NO170019B - Fremgangsmaate for fremstilling av deglucoteicoplanin (antibiotikum l 17392) - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av deglucoteicoplanin som er et antibiotisk stoff som vilkårlig er betegnet antibiotikum L 17392, samt salter derav med baser og syrer.

Dette antibiotiske stoff er i besittelse av antimikrobiell aktivitet hovedsakelig mot gram-positive bakterier (f.eks. Staphylococcus og Streptococcus-stammer). Dette antibiotikum oppnås ved kjemisk omdannelse av en teicoplaninforbindelse eller teicoplaninlignende forbindelse.

Teicoplanin er den internasjonale ikke-navnebesktyttede betegnelse (INN) på det antibiotiske stoff som tidligere er betegnet teicomycin som oppnås ved dyrking av stammen Actinoplanes teichomyceticus nov. sp. ATCC 31131 i et kulturmedium inneholdene assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter (se US patent 4.239.751).

Ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i nevnte patent, blir et antibioitisk kompleks (identifisert som teicomycin) inneholdene faktorer A]_, A2 og A3 , utvunnet fra fermen-teringsbuljongen ved ekstraksjon med et egnet vannuoppløselig organisk oppløsningsmiddel og utfelt fra det organiske oppløsningsmidlet ifølge vanlige metoder. Faktor A2 , som er den dominerende faktoren i det isolerte antibiotiske komplekset, separeres deretter fra de andre faktorene ved hjelp av kolonnekromatografi på "Sephadex". Faktor A]_ og faktor A3 er tilstede bare i mindre mengder.

Publisert GB-patentsøknad nr 2121401 beskriver at antibiotisk faktor A2 på sin side faktisk er en blanding av fem nær beslektede koproduserte hovedkomponenter.

Fra fermenterings- og rensingsoperasjoner (f.eks. ved kolonnekromatografi) oppnås et teicoplaninprodukt som i det vesentlige består av faktor A2 ledsaget av mindre mengder faktor A3. Nylige studier viser at teicoplanin faktor A2 og dens individuelle hovedkomponenter kan representeres ved følgende formel:

hvor

R er en N-[(Cio_cii) alifatisk acyl]-D-glukosaminrest,

R<1> er en N-acetyl-D-glukosaminrest, og

R<2> er en D-mannonserest.

Alle sukkergrupper som er identifisert ovenfor, er bundet til kjernemolekylet gjennom O-glykosidbindinger.

Et stoff som har den samme strukturelle formel, er beskrevet i publisert EP patentsøknad nr 0090578 og er betegnet antibiotikum A4103 0 faktor B. Dette stoff oppnås ved hjelp av en mikrobiologisk prosess som innebærer fermentering av stammen Streptomyces virginiae NRRL 12525 eller Streptomyces virginiae NRRL 15156 i et egnet medium, isolering, rensing og separering i dets komponenter av antibiotikum A 41030, et antibiotisk kompleks med minst syv faktorer, antibiotikum A 4103 0 faktor B, inkludert.

I EP patentsøknader 84102665 og 84102666 er det beskrevet partielle hydrolyseprodukter av teicoplanins faktor A2 hvori en eller to sukkergrupper er avspaltet. Disse produktene er betegnet henholdsvis antibiotikum L 17054 og L 17046. Produktene oppnås ved å underkaste teicoplanin faktor A2 for spesifikke syrehydrolysebetingelser. For L 17054 utføres hydrolysen fortrinnsvis ved bruk av 0,5 N saltsyre ved en temperatur mellom 70 og 90°C i 15-90 minutter. For L 17046 foretas hydrolysen fortrinnsvis ved bruk av saltsyre ved en konsentrasjon på 1-3 N ved en temperatur mellom 70 og 90°C i 30-60 minutter.

Antibiotikum L 17054 kan representeres ved formel I ovenfor, hvorved R er erstattet av hydrogen, R<1> er en N-acetyl-D-glukosaminrest og R<2> er en D-mannoserest. Antibiotikum L 17046 kan representeres ved formel I ovenfor hvori R og R<2 >begge er erstattet av hydrogen, og R<1> er en N-acetyl-D-glukosaminrest.

I foreliggende sammenheng menes med betegnelsen "teicoplaninforbindelse" et stoff valgt fra teicoplaninkomplekset oppnådd ved fermentering av Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121 fulgt av rensingsoperasjoner ifølge US patent 4.239.751, eventuelt ytterligere renset preparat derav, teicoplanin faktor A2, teicoplanin faktor A3, hver av hovedkomponentene i teicoplanin faktor A2. Med betegnelsen "teicoplaninlignende forbindelse" menes her enhver forbindelse som har den samme grunnstrukturen formel I som ovenfor, hvor R er hydrogen, R<1 >er hydrogen eller en N-acetyl-D-glukosaminrest, R<2> er hydrogen eller en D-mannonserest, forutsatt at R, R<1> og R<2 >ikke samtidig kan være hydrogen, og en blanding av to eller flere av en av de ovenfor angitte stoffer og/eller forbindelser i et hvilket som helst mengdeforhold.

Ifølge foreliggende oppfinnelses formål er det funnet at antibiotikum L 17392 (deglukoteicoplanin) og dets salter med baser og syrer kan oppnås ved å underkaste en teicoplaninforbindelse eller en teicoplaninlignende forbindelse for regulerte, sterkt sure hydrolysebetingelser.

De "regulerte, sterkt sure hydrolysebetingelsene" som er egnet for foreliggende fremgangsmåte, er de reaksjons-betingelser hvorved det tilveiebringes tilstrekkelig syrestyrke til å forårsake fjerningen av alle sukkergrupper i teicoplaninforbindelser og/eller teicoplaninlignende forbindelser uten samtidig å bevirke andre uønskede modifikasjoner eller forandring av den kjemiske struktur til og chirale sentere i substratet.

Det er kjent at fjerning av alle sukkergrupper fra en kompleks molekylstruktur slik som den for glykopeptid-antibiotika, alltid representerer betydelige vanskeligheter fordi hydrolysebetingelser med svak syre vanligvis bare forårsaker delvis fjerning av sukkergrupper mens hydrolysebetingelser med sterk syre fremmer delvis nedbrytning av substratet og/eller forandringer i den stereokjemiske konfigurasjon til chirale sentere. For avoparcin, et kjent glykopeptidantibiotikum, ble f.eks. det virkelige aglykon aldri isolert.

Den følgende vitenskapelige litteratur understøtter de ovenfor angitte betrakninger: G.A. Ellestad et al., J. Am. Chem. Soc. 105, 6915 (1983); W-J- McGahren et al, J. of Antibiotics, 36, 1671 (1983). M.R. Bardone et al. (J. of Antibiotics, 31, 170 (1975)) beskriver hydrolytiske behandlinger av teicomycin faktor A2 både med vandig 2 N H2SO4 og med vandig 6 N HC1 ved 100°C. Ikke i noe tilfelle oppnås det virkelige aglykon av teicoplanin. Det er i det hele tatt ingen indikasjon i den ovenfor angitte litteratur som foreslår anvendelse av noen spesifikk hydrolysebetingelse for overføring av en teicoplaninforbindelse eller teicoplaninlignende forbindelse tilsvarende teicoplaninaglykon (eller deglukoteicoplanin).

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av deglukoteicoplanin (antibiotikum L 17392) ved omdannelse av et materiale valgt fra teicoplaninkompleks, teicoplanin faktor A2, teicoplanin faktor A3, hver av hovedkomponentene i teicoplanin faktor A2, og en teicoplaninlignende forbindelse med den ovenfor angitte generelle formel I, hvori R<1> er hydrogen eller en N-acetyl-D-glukosaminrest; R<2> er hydrogen eller D-mannoserest under den forutsetning at R<1> og R<2> ikke samtidig kan være hydrogen,, og en blanding av to eller flere av hvilke som helst av de ovenfor angitte stoffer i et hvilket som helst mengdeforhold, ved regulert, sterk syrehydrolyse, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at syrehydrolysen utføres ved anvendelse av (a) et organisk protisk oppløsningsmiddel, som ved reaksjonstemperaturen er flytende, valgt fra alifatiske syrer og alfa-halogenerte alifatiske syrer, alifatiske og cykloalifatiske alkanoler som er svakt blandbare med vann, fenylsubstituerte lavere alkanoler, hvori fenyldelen eventuelt kan omfatte (C]_-C4) alkyl-, (C1-C4) alkoksy- eller halogenrester som er svakt blandbare med vann, og beta-polyhalogenerte lavere alkanoler, (b) en sterk syre som er forenelig med oppløsningsmidlet valgt fra sterke mineralsyrer, sterke organiske syrer og sterkt sure kationutvekslerharpikser i hydrogenformen, og (c) en reaksjonstemperatur mellom 20 og 100°C.

Når det protiske oppløsningsmidlet velges fra alifatiske syrer og alfa-halogenerte alifatiske syrer, foretrekkes henholdsvis alifatiske syrer med 1-5 karbonatomer og alfa-halogenerte alifatiske syrer med 2-5 karbonatomer, skjønt en hvilken som helst alifatisk syre og en hvilken som helst alfa-halogenert alifatisk syre som, ved reaksjonstemperaturen, er i stand til å oppløse en teicoplaninforbindelse eller teicoplaninlignende forbindelse i tilstrekkelig mengde, vanligvis kan benyttes.

Med betegnelsen "i tilstrekkelig mengde" menes her at konsentrasjonen av forbindelsen i oppløsningsmidlet under reaksjonsbetingelsene ikke er så lav at reaksjonshastigheten er meget langsom og/eller en meget stor mengde av oppløs-ningsmiddel skal til for utførelse av reaksjonen i et forsøksanlegg eller i industriell målestokk.

Siden teicoplaninforbindelsene og de teicoplaninlignende forbindelsene inneholder funksjonelle grupper slik som hydroksy og amino, som kan reagere med alifatiske syrer og alfa-halogenerte alifatiske syrer, er en ytterligere betingelse for heldig anvendelse av de ovennevnte syrer som oppløsningsmidler for utførelse av den regulerte hydrolysen med sterk syre, at nevnte syrer ikke reagerer med substratet og gir uønskede funksjonelle derivater av de samme teicoplanin- og teicoplaninlignende forbindelsene. Eksempler på ovennevnte syrer er: maursyre, eddiksyre, propionsyre, smørsyre, isosmørsyre, valerianesyre, isovalerianesyre, trimetyleddiksyre, fluoreddiksyre, kloreddiksyre, difluor-eddiksyre, dikloreddiksyre, trifluoreddiksyre, trikloreddiksyre, pentafluorpropionsyre, 2,2,3,4,4,4-heksafluorsmørsyre, heptafluorsmørsyre og lignende.

