CN102703319A - 贴壁型细胞培养装置及贴壁型细胞培养系统 - Google Patents

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Abstract

一种贴壁型细胞培养装置及贴壁型细胞培养系统。其中，装置包括壳体，该壳体的空腔内水平设置有细胞生长层、过滤层和支撑层，细胞生长层、过滤层、支撑层三者将壳体的内部空腔分割为上部空腔和下部空腔，上部空腔内设置有一个狭长的流道，壳体的上部设置有与该上部空腔连通的进液口和出液口，壳体的下部设置有与该下部空腔连通的透过液口。本发明的装置创造性地将切向流技术与固定床技术有机结合起来，其兼具结构简单、工艺操作简单、生产出的产品质量均一、培养过程容易监控的优点，它能稳定地进行大规模细胞扩增培养。本发明的系统的储液装置能够通过补液控制细胞培养条件，与贴壁型细胞培养装置配合完成整个细胞培养过程。

Description

贴壁型细胞培养装置及贴壁型细胞培养系统
技术领域
本发明具体涉及一种用于大规模体外培养哺乳类动物细胞、昆虫细胞、植物细胞及人类细胞的贴壁型细胞培养装置及贴壁型细胞培养系统。
背景技术
采用大规模体外培养技术培养细胞是生产生物制品的有效方法。20世界60-70年代，用于大规模培养细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术就已创立。近数十年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，采用传统的生物化学技术从动物组织中获取生物制品的量已远远不能满足需求。随着细胞培养的原理与方法日臻完善，细胞大规模培养技术逐渐趋于成熟。
所谓细胞大规模培养技术(large-scale culture technology)是指在人工条件下(设定ph、温度、溶氧等)，在细胞生物反应器(bioreactor)中高密度大量培养用于生产生物制品的动物细胞的技术。目前可大规模培养的细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho(中华仓鼠卵巢)细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，它是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
第一代细胞培养技术使用转瓶(roller bottle)进行贴壁细胞的培养。转瓶培养技术具有劳动强度大、占地空间大、单位体积提供细胞生长的表面积小、细胞生长密度低、产品质量不均一、培养时监测和控制环境条件受限的缺点。随着生物技术的不断发展，迫切需要大规模的细胞培养，特别是培养表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足细胞数量及其分泌产物的需求。
自70年代以来，采用微载体技术培养细胞及其生物反应器(Bioreactor)得到了较快的发展，生物反应器的种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器、中空纤维管反应器、无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。八十年代以来，人们逐渐开始采用微载体技术以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。
动物细胞是一种无细胞壁的真核细胞，生长缓慢，对培养环境十分敏感。采用传统的生物化工技术进行动物细胞大量培养，除了要满足培养过程必需的营养要求外，有必需建立合理的控制模型，进行pH和溶氧(DO)的最佳控制。细胞生物反应器可通过微机有序地定量地控制加入动物细胞培养罐内的空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的流量，使其保持最佳的比例来控制细胞培养液中的pH值和溶氧水平，使系统始终处于最佳状态，以满足动物细胞的生长对pH值和溶解氧的需要。如为提高或达到一定的溶氧水平可改变通入培养罐内气体中氧气和氮气的比例来实现控制DO值的目的。细胞生物反应器采用二氧化碳/碳酸氢钠(CO2/NaHCO3)缓冲液系统来控制培养液的pH值。目前微载体培养广泛应用于培养多种类型细胞，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞，但由于微载体对细胞有一定要求，仍有多种细胞无法采用微载体技术进行培养。
现在，细胞培养技术在规模和可靠性方面都有不断的发展，并且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，人们对细胞培养的态度也已经发生了改变。许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对较大、较复杂或糖基化(glycosylated)的蛋白质来说，细胞培养是首选的生产方式。
