NO170768B - Fremgangsmaate ved dyrking av cellekulturer i bioreaktor - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår dyrking av cellekulturer i bioreaktor med sikte på å oppnå lengre levetid av kulturen og dermed høyere produktkonsentrasjon i reaktoren.

Tradisjonelt har strategien ved optimalisering av dyrkingsbetingelser for celler vært som ved mikrobielle fermenteringer, dvs. optimalisering og manipulering av parametre som: oppløst oksygen (DO), pH, energikilder (f.eks. glukose), karbonkilde og føding (tilførsel av friskt medium).

For å kunne oppnå høy produktkonsentrasjon i bioreaktorer, er det vanlig å benytte perfusjonskulturer der forbrukt medium erstattes av friskt medium som inneholder de næringsstoffer cellene trenger. For å hindre at celler som finnes fritt i mediet blir med ut av reaktoren, benyttes ofte mikroporøse membraner.Benyttes ultrafiltreringsmembraner, kan man også oppnå å holde produktet (f.eks. monoklonalt antistoff) tilbake i reaktoren. På denne måten kan en oppnå høyere produktkonsentrasjoner i en slik perfusjonskultur. For å kunne oppnå høyest mulig produktkonsentrasjon, vil en ofte tilstrebe så høye celletettheter og så lang levetid for kulturen som mulig.

Cellenes metabolisme eller stoffskifte produserer avfallsstoffer. Dette kan være stoffer som delvis hemmer kulturens videre vekst, delvis direkte toksiske substanser.

Avfallsstoffer fra cellene kan fjernes samtidig som nytt medium tilsettes over en og samme membran. Dette kalles dialyse. Erfaringene viser at celle- og produkt-konsentrasjonen i slike perfusjons-systemer kan bli adskillig høyere enn i batch-kulturer, f.eks. 2-10 ganger høyere.

Europeisk patentsøknad (EPs) nr. 270.908 (Bayer AG) omhandler en fremgangsmåte og en anordning for å dyrke celler i en suspensjonskultur. Fremgangsmåten omfatter utskifting av medium ved ultrafiltrering over en mikroporøs membran.

EPs 224.800 (Boehringer Mannheim GmbH) beskriver en fremgangsmåte og en anordning for å dyrke celler i en reaktor. Tilsetting av næringsstoffer og fjerning av avfallprodukter skjer over en semipermeabel membran, som slipper disse komponentene gjennom, men som ikke slipper gjennom de mer høy-molekylære bestanddeler i dyrkingsmediet.

US patent nr. 4.722.902 omhandler en fremgangsmåte og et apparat for å dyrke celler i en sløyfe (loop) hvor cellenes avfallsprodukter fjernes og produktet blir konsentrert. Et reservoir av friskt medium står i kontakt med nevnte sløyfe, som innbefatter et overføringsorgan i form av en semipermeabel membran.

De ovennevnte publikasjoner har det tosidige formål med membranen på den ene side å tilføre friskt medium, og på den andre side å fjerne avfallsstoffer fra cellekulturen.

EPs nr 219.791 (Hitachi Ltd.) omhandler en fremgangsmåte for dyrking av rekombinante celler med kompleks DNA. I patentet er fjerning av stoffer som hindrer cellevekst, spesielt eddiksyre, nevnt som ett av flere alternative trekk, likeledes fjerning av stoffer som hindrer dannelse av ønsket produkt, jfr. krav 1. Bruk av permeabel membran, ultrafiltermembran (for stoffer med lav molekylvekt), samt ioneveksling er foreslått for å fjerne de uønskede substanser, jfr. kol. 6, linje 42-47.

Membranutveksling er basert på diffusjon, noe som krever lang tid og stort volum friskt medium i forhold til reaktorvolum for å oppnå effektiv fjerning av substansene. Membranene er dessuten gjerne skjøre, slik at brudd eller lekkasjer ofte opptrer. Filtreringsenhetene er dyre, og kan som oftest bare brukes en gang. Videre oppstår gjerne adsorpsjon av proteiner (og celler) til filteret med den følge at filteret tettes. Generelt kan det sies at bruk av membran er rimelig velegnet til å tilføre friskt medium, men lite egnet til effektivt å fjerne avfallsstoffer.