Når ovennevnte alifatiske syrer og alfa-halogenerte alifatiske syrer anvendes som oppløsningsmidler for den regulerte hydrolysereaksjonen med sterk syre, er det foretrukket å utføre reaksjonen i nærvær av en viss mengde vann. Generelt varierer vannmengden mellom 2,5 og 25 vekt-% av det totale oppløsningsmiddel, skjønt en mindre mengde kan benyttes, spesielt med de syrer som er meget svakt blandbare med vann. Den ønskede vannmengden kan være oppløst i syreoppløsnings-middelet opprinnelig - eller, når det er nødvendig med tilsetning av en sterk syre som hydrolyse-promotor, kan den tilsettes sammen med nevnte sterke syre. Ifølge en foretrukket måte å utføre denne reaksjonen på, blir en bestemt mengde av en konsentrert vandig mineralsyre, slik som saltsyre, hydrobromsyre og svovelsyre, tilsatt til en blanding av teicoplanin eller teicoplaninlignende forbindelse i en lavere alifatisk syre (f.eks. eddiksyre) og blandingen oppvarmes deretter ved en temperatur mellom 40 og 100°C, fortrinnsvis mellom 65 og 85°C, i en tid som er nødvendig for å oppnå et tilfredsstillende utbytte av deglukoteicoplanin som bestemt ved analytiske forsøk.

Lavere alifatiske syrer slik som eddiksyre og propionsyre eller lavere alfa-halogenert alifatisk syre slik som kloreddiksyre, dikloreddiksyre, trikloreddiksyre, difluor-eddiksyre, klordifluoreddiksyre, trifluoreddiksyre og pentafluorpropionsyre er foretrukne reaksjonsoppløsnings-midler ifølge en utførelse av oppfinnelsen. Blant disse syreoppløsningsmidler kan de som er i besittelse av høy syrestyrke samtidig virke både som oppløsningsmidler og som en sterk syre som fremmer hydrolysereaksjonen, og det er således intet behov for en ytterligere tilsetning av

en sterk syre for å fremme hydrolysereaksjonen. For dette formål har trifluoreddiksyre vist seg å være særlig egnet når den benyttes i en konsentrasjon mellom 75 og 95% ved en temperatur mellom 60 og 90°C i en reaksjonstid varierende fra 0,5 til 8 timer. Når det protiske oppløsningsmiddelet

velges fra alifatiske alkanoler og cykloalifatiske alkanoler som ved reaksjonstemperaturen er væsker som er svakt blandbare med vann, er primære og sekundære alkanoler med minst 5 karbonatomer og sekundære cykloalkanoler med minst 5 karbonatomer vanligvis foretrukket. P.g.a. en mer passende håndtering under utvinningen av reaksjonsproduktet er alkanoler som er væsker ved romtemperaturen, de mest foretrukne. De ovennevnte primære og sekundære alkanolene kan ha rette eller forgrenede hydrokarbonkjeder. Disse kjedene kan også ha syreinerte umetninger og/eller innbefatte cykloalifatiske rester. Kommersielt tilgjengelige alkanoler med de ovenfor angitte kjennetegn har vanligvis et antall karbonatomer mellom 5 og 12, skjønt en hvilken som helst primær eller sekundær alifatisk og sekundær cykloalifatisk alkanol med de ovenfor illustrerte egenskaper kan benyttes ifølge foreliggende fremgangsmåte.

Det er særlig foretrukket at primære og sekundære alkanoler og sekundære cykloalkanoler med 5-10 karbonatomer benyttes som reaksjonsoppløsningsmiddel for den regulerte hydrolyse med sterk syre ifølge oppfinnelsen. Eksempler på alkanoler er: 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 1-heksanol, 2-heksanol, 3-heksanol, 3,3-dimetyl-l-butanol, 4-metyl-l-pentanol; 3-metyl-1-pentanol, 2,2-dimetyl-3-pentanol, 2,4-dimetyl-3-pentanol, 4,4-dimetyl-2-pentanol, 5-metyl-2-heksanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 5-metyl-1-heksanol, 2-etyl-1-heksanol, 2-metyl-3-heksanol, 1-oktanol, 2-oktanol, cyklopentanol, 2-cyklopentyletanol, 3-cyklopentyl-1-propanol, cykloheksanol, cykloheptanol, cyklooktanol, 2,3-dimetylcykloheksanol, 4-etylcykloheksanol, cyklooktyl-metanol, 6-metyl-5-hepten-2-ol, 1-nonanol, 2-nonanol, 1-decanol, 2-decanol og 3-decanol.

For bruk som oppløsningsmidler i den regulerte hydrolysen med sterk syre anvendes de ovennevnte alkanoler vanligvis i nærvær av en vannfase og en sterk syre som promotor for hydrolysereaksjonen. Ifølge et typisk eksempel med bruk av ovennevnte alkanoler i den regulerte hydrolyse med sterk syre, blir en teicoplaninforbindelse eller en teicoplaninlignende forbindelse bragt i kontakt med en konsentrert mineralsyre slik som vandig saltsyre (20-37% vekt/vol), vandig hydrobromsyre (20-62%, vekt/vol) og vandig svovelsyre (10-60%, vekt/vol-)-, i nærvær av et stort molekylært overskudd av 1-oktanol ved en temperatur mrllom 35 og 100°C, fortrinnsvis mellom 40 og 80°C, i fra ca. 4 timer til ca. 40 timer for oppnåelse av deglukoteicoplanin i godt utbytte.

Når det organiske protiske oppløsningsmiddelet velges fra fenylsubstituerte lavere alkanoler hvori fenylgruppen eventuelt kan omfatte ( C^- C^) alkyl-, (C^-C^) alkoksy-eller halogenrester, som ved reaksjonstemperaturen er svakt blandbare med vann, er den lavere alkanoldelen fortrinnsvis en primær eller sekundær alkanoldel med 1-4 karbonatomer, skjønt en hvilken som helst fenylsubstituert alkanol som ved reaksjonstemperaturen kan oppløse en teicoplaninforbindelse eller teicoplaninlignende forbindelse i tilstrekkelig mengde, hensiktsmessig kan benyttes. Også i dette tilfelle er en ønsket egenskap med oppløsningsmiddelet at det tillates lett håndtering av reaksjonsblandingen under prosessen med utvinning av reaksjonsproduktet og derfor er de ovennevnte fenylsubstituerte lavere alkanolene som er væsker ved romtemperatur, de mest foretrukne. Eksempler på nevnte fenylsubstituerte lavere alkanoler er følgende: benzylalkohol, m-klorbenzylalkohol, o-fluorbenzylalkohol, m-fluorbenzylalkohol, p-fluorbenzylalkohol, m-metylbenzyl-alkohol, m-metoksybenzylalkohol, o-etoksybenzylalkohol, m-butoksybenzylalkohol, p-tert.butoksybenzylalkohol, p-tert.butylbenzylalkohol, fenetylalkohol, o-klorfenetylalkohol, m-klorfenetylalkohol, o-metoksyfenetylalkohol, m-metoksyfenetylalkohol, o-propylfenetylalkohol, o-etoksy-fenetylalkohol, p-fluorfenetylalkohol, p-bromfenetylalkohol, 0- propoksyfenetylalkohol, o-butoksyfenetylalkohol, 1- (p-isopropylfenyl)etanol, 3-fenyl-l-propanol, 2-fenyl-1-propanol, 4-fenyl-l-butanol og 3-fenyl-l-butanol.

For bruk som oppløsningsmidler i den regulerte hydrolysen med sterk syre blir ovennevnte fenylsubstituerte lavere alkanoler vanligvis benyttet i nærvær av en vannfase og en sterk syre som promotor for hydrolysereaksjonen. Ifølge et typisk eksempel med bruk av ovennevnte fenylsubstituerte lavere alkanoler i den regulerte hydrolysen med sterk syre, blir en teicoplaninforbindelse eller teicoplaninlignende forbindelse bragt i kontakt med en konsentrert mineralsyre slik som vandig saltsyre (20-37%, vekt/vol), vandig hydrobromsyre (20-62%, vekt/vol) og vandig svovelsyre (10-60%, vekt/vol), i nærvær av et stort molekylart overskudd av benzylalkohol ved en temperatur mellom 35 og 100°C, fortrinnsvis mellom 4 0 og 80°C, i fra ca. 4 til ca. 40 timer hvilket gir deglukoteicoplanin i gode utbytter.

Når det organiske protiske oppløsningsmiddelet velges fra beta-polyhalogenerte lavere alkanoler som ved reaksjonstemperaturen er væsker, er beta-klor- og/eller fluor-substituerte alkanoler med 1-4 karbonatomer foretrukne. Eksempler på nevnte beta-polyhalogenerté lavere alkanoler er: dikloretanol, trikloretanol, diklorfluoretanol, difluor-kloretanol, difluoretanol, trifluoretanol, 1,1,1,3,3,3^ heksafluor-2-propanol, 2,2,3,4,4,4-heksafluorbutanol,

og 2,2,3,3,4,4,4-heptafluorbutanol.

Når ovennevnte beta-polyhalogenerte lavere alkanoler anvendes som oppløsningsmidler for den regulerte hydrolyse-reaks jonen med sterk syre, er vanligvis en viss mengde vann til stede under de typiske reaksjonsbetingelsene. Selv om det fra én side kan være ønskelig å holde mengden av vann så lav som mulig for å hindre uønskede sidereaksjoner som omleiring og/eller isomerisering av chirale sentere i substratet, blir fremgangsmåten for det formål å øke reaksjonshastigheten og forbedre opererbarheten, vanligvis utført i nærvær av en mengde vann mellom ca. 0,03 og ca. 3%

(vekt/volum) av den totale beta-polyhalogenerte alkanol benyttet som organisk protisk oppløsningsmiddel. Vannet kan tilsettes til oppløsningsmidlet eller kan opprinnelig være innbefattet i teicoplaninforbindelsen eller den teicoplaninlignende forbindelse som benyttes som et fuktig utgangs-materiale. En ønsket mengde vann kan også tilføres sammen med den sterke syren som tilsettes som promoter for hydrolyse-reaks jonen til blandingen av oppløsningsmidlet og utgangsmaterialet. Ifølge et typisk eksempel som representerer en utførelse av oppfinnelsen, oppnås det glukoteicoplanin i godt utbytte ved suspensjon av en teicoplaninforbindelse eller teicoplaninlignende forbindelse inneholdene ca. 10% vann (beregnet på vekt) i et stort molekylart overskudd av trifluoretanol i nærvær av et hydrogenhalogenid slik som hydrogenklorid eller hydrogenbromid ved en temperatur mellom 35°C og koketemperaturen for blandingen, fortrinnsvis mellom 40 og 80°C, i et tidsrom på 8-15 timer.

Det protiske organiske oppløsningsmiddel kan også bestå av en blanding av to eller flere av den ovennevnte oppløsnings-midlene. Blandingen av oppløsningsmidler kan bestå av ikke bare to eller flere oppløsningsmidler valgt fra den samme klassen slik som de alifatiske syrene, alkanolene, de beta-polyhalogenerte alkanolene som beskrevet ovenfor, osv., men den kan innbefatte oppløsningsmidler av forskjellig type som er forenelig med hverandre. F.eks. kan den bestå av en alifatisk eller cykloalifatisk alkanol og en beta-polyhalo-genert alkanol og/eller en fenylsubstituert lavere alkanol.