60年代初，英国AVRI研究所在贴壁细胞系BHK21中将口蹄疫病毒培养成功后，从最初的200ml和800ml玻璃容器开始，很快就放大到30L和100L不锈钢罐的培养规模。使用的是基于Eagle’s配方的培养基，补充5％成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome(现为Cooper动物保健)集团分布于欧洲、非洲和南美洲8个国家的生产厂商，应用此项技术工业规模化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗，已掌握了5000L的细胞罐大规模培养技术。
目前，国内很多企业仍然采用转瓶技术进行生产，然而由于转瓶技术具有不能大规模制备产品、生产批次间质量差异大、产品无法监控的缺点，新的生产线已经不允许采用转瓶技术。
由于微载体技术工艺操作复杂，对细胞生物反应器的要求高，设备完全依赖进口。目前国内企业对微载体技术的工艺不能完全掌握，只有少数企业可以做到300L的培养规模，国际上也仅有少数企业掌握了1000L以上的培养技术，无法超过5000L的培养规模，严重制约了疫苗及生物工程药物的研究及生产。
发明内容
本发明的目的之一是为了克服现有技术的缺陷，提供一种结构简单、工艺操作简单、生产出的产品质量均一、培养过程容易监控、能满足大规模动物细胞培养的贴壁型细胞培养装置。
本发明的第一目的是通过以下技术方案实现的：一种贴壁型细胞培养装置，包括中部具有空腔的壳体，该壳体的空腔内水平设置有细胞生长层、过滤层和支撑层，细胞生长层位于过滤层的上方，支撑层位于过滤层的下方，细胞生长层、过滤层、支撑层三者将壳体的内部空腔分割为位于细胞生长层的上方的上部空腔和位于支撑层下方的下部空腔，上部空腔内设置有一个狭长的流道，壳体的上部设置有与该上部空腔连通的至少一个进液口和至少一个出液口，下部空腔为透过液流道，所述壳体的下部设置有与该下部空腔连通的至少一个透过液口。
所述壳体的上部空腔内设置有多块纵向的挡板，这些挡板均匀的水平排开，相邻的挡板交错与壳体的左壁、右壁连接，相邻挡板相互平行且相邻挡板之间留有间隙，这些挡板与壳体的内壁之间构成了迂回的狭长的所述流道，所述进液口设置于该流道的起始处，所述出液口设置于该流道的终止处。
所述细胞生长层为细胞亲和性良好的一层或两层以上的疏松多孔结构或所述细胞生长层具有带透液孔的光滑表面。
所述过滤层为设置有过滤孔的细胞截留层，其中，过滤孔的孔径小于40um。
本发明的另一目的在于提供一种贴壁型细胞培养系统。
本发明的另一目的是通过以下技术方案实现的：一种贴壁型细胞培养系统，包括透过液容器、权利要求1-4中所述的贴壁型细胞培养装置以及通过补液调节该贴壁型细胞培养装置的细胞培养条件的储液装置，贴壁型细胞培养装置的透过液口通过管路与透过液容器连接，贴壁型细胞培养装置的出液口通过管路与储液装置的进液口连接，贴壁型细胞培养装置的进液口通过管路与储液装置的出液口连接，贴壁型细胞培养装置与储液装置之间的管路设置有循环泵。
本发明的有益效果是：本发明的贴壁型细胞培养装置创造性地将切向流技术与固定床技术有机结合起来，其兼具结构简单、工艺操作简单、生产出的产品质量均一、培养过程容易监控的优点，它能稳定地进行大规模细胞扩增培养。本发明的贴壁型细胞培养系统的储液装置能够通过补液控制贴壁型细胞培养装置的整个细胞培养过程的培养条件，与贴壁型细胞培养装置配合完成整个细胞培养过程。
附图说明
图1是本发明的整体结构示意图；
图2是本发明的俯视图；
图3是本发明的贴壁型细胞培养系统的结构示意图。
在图1、图2中：1-壳体；2-细胞生长层；3-过滤层；4-支撑层；5-上部空腔；6-流道；7-下部空腔；8-进液口；9-出液口；10-透过液口；11-挡板。
在图3中：12-贴壁型细胞培养装置；13-透过液容器；14-储液装置；15-循环泵。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作详细描述。
如图1所示，一种贴壁型细胞培养装置，包括中部具有空腔的壳体1，该壳体1的空腔内水平设置有细胞生长层2、过滤层3和支撑层4，细胞生长层2位于过滤层3的上方，支撑层4位于过滤层3的下方，细胞生长层2、过滤层3、支撑层4三者将壳体1的内部空腔分割为位于细胞生长层2的上方的上部空腔5和位于支撑层4下方的下部空腔7，上部空腔5内设置有一个狭长的流道6，壳体1的上部设置有与该上部空腔5连通的至少一个进液口8和至少一个出液口9，下部空腔7为透过液流道，壳体1的下部设置有与该下部空腔7连通的至少一个透过液口10。
传统死端过滤技术液体的流动方向垂直于过滤膜，随着时间的推移，颗粒会逐渐在滤膜表面堆积，最终造成堵塞。由于细胞在培养过程中不可避免的会有部分细胞老化死亡，从而产生细胞碎片，造成滤膜的堵塞，本发明运用了切向流过滤技术，切向流技术将液体流动方向平行于过滤膜，因而液体在流动的同时会将大量的颗粒从滤膜表面带走，避免了堵塞的情况。
