CN204752747U - 生物培养过程固形物截留器 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及生物培养过程固形物截留器，主要解决现有采用过滤材料进行过滤操作时容易造成固相物质堵塞过滤材料的问题，本实用新型通过采用生物培养过程固形物截留器，包括过滤材料(8)、由所述过滤材料(8)为分界的待过滤生物反应液外室(9)和滤过液内室(10)；所述滤过液内室(10)设置转轴(13)和与所述转轴相接的桨叶(14)的技术方案，较好地解决了该技术问题，可用于细胞培养生物工业生产中。

Description

生物培养过程固形物截留器

技术领域

本实用新型涉及生物培养过程固形物截留器，采用该截留器的生物培养生产装置。

背景技术

目前，在含氧气气氛存在下将种子动物细胞贴壁于微载体上悬浮于培养液中进行细胞生物培养，或者在含氧气气氛存在下菌种分散于悬浮有固形营养物的培养液进行细菌培养，均是常见的；它们的一个共同特点是生物培养体系中具有固形物，例如前述微载体或者固形营养物等。

在生物培养过程中，经常涉及从培养体系中分离出液体，而截留前述固形物。作为非限制性的举例，例如在动物细胞生物培养过程中采收不含微载体等固形物的产出液，或者当在反应器外的增氧塔对培养液进行增氧之前，为防止堵塞增氧塔，也需要将微载体等固形物隔离于增氧塔之外，或者在细菌培养过程中需要采收不含固形营养物的产出液。在本领域，这个分出液相同时截留固形物的过程可采用沉降器或过滤器进行。但沉降器沉降速度较慢，当采用过滤材料进行过滤操作时，容易造成固相物质堵塞过滤材料，不利于长周期连续运转。

实用新型内容

本实用新型要解决的技术问题之一是现有采用过滤材料进行过滤操作时，容易造成固相物质堵塞过滤材料的问题，提供一种新的生物培养过程固形物截留器，该截留器具有不易堵塞，有利于长周期连续运转的优点。

本实用新型要解决的技术问题之二是提供采用上述截留器的生物培养生产装置。

为解决上述技术问题之一，本实用新型的技术方案如下：生物培养过程固形物截留器，包括过滤材料8、由所述过滤材料8为分界的待过滤生物反应液外室9和滤过液内室10；所述滤过液内室10设置转轴13和与所述转轴相接的桨叶14。

上述技术方案中，所述滤过液内室10优选具有旋转体的形状，所述旋转体侧面为过滤部件，所述转轴13位于或大体位于所述旋转体轴心。对所述旋转体的几何形状没有特别限制，例如可以是但不限于圆柱形、圆台形、倒置圆台形、圆锥形、倒置圆锥形等等。

上述技术方案中，所述滤过液内室10的过滤部件优选为过滤网。

上述技术方案中，桨叶与转轴的连接方式无论是直接连接还是通过连接部件(例如但不限于连接杆)间接连接均没有特别限制，无论固定连接还是可拆卸连接没有特别限制。对桨叶的形状和数量没有特别限制，只要在随转轴转动时能使与桨叶接触到的液体产生离心力均可；关于桨叶的形状例如可以是但不限于选自矩形、正方形、圆形、椭圆形、弧形或螺旋形。更加优选的是，桨叶的形状和设置使得桨叶在随转轴转动时能使与桨叶接触到的液体产生离心力的同时还能产生向下的推力，为满足这个要求，本领域技术人员知道例如但不限于通过使桨叶稍倾斜设置，从而桨叶在行进过程中可以产生向下的推力。

为解决上述技术问题之二，本实用新型的技术方案如下：一种生物培养生产装置，包括生物培养反应器和上述技术问题之一的技术方案中任一项所述的截留器。

上述技术方案中，所述截留器可选位于所述生物培养反应器的外部(简称外置截留器)，所述截留器的反应液外室9由所述过滤材料和截留器壳体围拢而成；所述生产装置具有从所述反应器中取出流体并输送至所述反应液外室9的输送通道5。作为本领域的技术常识，此时所述的反应器带有任何形式的混合机构，这样便于正在培养的生物和培养液充分接触，有利于生物反应的进行。所述混合机构可以是但不限于搅拌桨混合机构、气升式混合机构，湍动式混合机构。例如所述的反应器为搅拌式反应器；再例如所述的反应器为具有从反应器的底部进行通气的生物培养搅拌式生物反应器；再例如所述的反应器为湍动床式生物培养反应器或气升式生物培养反应器等等。

对于外置截留器的情况，本领域技术人员知道，可以方便地采用各种形式设置产出液出料口11，而不限于图1所示的产出液出料口具体设置形式(图1是通过深入滤过液内室10的产出液采出管道进行的)，也可以方便地设置富含固相物料出料口12；本领域技术人员可以明了，为了防止固相物质在截留器壳体内壁累积，较优的是在壳体下部做成下凹的形式，例如但不限于球冠形、锥形等，并且将所述富含固相物料出料口12设置在下凹的最低点。本领域技术人员还可以想到，富含固相物料出料口12还可以外接固液分离器(例如但不限于沉降器、离心机等)对富含固相物料进一步固液分离，而可以通过液体回输管道将得到的液体回输反应液外室9进行循环过滤处理。当采用与出料口12密接的固定容积的沉降器为所述固液分离器时，随着进入沉降器内固相物质体积的增加，析出并由增加的固相物质等体积置换出的液体可以出料口12所在的通道作为液体回输管道回输反应液外室9进行循环过滤处理。