Selv om betegnelsen "oppløsningsmiddel" i foreliggende oppfinnelse er benyttet i bred forstand, er det ifølge foreliggende oppfinnelse ikke nødvendig at hverken teicoplaninut-gangsforbindelsen og/eller den teicoplaninlignende utgangs-forbindelsen eller det sluttlige deglukoteicoplaninprodukt er fullstendig oppløst i reaksjonsoppløsningsmiddelet (eller -midlene) for dannelse av en homogen reaksjonsoppløsning. I noen tilfeller er det faktisk blitt funnet at den regulerte hydrolyseprosessen med sterk syre er meget effektiv når den utføres som en heterogen fasereaksjon hvor både utgangsmaterialet og reaksjonsproduktet bare delvis er oppløst i det valgte organiske protiske oppløsningsmiddel. I noen tilfeller kan reaksjonsblandingen faktisk bestå av tre ad-skilte faser, nemlig fasen med det aprotiske organiske opp-løsningsmiddel, fasen med sterk vandig syre og fasen med det faste utgangsmaterialet og/eller sluttproduktet. Dannel-sen av en enkelt homogen fase eller flere heterogene faser ved den samme reaksjonstemperaturen avhenger hovedsakelig av det aprotiske organiske oppløsningsmiddel, typen av benyttet syre og dens konsentrasjon.

Med oppløsningsmidler slik som de lavere alifatiske syrene og de lavere alfa-halogenerte alifatiske syrene oppnås generelt en homogen fase etter oppvarming av reaksjonsblandingen ved reaksjonstemperaturen fordi teicoplanin-utgangsmaterialene er temmelig oppløselige i denne type oppløsningsmidler og den sterke syren som tilsettes som promotor for hydrolysereaksjonen - når den er nødvendig - er også temmelig oppløselig i nevnte oppløsningsmidler, enten i form av den rene syren eller som en sterkt konsentrert vandig oppløsning derav. Konsentrert saltsyre eller hydrobromsyre i eddiksyre (som oppløsningsmiddel) er et typisk eksempel på et reaksjonssystem hvorved den regulerte hydrolysen med sterk syre utføres som en reaksjon med homogen fase. Med de alifatiske og cykloalifatiske alkanolene, og de fenylsubstituerte lavere alkanolene som defi-nert ovenfor, blir foreliggende regulerte hydrolyseprosess med sterk syre fortrinnsvis utført som en reaksjon med heterogen fase idet reaksjonsblandingen vanligvis består av en organisk fase (oppløsningsmiddelet), en vandig fase

(den sterke syren) og en fast fase (utgangsmaterialetog sluttproduktet).

I noen tilfeller kan det være at den vandige fasen ikke er

til stede fordi syren er fullstendig oppløst i den organiske fasen. Videre, i noen tilfeller kan det være at den vandige fasen og/eller den faste fasen forsvinner i løpet av reaksjonen. Spesielt kan vannfasen forsvinne når reaksjonsbetingelsene fremmer fordampning, og dermed merkbart redu-serer dens andel i reaksjonsblandingen, og/eller øker konsentrasjonen av syren, som da blir fullstendig resorbert i det organiske laget. Den faste fasen kan forsvinne i løpet av reaksjonen p.g.a. modifikasjoner som oppstår i sammen-setningen av den faste blandingen av reaktanter og slutt-produktene hvilket kan forøke dens oppløselighet i det organiske laget.

Den sterke syren som skal til for å tilveiebringe de regulerte hydrolysebetingelsene med sterk syre i foreliggende fremgangsmåte, velges fra sterke mineral- og organiske syrer samt fra sterkt sure kationutvekslingsharpikser (hydrogenform).

Por mineralsyrenes vedkommende er hydrohalogensyrer slik som saltsyre og hydrobromsyre foretrukne, selv om andre sterke mineralsyrer slik som svovelsyre kan benyttes. Disse syrene anvendes vanligvis i en høy konsentrasjon og i et stort molart overskudd enten en vandig syreoppløsning tilsettes til det organiske oppløsningsmiddelet eller en direkte oppløsning av syren i det organiske laget fremstilles.

I noen tilfeller kan således hydrogenbromidet og hydrogen-kloridet oppløses i det organiske protiske oppløsningsmiddelet, og reaksjonsblandingen kan holdes under syremetningsbetingel-ser ved å boble syregassen inn i blandingen i løpet av hele reaksjonstiden. Alternativt blir en konsentrert vandig opp-løsning av syren tilsatt til blandingen av det organiske protiske oppløsningsmiddel og teicoplaninforbindelsen eller den teicoplaninlignende forbindelsen. Konsentrasjonen av den vandige syreoppløsningen varierer vanligvis mellom 20

og 37%-(vekt/vol) for saltsyre og mellom 20 og 62% (vekt/ vol) for hydrobromsyren. Når andre vandige mineralsyrer benyttes, slik som svovelsyre, er konsentrasjonen av den vandige oppløsningen tilsatt til blandingen vanligvis over 10% (vekt/vol), fortrinnsvis mellom 15 og 60%. I dette sistnevnte tilfellet kan imidlertid konsentrasjonen av syren i løpet av reaksjonen fremdeles øke p.g.a. fordampning av vann under reaksjonsbetingelsene.

Når sterke organiske syrer benyttes, kan de oppløses i det organiske protiske oppløsningsmiddelet, eller de kan tilsettes til reaksjonsblandingen som en konsentrert vandig oppløsning derav. Typiske eksempler på sterke organiske syrer som hensiktsmessig anvendes i den regulerte hydrolyseprosessen med sterk syre er den alfa-polyhalogenerte lavere alifatiske syre slik som trikloreddiksyre og trifluoreddiksyre. Andre eksempler på sterke organiske syrer som er egnede i denne fremgangsmåten, er alkansulfonsyrene, cyklo-alkansulfonsyrene og arylsulfonsyrene. Spesielle eksempler på nevnte sulfonsyrer er følgende: metansulfonsyre, trifluormetansulfonsyre, etansulfonsyre, benzensulfonsyre, p-toluensulfonsyre, cykloheksansulfon-syre, kamfersulfonsyre, alfa- og beta-naftalensulfonsyre. Passende sterkt sure betingelser for foreliggende fremgangsmåte kan også tilveiebringes ved å benytte sterkt sure kationutvekslingsharpikser i hydrogenformen. Typisk benyttes harpikser med grunnmasse av sulfonert styren og styren-divinylbenzen. Sterkt sure kationutvekslingsharpikser av nevnte type er f.eks. angitt i Merck Index,

7. utgave, sidene 1.579-1.585. Sterkt sure kationutvekslingsharpikser som er kommersielt tilgjengelige, inneholder vanligvis retensjonsvann. Ifølge en foretrukken utførelse av oppfinnelsen kan imidlertid vanninnholdet reguleres ved å fremstille harpiksen i en tørr form ved å vaske den grundig med metanol og suksessivt tilsette den ønskede mengde i vann. I nevnte tilfelle står den tilsatte vannmengden vanligvis i rimelig forhold til mengden av benyttede oppløsningsmidler for å oppnå det riktige prosentvise inn-hold av vann i hele reaksjonsblandingen, i overensstemmelse med det som er angitt ovenfor.

Ved bruken av sterkt sure utvekslingsharpikser blir et stort overskudd (beregnet på vekt) av harpiksen i forhold til teicoplaninforbindelsen eller den teicoplaninlignende forbindelsen vanligvis benyttet, og det organiske protiske oppløsningsmiddelet for hydrolysereaksjonen velges fortrinnsvis fra de oppløsningsmidler hvori utgangsmaterialet og sluttproduktet er temmelig oppløselige for å oppnå en fullstendig oppløsning og således lette utvinningen av sluttproduktet og spesielt separeringen av harpiksen fra reaksjonsblandingen. De organiske syrene slik som maursyre, eddiksyre og propionsyre, er egnede oppløsningsmidler for dette formål.

Både de sterkt konsentrerte syrene og de sterkt sure kation-utvekslingsharpiksene i hydrogenformen, må være forenlige med reaksjonsoppløsningsmiddelet siden de under reaksjons-med reaksjonsoppløsningsmiddelet siden de under reaksjonsbetingelsene ved foreliggende fremgangsmåte ikke må bevirke uønskede sidereaksjoner med selve oppløsningsmiddelet.

Som en generell illustrasjon av den regulerte hydrolyseprosessen med sterk syre blir teicoplaninforbindelsen eller den teicoplaninlignende forbindelsen oppløst eller suspen-dert i et stort molart overskudd av det valgte organiske protiske oppløsningsmiddelet som allerede kan inneholde et overskudd av den valgte sterke syren. Den sterke syren kan alternativt suksessivt tilsettes til oppløsningen eller suspensjonen av utgangsmaterialet i det organiske protiske oppløsningsmiddelet. Denne sistnevnte metode foretrekkes vanligvis med de sterkt sure kationutvekslingsharpik-sene i hydrogenformen. Reaksjonsblandingen holdes da under omrøring ved den ønskede temperaturen i et tidsrom som er tilstrekkelig til å oppnå tilfredsstillende utbytter av deglukoteicoplanin. Reaksjonstiden bestemmes vanligvis ved å overvåke reaksjonen gjennom analytiske forsøk. For det formål å gi en generell indikasjon uten å begrense foreliggende oppfinnelses omfang, kan reaksjonstiden vanligvis variere mellom 0,5 og 50 timer, avhengig av utgangsmaterialet, oppløsningsmiddelet (-midlene), den sterke syren, dens konsentrasjon og reaksjonstemperaturen. Reaksjonstemperaturen velges på riktig måte for hvert reaksjonssystem idet det tas hensyn til følgende faktorer: utgangsmaterialene, typene av organisk protisk oppløsningsmiddel, typen og konsentrasjonen av syren og deres innbyrdes mengdeforhold. Lavere reaksjonstemperatur krever vanligvis en lengre reaksjons-

tid for oppnåelse av tilfredsstillende omdannelsesutbytter. Generelt utføres den regulerte hydrolyseprosess med sterk syre ved en temperatur mellom ca. 20 og ca. 100°C, når koketemperaturen for reaksjonsblandingen er lavere enn 100°C, mellom ca. 20 og blandingens koketemperatur.

Et foretrukket temperaturområde er mellom 35 og 100°C idet området mellom 4 0 og 80°C er det mest foretrukne.

Dersom hydrolysereaksjonen utføres - i heterogen væskefase

med et oppløsningsmiddel som er svakt blandbart med den konsentrerte vandige oppløsning av den sterke syren (f.eks. primære og sekundære alkanoler og cykloalkanoler med 5-10 karbonatomer, fenylsubstituerte lavere alkanoler, osv.) oppnås gode resultater ved operasjon under redusert trykk.

Et redusert trykk av størrelsesorden 10-50 mm Hg foretrekkes i alminnelighet som det typiske operasjonstrykk.