由于细胞生长的过程中需要消耗大量的营养，也会产生大量的代谢废物，因此在细胞培养过程中不断的换培养液才能保证细胞的正常生长。同时，蛋白或病毒也存在于培养液中，及时的收获才能得到最大的设备利用率。因而，利用切向流技术进行换液非常适合细胞培养工艺。
如图2所示，壳体1的上部空腔5内设置有多块纵向的挡板11，这些挡板11均匀的水平排开，相邻的挡板11交错与壳体1的左壁、右壁连接，相邻挡板11相互平行且相邻挡板11之间留有间隙，这些挡板11与壳体1的内壁之间构成了迂回的狭长的流道6，进液口8设置于该流道6的起始处，出液口9设置于该流道6的终止处。培养基在狭长的流道6内流动，将营养物带给细胞，同时，将代谢废物带走。
在本发明中，细胞生长层2为细胞亲和性良好的一层或两层以上的疏松多孔结构或细胞生长层2具有带透液孔的光滑表面，这可以在有限空间内提供最大的细胞接触表面，培养基可自由穿透该细胞生长层2到达过滤层3，该细胞生长层2可采用纤维素及其衍生物、聚酯纤维(尼龙)、壳聚糖及其衍生物、胶原蛋白、明胶、聚乳酸、聚乙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨酯泡沫微载体、海藻酸盐、葡聚糖、玻璃、陶瓷等材料或上述材料相结合制成。过滤层3为设置有过滤孔的细胞截留层，其中，过滤孔的孔径小于40um，在保证培养基透过的同时，保证细胞不会穿过该过滤层3。支撑层4保证过滤层3不会在压力下破损。
如图3所示，一种贴壁型细胞培养系统，包括透过液容器13、贴壁型细胞培养装置12以及通过补液调节该贴壁型细胞培养装置12的细胞培养条件的储液装置14，贴壁型细胞培养装置12的透过液口10通过管路与透过液容器13连接，贴壁型细胞培养装置12的出液口9通过管路与储液装置14的进液口8连接，贴壁型细胞培养装置12的进液口8通过管路与储液装置14的出液口9连接，贴壁型细胞培养装置12与储液装置14之间的管路设置有循环泵15。
采用本发明进行细胞培养的方法如下。
1、贴壁
将贴壁型细胞培养装置12与细胞接种瓶进行无菌连接，通过蠕动泵循环将细胞接种瓶内的接种液送入贴壁型细胞培养装置12内，打开透过液口，以达到浓缩细胞的目的，待接种浓缩液将贴壁型细胞培养装置12的上部空腔5的流道6刚好充满时，将贴壁型细胞培养装置12的出液口9封闭，在进液口8加压或在透过液口10抽液，使流道6的液体排空，这样细胞即可与细胞生长层2紧密接触，在恒温环境中静置一段时间，细胞即可粘附到细胞生长层2上，达到贴壁的目的。
2、培养
将贴壁型细胞培养装置12与储液装置14按照附图3连接，储液装置14可采用能控制温度、溶氧、pH参数的发酵罐(或将整体系统安装于恒温环境中)，保证细胞培养的稳定温度条件，在培养过程中，通过蠕动泵将培养基注入贴壁型细胞培养装置12的流道6中，在给细胞提供营养的同时，将细胞代谢产物带走。
3、消化
培养结束后，将贴壁型细胞培养装置12中的培养基快速排干，加入消化液，静置一段时间后，通过透过液口10排出消化液，通过进液口8加入新鲜培养基，经过一段时间循环后，通过出液口9收集细胞。
4、感染及收获病毒
对于疫苗生产，可在培养结束后加入病毒，待病毒达到收获密度后，通过透过液口10收集病毒液或直接通过出液口9收集病毒。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种贴壁型细胞培养装置，其特征在于：所述贴壁型细胞培养装置包括中部具有空腔的壳体，该壳体的空腔内水平设置有细胞生长层、过滤层和支撑层，细胞生长层位于过滤层的上方，支撑层位于过滤层的下方，细胞生长层、过滤层、支撑层三者将壳体的内部空腔分割为位于细胞生长层的上方的上部空腔和位于支撑层下方的下部空腔，上部空腔内设置有一个狭长的流道，壳体的上部设置有与该上部空腔连通的至少一个进液口和至少一个出液口，下部空腔为透过液流道，所述壳体的下部设置有与该下部空腔连通的至少一个透过液口。
2.根据权利要求1所述的贴壁型细胞培养装置，其特征在于：所述壳体的上部空腔内设置有多块纵向的挡板，这些挡板均匀的水平排开，相邻的挡板交错与壳体的左壁、右壁连接，相邻挡板相互平行且相邻挡板之间留有间隙，这些挡板与壳体的内壁之间构成了迂回的狭长的所述流道，所述进液口设置于该流道的起始处，所述出液口设置于该流道的终止处。
3.根据权利要求2所述的贴壁型细胞培养装置，其特征在于：所述细胞生长层为细胞亲和性良好的一层或两层以上的疏松多孔结构或所述细胞生长层具有带透液孔的光滑表面。
4.根据权利要求2所述的贴壁型细胞培养装置，其特征在于：所述过滤层为设置有过滤孔的细胞截留层，其中，过滤孔的孔径小于40um。
5.一种贴壁型细胞培养系统，其特征在于：该贴壁型细胞培养系统包括透过液容器、权利要求1-4中所述的贴壁型细胞培养装置以及通过补液调节该贴壁型细胞培养装置的细胞培养条件的储液装置，贴壁型细胞培养装置的透过液口通过管路与透过液容器连接，贴壁型细胞培养装置的出液口通过管路与储液装置的进液口连接，贴壁型细胞培养装置的进液口通过管路与储液装置的出液口连接，贴壁型细胞培养装置与储液装置之间的管路设置有循环泵。
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