NO166582B - Anordning for parallell gjennomfoering av flere reaksjonssekvenser. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en anordning til gjennomføring av kjemiske prosesser av den art som er angitt i krav l's ingress. En slik anordning egner seg spesielt til syntese av polymermolekyler som nukleotider, proteiner etc. på et bærermateriale som for eksempel glass, kieselgel eller andre egnede materialer.

Vanligvis skjer den kjemiske oppbygning av slike polymer-molekyler i reaksjonskammeret (for eksempel fritter, søyler etc.) i hvilke den første byggesten av et molekyl som skal syntetiseres foreligger bundet på det tilsvarende polymer-materiale, og tilføring av for syntesen nødvendige reagenser enten kan skje manuelt eller automatisk.

Anordninger hvor slike reaksjonssekvenser kan utføres, er kjent fra Alvarado-Urbina, G. et al., Science 214 (1989),

s. 270 ff. og US-patenskrift nr. 4.353.989 og nr. 4.362.699. Alle disse anordninger har en reaktor og tilførselsledninger for polynukleotidets byggestener. Tilførselsledningene for disse reagenser kan forbindes etter hverandre med reaktoren over kompliserte ventilkombinasjoner.

US-patent nr. 2.792.122 beskriver en anordning som er kjennetegnet ved en stabel av like skiver som er anordnet på hverandre i sjikt. Men denne anordning vedrører en filter-anordning som hverken i sin oppbygning eller sin funksjon har noe til felles med foreliggende oppfinnelse. Skivene har bare enhetlige boringer, og ingen av disse er utvidet til et reaksj onskammer.

Det ligger i reaksjons-sekvensenes natur at det er nødvendig med forholdsvis lang tid for oppbygning av et lengerkjedet molekyl. Har man behov for en rekke ulike av de samme byggestener oppbyggede polymer-molekyler, så er den nødven-dige tid inntil alle ønskede synteseprodukter foreligger, ofte uutholdelig lang. Derfor oppstår et behov for en mulighet for simultan oppbygning av en rekke ulike polymer-molekyler fra de samme reagenser. Med dette som bakgrunn har oppfinnelsen oppgaven å frembringe en anordning med hvilken en rekke reaksjons-sekvenser kan gjennomføres simultant. I henhold til oppfinnelsen ble dette oppnådd ved den i patentkravet definerte anordning.

Anordningen tjener spesielt simultan syntese av en rekke DNA- og RNA-segmenter av forskjellig kjedelengde og sekvens på et polymert bærermateriale. På i og for seg kjent måte oppbygges derved DNA-segmentene fra mononukleotider, hvorved ethvert egnet bærermateriale, fortrinnsvis glasspartik-ler og ulike syntesestrategier, fortrinnsvis triester- eller fosfitt-triester-fremgangsmåten, kan anvendes.

I det følgende beskrives oppfinnelsen ved hjelp av de ved-lagte tegninger av et utførelseseksempel. Fig. 1 viser en anordning med ti reaksjonsskiver i perspek-tivisk fremstilling, delvis oppskåret,

Fig. 2 viser et grunnriss av en enkelt reaksjonsskive.

Fig. 1 viser en anordning for samtidig syntese av ti ulike DNA-segmenter, hvorved det som bærer anvendes et polymer-granulat. Den henholdsvis første byggesten av kjeden som skal syntetiseres, befinner seg allerede på bæreren før syntesen settes i gang-

Anordningen består av en stabel konsentrisk på hverandre liggende runde skiver, i hvilke det er utformet flere kanal system. De såkalte reaksjonsskiver 1-10 er tilordnet de ti oligonukleotider som skal syntetiseres, dvs. i hver reaksjonsskive bygges et bestemt oligonukleotid opp. For dette formål utviser eksempelvis den første reaksjonsskive et reaksjonskammer 11. Reaksjonskammeret 11 er et borehull som er anordnet ca. halvveis mellom aksen og skivens rand, og strekker seg ca. over tre fjerdeler av skivens tykkelse fra den øvre overflate. Kammeret tjener til opptak av bærergranulatet. På den øvre rand har kammeret en omløp-ende utvidelse til opptak av en fritte 12, hvilken avlukker reaksjonskammeret 11 oppover. I et konsentrisk uttak av kammerbunnen befinner det seg en ytterligere fritte 13, som utgjør avslutningen av kammeret nedover overfor en fra kammerbunnen til underflaten av skiven førende, gjennomgående boring med svært liten diameter, for eksempel 1 mm.