Når den benyttede sterke syre er en gass oppløst i reaksjons-oppløsningsmiddelet, slik som hydrogenklorid eller hydrogenbromid i beta-polyhalogenerte lavere alkanoler, og oppvarming av blandingen ved den valgte reaksjonstemperatur kan bevirke desorpsjon av nevnte syre og minske dens konsentrasjon i oppløsningsmiddelet, gjenopprettes syrekonsentrasjonen ved kontinuerlig bobling av syregassen inn i den samme reaksjonsblandingen. Når hydrolysereaksjonen utføres i heterogen væskefase med et oppløsnings-middel som er svakt blandbart med den konsentrerte vandige - oppløsning av den sterke syren, og den vandige syredelen kan reduseres vesentlig og/eller syrekonsentrasjonen nedsettes ved fordampning ved oppvarming ved den valgte reaksjonstemperatur og -trykk, kan syrekonsentrasjonen gjenopprettes ved ytterligere tilsetninger av vandig konsentrert syre eller ved bobling av syregass inn i den samme reaksjonsblandingen. Tilsetninger av syre kan kobles med tilsetninger av oppløsningsmiddel, spesielt ved operasjon under redusert trykk, hvilket gir opphav til fjerning av vesentlige mengder oppløsningsmiddel i løpet av reaksjonstiden. Reaksjons-, forløpet følges vanligvis gjennom analytiske tester, høy-ytelse-væskekromatografi (HPLC), for å bestemme den mest egnede reaksjonstiden for hvert spesielt tilfelle.

Når reaksjonen stoppes, foretas utvinning av reaksjonsproduktet på den vanlige måten. Dersom to væskefaser fremdeles er til stede ved slutten av reaksjonene, kan den vandige fasen avstrippes ved fordampning under redusert trykk og deretter avkjøles det organiske laget ved romtemperatur. Hvis en vesentlig mengde sluttprodukt er til stede som et fast bunnfall, separeres det ved filtrering eller sentrifugering. Det resterende organiske oppløsnings-middel kasseres eller, dersom HPLC-testene viser at det inneholder ytterligere mengder av sluttproduktet, blir det satt til side for utvinning av nevnte produkt.

Når mesteparten av sluttproduktet er oppløst i det organiske protiske oppløsningsmiddelet, blir reaksjonsblandingen ytterligere konsentrert for å oppnå et fast bunnfall som deretter separeres på den vanlige måten. Alternativt kan sluttproduktet utfelles fra den organiske oppløsningen ved tilsetning av et organisk oppløsningsmiddel hvori det er vesentlig uooppløselig slik som f.eks. etyleter. Dersom den sterke syren som anvendes, er en sterk kationutvekslings-harpiks i hydrogenformen, frafiltreres harpiksen mens oppløsningen fremdeles befinner seg ved reaksjonstemperaturen og deretter opparbeides væskefasen ifølge konvensjonelle metoder lik de som er nevnt ovenfor.

Det således oppnådde deglukoteicoplanin er vanligvis i form av et syreaddisjonssalt med den samme sterke syren som benyttet for tilveiebringelse av de sterkt sure hydrolysebetingelsene ifølge foreliggende fremgangsmåte. Nevnte syre-addis jonssalter kan ytterligere renses ifølge vanlige rense-teknikker og, spesielt, ved kolonnekromatografi. Syre-addis jonssal tet av deglukoteicoplanin kan omdannes til den frie syren ved konvensjonelle metoder, dvs. behandling med syreakseptorer slik som vandige oppløsninger av baser, vandige oppløsninger av ammoniumsalter av organiske syrer, basiske anionutvekslingsharpikser, etylen epoksyd osv. Om ønsket kan rensemetoden kombineres med syreakseptorbehandlingen for oppnåelse av vesentlig rent deglukoteicoplanin. Kolonne-kromatograf irensing kan f.eks. kobles med kontaktbehandling med en vandig oppløsning av en base eller fortrinnsvis med en vandig oppløsning av et ammoniumsalt av en organisk syre.

En foretrukken rensemetode innebærer følgelig bruken av reversert fase-kolonnekromatografi. Et foretrukket adsorpsjons-middel i dette tilfelle er den silanerte silisiumdioksydgel som har et område for partikkelstørrelsesfo-deling på 0,06-0,2 mm. Elueringsmiddelet kan være en av de hydrofile blandingene som kan anvendes i denne renseteknikk. Representative eksempler på disse hydrofile elueringsmidlene er blandingene av fortynnet vandig oppløsning av ammoniumsalter av organiske syrer, acetonitril eller vannoppløselige lavere alkanoler. Representative eksempler på fortynnede vandige oppløsninger av ammoniumsalter av organiske syrer er 0,1-6% vandige oppløsninger av ammoniumformiat, mens eksempler på egnede alkanoler er metanol, etanol, propanol og lignende.

Foretrukne elueringsmidler er blandingene av vandig ammoniumformiat og acetonitril ved en pH-verdi mellom 6,5 og 7,5 eller blandingene av vandig ammoniumformiat og metanol. Spesielt foretrukket for rensingen av et urent deglukoteico-, planinsalt er en metode som innbefatter: a) anbringelse av en oppløsning av det urene deglukoteicoplanin-syreaddisjonssalt i en blanding av 0,2% vandig ammoniumformiat/metanol/butanol, 1:2:3, eller acetonitril/5% vandig ammoniumformiat 1:9, i kontakt med silanert silisiumdioksydgel og avstripping av oppløsningsmidlene,

b) anbringelse av resten på toppen av en kolonne med silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm), utvikling med

0,6% vandig ammoniumformiat og acetonitril 9:1, kassering av eluatet og forsetting av elueringen med en lineær gradient av acetonitril i vann, fra 1:9 til 3:7 i en hastighet på 200 ml/time i 30 timer.

Det således oppnådde produkt er vesentlig rent deglukoteicoplanin som viser tilfredsstillende fysikalsk-kjemiske og biologiske egenskaper for bruk i de nedenfor angitte an-vendelser.

Vesentlig rent deglukoteicoplanin har en HPLC-titer over

95% (prosent toppområder ved 25 4 nm U.V. bølgelengden),

et vann- og oppløsningsmiddelinnhold fra 10 til 15 vekt-%

og en uorganisk rest under 0,5 vekt-%.

Krystallinsk rent (nåler) deglukoteicoplanin kan oppnås

ved suspensjon av ovennevnte preparat av vesentlig rent deglukoteicoplanin i vann/acetonitril 9:1 og deretter jus-tering av pH-verdien til 1,7 ved tilsetning av 1 N HC1. Den resulterende oppløsning anbringes deretter på en silanert silisiumdioksydgel-kolonne stabilisert med fortynnet (1%) vandig ammoniumformiat, og kolonnen vaskes først med vann og deretter utvikles den med en lineær gradient av acetonitril i vann fra 10 til 40% ved en hastighet på 70 ml/timer i 30 timer. Den oppsamlede fraksjon overvåkes ved HPLC. Fraksjonene inneholdende det rene deglukoteicoplanin oppsamles og hensettes i 24 timer og gis derved krystallinsk rent deglukoteicoplanin. Denne metode kan benyttes direkte på urent teicoplanin eller dets syre-addis jonssalter i de tilfeller hvor de utvinnes fra hydro-lysereaks jonen med tilstrekkelig renhetsgrad. Deglykoteico-planin oppnådd ifølge ovennevnte metoder har følgende egenskaper: a) det er oppløselig i vann ved en pH-verdi høyere enn 9 og vandig metanol, etanol og aceton; svakt

oppløselig i etylalkohol og dimetylformamid,

b) et ultrafiolett absorpsjonsmaksimum som er rapportert på fig. 1 i de medfølgende tegninger, som viser

følgende absorpsjonsmaksima:

- i 0,1 N saltsyre:

- i 0,1 N natriumhydroksyd:

c) et infrarødt absorpsjonsspektrum i nujol, vist på fig. 2, med følgende hovedsakelig og betydelige

absorps jonsmaks ima (cm "*") : ;3250 ( v NH og fenolisk v OH) ;1645 (amid I) ;1610 ( v COO") ;1595 ( 6 NH3<+>) ;1520 (amid II) ;d) et ^"H NMR-spektrum registrert ved 270 MHz med et "Bruker WH-270" spektrometer, i DMSO-dc b ved 50°C ;(indre standard TMS, 6 = 0,00 ppm) som på fig. 3. Noen av de oppnådde "<*>"H NMR-data etter forsøk med D20-utveksling og selektiv dekobling, er som følger: 6(ppm), multiplisitet: 2,85-3,30, 2 dd; 4,12, dd;

4,37, d; 4,45, d; 4,50, s; 5,00, ddd; 5,11, d;

5,14, d; 5,35, d; 5,56, d; 5,60, d; 6,3-7,9, m;

6,55, d; 7,37, d; 7,50, d; 7,61, d; 8,26, d;

8,28, d; 8,5-10,2, br.

d = dublett

dd = dubletter av dubletter

ddd = dublett av dubletter av dubletter

s = singlet

m = multiplet

br = bred

e) en elementæranalyse som indikerer føl-

gende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnittlig):

karbon 58,05%; hydrogen 3,58%; nitrogen 8,23%; klor 5,85%; (etter korresksjon for et vekttap på 11% målt ved termisk gravimetrisk analyse); f) en molekylvekt på 1.199 også bekreftet ved hurtig atomborbardement/massespektrometri-analyse (FAB-MS); f) formel [beregnet på grunnlag av de tilgjengelige data]: h) en retensjonstid (tR) på 12,2 minutter ved analyse ved hjelp av HPLC ved bruk av en pre-kolonne (5 cm) pakket med "Perisorb RP8" (30 ym) fulgt av en kolonne "Hibar RT250-4" forpakket med "LiChrosorb RP8" (10 ym) og eluering med en lineær-trinn-gradient varierende fra 10 til 30% av acetonitril i 0,2% vandig ammoniumformiat; strømningshastighet: 2 ml/min (som en referanse har teicoplanin faktor komponent 2 i publisert britisk patent-søknad 2121401 en t-verdi på 22,4 min i dette systemet); i) en sur funksjon som kan danne salter; 1) en basisk funksjon som kan danne salter;

m) ingen sukkerrest.

På grunnlag av de fysikalsk-kjemiske data og ved sammen-ligning med andre glykopeptidiske antibiotiske stoffer slik som vankomycin or ristocetin, kan følgende struktur forsøksvis tilskrives deglukoteicoplanin: Deglukoteicoplanin har sure og basiske funksjoner, og det kan derfor omdannes til dets salter med baser og syrer ifølge i og for seg kjente metoder. Slike metoder innbefatter reaksjon av den sure eller basiske funksjon hos deglukoteicoplanin med en ekvivalent mengde av den hensiktsmessige base eller syre i vann (foretrukken metode for saltene med baser) eller i en blanding av vann og butanol 30:70 (foretrukken metode for saltene med syrer) og lyofilisering av den oppnådde vandige oppløsning (salter med baser) eller konsentrasjon av vann/butanol-suspensjonen (salter med syrer) for vesentlig å eliminere vannet og deretter tilsetning av et overskudd av etyleter (for å utfelle syresaltene).

