JPH01180849A

JPH01180849A - ドコサペンタエン酸またはそのエステルの濃縮分離方法

Info

Publication number: JPH01180849A
Application number: JP311688A
Authority: JP
Inventors: Hidehiko Hibino; 日比野　英彦; Nobuo Fukuda; 信雄福田; Osamu Nakachi; 仲地　理
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1988-01-12
Filing date: 1988-01-12
Publication date: 1989-07-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、天然脂質原料からドコサペンタエン酸または
そのエステルを濃縮分離する方法に関する。

〔従来の技術〕

ドコサペンタエン酸はメチレン−インターラブテッド型
の炭素数２２個の非共役ペンクエン酸である。ドコサペ
ンタエン酸には、ｎ−６ドコサペンタエン酸であるΔ４
°７・１０・＋３・＋６ドコサペンタエン酸と、ｎ−３
ドコサペンタエン酸であるΔ７”ｉｏ＋　１３＋　１６
＋　１９　　ドコサペンタエン酸が知られている。

ｎ−６ドコサペンタエン酸は陸上動物から検出され、リ
ノール酸系列の代謝上の末端生成物であり、リノール酸
がＴ−リルン酸に代謝される不飽和脂肪酸生成過程にお
ける調節物質として注目されている。またｎ−３ドコサ
ペンタエン酸は特に水産動物に広く検出され、エイコサ
ペンクエン酸からドコサヘキサエン酸への生合成の中間
生成物であるが、近年、ドコサヘキサエン酸からエイコ
サペンクエン酸への逆転換酵素の存在性に生化学分野の
注目が集まり、ｎ−３ドコサペンタエン酸の生体内の挙
動が重要視されている。このようにドコサペンタエン酸
は生化学的に重要視されており、医学分野等での利用に
関して、高濃度の精製品の開発が望まれている。

本発明者が先に開示した高度不飽和脂肪酸の濃縮法は、
トリアジルグリセロール型による濃縮法（特開昭６１−
１９２７９７号）やリン脂質型による濃縮法（特開昭６
２−１２０３４０号）であるが、これらの方法ではドコ
サペンタエン酸の濃度上昇は僅かである。また遊離脂肪
酸や脂肪酸アルコールエステルによる濃縮法（特開昭６
１−１９２７９８号、特開昭６１−２１００４８号）で
もドコサペンタエン酸は、原料の脂肪酸中に共存する多
量成分の高度不飽和脂肪酸であるアラキドン酸（Ｃ２ｏ
、４）、エイコサペンクエン酸（Ｃｚｏ：ｓ）　、ドコ
サヘキサエン酸（Ｃｚｚ、６）等と類似の挙動を見せる
ため、大きな濃度上昇を期待出来ず分離出来ない。

〔発明が解決しようとする課題〕

ドコサペンタエン酸の生化学的価値が認られているにも
関わらず、従来、これらの濃縮物を容易に入手できなか
った。現在、ドコサペンタエン酸の市販品が存在しない
理由は、ドコサペンタエン酸がメチレン−インターラブ
テッド型の二重結合を５個持っているため化学合成経路
が複雑であること、反応過程で二重結合同士が容易に共
役化されるため極めて化学合成が難しいこと、また、ド
コサペンタエン酸は天然脂質原料中の脂肪酸組成におい
て微量成分であり、類似構造の多量成分が共存するため
、その濃縮分離法が確立されていないことが挙げられる
。

特に、ドコサペンタエン酸含有脂質には、一般にドコサ
ペンタエン酸の他にこれと同一炭素数のドコサヘキサエ
ン酸とドコサテトラエン酸、同一不飽和度のエイコサペ
ンクエン酸とヘンエイコサペンクエン酸が共存する。ま
た、クロマトグラフィーにおける物性が非常に近僚して
いるエイコサテトラエン酸（例えばアラキドン酸）とエ
イコサトリエン酸（例えばジ・ホモ・Ｔ−リルン酸）が
共存する。これらの構成脂肪酸は炭素１２〜２４個まで
広い範囲に分布している。この様な状況から、単一操作
のみでドコサペンタエン酸を単離したり濃縮することは
難しい。