Den største ulempen ved membranutveksling som metode ved dyrking for kommersielle formål, er imidlertid begrensningen i størrelse for reaktorsystemet. Reaktorer som benytter dialyse er bare mulig å realisere i ca. 1-10 - liters størrelse. Slike reaktorer kjøres gjerne kontinuerlig i noen måneder for å få et best mulig produktutbytte.

Anvendelse av ioneveksler som nevnt i EPs nr. 219.791, forutsetter at de uønskede stoffer binder seg til kolonnen med forskjellig styrke i forhold til produkt og vekstfaktorer. Metoden har derfor begrenset anvendbarhet.

Ingen av de ovennevnte publikasjoner beskriver noen metode for dyrking av celler i en storskala bioreaktor som gjør det mulig å effektivt fjerne uønskede substanser tilnærmet kvantitativt samtidig som vekstfaktorer og produkt blir holdt tilbake eller resirkulert.

En undersøkelse utført av Lindberg og Rønning: "Production of an inhibitory factor by hybridoma celles grown in vi tro", 1988, indikerer at i forbindelse med dyrking av hybridomceller, stanser celleveksten i hovedsak fordi cellene produserer veksthemmende substanser. Ved dyrking bl.a. av slike celler er det derfor av stor betydning å fjerne de veksthemmende substanser.

De ovenfor omtalte publikasjoner viser at det har skjedd en utvikling fra å legge hovedvekten på å regulere de tradisjonelle parametre til i større grad å ta hensyn til det problem som oppkonsentrering av avfallsstoffer i reaktoren innebærer.

Til tross for denne utviklingen, er det såvidt vites ennå ikke foreslått noen metode som er virkelig effektiv mht. å fjerne slike avfallsstoffer fra storskala bioreaktorer.

Foreliggende oppfinnelse har således det formål å komme frem til en metode ved dyrking av celler i en storskala bioreaktor hvor man unngår at cellene dør, ved å fjerne de veksthemmende substanser fra dyrkingsmediet i reaktoren vesentlig mer effektivt enn etter hittil kjente metoder.

I forbindelse med fjerning av lavmolekylære forurensninger fra makro-molekylløsninger, samt ved bufferskift på slike løsninger, er det kjent å benytte såkalte gelfiltreringskolonner. Når en komponentblanding passerer gjennom en slik kolonne, vil de høymolekylære komponenter passere raskere gjennom enn de lavmolekylære, slik at disse kan skilles fra hverandre.

Foreliggende oppfinnelse er basert på erkjennelsen av at de veksthemmende stoffene i hovedsak er relativt lavmolekylære, og vesentlig mindre enn produktet og vekstfaktorene i reaktoren. Oppfinnelsen går således ut på at gel-filtreringsprinsippet lar seg benytte i kombinasjon med dyrking av celler i en storskalabioraktor, med det formål å oppnå en dramatisk forbedring av produk-sjonsskala og dermed produktutbytte i slike reaktorer. Typisk molekylvekt, Mw, for de veksthemmende stoffene er mindre enn 5000 Dalton, selv om det også kan forekomme veksthemmende stoffer med vesentlig høyere molekylvekt. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte ved dyrking av cellekulturer i bioreaktor, kjennetegnet ved at mediet etter behov ledes gjennom en gelfiltreringskolonne for å skille de relativt lavmolekylære, uønskede substanser fra de relativt høymolekylære vekstfaktorer samt produktet, idet cellene holdes tilbake i reaktoren, og idet fraksjonen av høymolekylære substanser tilbakeføres fra kolonnen til reaktoren i basalt medium som kolonnen på forhånd ekvilibreres med, slik at lavmolekylære næringsstoffer som fraskilles i kolonnen sammen med de uønskede substanser blir erstattet, mens den lavmolekylære fraksjon som vesentlig inneholder de uønskede substanser, blir ført vekk fra reaktoren.

