NO163139B - Fremgangsmaate for fremstilling av n-3 flerumettede fettsyrer og deres derivater, spesielt lavere alkylestere fra tidligere oppkonsentrert foede. - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen vedrører bruk av superkritisk fluid kromatografi for preparativ fremstilling av n-3 flerumettede fettsyrer eller fettsyrederivat, som 20:5 eicosapentaensyre (EPA) og 22:3 docosahexaensyre (DHA).Fremgangsmåten utføres ved hjelp av i og for seg kjent apparatur, omfattende en kromatografisk kolonne og en tilhørende separator. Føde injiseres ved innløpet av kolonnen, og oppsamling og deteksjon av fraksjonen av føden foregår ved utløpet. De nevnte fraksjoner dirigeres til en separator for fraskilling av elueringsmiddel i en ende og separering av de anrikede komponenter ved separatorens motsatte ende, med resirkulering av renset elueringsmiddel til innløpet av kolonnen. Kolonnen er pakket med partikler hvis adsorbsjonsevne og retensjonsevne avhenger av antall karbonatomer og antall dobbeltbindinger i fettsyrekjeden. Herved oppnås en preparativ fremgangsmåte som er driftssikker og stabil under drift, og som gir et uventet høyt utbytte.

Description

Den foreliggede oppfinnelse omhandler fremgangsmåte for fremstilling av konsentrerte flerumettede n-3 fettsyrer og deres derivater fra marine oljer, spesielt lavere alkylestere med høy renhet under anvendelse av superkritisk fluid ekstraksjon på en tidligere oppkonsentrert føde, som inneholder minst 55% av slike essensielle fettsyrer.

Flerumettede fettsyrer og fettsyrederivater er meget viktige for medisinske formål og som helseprodukter, f.eks. som anti-trombotiske midler. Den komplekse kjemien til disse produktene gjør det svært vanskelig å separere de individu-elle komponentene slik at man oppnår produkter med tilstrek-kelig høy renhet og konsentrasjon, særlig å oppnå slike konsentrater av den viktige all cis - 5, 8, 11, 14, 17 - eicosapentaensyre (EPA) og all cis - 4, 7, 10, 13, 16, 19 - docosahexaensyre (DHA) eller deres derivater slik som deres metyl- eller etylestere.

En kjent metode for en første trinns oppkonsentrering av disse n-3 flerumettede syrene er kompleksdannelse av uønskede syrer med urea, som beskrevet i vår tidligere patentsøknad 855147 fra 19. 12. 1985 nå norsk patent nr. 157302. Slik ureafraksjonering kan ifølge vårt tidligere patent bli fulgt av superkritisk ekstraksjon eller preparativ væskekromatografi. Den sistnevnte teknikk resulterte i konsentrater av EPA og DHA som oversteg renhet på henholdsvis 95% og 85% Imidlertid var produktiviteten svært lav. Superkritisk fluid ekstraksjon ved å benytte superkritisk fluid C02 ga høyere produktivitet, men mindre konsentrerte fraksjoner. Metoden for separasjon og rensing av fettsyrebland-inger av EPA og DHA syrer eller estere ved hjelp av "high-performance liquid chromotography" (HPLC) er også kjent fra japansk patent Japanese Kokai J 58. 08339. En tilsvarende metode er også beskrevet av Kelly et al. i Rev. Fr. des Corps Gras, 34 (2), 69, 1987, hvor det ble produsert DHA konsentrater i renhet 83,1% ved hjelp av kombinerte ureafraksjonering og stor skala HPLC.

Ulempen ved slike metoder, ved siden av lav produktivitet,

er kostbar regenerering av løsningsmidler, eksplosjons-

og brannfare. Ulemper er også oppkonsentrerting av tunge forurensninger i elueringsvæsken og vansker med å oppnå et sluttprodukt som er fullstendig fritt fra elueringsvæske. Dette betyr at for ustabile produkter må man benytte meget kostbare opparbeidelsesmetoder slik som molekylardestillasjon som siste prosesstrinn.