またドコサペンタエン酸は炭素数２２個である点から、
この炭素数のみを、低級および中級脂肪酸の分離に使用
する分別蒸留で単離することは理論段から難しく、長期
の加熱は高度不飽和脂肪酸の熱変性を起こすので不適で
ある。長期の加熱処理を伴わない分離方法としては液体
クロマトグラフィーが適しているが、炭素数と不飽和度
の分布が広いため、前処理なしで直接応用できない。前
処理を施しても、高度不飽和脂肪酸が最終溶出物となる
順相吸着クロマトグラフィーは経済的に不通である。

また逆相分配クロマトグラフィーでは不飽和度の高い順
から溶出するため、高級脂肪酸に関して飽和酸やモノエ
ン酸は著しく溶出時間を要する。

長い溶出時間は大量の溶離液の使用を伴い経済性が悪い
。

本発明は、これらの方法を改善し、ドコサペンタエン酸
含有脂質からドコサペンタエン酸を効率的に濃縮分離す
る方法を提供することを目的としている。

（課題を解決するための手段〕本発明の濃縮分離方法は、ドコサペンタエン酸含有脂質
から高度不飽和脂肪酸またはそのエステルを濃縮し、次
いでその濃縮物から逆相分配クロマトグラフィーにより
炭素数２０個以下の成分を除去して炭素数２２個を主成
分とする分画を得、さらに逆相分配クロマトグラフィー
において５〜３０容量％の水を含むメタノールを溶離液
として用い、ドコサペンタエン酸またはそのエステルを
分画することを特徴とする。

本発明において、ドコサペンタエン酸含有脂質は陸上動
物や水産動物を起源として抽出されたものが使用でき、
哺乳動物の脳白質、臓器、血球等に存在するもの、水産
動物では海水魚、淡水魚、貝類に含まれもの等が入手容
易である。ｎ−６ドコサペンタエン酸含有脂質は、肝臓
由来の一般魚油に０．１〜１．０％程度存在し、またｎ
−３ドコサペンタエン酸含有脂質は０．６〜２．５％程
度存在する。上記の各原料脂質中のドコサペンタエン酸
の含量は、中性脂質や極性脂質等の分子種により一定の
範囲内で変化するが、その構成脂肪酸、特に高度不飽和
脂肪酸の種類はあまり変化しない。

本発明では前処理として、高度不飽和脂肪酸またはその
エステルを濃縮するが、その方法は例えば、蒸留によっ
て中級脂肪酸群を留去し、その後尿素付加俸処理を施し
て高級脂肪酸の高度不飽和酸を濃縮する。この際、蒸留
は分子蒸留が好ましい。

次に濃縮物を逆相分配クロマトグラフィーにかける。ド
コサペンタエン酸はペンクエン酸であるため、上記の高
度不飽和酸組成物中のドコサヘキサエン酸やエイコサペ
ンクエン酸の様な成分の共存状態で濃縮することは難し
い。そこでドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン酸と
の炭素数２２個の高度不飽和酸同士の分離の際に、ドコ
サペンタエン酸と非常に類似した溶出挙動を取る炭素数
２０個の高度不飽和酸であるジ・ホモ・Ｔ−リルン酸、
アラキドン酸、エイコサペンクエン酸を除去する。

通常の逆相分配クロマトグラフィーでは同一不飽和度の
場合、より炭素数の少ない高度不飽和酸から溶出するた
め、炭素数２０個の高度不飽和酸は炭素数２２個の高度
不飽和酸より早く溶出する。溶出時間に関して不飽和度
１個は炭素数２個分早くなる現象がしばしば認められる
が、炭素数２０個以上のペンクエン酸やヘキサエン酸で
は不飽和度１個の及ぼす効果が中級から高級飽和脂肪酸
に対する効果に比べて著しく少なく、炭素数の効果が強
い。そのため、ドコサペンタエン酸とドコサヘキサエン
酸の分離はされず、これらの炭素数２２個の高度不飽和
酸は、炭素数２０個の高度不飽和酸群の流出後に溶出す
る。