Saltene med syrer innbefatter de med farmasøytisk akseptable syrer, f.eks. de avledet fra følgende syrer: saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre, fosforsyre, glykol-syre, melkesyre, pyrodruesyre, malonsyre, ravsyre, fumarsyre, eplesyre, vinsyre, sitronsyre, askorbinsyre, maleinsyre, hydroksymaleinsyre, benzosyre, hydroksybenzosyre, fenyl-eddiksyre, kanelsyre, 2-fenoksybenzosyre, metansulfonsyre og 2-hydroksyetansulfonsyre.

Blant saltene med baser er alkalimetallsaltene og ammonium-og alkylammoniumsaltene foretrukne i betraktning av deres lette fremstilling og ønskede oppløselighetsegenskaper. Saltene med baser omfatter også salter med basiske amino-syrer slik som lysin og arginin. I betraktning av likheten med egenskapene til deglukoteicoplanin og dets salter, omfatter foreliggende oppfinnelse også saltene av nevnte antibiotiske stoffer og fremgangsmåten for deres oppnåelse.

Den in vitro antibakterielle aktivitet til deglukoteicoplanin ble bestemt ved bruk av 2-fold-fortynningsmetoden i mikrotitersystemet. Todd-Hewitt-buljong (Difco) ble benyttet for streptococci og isosensitest-buljong ("Oxoid") for staphylococci og gram-negative bakterier. Natten over ble buljongkulturer fortynnet slik at det sluttlige inoculum

-4

omfattet ca. 10 kolonidannende enheter pr. ml (cfu/ml). Minimal inhiberende konsentrasjon (MIC) ble avlest som den laveste konsentrasjon som ikke viste noen synlig vekst etter 18-24 timers inkubasjon ved 37°C. De oppnådde resultatene er angitt i nedenstående tabell I:

Deglukoteicoplanin ble funnet å være meget aktiv mot staphylococci (S. Aureus, S. epidermidis). Spesielt var det meget effektivt mot forskjellige klinisk isolerte methicillin-resistente staphylococci (S. aureus, S. epidermidis). Noen eksperimentelle resultater er rapportert i tabell II:

I eksperimentell infeksjon hos mus infisert med S. pyogenes viser deglukoteicoplanin en ED^Q-verdi på 0,95 mg/kg ved subkutan administrasjon.

Deglukoteicoplanin og dets farmasøytisk akseptable salter med baser og syrer kan effektivt benyttes som den aktive bestanddel i antimikrobielle preparater benyttet innen human- og veterinærmedisinen for bekjempelse og behandling av infeksjonssykdommer forårsaket av patogene bakterier som er mottagelig for nevnte aktive bestanddeler.

Ved slike behandlinger kan disse forbindelsene benyttes som sådan eller også i form av blandinger i et hvilket som helst mengdeforhold.

Forbindelse i foreliggende forbindelse kan administreres oralt, topisk eller parenteralt, idet den parenterale administrasjon er foretrukket. Avhengig av administrasjons-måten kan disse forbindelsene formuleres til forskjellige doseringsformer. Preparater for oral administrasjon kan være i form av kapsler, tabletter, væskeformige oppløs-ninger eller suspensjoner. Som kjent innen teknikken kan kapslene og tablettene i tillegg til den aktive bestanddel inneholde konvensjonelle excipienser slik som fortynnings-midler, f.eks. laktose, kalsiumfosfat, sorbitol og lignende, smøremidler, f.eks. magnesiumsterarat, talk, polyetylenglykol, bindemidler, f.eks. polyvinylpyrrolidon, gelatin, sorbitol, tragant, akasie, smaksstoffer og akseptable desintegrerings- og fuktemidler. De flytende preparatene som vanligvis er i form av vandige eller oljeaktige opp-løsninger eller suspensjoner kan inneholde konvensjonelle additiver slik som suspenderingsmidler. For topisk bruk kan forbindelsene i foreliggende opfinnelse også prepareres i egnede former for absorpsjon gjennom slimhinnene i nesen og svelget eller bronkialvev, og kan konvensjonelt ha form av flytende spray eller inhaleringsmidler, pastiller, munnvask eller penslingsmidler for svelg. For medikering av øyne eller ører kan preparatet presenteres i væskeform eller halvvæskeform. Topisk anvendelsesformer kan formuleres i hydrofobe eller hydrofile baser som salver, kremer, lotions, sminkeaktige preparater eller pulvere.

Preparater for injeksjon kan ha slike former som suspensjoner, oppløsninger eller emulsjoner i oljeaktige eller vandige bærere, og kan inneholde formuleringsmidler slik som suspensjons-, stabiliserings- og/eller dispergerings-midler.

Den aktive bestanddel kan alternativt være i pulverform for rekonstituering, ved tidspunktet for avlevering, sammen med en passende bærer slik som sterilt vann.

Mengden av aktivt stoff som skal administreres, avhenger

av forskjellige faktorer slik som størrelse og tilstand til vedkommende som skal behandles, administrasjonsvei og

-frekvens, og sykdomsårsaken.

Deglukoteicoplanin og dets farmasøytisk akseptable salter med baser og syrer er vanligvis effektive i en daglig dose mellom ca. 0,1 og ca. 20 mg aktiv bestanddel pr. kilo legemsvekt, fortrinnsvis i 2 til 4 administrasjoner pr.

dag.

Særlig ønskede preparater er de som fremstilles i form av doseringsenheter inneholdende fra ca. 5 til ca. 250 mg pr. enhet.

Representative eksempler på fremstilling av farmasøytiske preparater er som følger:

En parenteral oppløsning fremstilles med

100 mg deglukoteicoplanin-natriumsalt opp-løst i 2 ml sterilt vann for injeksjon;

En parenteral oppløsning fremstilles med

250 mg deglukoteicoplanin-natriumsalt opp-løst i

3 ml sterilt vann for injeksjon.,.

En topisk salve fremstilles med

200 mg deglukoteicoplanin

3,6 g polyetylenglykol 4 000 U.S.P.

6,2 g polyetylenglykol 400 U.S.P.

Foruten deres aktivitet som medikamenter kan forbindelsene

i foreliggende oppfinnelse benyttes som vekstpromotorer for dyr. For dette formål blir en eller flere av forbindelsene i oppfinnelsen administrert oralt i et egnet f6r. Den nøyaktige konsentrasjon som benyttes, er den som skal til for å tilveiebringe det aktive middel i en vekstfremmende effektiv mengde når normale formengder konsumeres. Tilsetningen av de aktive forbindelsene i oppfinnelsen til dyre-f6r oppnås fortrinnsvis ved fremstilling av en passende for-

forblanding inneholdende de aktive forbindelsene i en effektiv mengde og inkorporering av forblandingen i den totale férrasjon.

Et intermediært konsentrat eller f6rsupplement inneholdende den aktive bestanddel kan alternativt innblandes i fSret.

Fremstillingen av slike f6r-forblandinger og fullstendige rasjoner og administrasjon derav er beskrevet i litteraturen (slik som "Applied Animal Nutrition", W. H. Freedman og Co., S. Francisco, USA, 1969, eller "Livestock Feeds and Feeding", 0 og B Books, Corvallis, Oregon, USA, 1977) .

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

L/ G TEICOPLANINKOMPLEKS (dvs. det antibiotiske kompleks inneholdende teicomycinfaktorer A^, A 2 og A^ som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751) oppløses i 90% vandig trifluoreddiksyre (200 ml) og oppvarmes til ca. 80°C i 2 timer. Etter avkjølin- til rom-emperatur helles reaksjonsblandingen i isavkjølt etyleter (1 liter). Det oppnådde bunnfall oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes deretter i luft for oppnåelse av det urene trifluoreddiksyreaddisjons-

salt av deglukoteicoplanin (6,3 g).

5,3 g av dette urene materialet oppløses i 1 liter av en blanding av 0,2% ammoniumformiat/metanol/n-butanol,

1:2:3 og silanert silisiumdioksydgel (20 g); 0,06-0,2 mm; "silanert silisiumdioksydgel 60") tilsettes dertil. Etter hensiktsmessig omrøring strippes oppløsningsmidlene av

under vakuum, og resten anbringes på toppen av en kromatografisk kolonne preparert med 750 g silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm) i vann. Kolonnen utvikles med en blanding av 0,6% vandig ammoniumformiat og acetonitril, 9:1. Eluatet kasseres, deretter fortsetter selueringen med en lineær gradient av acetonitril/vann fra 1:9 til 3:7 ved en hastighet på 200 ml/time i 30 timer.

Fraksjoner av 25 ml hver oppsamles og overvåkes ved HPLC.

De deglukoteicoplaninholdige fraksjonene (200 til 250) oppsamles, og n-butanol tilsettes. Etter omrøring konsentreres blandingen til et lite volum, etyleter tilsettes, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes ved 40°C under vakuum, hvilket gir 0,9 g av vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Krystallinsk deglukoteicoplanin oppnås ved hjelp av

følgende metode:

Til en suspensjon av 0,9 g vesentlig rent deglukoteicoplanin i 250 ml av en blanding av vann/acetonitril 90:10 (v/v) tilsettes 1 N HC1 dråpevis ved romtemperatur til pH 1,7. Den resulterende oppløsning anbringes på en silanert silisium-dioksydgelkolonne (200 g, 0,06-0,2 mm), stabilisert i 1% vandig ammoniumformiat, ved en hastighet på 20 ml/time. Kolonnen elueres med 300 ml destillert vann som kasseres og utvikles deretter med en lineær gradient av acetonitril i vann fra 10 til 40% ved en hastighet på 70 ml/time i 30 timer. En fraksjon på 7 ml hver oppsamles- og overvåkes ved HPLC. Fraksjonene inneholdende rent deglukoteicoplanin (221-239) kombineres og hensettes i 24 timer ved romtemperatur. Det krystallinske faste bunnfall oppsamles ved filtrering, vaskes med en liten mengde (10 ml) acetonitril og deretter med etyleter (100 ml). Dette produktet rekrystalliseres fra en blanding av vann/acetonitril 80:20 (v/v) og det således oppnådde krystallinske faste stoff oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes til slutt under vakuum (2 mm Hg) i 3 dager, hvilket gir 0,55 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin som har de samme fysikalsk-kjemiske egenskapene som angitt ovenfor.

Hydrokloridsaltet av deglukoteicoplanin fremstilles ifølge nedenstående metode: En del på 130 mg krystallinsk, rent deglukoteicoplanin suspenderes i 10 ml av en blanding av acetonitril/vann 2:3

(v/v) og 0,2 ml 1 N HC1 tilsettes dertil. Etter tilsetning av 15 ml n-butanol konsentreres den resulterende oppløsning til 2 ml under redusert trykk (20 mm Hg) ved 4 0°C. Det faste bunnfallet som dannes ved tilsetning av 10 ml etyleter, oppsamles, vaskes med etyleter på filteret, og tørkes under vakuum ved 50°C natten over. Utbytte: 107 mg deglukoteicoplaninhydroklorid.

