NO174468B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive 5,11- di-hydro-6H-dipyrido (3,2-b:2',3'-e)(1,4) diazepin-6-oner og -tioner - Google Patents

Abstract

Nye 5,ll-dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-oner og -tioner er omtalt. Disse er nyttige ved forebygging eller behandling av AIDS.Forbindelse med formel I

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen gjelder fremgangsmåter for fremstilling av nye 5,ll-dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2' , 3'-e][1,4]diazepin-6-oner og -tioner og farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter av disse. Disse forbindelser kan benyttes ved forebygging eller behandling av AIDS.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Sykdommen på mennesker, Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), forårsakes av "Human Immunodeficiency Virus (HIV), særlig stammen kjent som HIV-1.

Som andre viruser kan HIV-1 ikke formere seg uten å okkupere det biosyntetiske apparat hos vertscellen som den infiserer. Den får dette apparat til å produsere de strukturelle proteiner som danner virusavkommet. Disse proteiner er kodet i det genetiske materiale som inneholdes i de infiserende viruspartikler eller virion. Imidlertid fordi det er et retrovirus, er det genetiske materiale i HIV RNA, ikke DNA som i vertscellens kromosomsett. Således må virusets RNA først overføres til DNA og deretter integreres i vertscellens kromosomsett for å at vertscellen skal kunne produsere de nødvendige virusproteiner.

Overføring av RNA til DNA gjennomføres ved bruk av enzymet revers transcriptase (RT), som sammen med RNA er inkludert i det infiserende virion. Revers transcriptase har tre enzymatiske funksjoner; det virker som en RNA-avhengig DNA-polymerase, som en ribonuklease, og som en DNA-avhengig DNA-polymerase. Ved først å virke som en RNA-avhengig DNA-polymerase, lager RT en enkel-trådet DNA-kopi av virusets RNA. Deretter, ved å virke som en ribonuklease, frigjør RT DNA som nettopp er produsert fra det originale virus-RNA og ødelegger deretter det originale RNA. Tilslutt, ved igjen å virke som en DNA-avhengig DNA-polymerase, lager RT en annen komplementær DNA-tråd, ved å bruke den første DNA-tråd som mønster. De to tråder lager dobbelt-trådet DNA som integreres i vertscellens kromosomsett ved hjelp av.et annet enzym som kalles en integrase.

Forbindelser som hemmer den enzymatiske virkning av HIV-1 revers transcriptase, vil hemme formering av HIV-1 i infiserte celler. Slike forbindelser er nyttige ved forebygging eller behandling av HIV-l-infeksjon hos mennesker.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Oppfinnelsen omfatter fremstilling av 5,ll-dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-oner og -tioner med formel

der

Z er oksygen eller svovel;

R<1> er hydrogen, alkyl med 1 til 5 karbonatomer, fenylmetyl, alkanoyl med 2 til 3 karbonatomer eller alkyltioalkyl med 2 til 4 karbonatomer;

R<2> er hydrogen, alkyl eller fluoralkyl med 1 til 5 karbonatomer, alkenyl eller alkynyl med 2 til 5 karbonatomer, alkyltioalkyl med 2 til 4 karbonatomer, alkanoyl med 2 til 4 karbonatomer, fenylmetyl (som enten er ikke-substituert eller substituert med alkoksy med 1 til 3 karbonatomer eller halogen), eller fenyl; og

R<3> til R<8> alle er hydrogen; eller

en av R<3> til R<8> er alkyl med 1 til 4 karbonatomer, alkoksy med 1 til 4 karbonatomer, nitro, hydroksyl, amino, monoalkyl-

aminoalkyl der alkyl-enheten inneholder 1 til 2 karbonatomer, eller halogen, med de andre fem substituenter som hydrogen.

Et spesielt aspekt ved oppfinnelsen utgjør fremstilling av forbindelser med formel I der,

Z er oksygen eller svovel;

R<1> er hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer;

R<2> er alkyl eller fluoralkyl med 1 til 4 karbonatomer, allyl eller benzyl; og

R3 til R<9> er alle hydrogen.

Forbindelsene med formel I kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter eller innlysende modifikasjoner av disse. Fremgangsmåtene A, B og C beskrevet nedenfor, representerer fremgangsmåtene til fremstilling av forbindelsene.

Fremgangsmåte A

Forbindelser med generell formel I hvor R<2> er forskjellig fra hydrogen, kan fåes ved ringdannelse i et karboksylsyreamid med generell formel II

der R<1> og R3 til R<8> har samme definisjoner som er gitt med hensyn til formel I, R<2>' er som definert for R2 bortsett fra hydrogen og Hal betegner fluor, klor, brom eller jod.

Fremgangsmåte B

Forbindelser med generell formel Ib

der R<1> og R3 til R8 er som definert ovenfor for formel I, kan fremstilles ved hydrolytisk spaltning av arylmetylgruppen i forbindelser med generell formel III

der R<1> og R3 til R<8> defineres som nevnt ovenfor og Ar kan være for eksempel en fenyl- eller 4-metoksyfenylgruppe.

Fremgangsmåte C

Forbindelser med generell formel I hvor R2 til R<8> er som angitt for formel I og R<1> er forskjellig fra hydrogen, kan fåes ved overføring av et 5,ll-dihydro-6H-dipyrido-[3,2-b:2',3'-ej[1,4]diazepin-6-on med formel IV der R<2> til R<8> er som definert ovenfor, til den tilsvarende 5-alkali- eller jordalkalimetall-forbindelse og deretter omsetning av alkalimetallforbindelsen med en forbindelse med formel V

der R<1>' har samme betydninger som R<1> bortsett fra hydrogen, og X er radikalet av en reaktiv ester, et halogenatom, gruppen OSO2OR1', metansulfonyloksy- eller etansulfonyloksy-gruppe eller en aromatisk sulfonyloksygruppe.