Det andre alternativ er å bruke superkritisk ekstraksjon

som beskrevet ovenfor i vårt tidligere patent, og også beksrevet i US patent 4.675132 Stout & Spinelli. Ekstraksjon med superkritiske fluider som C02 resulterer i seleksjon hovedsakelig bare på grunnlag av kjedelengde.

Bruk av superkritisk ekstraksjon er også beksrevet av Eisenbach, i Ber. Bunsengers, Phys. Chem. 88, 1984 side

882 for separasjon av EPA - i form av dets etylestere fra en blanding av fettsyre etylestere fra torskeolje.

Det ville ha vært mer fordelaktig å benytte en ekstraksjons-metode hvor separasjon basert på kjedelengde kunne kombineres med separasjon i henhold til grad av umettethet dvs. antall dobbeltbindinger i molekylene. Dette vil resultere i mer effektiv separasjon som bygger på molekylstørrelse så vel som på grad av umettethet.

En prosess for ekstraksjon og fraksjonering basert på kromatografi med en superkritisk fluid, hvor elueringsmiddelet i den superkritiske tilstand sirkulerer kontinuerlig gjennom en kromatografisk kolonne, kunne være en passende metode. En slik prosess er beskrevet i fransk patentsøknad nr. 2.527934. Blandingen som skal fraksjoneres injiseres periodisk ved inngangen til kolonnen. Komponenter fra føden samles ved enden av kolonnen og dirigeres selektivt mot en separator eller et separatorbatteri, hvor elueringsmiddelet frasepareres ved oppvarming og/eller ekspansjon. Oppsamlet elueringsmiddel renses og bringes tilbake til superkritisk tilstand og resirkuleres i kolonnen.

I henhold til det foreliggende patent har vi funnet at n-3 flerumettede syrer slik EPA og DHA og deres derivater med fordel kan fremstilles ved slik preparativ kromatografi, hvor hovedkomponenten av elueringsmiddelet er fluid i superkritisk tilstand, og hvor kolonnen er fremstilt ved hjelp av et pakkemateriale hvis adsorpsjonsegenskaper også er avhengig av antall dobbeltbindinger i produktet som skal fraksjoneres.

I henhold til oppfinnelsen har vi vist at en slik.metode

er velegnet for produksjon av EPA så vel som DHA, og deri-vatene til disse syrene slik som etylestere.

Hovedtrekkene til metoden i henhold til den foreliggende oppfinnelse er beskrevet i vedlagte krav.

Videre vil karakteristikkene og fordelene ved den foreliggende oppfinnelse fremstå mer detaljert ved den følgende beskrivelse supplert med eksempler.

Det foretrukne elueringsmiddelet for denne prosessen er karbondioksyd, pga. den lette håndterbarhet siden den ikke er giftig og ikke brennbar. C02 har dessuten lave produk-sjonskostnader, gode fysikalsk-kjemiske egenskaper og kritisk temperatur nær romtemperatur.

Den apparatur som ble satt opp var tilnærmet som beskrevet

i den ovennevnte franske patentsøknad nr. 2.527934, som korresponderer til US patent nr. 4.478720, fig. 1.

Den kromatografiske kolonnen ble pakket med et porøst materiale av tilsvarende type og med fysikalske former slik som benyttet i HPLC, men med nøye utvalgte materialer slik at retensjonen avhenger av forskjell i umettethetsgrad og forskjell i molekylstørrelse eller kjedelengde. De materialer som ble valgt var omvendt fase C 18, (Merck Alltech-RP18) (40-65 ;u) og silica (Merck Si60). Imidlertid gis disse pakkematerialene bare som eksempler. Enhver stasjonær fase kan bli valgt forutsatt at dens adsorpsjons-og retensjonsevne avhenger både av molekylstørrelse og antall dobbeltbindinger i fettsyrekjeden. Arbeidstemperaturen var nær romtemperatur slik at ustabile molekyler ikke ble ødelagt. Separasjon av eluent og produkt ble oppnådd ved rask reduksjon av eluentens tetthet hvorved man oppnådde en enkel resirkulering av eluenten.