Eksempel 2

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra antibiotikum L 17046

a) E£§5§tiliiB2_^Y_5D£ibiotikum_L_17046

Antibiotikum L 17046 fremstilles ved å underkaste 10 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks som inneholder teicomycin faktorer A^, A2 og A^, som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751) for syrehydrolyse ved bruk av 150 ml 1 N HC1 ved 80°C i 4 5 minutter under omrøring. Deretter avkjøles denne blandingen til 0-5°C og 37% saltsyre (30 ml) tilsettes. Omrøring opprettholdes i 10 minutter hvoretter det utfelte faste stoffet utvinnes ved filtrering, vaskes med 20 ml 2 N HC1, deretter med etyleter og tørkes over natten over kalium-hydroksydpellets ved romtemperatur, hvilket gir 8,3 g urent antibiotikum L 17046 hydroklorid. En del av dette produktet (6,2 g) oppløses i 80% vandig metanol (500 ml) og silisiumdioksydgel (30 g, 0,06-0,2 mm) tilsettes. Etter tilsetningen av n-butanol (200 ml) fjernes oppløsningsmiddelet under vakuum. Resten anbringes på en silisiumdioksydgel-kromatografi-kolonne (300 g; 0,06-0,2 mm, "silisiumdioksydgel 60") i acetonitril.

Kolonnen utvikles ved sekvensmessig bruk av følgende opp-løsningsmiddelblandinger:

De eluerte fraksjonene kasseres mens kolonnen utvikles ved bruk av en lineær trinn-gradient av acetonitril/vann fra 85:15 (v/v) til ca. 70:30 (v/v) ved en hastighet på

357 ml/time.

Fraksjoner på 25 ml hver oppsamles og overvåkes ved HPLC. Fraksjonene som inneholder antibiotikum L 17046 (fraksjoner 170-200) kombineres, n-butanol (400 ml) tilsettes til de sammenslåtte fraksjonene, og den resulterende blanding konsentreres til et lite volum. Aceton tilsettes deretter til den blakke oppløsning og, etter avkjøling til ca. 10°C, begynner det å danne seg et bunnfall. Etter noen timer er bunnfellingen fullstendig, og det faste stoffet oppsamles deretter ved filtrering, vaskes med aceton, tørkes under vakuum ved romtemperatur, hvilket gir 1,9 g vesentlig rent antibiotikum L 17046 som har følgende egenskaper:

a) den spesifikke rotasjon Cct]^ er -44°

(c = 1%, DMF)

b) det er lett oppløselig i vann ved pH > 8,0, i dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, propylenglykol og

metylcellusol; svakt oppløselig i metanol, nesten uoppløse-lig i n-heksan, etyleter og aceton; c) det har et ultrafiolett absorpsjonsspektrum som viser følgende absorpsjonsmaksima:

- i 0,1 N saltsyre:

- i 0,1 N natriumhydroksyd: - i fosfatbuffer pH 7,4: d) -et infrarødt absorpsjonsspektrum i nujol me følgende observerbare absorpsjonsmaksima (cm ^): 3700-2000, 2970-2850 (nujol), 1655, 1610, 1595, 1515, 1490, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1145, 1060, 1010, 890, 850, 820, 720 (nujol); e) en elementæranalyse, etter at prøven er tørket på forhånd ved ca. 140° under inert atmosfære (vekttap = 8,4%), hvilket indikerer følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 56,74%; hydrogen 4,27%; nitrogen 7,99%; klor 55%%; aske 0,6%; f) følgende R^-verdier i nedenstående angitte TLC-systemer:

g) en retensjonstid (t ) på 10,8 minutter ved analyse ved HPLC med reversert fase ved bruk av en 150 x

4,0 mm "Zorbax ODS" (5-6 ym) kolonne ("Zorbax" er en okta-decylsilan-silisiumdioksydgrunnmasse), og eluering med en lineær gradient fra 0-til 50% oppløsning B i oppløsning A i 40 minutter,

oppløsning A: 25 mM NaH2P04/acetonitril (9,1) bufret ved pH 6,0 med 0,1 N NaOH

oppløsning B: 25 mM NaH2P04/acetonitril (3/7)

bufret ved pH 6,0 med 0,1 N NaOH, med en strømningshastig-het på 2 ml/min; (internasjonal standard: 3,5-dihydroksy-toluen t 5,60 minutter);

h) <1>H MNR-spekteret registrert ved 270 MHz i DMSO-d, ved 60°C og med en prøvekonsentrasjon på 20 mg/ml

(indre standard, TMS 6 = 0,00 ppm). Noen av <1>H NMR-dataene oppnådd etter D20-utveksling og selektiv dekoblingsforsøk er som følger (6ppm, multiplisitet):

1,86, s; 2,81, d; 3,5, dd; %3-4; 4,12, d; 4,32, d; 4,37, d; 4,56, s; 4,95, ddd; 5,07, s; 5,31, d; 5,39, s; 5,51, s; 5,66, d; 6,12, d; 6,29, s; 6,32, s; 6,37, s; 6,42, s; 6,60, d; 6,62, s; 6,64, d; 6,92, d; 7,09, s; 7,12, d; 7,21, d; 7,25, d; 7,43, d; 7,64, d; 7,66, d; 7,70, d; 7,85, s; 8,12, d; 8,46, d; ^ 9,5, s; i) en potensiometrisk titreringsprofil som viser tre titreringshellinger med pH 1/2-verdier lik 5,0 (en ekvivalent), 7,0 (en ekvivalent), og 11 (fem ekvivalenter) i metylcellusolve/vann 4:1 ved titrering med 0,01 N NaOH av oppløsningen av testforbindelsen inneholdende et overskudd av 0,01 N HCL i den samme oppløsningsmiddel-blandingen; 1) en sur funksjon som kan danne salter;

m) en basisk funksjon som kan danne salter;

n) en sukkerrest som er N-acetyl-D-glukosamin.

På grunnlag av de fysikalsk-kjemiske data og ved sammen-ligning med andre glykopeptidiske antibiotiske stoffer, slik som vankomycin og ristocetin, kan følgende struktur forsøksvis tilskrives antibiotikum L 17046:

b) fE§mstillin2_av_de2lukoteicoEla£in

14 g rent antibiotikum L 17046 (fremstilt som angitt ovenfor)

oppløses i 90% vandig trifluoreddiksyre (500 ml) og oppvarmes ved 80°C i 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur helles reaksjonsblandingen i isavkjølt etyleter. Det oppnådde bunnfall oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes i luft for oppnåelse av det urene trifluoreddiksyreaddisjons-

saltet av deglukoteicoplanin (6,3 g) .

En del åv dette urene materialet (5,3 g) oppløses i 1 liter av en blanding av 0,2% ammoniumformiat/metanol/n-butanol, 1:2:3 og silanert silisiumdioksydgel (20 g, 0,06-0,2 mm) tilsettes dertil. Etter passende omrøring fjernes oppløsnings-midlene under vakuum, og resten anbringes på toppen av en kromatografisk kolonne fremstilt med 750 g silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm) i vann. Kolonnen utvikles med en blanding av 0,6% vandig ammoniumformiat og acetonitril, 9:1. Eluatet kasseres, deretter fortsettes elueringen med en lineær gradient av en elueringsblanding oppnådd ved blanding av 3 liter hver av følgende blandinger:

Acetonitril/vann, 1:9

Acetonitril/vann, 3:7

ved en hastighet på 200 ml/time.

Fraksjoner av 25 ml hver oppsamles og undersøkes ved HPLC. De deglukoteicoplaninhbldige fraksjonene (200-250) kombineres, og n-butanol tilsettes. Etter omrøring konsentreres blandingen til et lite volum, etyleter tilsettes, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles ved filtrering, vaskes med

etyleter og tørkes ved 40°C under vakuum, hvilket gir 0,9 g

vesentlig rent deglukoteicoplanin. Dette produktet underkastes ytterligere rensing som i eksempel 1, og dette gir 0,5 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 3

F remstilling av deglukoteicoplanin fra antibiotikum L 17054

a) £^§^stilling_av_antibiotikum_L_17054

5 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks som

inneholder teicomycinfaktorer A^, A2 og A^, som oppnådd ved

fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751) tilsettes til 60 ml 0,5 N vandig saltsyre forvarmet til 80°C under kraftig omrøring.

Omrøring fortsettes, og temperaturen holdes ved ca. 80°C i

30 minutter. Deretter filtreres blandingen hurtig, filtratet avkjøles til 0-5°C og 6 N saltsyre (10 ml) tilsettes. Den resulterende suspensjon omrøres i ca. 15 minutter mens temperaturen holdes ved 0-5°C. Bunnfallet oppsamles, vaskes med 20 ml kald 1 N HC1, og deretter med etyleter og tørkes under redusert trykk ved romtemperatur, og dette gir urent antibiotikum L 17054 hydroklorid (4,5 g). En prøve av dette produktet kan renses ved følgende metode: Urent antibiotikum L 17054 hydroklorid (3 g) suspenderes i en blanding av 0,2 vandig ammoniumformiat/acetonitril 95:5 (v/v) (150 ml). pH-verdien bringes til ca. pH 7,5 med 1 N NaOH, og produktet oppløses. Den resulterende oppløsning anbringes på en kolonne inneholdende 150 g silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm) fremstilt i den samme oppløsnings-middelblandingen. Kolonnen utvikles med en lineær gradient-eluering fra 5 til 21% av acetonitril i 0,2% vandig ammoniumformiat (v/v), idet 20 ml fraksjoner oppsamles, og disse undersøkes ved HPLC. Fraksjoner (70-96) inneholdende L 17054 kombineres, og acetonitrilet fjernes under vakuum. Den resterende vandige oppløsning anbringes på en kolonne av 10 g silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm) i destillert vann. Etter vasking med destillert vann inntil saltene er fullstendig eliminert, elueres produktet med en blanding acetonitril/vann 1:1 (v/v).

Den oppsamlede oppløsning konsentreres under vakuum til et lite volum, og antibiotikumet utfelles ved tilsetning av aceton.

Etter tørking ved romtemperatur oppnås 0,9 g rent antibiotikum L 17054.