Den fremstilte forbindelse med formel I kan isoleres som den er eller som et farmasøytisk godtagbart syreaddisjonssalt.

Ved fremgangsmåte A skjer ringdannelsen fortrinnsvis ved overføring av forbindelsene med generell formel II til deres alkalimetallsalter og påfølgende kondensering ved temperaturer mellom 0°C og reaksjonsblandingens kokepunkt.

Hvis R<1> i utgangsforbindelsene med generell formel II er forskjellig fra hydrogen, krever reaksjon med metall minst 1 mol av metallreagenset.

Hvis på den annen side R<1> er hydrogen, må minst 2 mol av dette reagens benyttes. Til reaksjon med metall brukes fortrinnsvis litium-, natrium- og kaliumhydrider, litiumalkyler så som n-butyllitium.

Omsetningen gjennomføres vanligvis i inerte oppløsningsmidler, for eksempel i tetrahydrofuran, 1,4-dioksan, glykoldimetyleter, dietylenglykol-dimetyleter, trietylenglykol-dimetyleter, dimetylformamid, benzen eller anisol. Ringdannelsen kan også gjennomføres ved oppvarmning av karboksylsyreamider med generell formel II i dipolare ikke-protonholdige oppløsningsmidler, fortrinnsvis i sulfolan eller dimetylsulfon. Katalytiske mengder av sterke syrer, for eksempel svovelsyre, saltsyre, hydrogenbromidsyre, fosforsyre, polyfosforsyre, metansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre, har vist seg å være av nytte. Den nødvendige omsetningstemperatur er vanligvis mellom 110 og 220°C, det foretrukne temperaturområde er mellom 13 0 og 170°C.

Ved fremgangsmåte B gjennomføres hydrolysen fortrinnsvis ved middels til sterke syrer eller Lewis-syrer ved temperaturer mellom -20 og +150°C. Slike syrer kan for eksempel være svovelsyre, metansulfonsyre, trifluoreddiksyre, trifluormetansulfonsyre, fosfor- eller polyfosforsyre. Ved bruk av fosfor- eller polyfosforsyre, har tilsetning av oppløsningsmidler så som benzen, toluen, fenol, anisol eller veratrol vist seg å være fordelaktig.

Hvis Lewis-syrer så som aluminiumklorid eller -bromid benyttes for å eliminere arylmetylgruppen, er

oppløsningsmidler så som aromatiske hydrokarboner, for eksempel benzen, toluen, anisol eller blandinger av disse med diklormetan, egnet.

Det vil være klart for dem som har fagkunnskap at fremgangsmåte B ikke foretrekkes i de tilfeller der noen av R<1 >og R<3> til R<8> er lett hydrolyserbare substituenter, for eksempel der R<1> er alkanoyl eller noen av R3 til R<8> er alkanoylamino eller alkoksykarbonyl. I tilfeller der for eksempel R<1> er alkanoyl eller noen av R3 til R<8> er alkoksykarbonyl, er det å foretrekke å benytte fremgangsmåte A beskrevet ovenfor; når R<1 >er hydrogen, må to ekvivalenter base benyttes. I tilfeller der for eksempel noen av R3 til R<8> er alkanoylamino, er det å foretrekke å gjennomføre hydrolysen (og påfølgende acylering) på det tilsvarende nitro-derivat og deretter redusere nitro-enheten til aminet, fulgt av acylering for å gi det ønskede produkt.

I stedet for overføring av forbindelsen med generell formel IV til dets tilsvarende alkalimetallsalt i første trinn av fremgangsmåte C, kan alkylering av en forbindelse med formel IV også gjennomføres ved omsetning med en forbindelse med formel V i nærvær av aminer så som trietylamin, diazabicykloundecen eller 4-(dimetylamino)pyridin, eller alkalikarbonater eller -bikarbonater, så som natrium- eller kaliumkarbonat eller natriumbikarbonat.