Før injeksjon på den kromatografiske kolonnen vil det være av verdi å benytte en forkolonne med lite volum og fylt med et tilsvarende pakkemateriale som den kromatografiske kolonnen. Dette vil medføre at man fanger opp tunge eller polare komponenter. Dette vil gi lengre levetid for den kromatografiske kolonnen og øke produktiviteten samtidig som man reduserer forbruk av kostbart kolonnemateriell.

Prosessen og apparaturen er beskrevet i fig. la og lb,

hvor la viser et flytskjema av prosessen og apparaturen og fig. lb er et Mollier diagram som viser et eksempel på en syklus for elueringsmiddelet.

Injeksjon av n-3 fettsyreblandingen i den superkritiske eluenten skjer periodisk, separasjon finner sted langs kolonnen COL. Ved utløpet av kolonnen gir en detektor et signal som tillater produktene å bli sendt periodisk til fellene A, B, C hvor de separeres fra elueringsmiddelet ved isoterm avspenning ved c. Elueringsmiddelet, nå i gassform ved B, blir overført til væskeform ved d, komprimert ved e, oppvarmet og sendt tilbake til kolonneinngangen ved a. Før. den preparative superkritiske fluid kromatografi prosessen (PSFCP) finner sted kan man benytte andre former for innledende prosessering slik som bruk av urea komplekse-ring som fjerner mettede syrer etc, væske kromatografi (HPLC) og bruk av superkritisk ekstraksjon (SCE).

Særlig synes bruken av SCE gunstig for å øke EPA og DHA konsentrasjonene og derved gi et mellomprodukt som er meget gunstig for bruk i en prosess i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1.

Som et mellomprodukt og utgangsstoff ble det benyttet en blanding i form av et mellomprodukt fremkommet ved ureafraksjonering av metylestere av fiskeoljer. Fremgangsmåten er nærmere omtalt i vårt norske patent nr. 157302. De relative forhold mellom n-3 flerumettede forbindelser vil her kunne variere avhengig av råstoff. Følgende betingelser forelå:

Føden ble injisert ved en hastighet på 19,7 g/t. Ved fraksjonering ble det produsert DHA med renhet på 77.7% (3,8

g/t) og EPA med renhet på 55,5% (7,7 g/t), begge som metylestere.

Eksempel 2.

Det ble benyttet samme kolonne, elueringsmiddel og temperatur som i eksempel 1. Inngangstrykket ble senket til 150

bar og den føden som ble benyttet inneholdt 81% DHA (som metyl ester) som var forkonsentrert ved hjelp av superkritisk

fluid ekstraksjon.

Injeksjonshastigheten (fødehastigheten) var 23,5 g/t. Det isolerte produkt inneholdt 90% DHA og produksjonshastigheten økte til 13,1 g/t.

Eksempel 3.

Det pakkemateriale som ble benyttet var silica (Merck Si60) med mindre partikkelstørrelse: 15-25 yum. Elueringsmiddel og kolonnestørrelse var som i eksempel 2. Inngangstrykket var redusert til 140 bar og temperaturen senket til 25°C. Føden inneholdt 45% EPA. Det ble isolert kutt på 11 ml/dag tilsvarende 25% av føden, og analyser viste at dette inneholdt 91% EPA.

Eksempel 4.

Pakkemateriale, elueringsmiddel og kolonnestørrelse som i eksempel 3. Inngangstrykket var 140 bar og temperaturen 35°C. Føden inneholdt 45% EPA som metyl ester.

Det ble isolert et kutt på 20 g/dag som tilsvarte 25% av føden. Analyser viste at dette produktet inneholdt 91% EPA.