上述技术方案中，所述截留器可选位于所述生物培养反应器的内部(简称内置截留器)。此时，可以将图1所示外置具有独立壳体的截留器置于反应器内，但优选所述反应器内允许反应混合物占用的空间通过所述过滤材料8与滤过液内室10相隔。(也即，此时反应器内允许反应混合物占据的空间与所述截留器的反应液外室合二为一，截留器的壳体与反应器的壳体合二为一，省去了外置截留器那样的独立的壳体)。此时所述生产装置优选进一步包括滤过液增氧塔18；所述增氧塔18内部具有如下布置：上部空间设置液体分布器19、下部设置有与增氧气体入口相连通的增氧塔气体分布器16，液体分布器19和增氧塔气体分布器16之间设置填料层15；所述增氧塔顶部具有增氧塔尾气排放口17；所述生产装置具有从所述滤过液内室10取出液体物料并输送至所述增氧塔顶部与液体分布器19相通的增氧塔进料通道I20；所述生产装置具有从所述增氧塔底部取出液体物料并输回所述反应器的液体物料回输通道II21。

虽然本实用新型关于截留器内置时的具体实施方式中未采用反应器混合机构(参见图1)，但本领域技术人员知道，为便于生物反应更好地进行，当截留器内置时，所述的反应器自身可以带有混合机构。所述混合机构可以是但不限于搅拌桨混合机构、气升式混合机构，湍动式混合机构。例如所述的反应器为搅拌式反应器；再例如所述的反应器为具有从反应器的底部进行通气的生物培养搅拌式生物反应器；再例如所述的反应器为湍动床式生物培养反应器或气升式生物培养反应器等等。

上述技术方案中，对增氧塔内的填料层15中填料的材质和形状没有特别限制，均可以采用现有技术中已有的那些。例如可选填料的材质可以为但不限于316L不锈钢、高硼玻璃、聚四氟乙烯；填料的形状可以是但不限于波纹板、丝网、鞍状、拉西环、泡罩板、筛板、纤维堆积体等。

对于反应器内置本实用新型截留器的情况，通道I和通道II采用的输送动力的来源和种类没有特别要求，在本实用新型说明书记载的基础上本领域技术人员能够合理选择。例如通道I和通道II之一可以采用反应器和增氧塔的位置高低使得其中一个通道通过液位差提供输送动力，而另一个通道的输送动力需要借助于输送泵或压力罐或真空泵。例如通过调高增氧塔的高度或者调低反应器的高度的方法可以实现通道II的输送动力来自液位差，而通道I借助输送泵；或者通过调低增氧塔的高度或者调高反应器的高度的方法可以实现通道I的输送动力来自液位差，而通道II借助输送泵。还可以通道I和通道II均采用输送泵等提供输送动力。本实用新型装置的产出液出料口11没有特别限制，本领域技术人员可以合理确定，例如但不限于设置在通道I或通道II。当通道I设置输送泵时可将放料口设置在邻近输送泵的出口端(例如图3所示装置的产出液出料口11)。

作为本实用新型的优选方案之一，所述通道I设置输送泵22。

本领域技术人员知道，在通道I和/或通道II使用输送泵的场合，为了降低在生物培养过程中流量的波动，从而有利于培养过程更平稳地运行，还可以在相应的通道中设置中间槽，使中间槽与输送泵的入口相连通；本领域技术人员还知道，为了提高增氧塔的生产负荷，还可以为增氧塔自身建立循环回路。

为了更方便监测细胞培养过程中反应器内的培养液的温度，还可以在反应器上设置温度电极，从而有利于调节反应器内培养液的温度；为监测装置运行过程中装置内由于液体与气体混合造成的泡沫情况，还可以在生物反应器设置消泡电极，从而有利于通过适时加入适量的消泡剂将装置内的泡沫控制在较小的范围内；为了更方便监测生物培养过程中反应器内的压力，还可以在反应器上设置压力表；为了将反应器中所有物料排空，可以采用多种方法实现，但为了更加方便地进行排空操作，可以为反应器设置专门用于排空物料的物料排空口，从而能够将反应器最底部的物料排空，而反应器上的物料排空口的位置也没有特别要求，例如可以设置在反应器顶部而通过管道直达反应器内的最底部物料，当然还可以把物料排空口设置在反应器的最底部位置；等等。

pH检测装置和溶解氧电极不是本实用新型生产装置的必需配置，但为了控制pH和溶解氧的快捷便利，本实用新型实施例和比较例中使用了pH检测装置和溶解氧电极，但未在相应的说明书附图中标出。

本实用新型中具体实施方式和实施例中所涉及的溶解氧浓度，以相对饱和溶解度来表示，刚经过121℃灭菌后降温到所需培养温度(36.8℃±0.2℃)的培养液，溶解氧电极测到的溶解氧浓度信号作为0％，然后通增氧气体至溶解氧达饱和，溶解氧的浓度不再增加，此时溶解氧电极电信号走平，此时溶解氧浓度作为100％。溶解氧浓度可以控制在10％以上，例如10～100％，更常用的是控制在40％以上，例如40～100％。本实用新型实施例中反应器内的溶解氧浓度均控制在40％以上。为了提高溶解氧浓度，可以通过提高增氧气体的用量和/或降低待增氧液体的用量等方式实现；反之亦然，为了降低溶解氧浓度，可以通过减少增氧气体的用量和/或增加待增氧液体的用量等方式实现。本实用新型实施例均通过调节通入增氧塔的增氧气体的流量使生物反应器内培养液的溶解氧浓度在40％以上，而比较例则是通过调节通入生物反应器内的增氧气体的流量将培养液的溶解氧浓度在40％以上。