Overføring av en forbindelse med generell formel IV til den tilsvarende alkalimetall- eller jordalkalimetall-forbindelse, kan gjennomføres ved omsetning av en forbindelse med formel IV med et alkalimetall- eller jordalkalimetall-hydroksyd, så som 1itiumhydroksyd, bariumhydroksyd, natriumhydroksyd eller kaliumhydroksyd, med et alkalimetall-alkoholat, så som natriummetanolat eller kalium-tert-butoksyd, med et alkalimetallamid, så som natriumamid eller kaliumamid, eller med et alkalimetallhydrid, så som natriumhydrid eller kaliumhydrid. Omsetningen gjennomføres fortrinnsvis ved fohøyede temperaturer og i nærvær av et egnet organisk oppløsningsmiddel. Inerte organiske oppløsningsmidler så som tetrahydrofuran eller glykol-dimetyleter foretrekkes hvis alkalimetallhydrider benyttes som metallreagenser, mens hvis et alkali- eller jordalkalimetall-hydroksyd benyttes, kan en vandig blanding med et organisk oppløsningsmiddel, så som metanol eller tetrahydrofuran også benyttes. Til overføring av alkali- eller jordalkalimetallsubstituert 5,ll-dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2' ,3.'-e] [1, 4]diazepin-6-on som således er dannet, til en forbindelse med generell formel Ic, omsettes oppløsningen eller suspensjonen av alkali- eller jordalkalimetall-forbindelsen direkte, det vil si uten isolering, med en forbindelse med formel V ved -2 0°C eller ved forhøyede temperaturer, opptil kokepunktet for oppløsningsmidlet eller reaksjonsmediet, den som er lavest av disse. Substitusjonen finner sted omtrent utelukkende på nitrogenatomet i 5-posisjon på dihydro-dipyrido-diazepinon, selv om R<2> i utgangsmaterialet med formel IV er et hydrogenatom, forutsatt at en ekvivalent base og en ekvivalent av en forbindelse med formel V benyttes. Det vil være klart for dem som har fagkunnskap at tilstedeværelse av nukleofile substituenter i forbindelsene med formel Ic kan kreve bruk av en utgangsforbindelse med formel Ic som har substituenter som er, bortsett fra nitrogenet i 11-posisjon, ikke-nukleofile men som det kan lages derivat av så en får den nødvendige gruppe. For eksempel oppnås amino- eller monoalkylamino-substituenter på noen av R<3 >til R<8> fortrinnsvis ved alkylering eller acylering av en utgangsforbindelse med formel Ic som har en nitrogruppe på en av R<3> til R<8>, med påfølgende reduksjon av nitrogruppen og alkylering, om det passer, for å gi sluttproduktet.

Karboksylsyreamidene med generell formel II som benyttes som utgangsmaterialer, fåes for eksempel ved aminering av 2-klornikotinsyreamider med generell formel VIII

der R<1> til R<8> og Hal er som definert her tidligere, med primære aminer med generell formel IX

der R<2>' er som definert her tidligere. Omsetningen kan også gjennomføres i nærvær av uorganiske eller organiske andre baser, så som trietylamin, N,N-dimetylanilin eller natrium-eller kaliumkarbonat. Omsetningen kan skje uten bruk av oppløsningsmiddel; det kan imidlertid være gunstig å bruke inerte organiske oppløsningsmidler ved temperaturer mellom 0°C og 150°C, fortrinnsvis ved tilbakeløpstemperaturen. Egnede inerte oppløsningsmidler som kan benyttes, omfatter et overskudd av det primære amin med generell formel IX, etere

med åpen kjede eller cykliske etere så som tetrahydrofuran, 1,4-dioksan, glykoldimetyleter, dietylenglykol-dimetyleter; aromatiske hydrokarboner så som benzen, toluen, xylen, klorbenzen eller pyridin; alkoholer så som metanol, etanol, isopropanol; dipolare ikke-protonholdige oppløsningsmidler så som dimetylformamid; 1,3-dimetyl-2-imidazolidinon, 1,3-dimetyl-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinon og sulfolan. Utgangsmaterialer med generell formel VIII der R<1> er forskjellig fra hydrogen, kan fremstilles fra 2-klornikotinsyreamider med generell formel X

ved omsetning med alkyleringsmidler med generell formel V i nærvær av protonakseptorer, for eksempel aminer så som trietylamin, diazabicykloundecen, 4-(dimetylamino)pyridin eller alkali- eller jordalkalimetallhydroksyder så som natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, kalsiumhydroksyd eller alkalikarbonater eller jordalkalimetallkarbonater eller hydrogenkarbonater, så som natriumkarbonat eller kaliumkarbonat eller kaliumhydrogenkarbonat.

2-klornikotinsyreamider med generell formel X kan fåes ved kondensering av 2-klornikotinsyreklorid med 3-amino-2-halogenpyridiner under vel kjente reaksjonsbetingelser.

Alle de andre utgangsmaterialer er kjent fra litteraturen eller kan kjøpes eller fåes ved fremgangsmåter kjent fra 1itteraturen.

Forbindelser med formel I kan om ønsket overføres til sine ikke-toksiske, farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter ved vanlige fremgangsmåter; for eksempel ved oppløsning av en forbindelse med formel I i et egnet oppløsningsmiddel og surgjøring av oppløsningen med én eller flere molare ekvivalenter av den ønskede syre. Oppfinnelsen omfatter også fremgangsmåte for fremstilling av slike salter.

Eksempler på uorganiske og organiske syrer som kan danne ikke-toksiske, farmasøytisk godtagbare syreaddisjonssalter med en forbindelse med formel I, er de følgende: saltsyre, hydrogenbromidsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, tartarsyre, sitronsyre, metansulfonsyre og lignende. Forbindelser med generell formel I danner vanligvis syreaddisjonssalter med én molar ekvivalent av syren.

De ovenfor beskrevne forbindelser med formel I har hemmende virkning på HIV-1 revers transcriptase. Administrert i egnede doseringsformer, er de nyttige til forebygging eller behandling av AIDS, ARC eller beslektede forstyrrelser forbundet med HIV-infeksjon. Et annet aspekt ved oppfinnelsen er derfor en fremgangsmåte til forebygging eller behandling av HIV-l-infeksjon som omfatter administrering til et menneske som er utsatt for eller infisert av HIV-1, en profylaktisk eller terapeutisk virksom mengde av en ny forbindelse med formel I som beskrevet ovenfor.