Eksempel 5.

Kolonne, pakkemateriale og føde var som i eksempel 3. Temperaturen var øket til 40'C og inngangstrykket redusert til 120 bar. Elueringsmiddelet var C02 hvortil det var tilsatt inntil 10% (vekt) etanol.

Det ble fortsatt produsert et kutt tilsvarende 25% av føden, men mengden av dette produktet var nå øket til mer enn det firedoble, dvs. 90 g/dag, og konsentrasjonen ble bestemt til 89% EPA, en forskjell som ikke er signifikant sammen-lignet med eksempel 3 og 4.

Eksemplene ovenfor er ikke uttømmende med hensyn til hvilke konsentrattyper som kan produseres. For den som er kjent med teknikken vil det være innlysende at sammensetningen av konsentratene kan varieres slik at man også oppnår konsentrater med en viss kombinasjon av to eller flere n-3 fettsyrer eller deres derivater.

For eksempel kan produktiviteten økes ved å benytte et pakkemateriale med uniform (monodisperse) partikkelstørrelse.

Elueringsmiddelet er fortrinnsvis C02 og aktiviteten kan økes og retensjonstiden reduseres ved tilsetting av små mengder av alkohol slik som etanol eller metanol.

Når man benytter superkritisk fluid C02' må temperatur og trykk være over det kritiske punkt (304,2 K og 73,9 bar). Imidlertid (som vist i eksempel 3), kan verdifulle resultater også oppnås ved lavere temperaturer. Når man benytter andre elueringsmidler, f.eks.lavere hydrokarboner, må temperatur og trykk varieres i henhold til det kritiske punkt for disse elueringsmidlene.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av n-3 flerumettede fettsyrer eller fettsyrederivater, spesielt lavere alkylestere av n-3 flerumettede fettsyrer, som 20:5 eicosapentaensyre (EPA) og/eller 22:6 docosahexaensyre (DHA) med høy renhet, under anvendelse av superkritisk fluid ekstraksjon på en tidligere oppkonsentrert føde, som inneholder minst 55% n-3 flerumettede forbindelser karakterisert ved at n-3 fettsyreproduktene isoleres ved hjelp av preparativ superkritisk fluid kromatografi, og inkluderer injeksjon av den føde eller blanding som skal fraksjoneres ved innløpet til kolonnen, oppsamling og deteksjon av fraksjoner av den nevnte føde ved utløpet av kolonnen, og dirigering av de nevnte fraksjoner til en separator hvor elueringsmiddelet separeres, de nevnte komponenter oppsamles fra en ende av separatoren, og det nevnte elueringsmiddel separeres ved andre ende av separatoren, og det rensende elueringsmiddel resirkuleres til innløpet av den kromatografiske kolonnen, og hvor den nevnte kolonne er pakket med materiale slik som porøse silika-gel-partikler eller partikler med en bundet organisk fase, hvis absorpsjons- og retensjonsevne avhenger av antall karbonatomer og antall dobbeltbindelinger i fettsyrekj eden.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av n-3 flerumettede fettsyrer eller fettsyrederivater i henhold til krav 1, karakterisert ved at den stasjonære fase i kromatografikolonnen består av partikler med partikkelstørrelse mindre nn 100 pm, fortrinnsvis 10 ^um eller mindre.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av n-3 fettsyrer eller fettsyrederivater i henhold til krav 1, karakterisert ved at føden ledes gjennom en kromatografisk kolonne pakket med bundet fase silica ved et inngangstrykk på 70-250 bar og en temperatur på 25-80°C.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at føden ledes gjennom en kromatografisk kolonne som er pakket med silica som stasjonær fase med C02 som eluent, ved en temperatur på 25-80 °C og et inngangstrykk fra 70-250 bar.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at før injeksjon på den kromatografiske kolonnen benyttes det en forkolonne med lite volum med tilsvarende stasjonær fase som den kromatografiske kolonnen.