Cellene kan holdes tilbake i reaktoren ved at de enten immobiliseres i mikro-carriers, gelkuler eller keramiske kuler, eller ved hjelp av spinnfilter av stål, kontinuerlig sentrifugering, mikroporøs membran eller innkapslingsteknikker. Hvilken metode som foretrekkes i det enkelte tilfelle, vil kunne variere bl.a. etter størrelse på reaktoren m.m.

Fordelene med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at man kan benytte bioreaktorer med størrelse inntil flere tusen liter og likevel oppnå høy produktkonsentrasjon, ved at man får en nær fullstendig fjerning av uønskede substanser på kort tid og dermed lang levetid for kulturen.

Teknikken er pålitelig, og billig i bruk. En kolonne kan brukes minst 1000 ganger eller 1-2 år uten ompakking. Gelen kan brukes om igjen etter ompakking, og det skjer minimal adsorpsjon av makromolekyler til gelmaterialet. Vekstfaktorene returneres til reaktoren sammen med produktet etter kolonnebehandlingen, og trenger derfor ikke erstattes.

Fremgangsmåten lar seg anvende for de forskjelligste cellekulturer, så som hybridomceller, gjærsopp, mikroorganismer og rekombinante celler.

Oppfinnelsen innebærer således et skifte i størrelsesorden for produksjon i bioreaktorer med fjerning av uønskede substanser, med den følge at produkter som fremstilles i slike reaktorer - så som monoklonale antistoffer, rekombinante og naturlige forekommende produkter - kan fremstilles til vesentlig redusert kostnad.

En utførelsesform av oppfinnelsen er i det følgende beskrevet nærmere under henvisning til figurene. Figur 1 viser skjematisk en apparatoppstilling egnet til bruk ved utførelse av fremgangsmåten ifølge opfinnelsen. Figur 2 viser forskjell i viabilitet for cellekulturer dyrket med og uten hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte.

En gelfiltreringskolonne (1) kobles til en bioreaktor (2). Væske føres til toppen av kolonnen enten fra bioreaktoren eller fra et reservoir (3) med basalt medium (uten serum og vekstfaktorer) avhengig av innstillingen på en ventil (4). En pumpe (5) driver væskestrømmen. Fra bunnen av kolonnen føres væsken enten tilbake til bioreaktoren (2) eller til et avfallsreservoir (6), avhengig av innstillingen på en ventil (7). Hele prosessen kan gjøres personuavhengig ved at pumpe og ventiler styres automatisk, f.eks. ved hjelp av en mikroprosessorenhet (8).

I gelfiltreringskolonnen er hastigheten til molekylene avhengig av molekyl-vekten. Store molekyler passerer raskere enn små, slik at makromolekyl-fraksjonen kommer ut først, og blir returnert til bioreaktoren, mens små-molekylfraksjonen blir ført til avfallsreservoiret.

En slik gruppeseparering i kun to fraksjoner krever vanligvis et kolonnevolum på ca. 3 ggr. volumet av mediet som påsettes kolonnen. Dette innebærer at man unngår noen merkbar fortynning ved kolonnebehandlingen, idet tilnærmet samme volum tilbakeføres til reaktoren som det volum som gikk ut. I forbindelse med produksjon av monoklonalt antistoff, vil kolonnen typisk være pakket med en gel som retarderer molekyler mindre enn ca. 5000 Dalton.

Kolonnen er på forhånd ekvilibrert med basalt medium, slik at makromolekyl-fraksjonen blir eluert i dette før den blir returnert til bioreaktoren. På denne måten blir nytt basalt medium tilført cellekulturen.

Det er gjort forsøk med produksjon av monoklonale antistoffer av hybridomceller in vi tro. Typiske celletettheter i batchkul turer er 1-5 millioner/ml, og med antistoffkonsentrasjoner på 10-100 ug/ml. Når levetiden på en batchkultur økes, øker antistoffkonsentrasjonen tilsvarende.

Mediet behandles ved hjelp av gelfiltreringskolonnen når celletettheten er maksimal, etter typisk 5-7 dager.