Forbindelsene med formel I kan administreres i enkle eller delte doser ad oral, parenteral eller topisk vei. En egnet oral dose av en forbindelse med formel I ville være i området fra rundt 10 til 500 mg per dag. I parenterale preparater, kan en egnet doseringsenhet inneholde fra 1 til 50 mg av nevnte forbindelse, mens til topisk administrering, foretrekkes preparater som inneholder 0,01 til 1% aktiv ingrediens. Det må imidlertid være klart at doseringsadministrering vil variere fra pasient til pasient, og dosering til en spesiell pasient vil avhenge av bedømmelsen til legen som vil bruke som kriterier for å bestemme en passende dosering, størrelsen og tilstanden til pasienten samt pasientens reaksjon på legemidlet.

Når forbindelsene fremstillet ifølge den foreliggende oppfinnelse skal administreres ad oral vei, kan de administreres som medikamenter i form av farmasøytiske preparater som inneholder dem i blanding med et forenelig farmasøytisk bæremateriale. Slikt bæremateriale kan væra et inert organisk eller uorganisk bæremateriale egnet til oral administrering. Eksempler på slike bærematerialer er vann, gelatin, talk, stivelse, magnesiumstearat, gummi arabicum, vegetabilske oljer, polyalkylenglykoler, vaselin og lignende.

De farmasøytiske preparater kan tilberedes på vanlig måte og endelige doseringsformer kan være doseringsformer i fast form, for eksempel tabletter, drasjeer, kapsler og lignende, eller flytende doseringsformer, for eksempel oppløsninger, suspensjoner, emulsjoner og lignende. De farmasøytiske preparater kan utsettes for vanlige farmasøytiske behandlinger så som sterilisering. Videre kan de farmasøytiske preparater inneholde vanlige tilsetningsstoffer, så som konserveringsmidler, stabiliseringsmidler, emulgeringsmidler, smaksforbedringsmidler, fuktemidler, buffere, salter for å variere det osmotiske trykk og lignende. Fast bæremateriale som kan benyttes omfatter for eksempel stivelse, laktose, mannitol, metylcellulose, mikrokrystallinsk cellulose, talk, silisiumoksyd, dibasisk kalsiumfosfat og polymere med stor molekylvekt (så som polyetylenglykol).

Til parenteralt bruk kan en forbindelse med formel I administreres i en vandig eller ikke-vandig oppløsning, suspensjon eller emulsjon i en farmasøytisk godtagbar olje eller en blanding av væsker som kan inneholde bakteriostatiske midler, antioksydasjonsmidler, konserveringsmidler, buffere eller andre oppløste stoffer for å gjøre oppløsningen isotonisk med blodet, fortykningsmidler, suspensjonsmidler eller andre farmasøytisk godtagbare tilsetningsstoffer. Tilsetningsstoffer av denne type omfatter for eksempel tartrat-, citrat- og acetat-buffere, etanol, propylenglykol, polyetylenglykol, kompleksdannere (så som ETDA), antioksydasjonsmidler (så som natriumbisulfitt, natriummetabisulfitt og ascorbinsyre), polymere med høy molekylvekt (slik som flytende polyetylenoksyder) til regulering av viskositeten og polyetylen-derivater av sorbitolanhydrider. Konserveringsmidler kan også tilsettes om nødvendig, så som benzosyre, metyl- eller propyl-paraben, benzalkoniumklorid og andre kvartære ammoniumforbindelser.

Forbindelsene fremstillet ifølge denne opfinnelsen kan også administreres som oppløsninger til nasal påføring og kan inneholde i tillegg til forbindelsene fremstillet ifølge denne oppfinnelsen, egnede buffere, midler for å justere tonisiteten, konserveringsmidler mot mikrober, antioksydasjonsmidler og viskositetsøkende midler i et vandig medium. Eksempler på midler brukt for å øke viskositeten er polyvinylalkohol, cellulosederivater, polyvinylpyrrolidon, polysorbater eller glycerin. Konserveringsmidler mot mikrober som tilsettes, kan omfatte benzalkoniumklorid, thimerosal, klorbutanol eller fenyletylalkohol.

I tillegg kan forbindelsene fremstillet ifølge oppfinnelsen administreres som stikkpiller.

Som angitt tidligere, hemmer forbindelsene fremstillet ifølge oppfinnelsen, den enzymatiske virkning av HIV-l-RT. Basert på testing av disse forbindelser som beskrevet nedenfor, er det kjent at de hemmer den RNA-avhengige DNA-polymerase-aktivitet av HIV-RT. Basert på andre undersøkelser, ikke beskrevet her, antas det at de også hemmer den DNA-avhengige DNA-polymerase-aktivitet til HIV-RT.

Ved bruk av "Reverse Transcriptase (RT) Assay" beskrevet nedenfor, kan forbindelser testes med hensyn på deres evne til å hemme den RNA-avhengige DNA-polymerase-aktiviteten til HIV-RT. Visse spesifikke forbindelser beskrevet i eksemplene som forekommer nedenfor, ble testet på denne måten. Resultatene av denne testingen er oppført i Tabell I nedenfor.

" Reverse Transcriptase ( RT) Assay" Analyse-teori: Blant enzymene som Human Immunodefiency Virus (HIV-1) koder for, er en revers transcriptase (1), kalt slik for det det transkriberer en DNA-kopi fra et RNA-mønster. Denne aktiviteten kan kvantitativt måles i en cellefri enzymanalyse som er tidligere beskrevet (2) og er basert 'på observasjonen

at den reverse transcriptase er i stand til å benytte et syntetisk mønster [poly r(C) forsynt med oligo d(G)] for å transkribere en radioaktivt merket, DNA-tråd som kan felles ut med syre, ved bruk av <3>H-dGTP som substrat.