L 17054 har følgende egenskaper:

a) den spesifikke rotasjon [a]J°er -34°C (c = 1%, DMF) ; b) det er lett oppløselig i vann ved pH > 8,0, i dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, propylenglykol og metylcellusolve; tungt oppløselig i metanol, nesten uoppløselig i etyleter og aceton; c) et ultrafiolett absorpsjonsspektrum som har følgende absorpsjonsmaksima:

i 0,1 N saltsyre:

- i 0,1 N natriumhydroksyd: - i fosfatbuffer pH 7,4: d) et infrarødt absorpsjonsspektrum i nujol med følgende absorpsjonsmaksima (cm ^): 3700-2000, .™70-2850 (nujol), 1655, 1610, 1595, 1515, 1490, 1460 (nujol), 1375 (nujol), 1300, 1230, 1145, 1060, 1020, 970, 890, 820, 720 (nujol); e) en elementæranalyse, etter at prøven på forhånd har blitt tørket ved 140°C under inert atmosfære (vekttap = 7,8%), som indikerte følgende omtrentlige prosentvise sammensetning (gjennomsnitt): karbon 55,46%; hydrogen 4,50%; nitrogen 7,20%; klor 4,67%; aske 0,2%; f) det har følgende Rf-verdier i de nedenfor angitte TLC-systemer: g) en retensjonstid (tR) på 8,3 minutter ved analyse med HPLC ved bruk av 150 x 4,0 mm "Zorbax ODS (5-6 ym) - kolonne ("Zorbax" er en oktadecylsilan-silisiumdioksydgel-matrise), og eluering med en lineær gradient fra 0 til 50% oppløsning B i oppløsning A i 40 minutter (oppløsning A: 25 mM NaH2P04/acetonitril 9:1, bufret ved pH 6,0 med 0,1 N NaOH; oppløsning B: 25 mM NaH2P04/acetonitril 3:7, bufret ved pH 6,0 med 0,1 N NaOH), med en strømnings-hastighet på 2 ml/min. (indre standard: 3,5-dihydroksy-toluen t 5,60 minutter); h) <1>H NMR-spekteret registreres ved 270 MHz i DMSO-dg ved 60°C og med en prøvekonsentrasjon på 20 mg/ml (indre standard TMS, 6 = 0,00 ppm); noen av "Sj NMR-dataene oppnådd etter forsøk med D20-utveksling og selektiv dekobling er som følger: (6 ppm, multiplisitet): 1,88, s; 2,85, d; ^ 3,5, dd; 3-4; 4,20, d; 4,48, d; 4,50, d; 4,62, s; 4,96, ddd; 5,18 d; 5,31, s; 5,35, d; 5,39, s; 5,68, d; 5,71, s; 6,20, d; 6,41, s; 6,51, s; 6,56, s; 6,74, d; 6,77, s; 6,80, s; 6,80, d; 6,98, d; 7,08, s; 7,15, d; 7,21, d; 7,28, d; 7,35, d; 7,50, d; 7,56, d; 7,64, d; 7,73, d; 7,86, s; 8,42, d; i) en potensiometrisk titreringsprofil som viser tre titreringshellinger" med pH 1/2-verdier lik 5,0 (en ekvivalent), 7,0 (en ekvivalent), og 11 (fem ekvivalenter) i metylcellusolve/vann 4:1 ved titrering av en oppløsning av testforbindelsen inneholdende et overskudd av 0,01 N HC1 i metylcellusolve/vann 4:1 med 0,01 N NaOH i den samme oppløsningsmiddel-blandingen; 1) en sur funksjon som kan danne salter;

m) en basisk funksjon som kan danne salter;

n) to sukkerrester som er D-mannonse og N-acety 1-D-glukosamin.

På grunnlag av de fysikalsk-kjemiske data og ved sanmenligning med struktu-rene sam er kjent for andre glykopeptidiske antibiotiske stoffer, slik sam vankamycin og ristocetin, kan følgende struktur forsøksvis gis antibiotikum L 17054: hvor R<1> representerer gruppen med formelen:

En oppløsning av 2,0 g urent antibiotikum L 17054 i 50 ml 9 0% vandig trifluoreddiksyre oppvarmes ved 80°C i 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur helles reaksjonsblandingen i isavkjølt etyleter (400 ml). Det oppnådde bunnfall frafiltreres, vaskes med etylester og tørkes i luft, hvorved det oppnås urent deglukoteicoplanin som trifluoreddiksyre-addisjonssaltet (1,12 g) som deretter renses som beskrevet i eksempel 1, hvilket gir 0,7 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 4

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

10 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks som inneholder teicomycinfaktorer A^, A^ og A^, som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751) suspenderes i 80 ml benzylalkohol og 20 ml 37% (vekt/vol) vandig HC1 tilsettes til blandingen ved ca. 40°C. Blandingen omrøres under vakuum (20 mm Hg) i 12 timer ved 60°C mens det hver halvannen time tilsettes en blanding av 5 ml 37% vandig HC1 og 15 ml benzylalkohol. Ved slutten av reaksjonen avkjøles blandingen til romtemperatur, og 1 liter etyleter tilsettes dertil. Det urene bunnfall oppsamles, vaskes med aceton og med etylester, og deretter tørkes det under vakuum ved 4 0°C natten over, og dette gir 9,2 g av et urent produkt. Dette produkt oppløses i 250 ml av en blanding av metanol og 0,1 N HC1 3:2 (v/v) og til den resulterende opp-løsning tilsettes 1 liter av en blanding av vann/etylacetat/ n-butanol 4:5:1 (v/v/v). pH-verdien til den vandige fasen justeres til 8,5 ved tilsenting av 1 N NaOH, og det organiske laget blir deretter kassert. Den vandige fasen anbringes ved toppen av en kromatografisk kolonne fremstilt med 750 g silanert silisiumdioksydgel (0,06-0,2 mm) i vann.-

Kolonnen utvikles med en blanding av 0,6% vandig ammoniumformiat og acetonitril 9:1. Eluatet kasseres, og deretter fortsettes elueringen med en lineær gradient av en elueringsblanding oppnådd ved blanding av 3 liter hver av følgende blandinger:

acetonitril/vann, 1:9

acetonitril/vann, 3:7

ved en hastighet på 200 ml/time.

Fraksjoner hver på 25 ml oppsamles og undersøkes ved HPLC.

De deglukoteicoplanin-holdige fraksjonene (200-250) kombineres og n-butanol tilsettes. Etter omrøring konsentreres blandingen til et lite volum, etyleter tilsettes, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes ved 40°C under vakuum, hvilket gir 1,5 g vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 5

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplanin faktor A^

5 g teicoplanin faktor A^ (dvs. teicomycin A^ som oppnådd ifølge US patent 4.239.751) behandles på samme måte som beskrevet i eksempel 4. Utbytte av vesentlig rent deglukoteicoplanin er 0,85 g.

Eksempel 6

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

Til en suspensjon av 5 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks inneholdende teicomycin faktorer A^, A2 og A^, som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge

US patent 4.239.751) i 80 ml 1-oktanol tilsettes 20 ml 37%

(vekt/vol) vandig HC1 ved ca. 40°C, og blandingen oppvarmes ved 65°C og omrøres under vakuum i 13 timer. I løpet av reaksjonstiden gjentas tilsetninger av en blanding av 5 ml 37% vandig HC1 og 15 ml 1-oktanol hver to timer. Ved slutten av reaksjonen avkjøles blandingen til romtemperatur og helles deretter i 800 ml etyleter. Det faste stoffet som utskilles, vaskes med aceton og tørkes under vakuum ved 40°C natten over. Det således oppnådde urene produkt blir deretter opparbeides ifølge den siste delen av eksempel 4, og dette gir 0,6 g vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 7

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra en blanding av teico-planinf aktorer bg A., 5 g av en blanding av teicoplaninfaktorer A2 og A3 (80 vekt-% faktor A2, 10 vekt-% faktor A^, idet resten utgjøres av vann og mineralsalter) suspenderes i 80 ml 1-oktanol, og 20 ml 2 N E^ SO^ tilsettes dråpevis under avkjøling. Reaksjonsblandingen overføres deretter til en rotasjonsfordamper og oppvarmes deretter ved 65°C i en time ved atmosfæretrykk og ytterligere 30 min. under vakuum (20 mm Hg) for å fjerne mesteparten av vannet. Etter omrøring ved 65°C i ytterligere 20 timer av-kjøles reaksjonsblandingen til romtemperatur og helles deretter i 800 ml etyleter. Bunnfallet oppsamles på filter og oppløses deretter i 1 liter av en blanding av metanol/vann 1:3 (v/v). Den resulterende oppløsning ekstraheres to ganger med 500 ml etylacetat, og de organiske lagene kasseres. Det vandige laget ekstraheres deretter to ganger med 500 ml n-butanol, og den alkoholiske oppløsning konsentreres til et lite volum. Ved tilsetning av 500 ml aceton oppnås et fast bunnfall som oppsamles på filter og tørkes under vakuum ved 40°C i 18 timer, hvilket gir 2,25 g av et urent produkt som deretter opparbeides som i den andre delen av eksempel 1, og dettes gir 0,75 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 8

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra antibiotikum L 1704 6

Antibiotikum L 17046 (5,4 g) suspenderes i 90 ml n-oktanol

og 25 ml 2 N I^SO^ tilsettes dråpevis under avkjøling ved

-5°C. Reaksjonen utføres deretter i en rotasjonsfordamper som beskrevet i eksempel 7Omrøring fortsettes i 18 timer,

og produktet isoleres og renses som beskrevet i eksempel 7,

og dette gir 0,3 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin.

E ksempel 9

F remstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplanin faktor A^

En suspensjon av 5 g teicoplanin faktor A2 (dvs. teicomycin A2 som oppnådd ifølge US patent 4.239.751) i 150 ml 1-pentanol mettet med 37% (vekt/vol) vandig HCl omrøres ved 70°C i 6 timer. Deretter blir mesteparten av vannet fjernet gradvis under redusert trykk (20 mm Hg), og den blakke oppløsningen omrøres ved romtemperatur i ytterligere to timer. Etyleter (300 ml) tilsettes deretter til reaksjonsblandingen, og det utfelte faste stoffet oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes i vakuum ved 40°C i 18 timer over kaliumhydroksyd, og dette gir 4,6 g av et urent gult pulver. Dette produktet opp-løses i 500 ml av en blanding av n-butanol/metanol/vann 7:1:2 (v/v/v). Den resulterende oppløsning ekstraheres to ganger

med 250 ml vann mens pH-verdien til det vandige laget justeres til 9 ved tilsetning av 0,1 N NaOH. De kombinerte vandige lagene kombineres til et lite volum under redusert trykk

(20 mm Hg). Deretter tilsettes 0,1 N HCl til pH 5,6, og det faste stoffet som utskilles, oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes ved 40°C i 3 dager, og dette gir 0,88 g av et urent produkt som opparbeides som angitt i siste del av eksempel 4. Utbytte 0,51 g vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 10

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

2,5 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotikum som inneholder teicomycinfaktorer A^, A^ og A^, som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751) behandles på samme måte som beskrevet i eksempel 9 ovenfor ved anvendelse av passende mengdeforhold av oppløsnings-midler og reagenser. Utbytte av vesentlig rent deglukoteicoplanin er 0,16 g.