Reaksjonsskiven 1 utviser foruten reaksjonskammeret 11 fire gjennomgående boringer 14 med den samme lille diameter på for eksempel 1 mm. Disse borehull er overfor reaksjonskammeret anordnet forskøvet henholdsvis 72°, 144°, 216° og 288° .

De andre reaksjonsskiver er oppbygget på samme måte. De er individuelt dreibare i forhold til hverandre om et sentralt forbindelseselement.

Den umiddelbart tilstøtende reaksjonsskive 2 er vist på tegningen dreiet 144°, slik at dennes reaksjonskammer 15 ligger koaksialt til boringen 14 i den første skive 1.

Den neste reaksjonsskive 3, på tegningen ikke lenger vist oppskåret, befinner seg igjen i den stilling hvori reaksjonskammeret - som fremgår ved fritten 16 - ligger i flukt med reaksjonskammeret 11 til skiven 1. Ved skiven 3 ses en boring 17 som er forskøvet 72°.

Stabelen av reaksjonsskiver 1-10 blir begrenset av en øvre tilstøtningsskive 18 for sammenkobling av tilførselslednin-gene for reagensene og en nedre tilstøtende skive 21 for tilkobling av de vekkførende ledninger. Den øvre tilslutningsskive 18 utviser boringer 19, som ligger i flukt med kanalene henholdsvis reaksjonskamrene i reaksjonsskivene, utstyrt med gjenger for påskruing av "Fittings" fra til-førselledningene. Boringene 19 som utgjør ca. tre fjerde-deler av av skivens tykkelse, fortsetter på samme måte som på reaksjonsskiven i gjennomgående trange boringer til plateundersiden. Den nedre tilslutningsskive 21 kan enten ligne den øvre eller den har en enkel samlekanal (ikke vist) såfremt de forbrukte reagenser ikke lenger må føres adskilt.

Reaksjonsskivene 1-10 og tilslutningsskiven 18 utviser på sine nedre overflater renner som ringformig omgir de trange boringer, hvilke renner tjener til opptak av 0-ringer, med hvilke kanalene kan avtettes på overgangen mellom skivene. Dette tetningssystem er på tegningene utelatt for over-siktlighetens skyld.

Over den øvre tilslutningsskive 18 er det anordnet en øvre påpresningsskive 20. Tilsvarende befinner det seg under den nedre tilslutningsskive 21 en påpresningsskive 22. Disse påpresningsskiver 20, 22 overfører kraften fra bolten 2 3 som tjener som sentralt forbindelseselement hvilket befinner seg i en gjennom hele stabelen ført aksial boring og er utstyrt med en forskruing (mutter 24). Ved denne press-kraft på stabelen trykkes skivene slik på hverandre at det oppnås absolutt tetthet for kanalene, og mulig dødt rom innenfor tetningsringene elimineres.

Ved tilsvarende dreining av reaksjonsskivene 1-10 ligger disses reaksjonskamre og boringer slik i flukt at det i

stabelen oppstår fire kanaler som nå fylles med en av mono-nukleotidene A, T, C eller G (på tegningen antydet gjennom piler), hvorved de voksende DNA-stykker simultant forlenges med det tilsvarende nukleotid.

For dette bringes reaksjonskammeret 11 for skive 1 den nødvendige tid inn i den kanal, hvis nukleotid skal tilkobles (befinner seg på tegningen i kanalen i hvis forlengelse T befinner seg, mens kammeret fra skive 2 befinner seg i C-kanalen: herved vil altså C kunne sam-menføyes samtidig som T ved skive 1). Alle reaksjoner og vaskeprosesser som er nødvendig for påbygging av mono-nukleotidene (avspaltning av beskyttelsesgrupper, kapping, evt. oksidasjon), finner også sted simultant (kontinuerlig gjennomflytningsfremgangsmåte). Etter avslutning av en påbygningscyklus dreies de enkelte skivene igjen slik at disses kamre befinner seg i kanalen for det neste nukleotid som skal påbygges. For å dreie skivene, løsnes mutteren 24 og trekkes deretter til igjen. Er syntesen av et DNA-fragment i en av skivene ferdig, så settes dennes kammer i tomposisjonen, hvorved de resterende fire trange boringer i skiven opprettholder de fire forbindelseskanaler for forlengelsen av DNA-segmentene i de andre reaksjonsskiver.