Materialer:

a) Tilberedning av enzymet

Revers transcriptase-enzym fra LAV-stamme av Human

Immunodeficiency Virus (HIV-1) (1) ble isolert fra bakterie-stammen JM109 (3) som uttrykker DNA-klon pBRTprtl+ (2) som er under kontroll av lac-promotoren i ekspresjonsvektoren pIBI21 (4) . En kultur dyrket over natten i 2XYT-medium (37°C, 225 rpm) (5) tilsatt 100 iig/ ml ampicillin for positiv utvelgelse, inokuleres med en 1:40 fortynning i M9-medium tilsatt 10 jug/ml tiamin, 0,5% casaminosyre, og 50 jug/ml ampicillin (5). Kulturen inkuberes (37°C, 225 rpm) inntil den når en OD540 på 0,3-0,4. På dette tidspunkt tilsettes repressor-inhibitoren IPTG (isopropyl b-D-tiogalaktopyranosid) til 0,5 mM og inkuberes i ytterligere 2 timer. Bakteriene pelleteres, suspenderes på ny i en 50 mM Tris, 0,6 mM ETDA, 0,375M NaCl-buffer og løses opp ved tilsetning av lysozyme (1 mg/ml) i 30 minutter på is. Cellene "lyses" ved tilsetning til 0,2% NP-40 og bringes til IM NaCl.

Etter fjerning av uoppløselig avfallsstoff ved sentri-fugering, bunnfelles proteinet ved tilsetning av 3 volum mettet vandig ammoniumsulfat. Enzymet pelleteres, løses opp på ny i RT-buffer (50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,1% NP-40, 0,1M NaCl og 50% glycerol) og lagres ved -70°C for videre bruk.

b) Sammensetning av 2X konsentrert blanding av stam-reagenser.

Analyse-fremgangsmåte:

Den 2X konsentrerte stam-reagens-blanding porsjoneres ut og lagres ved -20°C. Blandingen er stabil og smeltes til bruk i hver analyse. Denne enzym-analysen er tilpasset til et mikro-titer platesystem med 96 hull og er tidligere beskrevet (6). Tris-buffer (50 mM, pH 7,4), hjelpestoff (oppløsningsmiddel fortynnet for å tilsvare forbindelsens fortynning) eller forbindelser i hjelpestoff, fylles i mikrotiterplater med 96 hull (10 /Jl/hull; 3 hull/forbindelse). HIV-RT-enzymet smeltes, fortynnes i 50 mM Tris pH 7,4 slik at 15 /il fortynnet enzym inneholder 0,001 enhet (en enhet er den mengde enzym som transformerer et mikromol substrat per minutt ved 25°C) og 15 /xl fylles i hvert hull. 20 fil 0,12-0,5M EDTA tilsettes til de første tre hull på mikrotiterplaten. EDTA kompleksbinder Mg"<*>-<1>" som er tilstede og forhindrer revers transkripsjon. Denne gruppen tjener som bakgrunnspolymerisering som trekkes fra alle andre grupper. 25 jul av 2X reaksjonsblanding tilsettes til alle hull og analysen får inkuberes ved romtemperatur i 60 minutter. Analysen avsluttes ved å felle ut DNA i alle hull med 50 jlaI 10% trikloreddiksyre (TCA) i 1% natriumpyrofosfat. Mikrotiterplaten inkuberes i 15 minutter ved 4°C og bunnfallet fikseres på #30 glassfiberpapir (Schleicher & Schuell) ved bruk av en Skatron halv-automatisk "harvester". Filtrene vaskes deretter med ytterligere 5% TCA som inneholder 1% natriumpyrofosfat, renses med 70% vandig etanol, tørres og overføres til scintillasjonsrør (6). Hvert rør mottar 2 ml scintillasjonsblanding og telles i en Beckman beta-teller.

Beregning av prosent hemming skjer på følgende måte:

Referanser:

1. Benn, S., et al., SCIENCE 230:949, 1985

2. Farmerie, W.G., et al., SCIENCE 236:305, 1987.

3. Yanisch-Perron, C., Viera, J., and Messing, J., GENE 33:103, 1985 4. International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT 06535 5. Maniatis, T., Fritsch, E.F., and J. Sambrook, eds. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring

Harbor Laboratory, 1982

6. Spira, T., et al., J. Clinical Microbiology, 25:97, 1987.

For å bekrefte at forbindelsene som er aktive i RT-analysen også har evnen til å hemme HIV-formering i et levende system, ble forbindelser fremstillet ifølge oppfinnelsen også testet ved "Human T-cell Culture Assay" beskrevet nedenfor. Resultatene av denne test er oppført i Tabell I.

Human T- cell Culture Assay

Analyse-teori:

Dannelse av syncytia er et trekk ved in vitro kulturer av CD4+ T-celler infisert med HIV-1. I denne analysen behandles T-celler med en antatt formeringshemmende forbindelse og infiseres deretter med HIV-1. Etter inkubering undersøkes kulturen med hensyn på dannelse av syncytia. Fravær eller reduksjon i antall syncytia benyttes som et mål på test-forbindelsens evne til å hemme HIV-formering.