本实用新型装置对细胞的种类没有特别限制，只要是培养过程中消耗氧的那些细胞或细菌等生物品种均可以采用本实用新型装置进行培养，均具有可比的技术效果。例如所述细胞可以是但不限于动物细胞，动物细胞中例如但不限于CHO细胞、Vero细胞、BHK细胞、293细胞、二倍体细胞、SP20细胞、淋巴细胞、地鼠肾细胞、猪睾丸细胞等；作为非限制性举例，本实用新型的装置可用于含有固体物料的微生物发酵过程例如以麸皮豆饼粉为原料的枯草芽孢杆菌及里氏木酶的混合菌种发酵生产脱墨酶菌的培养过程获得不含固形营养物等固形物的含脱墨酶的产出液。

采用本实用新型固形物截留器的生物培养生产装置，在生物培养过程中克服了过滤材料容易堵塞的问题，有利于生物培养过程长周期运转。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本实用新型进行详细的说明。

附图说明

图1为生物培养反应器外接本实用新型截留器的生物培养生产装置示意图，所述反应器是具有从反应器的底部进行通气的生物培养搅拌式生物反应器。

图2为生物培养反应器外接普通形式截留器的生物培养生产装置示意图，所述反应器是具有从反应器的底部进行通气的生物培养搅拌式生物反应器。

图3为本实用新型截留器内置于生物培养反应器且包括增氧塔的生物培养生产装置示意图。

图4为普通截留器内置于生物培养反应器且包括增氧塔的生物培养生产装置示意图。

图5为内筒旋转型截留器内置于生物培养反应器且包括增氧塔的生物培养生产装置示意图。

图1～5中，1为反应器进料口，2是反应器取样口，3为反应器的搅拌桨，4为反应器的接种口，5为从所述反应器中取出流体并输送至反应液外室9的输送通道，6为反应器排气口，7为反应器内气体分布器，8为过滤网，9为反应液外室，10为滤过液内室，11为本实用新型装置的产出液出料口，12为过滤后富含固相物料出料口，13为截留器中的转轴，14为截留器中的桨叶，15为填料层，16为增氧塔内部的气体分布器，17为增氧塔尾气排放口，18为增氧塔，19为液体分布器，20为通道I，21为通道II，22为通道I上设置的输送泵。

图1～5的反应器中还设置了pH检测装置和溶解氧检测装置，但未在图中示出。

图5中采用的内筒是钢筋骨架增强的过滤网，钢筋骨架未在图中示出。

具体实施方式

下面实施例1、实施例2、比较例1进行脱墨酶菌培养。

【实施例1】

一、实验装置：采用图1所示的生产装置

1、德国贝朗5L玻璃发酵罐

2、固体截留装置

自制。

内筒为圆柱形，同径100mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，上端与法兰焊接。

外筒是内径120mm的不锈钢管，下端锥面的锥度60°，锥体高度为104mm。

截留器中的转轴直径7mm，四个桨叶均为矩形(长30mm，高25mm)，相邻桨叶对置于转轴且在转轴轴向上错开设置，相邻桨叶之间在转轴上的间隙为20mm，最下层桨叶与内筒底间隙为10mm。

3、高速冷冻离心机：上海离心机研究所

二、实验材料

1、脱墨酶菌种

上海尚优生物科技有限公司提供。

2、培养基

由水、麸皮(过20目筛)、豆饼粉(过80目筛)、NH₄Cl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、大豆油组成的混合物，混合物中含麸皮30g/L、豆饼粉20g/L、NH₄Cl15g/L、Na₂HPO₄20g/L、NaH₂PO₄4g/L、NaCl20g/L和大豆油0.5g/L。该培养经121℃，30分钟灭菌后使用。

3、硫酸铵

AR，国药集团。

三、操作方法

1、菌种准备，取斜面菌种，接种到装有上述培养基的玻璃三角瓶，在空气浴恒温振荡器上35℃培养过夜。即为成熟种子液。

2、反应器内注入3.5L培养基。

3、开搅拌转速250转/分钟，通空气气量1.75L/min，恒温至35℃，通气至溶解氧电极走平，标定为溶解氧100％。

4、关联转速控制发酵过程维持溶解氧不低于40％。

5、发酵18小时，开始以20ml/分钟的速度补加培养基。

6、发酵液依靠罐内压力流出，进入截留器内，截留器内转轴的转速为200转/分，待截留器产品液从出料口11流出说明截留器已经注满，开始从出料口12富含固相物料同时考察截留器工作性能计时开始，富含固相物料以5ml/分钟的速度连续排出，产出液继续从出料口11流出。结果表明连续运行14天未发生堵塞。

7、每升酶液中加入350g的硫酸铵，有沉淀产生。离心弃上清，收集盐析沉淀，加水复溶并定容至原处理液体积的20％，得脱墨酶液。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置以及堵塞情况列于表1。