Etter avsluttet syntese av alle DNA-segmenter i de enkelte reaksjonsskiver fjernes - etter nedbygning av anordningen og borttagning av fritten 12 - bærermaterialet som den syntetiserte nukleotidsekvens sitter fast på. Etter avspalting av beskyttelsesgrupper og frigjøring fra bærermaterialet oppnås de ønskede ubeskyttede DNA-segmenter fra råblandingene ved hjelp av en egnet rensingsmetode i ren form.

For å opprettholde den individuelle dreiing av de enkelte reaksjonsskiver i egnede vinkelavsnitt på 72", må det i det minste være anbragt synlige markeringer. Det er dog bedre med en mekanisme som sørger for innklikking ved riktig vinkelposisjon.

Anordningen kan betjenes både manuelt og mekanisk med egnede driftsmidler. Sistnevnte arbeidsmåte kan også kombineres med programstyring.

Den forut som utførelseseksempel beskrevne anordning består av reaksjonsskiver med ca. 60 mm diameter og ca. 10 mm tykkelse. Boringene 14 har som allerede nevnt en diameter på ca. 1 mm. Reaksjonskamrene har en diameter på ca. 6 mm. Disse mål er dog kun av betydning i sammenheng med et bestemt synteseprogram. Anordninger med lignende oppbyg-nings- og funksjonsprinsipp kan utvise mål som kan velges innen vide grenser og kan spesielt være vesentlig større enn det beskrevne utførelseseksempel. Også antall boringer per skive kan være større enn det som er beskrevet ved det ovenstående eksempel. Dette er eksempelvis viktig for peptidsynteser.

Foruten dette er naturligvis også formen på skivene og spesielt reaksjonskamrene på ingen måte begrenset til ut-førelseseksempelet. Således er det for eksempel mulig, istedenfor den sirkelformede anordning av boringene på sirkelrunde skiver, å tenke seg en lineær anordning av boringene og tilsvarende en lineær forskyvning av skivene istedenfor dreining.

Claims (4)

1. Anordning for utførelse av kjemiske fremgangsmåter med en stabel like skiver som er anordnet på hverandre, hvilke skiver er forskyvbare mot hverandre mellom forutbestemte relative posisjoner, og som hver oppviser et antall boringer som er loddrett mot skiveflåtene, hvilke boringer i de nevnte relative posisjoner danner flere adskilte kanaler som løper gjennom stabelen, for gjennomføring av substanser, karakterisert ved at for å utføre kjemiske reaksjonssekvenser har minst én av boringene pr. skive et utvidet tverrsnitt og danner dermed et egnet reaksjonskammer for opptak av et bærermateriale, og ved at det fins - tildekningsmiddel på reaksjonskamrene for å holde tilbake bærermaterialet i kamrene, - tetningsmiddel mellom reaksjonsskivene omkring boringene, hvorved undersiden av reaksjonsskivene oppviser spor som forløper konsentrisk med boringene, i hvilke spor det er anbragt O-ringer, - festeanordning for å holde stabelen sammen, og - reagenstilførsels- og reagensavledningsmiddel.

2. Anordning i henhold til krav 1, karakterisert ved at reaksjonsskivene er sirkelformede og dreibare mot hverandre, og at boringene likeledes er anordnet sirkelformet på disse.

3. Anordning i henhold til krav 2, karakterisert ved at skrittavstandene er like vinkelskritt.

4. Anordning i henhold til krav 1, karakterisert ved at tetningsmidlene for tilbakeholdelse av bærermaterialet i reaksjonskammeret er fritter som er anordnet til reaksjonskammeret i tilsvarende fordypninger.