Analyse-metode:

Målcellene betegnet C8166, er en underklon av humane lymfomceller av T-celle-opprinnelse og plasseres med en opprinnelig tetthet på 5x10<*> per 100 pl i RPMI 1640 (+ 10% oksefosterserum) kulturmedium i flatbunnede plater med 96 hull. En valgt mengde testforbindelse løst opp i DMSO inkluderes. Etter 24 timer inokuleres hver kultur med 50-100 TCID50 (dosen som resulterer i påført virkning i 50% av testkulturene) av HTLV-IIIB stammen av HIV-1 (2). Kontrollkulturer får bare forbindelse eller virus. 4 dager etter virus-utfordringen, undersøkes kulturene visuelt med hensyn på hyppighet og fordeling av virus-bevirket kjempecelle-syncytia. Prosent hemming ved testforbindelsen bestemmes ved sammenligning med kontrollverdier. Bekreftelse av forekomst eller fravær av virus-formering gjøres ved å høste den cellefrie dyrkningsvæske fra alle eksperimentgrupper for å bestemme forekomst eller fravær av infiserende åvkom gjennom bevirkning av syncytia-dannelse i sekundære humane T-cellekulturer etter 3 dager.

Referanser:

(1) M. Somasundaran and H.L. Robinson, Science, 242, 1554

(1998) (2) G.M. Shaw, R.H. Hahn, S.K. Arya, J.E. Groopman, R.C. Gallo and F. Wong-Staal, Science, 226, 1165 (1984).

For å bedømme den spesifikke virkning av de enzym-hemmende forbindelser fremstillet ifølge oppfinnelsen, ble noen testet ved bruk av analysemetoder kjent i og for seg for deres evne til hemme "Feline Leukemia Virus"-avledet revers transcriptase og "Calf Thymus"-avledet DNA alfa-polymerase. Ingen av forbindelsene som ble slik testet kunne observeres å ha noen hemmende virkning overfor disse enzymer. Disse resultater indikerer at den enzym-hemmende virkning av disse forbindelser fremstillet ifølge oppfinnelsen, er rettet ganske spesifikt mot HIV-RT.

For løselig å anslå cytotoksisiteten til forbindelsene fremstillet ifølge oppfinnelsen, ble flere slike forbindelser testet i "MTT Cellular Cytotoxicity Assay" beskrevet nedenfor. Resultatene av denne testing er rapportert i Tabell I nedenfor. Forbindelser som har en ganske høy EC50 foretrekkes.

" MTT ASSAY FOR CELLULAR CYTOTOXICITY"

Analyse-teori:

MTT [3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid)-analyse er basert på spalting av tetrazoliumbromid av metabolsk aktive celler som resulterer i en meget kvantitativ blå farve. Denne analysen er tidligere beskrevet (1) men er blitt optimalisert med hensyn på testingen rapportert her. Analyse-metode: H9 cellelinjen (2), en etablert human lymfom-suspensjon-cellelinje dyrket i RPMI 1640 tilsatt 10% oksefosterserum, brukes som målcellelinje i analysen. Cellene (100 /il) settes på plater i mikrotest-platehull ved en konsentrasjon på 10<5 >celler per ml i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av inhibitor. Cellene inkuberes ved 3 7°C i en fuktig C02-inkubator. 5 dager senere, tilsettes 2 0 /il MTT (5 mg/ml) i RMPI 1640, "sonic"-behandlet, 0,2 mikron filtrert og lagret ved 4°C) til hvert hull. Etter 4 timers ytterligere inkubering ved 37°C, tilsettes 60 /il Triton-X til hvert hull og blandes omhyggelig for å hjelpe oppløsning av krystallene. Absolutt etanol (5 /il) inkuberes i 30 minutter ved 60°C og leses umiddelbart på en plate-leser (Dynatech) ved en bølgelengde på 570 nm.

Data fra denne analyse er brukt for å gi en ikke-lineær regresjonsanalyse som gir en EC50.

Referanser:

1. Mosmann, Tim, J. Immunol. Methods, 65:55, 198 3.

2. Jacobs, J.P., J. Nati. Cancer Inst., 34:231, 1965.

De følgende eksempler illustrerer videre den foreliggende oppfinnelse og vil sette andre som har fagkunnskap i stand til å forstå den mer fullstendig. Det må imidlertid være klart at oppfinnelsen ikke er begrenset til de spesielle eksempler som er gitt nedenfor.

Eksempel 1

5- ll- dihvdro- ll- etvl- 5- metvl- 6H- dipvridor3. 2- b:2'. 3'- el r 1. 41-diazepin- 6- tion

En blanding av 2,66 g (0,01 mol) 5,ll-dihydro-ll-etyl-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][l,4]diazepin-6-on og 2,10 g (0,005 mol) Lawesson's reagens (2,4-bis(4-metoksyfenyl)-1,3-ditia-2,4-difosfetan-2,4-disulfid) i 50 ml toluen ble tilbake-løpsbehandlet i 2,5 timer. Oppløsningsmidlet ble deretter fjernet i vakuum og vann ble tilsatt til resten. Produktet ble ekstrahert med etylacetat, tørret (vannfritt natriumsulfat) og konsentrert i vakuum. Rensing ble gjennomført på en silikagel-kolonne med bruk av metylenklorid til første utvasking, fulgt av etylacetat/heksan (1:4). Fjerning av oppløsningsmidlet i vakuum ga 2,20 g (74% av teoretisk) av 5,ll-dihydro-ll-etyl-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-tion som et gult pulver, som ble omkrystallisert fra 10% heksan/etylacetat og ga 1,1 g gule nåler, smp. 157-158°C.

Den resulterende forbindelse ble testet ved bruk av "Revers Transcriptase Inhibition Assay" (ved 10 jig/ml) og "T-cell Culture Assay" (ved 3 /xg/ml) og viste 100% hemming i begge tester.