【实施例2】

除了桨叶的布置与实施例1采用的图1所示生产装置不同以外，其他采用的实验材料和操作方法同实施例1和图1，具体如下：

一、实验装置：

1、德国贝朗5L玻璃发酵罐

2、固体截留装置

自制。

内筒为圆柱形，同径100mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，上端与法兰焊接。

外筒是内径120mm的不锈钢管，下端锥面的锥度60°，锥体高度为104mm。

截留器中的转轴直径7mm，四个桨叶均为矩形(长30mm，高25mm)，每两个桨叶作为一对，每对桨叶在转轴上相同高度相对设置，相邻桨叶对之间在转轴上的间隙为40mm，桨叶的相邻对之间在转轴横截面上投影的夹角为90°，最下层桨叶与内筒底间隙为10mm。

3、高速冷冻离心机：上海离心机研究所

二、实验材料

1、脱墨酶菌种

上海尚优生物科技有限公司提供。

2、培养基

由水、麸皮(过20目筛)、豆饼粉(过80目筛)、NH₄Cl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、大豆油组成的混合物，混合物中含麸皮30g/L、豆饼粉20g/L、NH₄Cl15g/L、Na₂HPO₄20g/L、NaH₂PO₄4g/L、NaCl20g/L和大豆油0.5g/L。该培养经121℃，30分钟灭菌后使用。

3、硫酸铵

AR，国药集团。

三、操作方法

1、菌种准备，取斜面菌种，接种到装有上述培养基的玻璃三角瓶，在空气浴恒温振荡器上35℃培养过夜。即为成熟种子液。

2、反应器内注入3.5L培养基。

3、开搅拌转速250转/分钟，通空气气量1.75L/min，恒温至35℃，通气至溶解氧电极走平，标定为溶解氧100％。

4、关联转速控制发酵过程维持溶解氧不低于40％。

5、发酵18小时，开始以20ml/分钟的速度补加培养基。

6、发酵液依靠罐内压力流出，进入截留器内，截留器内转轴的转速为200转/分，待截留器产品液从出料口11流出说明截留器已经注满，开始从出料口12富含固相物料同时考察截留器工作性能计时开始，富含固相物料以5ml/分钟的速度连续排出，产出液继续从出料口11流出。结果表明连续运行14天未发生堵塞。

7、每升酶液中加入350g的硫酸铵，有沉淀产生。离心弃上清，收集盐析沉淀，加水复溶并定容至原处理液体积的20％，得脱墨酶液。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置以及堵塞情况列于表1。

【比较例1】

除了采用图2所示的生产装置外，其他采用的实验材料和操作方法同实施例1，具体如下：

一、实验装置：采用图2所示的生产装置

1、德国贝朗5L玻璃发酵罐

2、固体截留装置

自制。

内筒为圆柱形，同径100mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，上端与法兰焊接。

外筒是内径120mm的不锈钢管，下端锥面的锥度60°，锥体高度为104mm。

截留器中不设置转轴和桨叶。

3、高速冷冻离心机：上海离心机研究所

二、实验材料

1、脱墨酶菌种

上海尚优生物科技有限公司提供。

2、培养基

由水、麸皮(过20目筛)、豆饼粉(过80目筛)、NH₄Cl、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、NaCl、大豆油组成的混合物，混合物中含麸皮30g/L、豆饼粉20g/L、NH₄Cl15g/L、Na₂HPO₄20g/L、NaH₂PO₄4g/L、NaCl20g/L和大豆油0.5g/L。该培养经121℃，30分钟灭菌后使用。

3、硫酸铵

AR，国药集团。

三、操作方法

1、菌种准备，取斜面菌种，接种到装有上述培养基的玻璃三角瓶，在空气浴恒温振荡器上35℃培养过夜。即为成熟种子液。

2、反应器内注入3.5L培养基。

3、开搅拌转速250转/分钟，通空气气量1.75L/min，恒温至35℃，通气至溶解氧电极走平，标定为溶解氧100％。

4、关联转速控制发酵过程维持溶解氧不低于40％。

5、发酵18小时，开始以20ml/分钟的速度补加培养基。

6、发酵液依靠罐内压力流出，进入截留器内，截留器内转轴的转速为200转/分，待截留器产品液从出料口11流出说明截留器已经注满，开始从出料口12富含固相物料同时考察截留器工作性能计时开始，富含固相物料以5ml/分钟的速度连续排出，产出液继续从出料口11流出。结果表明运行1小时，截留器开始堵塞，表现为滤过液排出量逐渐变小，至1.5小时已基本无滤过液排出，堵塞发生过程中，反应器液面上升。

7、每升酶液中加入350g的硫酸铵，有沉淀产生。离心弃上清，收集盐析沉淀，加水复溶并定容至原处理液体积的20％，得脱墨酶液。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置以及堵塞情况列于表1。

通过对实施例1、实施例1和比较例1连续运转过程的堵塞情况比较可以看出，在本实用新型截留器外置于反应器之外的情况下，本实用新型由于在内筒设置搅拌装置，在搅拌过程中对滤过液的离心作用，对滤材的滤孔起到了反冲更新作用，有效防止了固相颗粒对滤孔的堵塞。

