukter som har lavest mulig innhold av tilgjengelig jern. I tillegg må det benyttes mineralblandinger som ikke inneholder jerntillegg. Denne meget tidsødende og kostbare metode fremtrer i dag som den eneste mulighet for å produsere et kommersielt fiskemelbasert for med et jerninnhold på omtrent 100 mg jern pr. kg tørt for.

Det faktum at en ytterligere senkning av jerninnholdet er nødvendig gjør at dette bare kan oppnås gjennom bruk av spesielt utvalgte proteinprodukter. Dette vil føre til at foret blir- så dyrt at hele oppdrettsnæringen kan bli uøkonomisk. Det kan også finne sted en mangel på passende proteinråmaterialer og samtidig har dette negative økonomiske konsekvenser for de tradisjonelle fiskemelprodusenter.

Det er igangsatt spesielle studier for om mulig å forklare hvorfor oppdrettslaks som fores tradisjonelt har et slik markert misforhold i jernbalansen og en dårligere helsetilstand enn vill-laks .

Der kan være tre grunnleggende forklaringer på misforholdet i jernbalansen: 1) Vill-fisken har en mulighet for å regulere sitt opptak av jern på en hittil ukjent måte.

2) Der er for høyt innhold av jern i foret.

3) Tilgjengeligheten av jern som er tilstede i foret er for høy.

Våre tidligere omfattende undersøkelser på oppdrettslaks ser ut til å indikere at den ikke har en reguleringsmekansime for jernopptak som er sammenlignbar med den som er kjent fra pattedyr. Det er naturlig å anta at dette også vil være tilfelle med vill-laks og andre ville fiskearter. På grunn av at rå marin fisk og krepsdyr er naturlig føde for vill-laks, og at fiskemel utgjør en vesentlig andel av kommersielt fiskefor, har vi antatt at hovedforskjellen mellom for for vill-laks og for for oppdrettslaks ikke er det totale innhold av jern alene, men også tilgjengeligheten av det jern som er tilstede.

'Chelatorer er en felles betegnelse for alle stoffer som er i stand til å danne jernkomplekser, og derved redusere tilgjengeligheten av mineralet. Ødeleggende virkninger forårsaket

av for høye jerndoser, kan derfor muligens bli eliminert gjennom bruk av chelatorer eller inhibitorer for jernabsorpsjon, og resultere i at en større andel av jernet blir utskilt uten å blir absorbert.

Vi har utviklet den hypotese at misforholdet i jernbalansen blir skapt fordi jernet i kommersielt fiskemel er mer direkte tilgjengelig enn jern i rå fisk. Grunnen til dette er at rå marin fisk har et høyt naturlig innhold av den nitrogenholdige basen trimetylaminoksid (TMAO, (CH3) 3N0) . TMAO er kjent for dets potente evne til å presipitere jern. Fordi TMAO er naturlig tilgjengelig i alle marine fisker og krepsdyr, er det også en naturlig del av den føde som inntas av vill-laksen.

TMAO er ytterligere oppdaget i innvollene til fisk, som er det sted hvor jernopptaket foregår. Et stort antall analyser har i tillegg vist at TMAO-innholdet i fisk vil øke ved synkende sjøtemperaturer. Med utgangspunkt i våre tidligere oppdagelser, under henvisning til den ovenfornevnte patentsøknad nr. 902274, er det ved disse lave sjøtemperaturer av spesiell viktighet for laksen å redusere opptaket av jern. Grunnen er at in vitro studier har vist at de røde blodlegemer vil agglutinere og danne en fortykning når blodet inneholder mer jern enn transportmekanismen (serumtransferrin) kan ta vare på. Dette kan føre til trombose i fisken. Trombose er ifølge vår erfaring antagelig grunnen til at det oppstår vintersår på fisken. Vintersår er overflateriss på siden av laksen. Ved lave vanntemperaturer oppstår disse hyppig og har svært ødeleggende økonomiske virkninger fordi vintersår gir høy dødelighet samtidig som slik slaktet fisk blir degradert til produksjonsfisk.

Når vill-fisk således konsekvent opptar lave mengder av jern fra sin naturlige føde er dette ikke tilfelle for oppdrettslaks.

Grunnen til dette er at TMAO i produsert fiskefor ikke har evnen til å presipitere jern. Dette er tilfelle fordi TMAO blir forandret under oppvarming. Ved produksjon av fiskemel blir fisken oppvarmet over lengre tid. Under forproduksjonen blir råstoffet i tillegg oppvarmet idet det passerer gjennom en ekstruder eller annet produksjonsutstyr som etterfølges av et avsluttende tørketrinn for å fjerne gjenværende vann.

Vi har nå overraskende funnet at tilsetningen av syntetisk TMAO vil senke jernabsorpsjonen i oppdrettslaks. Laks ble foret med jernisotopen <59>Fe, med og uten tilsetning av syntetisk TMAO, og blodet ble analysert etter 24 timer. Vi fant markert lavere radioaktivitet i den fisk som hadde fått TMAO-tilsetning sammenlignet med fisk som ikke fikk TMAO-tilsetning. Dette viser at TMAO vil senke jernabsorpsjonen i oppdrettslaks.