Fremstilling av utgangsforbindelse

5. ll- dihydro- 6H- dipyrido r 3, 2- b:2', 3'- 41[ 1 . 41diazepin- 6- on

a) 2- klor- N-( 2- klor- 3- pyridinyl)- 3- pvridinkarboksamid

I en trehalset rundkolbe utstyrt med en effektiv tilbake-løpskjøler, mekanisk rører og dryppetrakt, ble det fylt 215 g (1,672 mol) 3-amino-2-klorpyridin løst opp i en blanding av 4 00 ml dioksan, 500 ml cykloheksan og 130 ml pyridin. Opp-løsningen av 299,2 g (1,7 mol) nyfremstillet 2-klor-3-pyridin-karboksylsyreklorid i 200 ml dioksan ble tilsatt med en slik hastighet at den kraftige reaksjonen ble holdt under kontroll. Deretter fikk reaksjonsblandingen kjølne til romtemperatur, og det resulterende krystallinske bunnfall ble filtrert fra og vasket etter tur med cykloheksan og eter.

Det mørkebrune produkt ble løst opp i 5 1 3% vandig oppløsning av natriumhydroksyd. Den resulterende oppløsning ble behandlet med trekull, filtrert med sug og filtratet surgjort ved tilsetning av 50% vandig eddiksyre. Det resulterende bunnfall ble samlet ved filtrering og vasket omhyggelig med vann. Etter tørring over natten i en strøm av nitrogen ved romtemperatur, hadde det nesten farveløse produkt et smeltepunkt på 156-159°C og var tilstrekkelig rent til videre omsetninger. Utbyttet var 376,0 g (84% av teoretisk).

b) N-( 2- klor- 3- pyridinyl)-2-r f( 4- metoksyfenvl) metyl] aminol-3- pyridinkarboksamid

13,4 g (0,05 mol) av produktet fremstillet i trinn a), ble løst opp i 20 ml xylen og den resulterende oppløsning ble blandet med 13,8 g (0,1 mol) p-metoksybenzylamin. Deretter ble blandingen tilbakeløpsbehandlet i 2 timer. Reaksjonsblandingen ble deretter dampet inn i vakuum, og resten ble renset ved kolonnekromatofering på silikagel (0,2-0,5 mm) med bruk av diklormetan/etylacetat 10/1 (vol/vol) til utvasking. Farveløse krystaller som smeltet ved 122-124°C (etter omkrystallisering fra acetonitril). Utbyttet var 17,2 g (93% av teoretisk).

c) 5, 11- dihydro- ll- r( 4- metoksyfenyl) metyl]- 6H- dipyrido-T3, 2- b:2', 3'- el r 1, 4] diazepin- 6- on

16,7 g (0,0453 mol) av produktet dannet i trinn b), ble løst opp i 150 ml absolutt dioksan og den resulterende oppløsning ble blandet med 6,7 g (0,14 mol) av en 50% dispersjon av natriumhydrid i mineralolje.

Deretter ble blandingen, mens den ble beskyttet mot ytre atmosfære av en lav strøm av nitrogen, tilbakeløpsbehandlet inntil intet utgangsmateriale kunne påvises ved TLC. Overskudd av natriumhydrid ble dekomponert ved forsiktig tilsetning av 10 ml av en blanding av metanol og tetrahydrofuran (50/50 vol/vol). Reaksjonsblandingen ble nøytralisert ved tilsetning av eddiksyre og ble deretter dampet inn i vakuum. Resten ble renset ved kolonnekromatografering på silikagel (0,2-0,5 mm) ved bruk av etter tur diklormetan/etylacetat 10/1 (vol/vol) og diklormetan/etylacetat 1/1 (vol/vol) til utvasking. Det krystallinske produkt dannet ved inndampning av passende fraksjoner, ble omkrystallisert fra acetonitril og 2-propanol. Produktet hadde et smeltepunkt på 213-215°C og ble identifisert som 5,11-dihydro-ll-[(4-metoksyfenyl)metyl]-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on. Utbyttet var 10,3 g (68% av teoretisk). RF 0,7 (Macherey-Nagel, Polygram<*> SIL G/UV254, ferdig belagte plastark for TLC; diklormetan/etylacetat 1/1 vol/vol).

d) 5, ll- dihvdro- 6H- dipyridor3, 2- b:2', 3'-e] fl, 4] diazepin- 6- on 10,0 g (0,3 mol) av produktet dannet i trinn c), ble løst

opp i 50 ml trifluoreddiksyre, hvorved blandingen ble litt varm. Deretter ble reaksjonsblandingen rørt ved 60°C i 1 time. Intet utgangsmateriale kunne påvises ved TLC på det tidspunkt. Blandingen ble deretter dampet inn .i vakuum. Resten som således fremkom ble omhyggelig rørt med 0,5% vandig ammoniakk og ble deretter filtrert med sug. Det urene produkt ble omkrystallisert fra 150 ml dimetylsulfoksyd og ga farveløse krystaller med smp. >340°C. Utbyttet var 4,8 g (75% av teoretisk).

Produktet ble identifisert som 5,ll-dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on.

e) Etter trinn c), kan 10 g av den resulterende forbindelse i stedet omsettes med trifluoreddiksyre, røres i 1 time ved

romtemperatur, syren fjernes i vakuum og resten røres i 1 time med 0,3% ammoniakk. Det faste stoff ble filtrert fra og tørret og ga 6,7 g av det 5-metyl-substituerte derivat.