下面实施例3、实施例4、比较例2和比较例3进行Vero细胞培养。

【实施例3】

一、实验装置

采用图3所示的生产装置，其中

5L生物反应器(工作体积3.5L)及控制柜：瑞士比欧公司；

增氧塔：自制

增氧塔塔体为直径200mm玻璃管，高度450mm，填料为直径为5mm的高硼硅酸盐玻璃球，填料层高度为250mm。

微载体截留器：自制

内筒为圆柱形，筒径80mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，上端焊接外径300、厚度0.8mm不锈钢法兰，以与罐盖的预留螺栓相连并固定。

截留器中的转轴直径7mm，四个桨叶均为矩形，长30mm，高25mm，相邻桨叶对置于转轴且在转轴轴向上错开设置，相邻桨叶之间在转轴上的间隙为20mm，最下层桨叶与内筒底间隙为10mm。

二、实验材料

Vero细胞：来自中国科学院上海细胞库；

微载体cytodexI：美国GE公司；

基础培养基M199：美国Hyclone公司；

按产品说明书将基础培养基M199溶解于注射用水，然后用碳酸氢钠饱和水溶液调节pH为7.20～7.30，并除菌过滤，待用，是为M199基础培养液；

新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；

完全培养液：按照体积比计，M199基础培养液:新生牛血清＝90:10混合；

消化液：含0.25w％胰蛋白酶和0.02w％EDTA的生理盐水。

增氧气体：体积比95％空气和5％二氧化碳混合气体。

三、操作方法

1、细胞准备

1.1细胞消化分散

倾去培养有Vero细胞的转瓶中的培养液，用生理盐水洗涤掉瓶子残余培养液，洁净室内和在25℃的温度，每个转瓶加500ml消化液进行消化，目测瓶壁上细胞开始收缩时，弃去消化液，每个转瓶用500ml生理盐水洗涤一次，洗去残留消化液。加入完全营养液，吹打，计数，得到的细胞悬液用于下述步骤1.2贴壁。

1.2贴壁

取1.1中得到的含7.50×10⁷个细胞/ml的悬液2500ml和1500含875g微载体(CytodexI)的完全培养液加入到移种瓶(移种瓶容积5000ml)，放入36.8℃±0.2℃二氧化碳培养箱中(通二氧化碳到培养箱内，使箱内含体积比为5％二氧化碳与95％空气)，每隔15分钟轻轻晃动移种瓶，使细胞和微载体充分接触，以利细胞在微载体均匀贴壁。重复4次。然后继续在所述培养箱中培养4.5小时，得到微载体贴壁细胞。倒掉部分培养液，保留微载体贴壁细胞，剩余至体积1500ml刻度，作为移种混合液，备用。

2、生产装置准备

2.1、经反应器入口1向反应器中注入完全培养液2000毫升，灭菌，待用。

2.2、将图3中所用器材经灭菌后，按图3在无菌条件下连接。

2.3、按说明书标定溶解氧电极0

设定生物反应器温度(36.8℃±0.2℃)、培养过程用饱和碳酸氢钠调节生物反应器内培养物pH在7.20～7.30。

2.4、注入完全培养液，开启截留器的转轴，转速为200转/分，开启输送泵22控制培养液进入增氧塔的流速为500ml/分钟，使生物反应器内液面稳定在2L刻度处。同时通过增氧塔的气体分布器连续向增氧塔通入无菌空气，无菌空气向上通过填料层15然后从增氧塔尾气排放口17排出；直至培养液在反应器和增氧塔之间达到稳定循环。

2.5、按说明书标定溶氧电极100％。

2.6、设定生物反应器溶氧不低于40％，溶解氧反馈控制增氧气体流速。

3、细胞培养和取样分析

3.1、经接种口4将步骤1.2获得的移种混合液转接到生物反应器。并调节生物反应器内液面在3.5L刻度处。

3.2、经进料口1以5.85升/小时的速度连续补充完全培养液，同时从产出液出料口11以5.85升/小时的连续速度取出培养液。开始计时，连续补充完全培养液5天截留器未堵塞。

3.3、取样分析

从反应器的取样口2定时取样1ml，样品以1000转/分钟离心处理，弃上清液。10毫升消化液消化，将贴壁于微载体的细胞消化下来。用生理盐水稀释后用血球计数板对细胞计数，换算出相应时刻的生物反应器中的细胞密度。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置以及堵塞情况列于表1。

【实施例4】

除了桨叶的布置与实施例3采用的图3所示生产装置不同以外，其他采用的实验材料和操作方法同实施例3和图3，具体如下：

一、实验装置

采用图3所示的生产装置，其中

5L生物反应器(工作体积3.5L)及控制柜：瑞士比欧公司；

增氧塔：自制

增氧塔塔体为直径200mm玻璃管，高度450mm，填料为直径为5mm的高硼硅酸盐玻璃球，填料层高度为250mm。

微载体截留器：自制

内筒为圆柱形，筒径80mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，上端焊接外径300、厚度0.8mm不锈钢法兰，以与罐盖的预留螺栓相连并固定。

截留器中的转轴直径7mm，四个桨叶均为矩形(长30mm，高25mm)，每两个桨叶作为一对，每对桨叶在转轴上相同高度相对设置，相邻桨叶对之间在转轴上的间隙为40mm，桨叶的相邻对之间在转轴横截面上投影的夹角为90°，最下层桨叶与内筒底间隙为10mm。