Den markerte forskjell mellom jerntilgjengelighet i rå og forarbeidet fisk er dokumentert innenfor pelsdyrnæringen. I denne forbindelse refereres til A. Skrede: "Meldinger fra Norges Landbrukshøgskole, Vol. 62, Nr. 4". Her er dokumentert at mink som ble foret med rå fisk fikk anemi (lave nivåer av blodhemoglobin) som forårsaket hvit underpels og resulterte i et produkt uten økonomisk verdi.

Mink som ble matet med kokt fisk fikk imidlertid ikke anemi og hadde normal pels.

Grunnen til dette er at rå fisk har høyt innhold av aktivt TMAO. TMAO forårsaket anemi fordi fritt jern ble overført til uoppløselig jernoksyhydroksid. Disse erfaringer ble gjort for første gang innenfor pelsnæringen for 20 - 25 år siden og vedrører mangel på biotilgjengelig jern i minkfor.

Vår nye kunnskap i forbindelse med at jernopptak-reguleringsmekanismen i oppdrettslaks mangler, indikerer at et for for fiskeoppdrettsnæringen vil behøve en annen tilnærming: hvordan kan mengdene av biotilgjengelig jern reduseres for derved å oppnå optimalt opptak av jern?

Det er derfor et hovedformål med den foreliggende oppfinnelse å fremstille et fiskefor hvor mengden av biotilgjengelig jern kan styres.

Et annet formål er å muliggjøre fortsatt bruk av marint fiskemel som en proteinkilde i fiskefor.

Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et fiskefor og en fremgangsmåte for å produsere det, hvor mengden av biotilgjengelig jern blir styrt for å oppnå en optimal synergetisk effekt mellom jern og omega-3 fettsyrene som er tilstede.

Et ytterligere formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe et tilsetningsstoff som kan kontrollere mengden av biotilgjengelig jern.

Disse og også andre formål blir oppnådd ved den oppfinnelse som er definert i de etterfølgende patentkrav 1-3.

Oppfinnelsen vil i det etterfølgende bli beskrevet mer detaljert i tilknytning til de resultater som er oppnådd ifølge eksperimentene 1-3, og som illustrert på tegningene, hvor

Fig. 1 viser den avtagende biotilgjengelighet av jern med

økende mengder tilsatt TMAO.

Fig. 2 viser det reduserte opptak av jern i blod, lever, milt

og hjerte for oppdrettslaks når TMAO er tilstede og

Fig. 3 at TMAO viser en preferanse mot jern i forhold til andre essensielle mineraler slik som sink og mangan.

RESULTATER

Forsøk 1.

25 laks ble oppdelt i 5 grupper, hver på 5 fisk. Samtlige ble foret med en oppløsning av 200 yug toverdig (ferrous) jern og fem ulike mengder av TMAO: 0, 5, 10, 20 og 40 ganger mengden av jern. All fisk ble tatt blodprøve av etter 24 timer for å bestemme innholdet av radioaktivt jern i blodet. Vi observerte en distinkt, signifikant og lineær korrelasjon mellom jern absorbert og TMAO tilsatt i den ferdige løsning (r = -0,998, df = 4, p<0,001, Tabell 1 og Fig. 1).

Forsøk 2.

Tidspunktet for blodprøvetaking kan være kritisk. For å tilveiebringe dokumentasjon av de totale virkninger av TMAO på jernopptak, kan det derfor være nødvendig med blodprøver ved forskjellige tidsintervaller etter foring. I tillegg er det påkrevet å måle nivået av radioaktivt jern i lever og milt av fisk som fores med forskjellige mengder av TMAO. Hvis mer radioaktivt jern blir funnet i milten for fisk som ikke fores med TMAO, enn i fisk som fores med TMAO, kan det tyde på ødeleggelse

av cellemembran i de røde blodcellene.

30 laks ble delt i 2 grupper på 15 fisk. Samtlige fisk i kontrollgruppen ble tilført en foroppløsning på 200 jixg (ferrous) jern uten TMAO-tilsetning. Den gjenværende fisk ble foret med den samme mengde jern sammen med 8 mg TMAO (TMAO: Fe = 40:1).

Blod, lever og milt ble tatt prøver av fra hver gruppe ved 3 forskjellige tidsintervall etter foring:

Vi observerte redusert opptak av jern i blod, lever og milt ved samtlige tidsintervaller etter foring med fiskefor med TMAO (Tabell 2 og Fig. 2) . Det reduserte opptak av jern i TMAO-gruppen, sammenlignet med kontrollgruppen, var signifikant ved alle tidsintervaller og organer bortsett fra: blod etter 48 timer (p<0,l), milt etter 48 timer og milt etter 96 timer (p<0,l).

Overdosering av jern kan ha forbindelse med hjertesykdommer i atlantisk oppdrettslaks. Derfor ble jernopptaket i hjertet etter 96 timer målt (Tabell 2) . Fisk som ble tilført TMAO i dietten hadde vesentlig redusert jerninnhold i hjertet sammenlignet med fisk i kontrollgruppen (p<0,005).