2,0 g av en 50% dispersjon av NaH i mineralolje ble

tilsatt til 5,75 g av 5-metyl-derivatet i 100 ml dimetylformamid. Etter at hydrogenutviklingen stoppet, ble blandingen varmet til 50°C i 30 minutter og blandingen ble rørt over natten ved romtemperatur. Overskudd av natriumhydrid ble dekomponert ved tilsetning av is fulgt av vann. Produktet ble ekstrahert med eter, tørret (vannfritt natriumsulfat) og dampet inn og ga 4,5 g 5,ll-dihydro-ll-etyl-5-metyl-6H-dipyrido[3,2-b:2<»>,3'-e][1,4]diazepin-6-on, smp. 130-132°C.

De følgende forbindelser ble fremstillet analogt med Eksempel 1 (fremstilling av utgangsmaterialer) og ifølge fremgangsmåtene C og D (for Z = 0) og analogt med Eksempel 1 (fremgangsmåte E) (for Z = S), og ble testet med bruk av "Reverse Transcription Inhibitory Assay" beskrevet ovenfor.

Z er et oksygenatom hvis ikke forbindelsen er angitt å være et tiolaktam.

Forbindelsene er ikke-substituert i 2, 3, 4, 7, 8 og 9-posisjonene hvis ikke annet er angitt i kolonnen med overskrift "Annet".

Eksempel A

Kapsler eller tabletter

Forbindelsene fra Eksempel 2 blandes i en pulverblanding med de på forhånd blandede tilsetningsmaterialer som angitt ovenfor, bortsett fra smøremidlet. Smøremidlet blandes deretter i og den resulterende blanding presses til tabletter eller fylles i hårde gelatinkapsler.

Eksempel B

Parenterale oppløsninger

Tilsetningsmaterialene blandes med vannet og deretter tilsettes den aktive forbindelse. Blandingen fortsetter inntil oppløsningen er klar. pH i denne oppløsning justeres til 3,0 og den filtreres deretter i passende rør eller ampuller og steriliseres ved autoklavering.

Eksempel C

Oppløsninger til nese

Tilsetningsstoffene blandes med vannet og deretter tilsettes den aktive forbindelse og blandingen fortsetter inntil oppløsningen er klar. pH i denne oppløsning justeres til 4,0 og deretter filtreres den i passende rør eller ampuller.

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive forbindelse med formel der Z er oksygen eller svovel; R<1> er hydrogen, alkyl med 1 til 5 karbonatomer, fenylmetyl, alkanoyl med 2 til 3 karbonatomer eller alkyltioalkyl med 2 til 4 karbonatomer; R2 er hydrogen, alkyl eller fluoralkyl med 1 til 5 karbonatomer, alkenyl eller alkynyl med 2 til 5 karbonatomer, alkyltioalkyl med 2 til 4 karbonatomer, alkanoyl med 2 til 4 karbonatomer, fenylmetyl (som enten er ikke-substituert eller substituert med alkoksy med 1 til 3 karbonatomer eller halogen), eller fenyl; og R3 til R<8> alle er hydrogen; eller en av R3 til R8 er alkyl med 1 til 4 karbonatomer, alkoksy med 1 til 4 karbonatomer, nitro, hydroksyl, amino, monoalkyl-aminoalkyl der alkyl-enheten inneholder 1 til 2 karbonatomer, eller halogen, med de andre fem substituenter som hydrogen; eller et farmasøytisk godtagbart syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved A for fremstilling av forbindelser i samsvar formel I der R<2 > er forskjellig fra hydrogen, ringdannelse i et karboksylsyreamid med den generelle formel II der R<1> og R3 til R<8> har de samme betydninger som angitt med hensyn til formel I og R<2>' har de samme definisjoner som R2 bortsett fra hydrogen, B for fremstilling av forbindelser i samsvar med formel Ib der R<1> og R3 til R<8> har de samme betydninger som angitt med hensyn til formel I, hydrolytisk spaltning av arylmetylgruppen i en forbindelse med generell formel III der R<1> og R<3> til R<8> er som definert ovenfor og Ar er en fenyl- eller 4-metoksyfenylgruppe, C for fremstilling av forbindelser i samsvar med formel I der R<2> til R<8> er som definert med hensyn til formel I og R<1> er forskjellig fra hydrogen, overføring av et 5,11-dihydro-6H-dipyrido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-on med formel IV der R<2> til R<8> er som definert ovenfor, til de tilsvarende 5-alkali- eller jordalkalimetallforbindelser med påfølgende omsetning av alkalimetallforbindelsen med en reaktiv ester med formel V der R<1>' har de samme definisjoner som for R<1> bortsett fra hydrogen og X er radikalet av en reaktiv ester, et halogenatom, gruppen OSOgOR<1>', metansulfonyloksy- eller etansulfonyloksygruppe eller en aromatisk sulfonyloksygruppe, og deretter isolering av forbindelsen med formel I som den er eller som et farmasøytisk godtagbart syreaddisjonssalt derav.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 for fremstilling av forbindelser med formel I der Z er oksygen eller svovel; R<1> er hydrogen eller alkyl med 1 til 4 karbonatomer; R<2> er rett eller forgrenet alkyl eller fluoralkyl med 1 til 4 karbonatomer, allyl eller benzyl og R<3> til R<9> er alle hydrogen; eller et farmasøytisk godtagbart syreaddisjonssalt derav, karakterisert ved bruk av tilsvarende utgangsmaterialer.