二、实验材料

Vero细胞：来自中国科学院上海细胞库；

微载体cytodexI：美国GE公司；

基础培养基M199：美国Hyclone公司；

按产品说明书将基础培养基M199溶解于注射用水，然后用碳酸氢钠饱和水溶液调节pH为7.20～7.30，并除菌过滤，待用，是为M199基础培养液；

新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；

完全培养液：按照体积比计，M199基础培养液:新生牛血清＝90:10混合；

消化液：含0.25w％胰蛋白酶和0.02w％EDTA的生理盐水。

增氧气体：体积比95％空气和5％二氧化碳混合气体。

四、操作方法

1、细胞准备

1.1细胞消化分散

倾去培养有Vero细胞的转瓶中的培养液，用生理盐水洗涤掉瓶子残余培养液，洁净室内和在25℃的温度，每个转瓶加500ml消化液进行消化，目测瓶壁上细胞开始收缩时，弃去消化液，每个转瓶用500ml生理盐水洗涤一次，洗去残留消化液。加入完全营养液，吹打，计数，得到的细胞悬液用于下述步骤1.2贴壁。

1.2贴壁

取1.1中得到的含7.50×10⁷个细胞/ml的悬液2500ml和1500含875g微载体(CytodexI)的完全培养液加入到移种瓶(移种瓶容积5000ml)，放入36.8℃±0.2℃二氧化碳培养箱中(通二氧化碳到培养箱内，使箱内含体积比为5％二氧化碳与95％空气)，每隔15分钟轻轻晃动移种瓶，使细胞和微载体充分接触，以利细胞在微载体均匀贴壁。重复4次。然后继续在所述培养箱中培养4.5小时，得到微载体贴壁细胞。倒掉部分培养液，保留微载体贴壁细胞，剩余至体积1500ml刻度，作为移种混合液，备用。

2、生产装置准备

2.1、经反应器入口1向反应器中注入完全培养液2000毫升，灭菌，待用。

2.2、将图3中所用器材经灭菌后，按图3在无菌条件下连接。

2.3、按说明书标定溶解氧电极0

设定生物反应器温度(36.8℃±0.2℃)、培养过程用饱和碳酸氢钠调节生物反应器内培养物pH在7.20～7.30。

2.4、注入完全培养液，开启截留器的转轴，转速为200转/分，开启输送泵22控制培养液进入增氧塔的流速为500ml/分钟，使生物反应器内液面稳定在2L刻度处。同时通过增氧塔的气体分布器连续向增氧塔通入无菌空气，无菌空气向上通过填料层15然后从增氧塔尾气排放口17排出；直至培养液在反应器和增氧塔之间达到稳定循环。

2.5、按说明书标定溶氧电极100％。

2.6、设定生物反应器溶氧不低于40％，溶解氧反馈控制增氧气体流速。

3、细胞培养和取样分析

3.1、经接种口4将步骤1.2获得的移种混合液转接到生物反应器。并调节生物反应器内液面在3.5L刻度处。

3.2、经进料口1以5.85升/小时的速度连续补充完全培养液，同时从产出液出料口11以5.85升/小时的连续速度取出培养液。开始计时，连续补充完全培养液5天截留器未堵塞。

3.3、取样分析

从反应器的取样口2定时取样1ml，样品以1000转/分钟离心处理，弃上清液。10毫升消化液消化，将贴壁于微载体的细胞消化下来。用生理盐水稀释后用血球计数板对细胞计数，换算出相应时刻的生物反应器中的细胞密度。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置以及堵塞情况列于表1。

【比较例2】

除了采用图4所示的生产装置外，其他采用的实验材料和操作方法同实施例3，具体如下：

一、实验装置

采用图4所示的生产装置，其中

5L生物反应器(工作体积3.5L)及控制柜：瑞士比欧公司；

增氧塔：自制

增氧塔塔体为直径200mm玻璃管，高度450mm，填料为直径为5mm的高硼硅酸盐玻璃球，填料层高度为250mm。

微载体截留器：自制

内筒为圆柱形，筒径80mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，上端焊接外径300、厚度0.8mm不锈钢法兰，以与罐盖的预留螺栓相连并固定。

截留器内筒中不设置转轴和桨叶。

二、实验材料

Vero细胞：来自中国科学院上海细胞库；

微载体cytodexI：美国GE公司；

基础培养基M199：美国Hyclone公司；

按产品说明书将基础培养基M199溶解于注射用水，然后用碳酸氢钠饱和水溶液调节pH为7.20～7.30，并除菌过滤，待用，是为M199基础培养液；

新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；

完全培养液：按照体积比计，M199基础培养液:新生牛血清＝90:10混合；

消化液：含0.25w％胰蛋白酶和0.02w％EDTA的生理盐水。

增氧气体：体积比95％空气和5％二氧化碳混合气体。

五、操作方法

1、细胞准备

1.1细胞消化分散

倾去培养有Vero细胞的转瓶中的培养液，用生理盐水洗涤掉瓶子残余培养液，洁净室内和在25℃的温度，每个转瓶加500ml消化液进行消化，目测瓶壁上细胞开始收缩时，弃去消化液，每个转瓶用500ml生理盐水洗涤一次，洗去残留消化液。加入完全营养液，吹打，计数，得到的细胞悬液用于下述步骤1.2贴壁。