Eksempel:

En hybridomcellelinje ble dyrket i Dulbeccos modifiserte eagles medium (DMEM) tilsatt Na-pyruvat, L-glutamine, kanamycin samt 15% føtalt kalveserum (FCS). Cellene ble dyrket i stillestående kulturer å 200 ml ved 37°C og 5% CO2. Celletettheten ved utsåing var 100.000 celler/ml. Da celletettheten etter 5 dager hadde nådd 3 mill. celler/ml, ble mediet fjernet og sentrifugert i 5 min. ved 300 x g (g=jordgravitasjonen) for å fjerne cellene. Cellene ble ført tilbake til flasken i 30 ml medium. Resten av mediet, 170 ml, ble kjørt gjennom en kolonne (Pharmacia, 50/50, Sephadex G-25, 430 ml gel, 7 ml/min). Kolonnen var på forhånd ekvilibrert med DMEM. Etter at mediet fra cellene var satt på, ble kolonnen eluert med DMEM. Optisk tetthet (OD) ved 280 mm ble registrert i eluatet, og den delen av eluatet (170 ml) som absorberte mer enn 1/2 ODmax ble tilsatt samme flaske som mediet opprinnelig ble tatt fra. Cellenes viabilitet ble målt med MTT testen, og etter 8 døgn ble konsentrasjonen av antistoff i mediet målt med ELISA. For sammenligning ble det preparert en flaske med samme celletall, der mediet ikke ble gelfiltrert.

Figur 2 viser viabiliteten i kulturen med hybridomceller dyrket i medium som beskrevet over, som funksjon av antall dager etter gelfiltrering. Kulturen med gelfiltrert medium (heltrukket linje) har vesentlig høyere viabilitet enn den andre gjennom hele dyrkingsperioden.

Tabell 1 (neste side) viser at innholdet av monoklonalt antistoff er omlag dobbelt så høyt i kulturene hvor mediet ble gelfiltrert sammenlignet med ubehandlet medium. Tabellen viser gjennomsnitt og standardavvik for tre forsøk.

Ved den dyrkingsprosess som oppfinnelsen beskriver, kan en altså oppnå dobbelt så høyt utbytte av antistoff sammenlignet med en cellekultur dyrket som batchkultur.

Ved å la mediet passere gjennom en gelfiltreringskolonne på omlag 3 ggr. reaktorvolumet, slik oppfinnelsen beskriver, vil det være mulig å hente ut dobbelt så mye antistoff som ved tradisjonelle batchdyrkinger. Oppfinnelsen representerer derfor en mulighet f.eks. for produsenter av monoklonalt antistoff som har basert seg på relativt store dyrkingstanker til å gjøre prosessen mer lønnsom. Mens høyproduktive systemer hittil har vært forbeholdt produsenter som benytter de volummessig svært mye mindre perfusjonssystemene, kan det samme nå oppnås også for storskala bioreaktorer.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved dyrking av cellekulturer i bioreaktor, karakterisert ved at mediet etter behov ledes gjennom en gelfiltreringskolonne for å skille de relativt lavmolekylære, uønskede substanser med typisk molekylvekt mindre enn 5000 Dalton fra de mer høymolekylære vekstfaktorer med molekylvekt typisk større enn 5000 Dalton samt produkter, idet cellene holdes tilbake i reaktoren, og idet fraksjonen av høymolekylære substanser tilbakeføres fra kolonnen til reaktoren i basalt medium som kolonnen på forhånd ekvilibreres med, slik at lavmolekylære næringsstoffer som fraskilles i kolonnen sammen med de uønskede substanser blir erstattet, mens den lavmolekylære fraksjon som vesentlig inneholder de uønskede substanser, ikke blir tilbakeført til reaktoren. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at cellene holdes tilbake i reaktoren ved hjelp av microcarriers, gelkuler eller keramiske kuler, spinnfilter, kontinuerlig sentrifugering, mikroporøs membran eller innkapslingsteknikker. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som cellekultur benyttes hybridomceller, og at produktet er monoklonalt antistoff. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som cellekultur benyttes rekombinante celler som gir et rekombinant produkt. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som cellekultur benyttes mikroorganismer , og at produktet er et naturlig eller et rekombinant produkt. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som cellekultur benyttes gjærsopp, og at produktet er rekombinante proteiner.