E ksempel 11

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

20 g teicoplaninkompleks (dvs. det.antibiotiske kompleks som inneholder teicomycinfaktorer A^, A2 og A^, som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751; vanninholdet som bestemt ifølge Karl-Fischer-metoden er 12 vekt-%) suspenderes i 300 ml 0,5 N hydrogenkloridoppløsning i absolutt trifluoretanol, og suspensjonen oppvarmes ved 80°C under omrøring og ved kontinuerlig bobling av vannfritt hydrogenklorid i 12 timer. Etter avkjøling til romtemperatur filtreres reaksjonsblandingen, og det oppsamlede faste stoff vaskes med etyleter og suspenderes deretter i vann

( 1 liter).. pH-verdien til vannsuspensjonen justeres til

1,9 ved tilsetning av 1 N HCl, og den oppnådde oppløsning vaskes med 1 liter etylacetat, kasseres og ekstraheres deretter med 1 liter av en blanding av n-butanol/etylacetat 1:1 (v/v). Den organiske fasen vaskes med vann mettet med NaCl (500 ml) og konsentreres deretter til et lite volum. Ved tilsetning av 500 ml etyleter dannes et fast bunnfall som oppsamlet ved filtrering, vaskes med etyleter og tørkes i luft, og dette gir 18,6 g urent produkt. Dette produktet opp-løses i 1 liter metanol og 25 g silanert silisiumdioksydgel

(0,06-0,2 mm) tilsettes, og oppløsningsmiddelet strippes av

i vakuum ved 35°C. Resten suspenderes i 500 ml av en blanding av acetonitril/5% vandig ammoniumformiat 1:9 og anbringes på toppen av en kolonne preparert med 2,5 kg av den samme silanerte silisiumdioksydgel, bufret med 1 liter 10% vandig ammoniumformiat og stabilisert med 500 ml av en blanding av acetonitril/5% ammoniumformiat 1:9. Kolonnen vaskes deretter med 2 liter av en blanding av vann/acetonitril 1:9 og utvikles deretter med 8 liter av en lineær gradient fra 10 til 40% (v/v) av acetonitril i vann. Fraksjoner på 20 ml hver oppsamles og undersøkes ved HPLC. Fraksjon 71-420 kombineres og konsentreres etter tilsetning av N-butanol (4 liter) til et lite volum. Ved tilsetning av etyleter oppnås et bunn-

fall som oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og deretter tørkes i <s>luft, og dette gir 6,5 g vesentlig rent deglukoteicoplanin. Krystallinsk rent deglukoteicoplanin oppnås ved å underkaste dette produkt den samme metode som beskrevet i siste del av eksempel 1. Utbytte 3,5 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin som har de fysikalsk-kjemiske egenskapene som er beskrevet i det ovenstående.

Eksempel 12

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra en blanding av teico-planlnfaktorer Ap bg A., 10 g av en blanding av teicoplaninfaktorer A2 og A^ (80 vekt-%: faktor A2; 9,5 vekt-%: faktor A3; 10,0 vekt-%: vann; 0,5% vekt-%: uorganiske salter) utsettes for den samme metoden som. i eksempel 11 ved bruk av hensiktsmessige andeler av reagenser og oppløsningsmidler. Utbytte 4g vesentlig rent deglukoteicoplanin. Fra 2 g av dette produktet oppnås 1,15 g krystallinsk rent declukoteicoplanin.

Eksempel 13

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplanin faktor A^, komponent 2

1,5 g teicoplanin faktor A2, komponent 2, oppnådd ifølge britisk patentsøknad 2.121.401, hvor den er identifisert som teicomycin A^, faktor 2) inneholdende 10% vann (Karl-Foscher-metode) utsettes for den samme fremgangsmåten som i første del av eksempel 11 ved anvendelse av de hensiktsmessige andeler av oppløsningsmidler og reagenser. Utbytte 1,2 g urent produkt. Dette produkt underkastes direkte rensingsmetoden for oppnåelse av krystallinsk rent deglukoteicoplanin som beskrevet i siste del av eksempel 1. Utbytte 450 mg krystallinsk rent deglukoteicoplanin.

E ksempel 14

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

2,5 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks som inneholder teicomycin faktorer A^, A^ og A^, som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751, vanninnholdet som bestemt ved Karl-Fischer-metoden er 13,5 vekt-%) suspenderes i 50 ml trikloretanol, og blandingen om-røres ved 90°C i 12 timer under kontinuerlig bobling av vannfritt hydrogenklorid. Reaksjonsblandingen opparbeides deretter som i eksempel 11, og dette gir 700 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 15

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra antibiotikum L 17046

Antibiotikum L 17046 (1,5 g) suspenderes i 35 ml trikloretanol og behandles deretter som i eksempel 13. Utbytte 475 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 16

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

2,65 g teicopalninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks som inneholder teicomycin faktorer A^, A2 og A^ som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751), oppløses under omrøring i 180 ml eddiksyre. Til denne oppløsning tilsettes 20 ml 37% (vekt/vol) HCl, og blandingen oppvarmes ved 80°C i 1 time (reaksjonstiden har blitt bestemt ifølge tidligere forsøk hvor reaksjonen ble fulgt med HPLC). Etter avkjøling til romtemperatur helles reaksjonsblandingen i 1 liter isavkjølt etyleter. Det oppnådde bunnfall oppsamles ved filtrering, vaskes med etyleter og oppløses deretter i 60 ml av en blanding av metanol og 0,1 N HCl 3:2 (v/v). Til den resulterende oppløsning tilsettes 600 ml av en blanding av vann/etylacetat/n-bitanol 4:5:1 (v/v/v) og pH-verdien justeres til 8,5 ved tilsetning av 1 N NaOH. Det organiske laget kasseres deretter, og den vandige fasen kromatograferes gjennom en kolonne fremstilt med 270 g silanert silisiumdioksydgel som beskrevet i siste del av eksempel 4. Utbytte 750 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin.

E ksempel 17

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplanin faktor A^

2,55 g teicoplanin faktor A2 (dvs. teicomycin A2 som oppnådd ifølge US patent 4.239.751) suspenderes under omrøring i 160 ml eddiksyre, og deretter tilsettes 16 ml 40% (vekt/vol)

HBr til reaksjonsblandingen. Etter oppvarming ved 80°C i

en time avkjøles blandingen til romtemperatur, og helles i 1 liter etyleter. Det urene bunnfallet vaskes med etyleter og opparbeides deretter som i eksempel 16, og dette gir 16 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin.

E ksempel 18'

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

2,5 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks inneholdende teicomycin faktorer A^, A2 og A^ som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751), oppløses i 150 ml eddiksyre ved 80°C. Til denne oppløsning tilsettes 480 mg "Dowex HCR-S" (en sterkt sur kationutveksler av styren-divinylbenzensulfonert harpiks i hydrogenform; standard mesh-størrelse: 20-50; harpiksen er på forhånd frigjort for vann ved vasking med fem porsjoner metanol hver på 100 ml og deretter tørket i luft natten over) samt 0,13 ml vann. Blandingen omrøres kraftig i 20 timer, og deretter frafUtreres harpiksen, og vasking foretas to ganger med 100 ml porsjoner eddiksyre inneholdende 10% (v/v) 37% (vekt/vol) vandig HCl. Den organiske oppløsningen kombineres og helles i to liter etyleter. Det urene bunnfallet vaskes med etyleter og opparbeides deretter som i eksem-

pel 4, hvilket gir 600 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin.

Eksempel 19

Fremstilling av deglukoteicoplanin fra antibiotikum L 17046

Antibiotikum L 17046 (2,5 g) oppløses i 150 ml eddiksyre

ved 80°C. Denne oppløsning behandles på samme måte som i eksempel 18. Det urene produktet (utfelt ved tilsetning av

etyleter) renses som i siste del av eksempel 4, hvilket gir 900 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin.

E ksempel 20

Deglukoteicoplanin fra teicoplaninkompleks

10 g teicoplaninkompleks (dvs. det antibiotiske kompleks som inneholder teicomycin faktorer A^, A^ og A^ som oppnådd ved fermentering av stamme ATCC 31121 ifølge US patent 4.239.751; vanninnholdet som bestemt ved Karl-Fischer-metoden er 10,5 vekt-%) suspenderes i 100 ml 0,5 N salt-syreoppløsning i l,l,l,3,3,3-heksafluor-2-propanol, og suspensjonen oppvarmes ved 70°C under omrøring og kontinuerlig boblig av vannfritt hydrogenklorid i 20 timer. Reaksjonsblandingen opparbeides deretter som i eksempel 11, og dette gir 3,8 g vesentlig rent deglukoteicoplanin. Fra 0,8 g av denne prøve oppnås 0,5 g krystallinsk rent deglukoteicoplanin ved anvendelse av metoden som beskrevet i siste del av eksempel 1.

Eksempel 21

DeglukoteicopTanin fra teicoplanin faktor A ?

1,5 g teicoplanin faktor A^, komponent 2 (oppnådd ifølge britisk patentsøknad 2.121.401, hvor den er identifisert som teicomycin A^, faktor 2) inneholdende 10% vann (Karl-Fischer-metoden) underkastes samme fremgangsmåte som i første del av eksempel 20 ved anvendelse av hensiktsmessige andeler og reagenser. Utbytte 55 0 mg vesentlig rent deglukoteicoplanin .

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av deglukoteicoplanin (antibiotikum L 17392) ved omdannelse av et materiale valgt fra teicoplaninkompleks, teicoplanin faktor A2, teicoplanin faktor A3, hver av hovedkomponentene i teicoplanin faktor A2, og en teicoplaninlignende forbindelse med den generelle formel hvori R<1> er hydrogen eller en N-acetyl-D-glukosaminrest; R<2> er hydrogen eller D-mannoserest under den forutsetning at R<1> og R<2> ikke samtidig kan være hydrogen, og en blanding av to eller flere av hvilke som helst av de ovenfor angitte stoffer i et hvilket som helst mengdeforhold, ved regulert, sterk syrehydrolyse, karakterisert ved at syrehydrolysen utføres ved anvendelse av (a) et organisk protisk oppløsningsmiddel, som ved reaksjonstemperaturen er flytende, valgt fra alifatiske syrer og alfa-halogenerte alifatiske syrer, alifatiske og cykloalifatiske alkanoler som, er svakt blandbare med vann, fenylsubstituerte lavere alkanoler, hvori fenyldelen eventuelt kan omfatte (C]_-C4) alkyl-, (C1-C4) alkoksy- eller halogenrester som er svakt blandbare med vann, og beta-polyhalogenerte lavere alkanoler, (b) en sterk syre som er forenelig med oppløsningsmidlet valgt fra sterke mineralsyrer, sterke organiske syrer og sterkt sure kationutvekslerharpikser i hydrogenformen, og (c) en reaksjonstemperatur mellom 20 og 100°C.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det organiske protiske oppløsningsmidlet velges fra alifatiske syrer og alfa-halogenerte alifatiske syrer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det organiske protiske oppløsningsmidlet velges fra alifatiske syrer med 1-5 karbonatomer, og at den sterke syren velges fra konsentrerte, vandige mineralsyrer og sterkt sure kationutvekslingsharpikser i hydrogenformen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det organiske protiske oppløsningsmidlet er eddiksyre, den sterke syren velges fra saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og de sterkt sure kationutvekslerharpiksene i hydrogenformen, og ved at reaksjonstemperaturen er mellom 65 og 85°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det organiske protiske oppløsningsmidlet velges fra alfa-halogenerte alifatiske syrer med 2-5 karbonatomer og også virker som sterk syre som fremmer hydrolysereaksjonen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den alfa-halogenerte alifatiske syren er vandig trifluroeddiksyre med en konsentrasjon mellom 75 og 90%, og at reaksjonstemperaturen er mellom 60 og 90°C.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det organiske protiske oppløsningsmidlet velges fra alifatiske alkanoler og cykloalifatiske alkanoler med minst fem karbonatomer, som ved reaksjonstemperaturen er en væske som er svakt blandbar med vann.