1.2贴壁

取1.1中得到的含7.50×10⁷个细胞/ml的悬液2500ml和1500含875g微载体(CytodexI)的完全培养液加入到移种瓶(移种瓶容积5000ml)，放入36.8℃±0.2℃二氧化碳培养箱中(通二氧化碳到培养箱内，使箱内含体积比为5％二氧化碳与95％空气)，每隔15分钟轻轻晃动移种瓶，使细胞和微载体充分接触，以利细胞在微载体均匀贴壁。重复4次。然后继续在所述培养箱中培养4.5小时，得到微载体贴壁细胞。倒掉部分培养液，保留微载体贴壁细胞，剩余至体积1500ml刻度，作为移种混合液，备用。

2、生产装置准备

2.1、经反应器入口1向反应器中注入完全培养液2000毫升，灭菌，待用。

2.2、将图4中所用器材经灭菌后，按图4在无菌条件下连接。

2.3、按说明书标定溶解氧电极0

设定生物反应器温度(36.8℃±0.2℃)、培养过程用饱和碳酸氢钠调节生物反应器内培养物pH在7.20～7.30。

2.4、注入完全培养液，开启截留器的转轴，转速为200转/分，开启输送泵22控制培养液进入增氧塔的流速为500ml/分钟，使生物反应器内液面稳定在2L刻度处。同时通过增氧塔的气体分布器连续向增氧塔通入无菌空气，无菌空气向上通过填料层15然后从增氧塔尾气排放口17排出；直至培养液在反应器和增氧塔之间达到稳定循环。

2.5、按说明书标定溶氧电极100％。

2.6、设定生物反应器溶氧不低于40％，溶解氧反馈控制增氧气体流速。

3、细胞培养和取样分析

3.1、经接种口4将步骤1.2获得的移种混合液转接到生物反应器。并调节生物反应器内液面在3.5L刻度处。

3.2、经进料口1以5.85升/小时的速度连续补充完全培养液，同时从产出液出料口11以5.85升/小时的连续速度取出培养液。开始计时，连续补充完全培养液至15分钟时截留筒开始堵塞，表现为从产出液口11流出的速度逐渐变小，至20分钟时已经没有产出液流出，堵塞过程中，反应器液面迅速上升。

3.3、取样分析

从反应器的取样口2定时取样1ml，样品以1000转/分钟离心处理，弃上清液。10毫升消化液消化，将贴壁于微载体的细胞消化下来。用生理盐水稀释后用血球计数板对细胞计数，换算出相应时刻的生物反应器中的细胞密度。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置情况以及堵塞情况列于表1。

通过对实施例3、实施例4和比较例2连续运转过程的堵塞情况比较可以看出，在本实用新型截留器内置于反应器内的情况下，本实用新型由于在内筒设置搅拌装置，在搅拌过程中对滤过液的离心作用，对滤材的滤孔起到了反冲更新作用，有效防止了固相颗粒对滤孔的堵塞。

【比较例3】

除了采用图5所示的生产装置外，其他采用的实验材料和操作方法同实施例3，具体如下：

一、实验装置

采用图5所示的生产装置，其中

5L生物反应器(工作体积3.5L)及控制柜：瑞士比欧公司；

增氧塔：自制

增氧塔塔体为直径200mm玻璃管，高度450mm，填料为直径为5mm的高硼硅酸盐玻璃球，填料层高度为250mm。

微载体截留器：自制

内筒为圆柱形，筒径80mm，高300mm，侧面和底面为180目钢丝过滤网，无顶面，内筒上边沿与反应器顶盖间隙为20mm。内筒内侧由高为300mm的钢筋骨架增强，所述钢筋骨架由三个钢筋圆圈(分别为上部钢筋圆圈、中部钢筋圆圈和下部钢筋圆圈)、与上述三个钢筋圆圈相焊接的四根钢筋杆(钢筋杆与钢筋圆圈所在的平面垂直)、和与下部钢筋圆圈的四个焊接点相焊接的钢筋十字构成。中部钢筋圆圈位于上部和下部钢筋圆圈的正中间，三个钢筋圆圈的外径均为80mm，骨架采用的钢筋为直径为5mm的钢筋。

截留器转轴直径7mm，垂直于下部钢筋圈平面并与上述钢筋十字的中心焊接连接。二、实验材料

Vero细胞：来自中国科学院上海细胞库；

微载体cytodexI：美国GE公司；

基础培养基M199：美国Hyclone公司；

按产品说明书将基础培养基M199溶解于注射用水，然后用碳酸氢钠饱和水溶液调节pH为7.20～7.30，并除菌过滤，待用，是为M199基础培养液；

新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；

完全培养液：按照体积比计，M199基础培养液:新生牛血清＝90:10混合；

消化液：含0.25w％胰蛋白酶和0.02w％EDTA的生理盐水。

增氧气体：体积比95％空气和5％二氧化碳混合气体。

六、操作方法

1、细胞准备

1.1细胞消化分散

倾去培养有Vero细胞的转瓶中的培养液，用生理盐水洗涤掉瓶子残余培养液，洁净室内和在25℃的温度，每个转瓶加500ml消化液进行消化，目测瓶壁上细胞开始收缩时，弃去消化液，每个转瓶用500ml生理盐水洗涤一次，洗去残留消化液。加入完全营养液，吹打，计数，得到的细胞悬液用于下述步骤1.2贴壁。