Antall fisk var 5 for hver behandling, unntatt for TMAO/24 timer og Kontroll/48 timer hvor antallet var 4.

Forsøk 3.

I eksempel 1 og 2, ble virkningen av TMAO på jernopptak studert uten noen innvirkning fra andre mineraler. Det er imidlertid også av avgjørende viktighet å vite om TMAO også innvirker på opptak av andre mineraler. Effekten av TMAO på et blandet for ble derfor studert. I foret var tilsatt radioaktive isotoper av tre forskjellige mineraler.

Isotoper:

i) <65>Zn

ii) <54>Mn

iii) <59>Fe

Fisken ble foret med en oppløsning med 2 00 g jern, 150 g sink og 50 g mangan. 2 behandlinger ble benyttet, Kontroll og TMAO. Mengden av TMAO tilført var 40 ganger mengden av jern, 53 ganger mengden av sink og 160 ganger mengden av mangan. Tidspunkt for blodprøvetaking var 24 timer etter foring. I tillegg til den blandede mineraloppløsningen ble det gjort individuelle studier for jern, sink og mangan.

Fisk som ble foret med TMAO og en sammensatt blanding av samtlige mineraler hadde vesentlig redusert innhold av radioaktivt jern i blodet, sammenlignet med fisk i Kontroll-gruppen (p<0,001). TMAO reduserte ikke opptak av sink og mangan (Tabell 3, Fig.3).

I eksperimentet med ett enkelt mineral i oppløsningen, reduserte TMAO opptaket på følgende måte: jern = 82% (p<0,05), sink = 30%

(ikke signifikant) og mangan = 69% (ikke signifikant).

Antall fisk var 5 for hver behandling.

Standard fiskeforblandinger inneholder i det grunnleggende proteiner, lipider og noe karbohydrater som hovedkomponenter. I tillegg blir andre tilsetninger slik som bindemidler, konserveringsmidler, vitaminer og mineraler tilsatt. Ingrediensene blir blandet sammen i de nødvendige mengder og blandingen kan gjennomføres med eller uten tilsetning av vann eller væske for å fremstille et tørt, mykt eller vått for. Som proteinkilde benyttes fortrinnsvis fiskemel og som lipid benyttes marine oljer, fortrinnsvis fiskeoljer og fiskeoljekonsentrater. Mineralblandingen som benyttes bør være uten jerntilsetninger. Selv om det krever vesentlig erfaring og kunnskap å produsere et høykvalitets fiskefor, er den grunnleggende prosess vel kjent i litteraturen og burde derfor ikke være nødvendig å beskrive i detalj her. Ved å 'variere mengden av fiskeolje eller fiskeoljekonsentrater som benyttes, kan omega-3 innholdet i foret bli justert slik at det ligger i et område fra 2,0 % til 8,5 % mens mengden av jern vil bli variert til å ligge mellom 100 - 400 mg pr. kg tørt for, avhengig av de valgte råstoffer. Også Ph av foret må beregnes og bør ikke være lavere enn 5,5 og fortrinnsvis bli justert til mellom 6-7.

Den nødvendige mengde TMAO kan beregnes utfra den kurve og den ligning som er vist på Fig. 1. Fra regress-ligningen kan den nødvendige mengde av TMAO for å redusere opptak av jern til det ønskede nivå estimeres.

TMAO er fortrinnsvis i form av trimetylaminoksid-modifiserte molekyler, eller et derivat av samme i tørr eller flytende form, med den samme virkning. TMAO kan fortrinnsvis bli tilsatt i form av et tørt pulver med forskjellige mengder av TMAO eller blandet med et tørt fiskemel. Det kan alternativt være oppløst og utspedd med vann eller væske og tilsatt forblandinger.

Avhengig av det gjennomsnittlige innhold av jern og omega-3 gitt ovenfor, og når det benyttes fiskemel som proteinkilde og fiskeolje som væskekilde med Ph på 6,0, vil den nødvendige mengde TMAO være 3,8 g for å oppnå en reduksjon av jern fra 150 - 75 mg pr. kg.

Viktigheten av å redusere jerntilgjengeligheten gjennom tilsetning av TMAO i fiskeforet, eller ved dets bruk som et tilsetningsmiddel,- er ikke bare viktig i forhold til oppdrettslaks, men har også virkning for andre marine oppdrettsarter for foring av yngel såvel som foring av større fisk.

Claims (3)

1. Anvendelse av trimetylaminoksid (TMAO) i tørr tilstand eller væskeform i fremstilling av for til marine arter, fisk og krepsdyr, og hvor foret inneholder proteiner, lipider og karbohydrater i kombinasjon med ett eller flere tilsetningsstoffer, og hvor innholdet av biotilgjengelig jern i det ferdige for kontrolleres til under 100 mg jern/kg tørt for.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der foret inneholder fra 2,0 til 8,5% omega-3 fettsyrer basert på tørrstoffinnholdet.

3. Anvendelse ifølge krav 1, der foret inneholder tilsetningsstoffer som fyllstoff, bindemidler, preserveringsmidler, vitaminer og mineraler.