1.2贴壁

取1.1中得到的含7.50×10⁷个细胞/ml的悬液2500ml和1500含875g微载体(CytodexI)的完全培养液加入到移种瓶(移种瓶容积5000ml)，放入36.8℃±0.2℃二氧化碳培养箱中(通二氧化碳到培养箱内，使箱内含体积比为5％二氧化碳与95％空气)，每隔15分钟轻轻晃动移种瓶，使细胞和微载体充分接触，以利细胞在微载体均匀贴壁。重复4次。然后继续在所述培养箱中培养4.5小时，得到微载体贴壁细胞。倒掉部分培养液，保留微载体贴壁细胞，剩余至体积1500ml刻度，作为移种混合液，备用。

2、生产装置准备

2.1、经反应器入口1向反应器中注入完全培养液2000毫升，灭菌，待用。

2.2、将图5中所用器材经灭菌后，按图5在无菌条件下连接。

2.3、按说明书标定溶解氧电极0

设定生物反应器温度(36.8℃±0.2℃)、培养过程用饱和碳酸氢钠调节生物反应器内培养物pH在7.20～7.30。

2.4、注入完全培养液，开启截留器转轴，转速为200转/分，开启输送泵22控制培养液进入增氧塔的流速为500ml/分钟，使生物反应器内液面稳定在2L刻度处。同时通过增氧塔的气体分布器连续向增氧塔通入无菌空气，无菌空气向上通过填料层15然后从增氧塔尾气排放口17排出；直至培养液在反应器和增氧塔之间达到稳定循环。

2.5、按说明书标定溶氧电极100％。

2.6、设定生物反应器溶氧不低于40％，溶解氧反馈控制增氧气体流速。

3、细胞培养和取样分析

3.1、经接种口4将步骤1.2获得的移种混合液转接到生物反应器。并调节生物反应器内液面在3.5L刻度处。

3.2、经进料口1以5.85升/小时的速度连续补充完全培养液，同时从产出液出料口11以5.85升/小时的连续速度取出培养液。开始计时，结果表明连续补充完全培养液至10小时时截留筒开始堵塞，表现为从产出液口11流出的速度逐渐变小，至12小时时已经没有产出液流出，堵塞过程中，反应器液面迅速上升。

3.3、取样分析

从反应器的取样口2定时取样1ml，样品以1000转/分钟离心处理，弃上清液。10毫升消化液消化，将贴壁于微载体的细胞消化下来。用生理盐水稀释后用血球计数板对细胞计数，换算出相应时刻的生物反应器中的细胞密度。

为便于比较，将截留器和桨叶的设置以及堵塞情况列于表1。

通过对实施例3、实施例4和比较例3连续运转过程的堵塞情况比较可以看出，在本实用新型截留器内置于反应器内的情况下，本实用新型由于在内筒设置搅拌装置，在搅拌过程中对滤过液的离心作用，对滤材的滤孔起到了反冲更新作用，优于滤筒旋转形式的截留器，有效防止了固相颗粒对滤孔的堵塞。

表1

Claims (10)

1.生物培养过程固形物截留器，包括过滤材料(8)、由所述过滤材料(8)为分界的待过滤生物反应液外室(9)和滤过液内室(10)；所述滤过液内室(10)设置转轴(13)和与所述转轴相接的桨叶(14)。

2.根据权利要求1所述的截留器，其特征是所述滤过液内室(10)具有旋转体的形状，所述旋转体侧面为过滤部件，所述转轴(13)位于或大体位于所述旋转体轴心。

3.根据权利要求2所述的截留器，其特征是所述滤过液内室(10)的过滤部件为过滤网。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的截留器，其特征是所述的桨叶选自矩形、正方形、圆形、椭圆形、弧形或螺旋形。

5.一种生物培养生产装置，包括生物培养反应器和权利要求1～4中任一项所述的截留器。

6.根据权利要求5所述的生产装置，其特征是所述截留器位于所述生物培养反应器的外部，所述截留器的反应液外室(9)由所述过滤材料和截留器壳体围拢而成；所述生产装置具有从所述反应器中取出流体并输送至所述反应液外室(9)的输送通道(5)。

7.根据权利要求5所述的生产装置，其特征是所述截留器位于所述生物培养反应器的内部。

8.根据权利要求7所述的生产装置，其特征是所述反应器内允许反应混合物占用的空间通过所述过滤材料(8)与滤过液内室(10)相隔。

9.根据权利要求8所述的生产装置，其特征是所述生产装置还包括滤过液增氧塔(18)；所述增氧塔(18)内部具有如下布置：上部空间设置液体分布器(19)、下部设置有与增氧气体入口相连通的增氧塔气体分布器(16)，液体分布器(19)和增氧塔气体分布器(16)之间设置填料层(15)；所述增氧塔顶部具有增氧塔尾气排放口(17)；

所述生产装置具有从所述滤过液内室(10)取出液体物料并输送至所述增氧塔顶部与液体分布器(19)相通的增氧塔进料通道I(20)；

所述生产装置具有从所述增氧塔底部取出液体物料并输回所述反应器的液体物料回输通道II(21)。

10.根据权利要求9所述的生产装置，其特征是所述通道I设置输送泵(22)。