このようにして、炭素数２０個の高度不飽和酸を除去し
たドコサペンタエン酸を高濃度に含むドコサヘキサエン
酸主成分画分を得る。

分画に使用する液体クロマトグラフィーは分取用のもの
が好ましく、特に高圧、高速、大量分取用のものが好ま
しい、クロマトグラフィーに装着するカラムはできるだ
け大きいものが好ましく、例えば２インチカラム（直径
５５．Ｏｎ、長さ６０ｃｍ）のものが使用できる。カラ
ムに充填する充填材としてはスチレン−ジビニルヘンゼ
ン等の高分子ゲルやシリカゲル、硝酸銀シリカゲル、ア
ルミナゲル等が使用できる。

ン容離液としてはアセトン、メチルエチルケトン、アセ
トニトリル、ジクロルメタン等が使用できる。

分取した炭素数２２を主成分とする画分は、ドコサヘキ
サエン酸を９０％程度も含み、通常のクロマトグラフィ
ーの条件では主要成分の絶対量の影響が大きく、ドコサ
ペンタエン酸の濃縮は困難である。そこでクロマトグラ
フィーの形式、分解性、溶離液極性、溶離液に対する溶
質挙動を検討した結果、高性能大量分取液体クロマトグ
ラフィーに高圧分取用ＯＤＳを充填したカラムを装着し
、溶質が溶けうる限度の極度の極性を持っ溶離液でクロ
マトグラフィーを実施すると、ドコサヘキサエン酸から
ｎ−３ドコサペンタエン酸とｎ−５ドコサペンタエン酸
が同時に別々に濃縮分離できる。

ここで用いる溶離液は５〜３０容量％の水を含むメタノ
ール−水混合液であり、好ましくは７〜２５容量％であ
る。水の量が５容量％未満ではドコサペンタエン酸の分
離性能が低下し、３０容量％を超えると溶離に長時間を
要して経済的に不利である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ドコサペンタエン酸を含む天然脂質原
料から効率良く、多量にドコサペンタエン酸を製造する
ことができる。さらにドコサペンタエン酸の異性体であ
るｎ−３ドコサペンタエン酸とｎ−６ドコサペンタエン
酸を精度良く分離濃縮することもできる。得られたｎ−
５ドコサペンタエン酸は、リノール酸からＴ−リルン酸
へのデルタ−６デサチユラ一ゼ代謝異常の改善剤、およ
びｎ−６系の脂肪酸生合成分野の生化学的研究試薬とし
て、またｎ−３ドコサペンタエン酸は、エイコサペンク
エン酸からドコサヘキサエン酸へのデルタ−４デサチユ
ラ一ゼ代謝異常の改善剤、およびｎ−３系の脂肪酸生合
成分野の生化学的研究試薬として利用できる。

〔実施例〕

以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１イワシ油２００ｇにエチルアルコール９０ｍ１と水酸化
カリウム２．６ｇを加えて室温で一昼夜、窒素気流下で
攪拌しながらエステル化した。得られた脂肪酸エチルエ
ステル組成物中の代表的な高度不飽和脂肪酸は、エイコ
サペンクエン酸１４．８％、ｎ−５ドコサペンタエン酸
０．５％、ｎ−３ドコサペンタエン酸１．７％、ドコサ
ヘキサエン酸９．８％、その他７３．２％であった。次
いでエチルエステルを分子蒸留機（柴田科学社製Ｍ　Ｓ
　３００）を用いて３　Ｘｌ０−３）−ル、１２０℃で
分留した。前留分を４０％カットし、後留分１２０ｇを
得た。後留分の脂肪酸組成はエイコサペンタエン１２３
．７％、ｎ−６ドコサペンタエン酸０．８％、ｎ−３ド
コサベンクエン酸２．７％、ドコサヘキサエン酸１５．
７％、その他５７．１％であった。

後留分エチルエステル１１０ｇ、尿素５００ｇ、メタノ
ール１．８１に調製して６０℃３時間攪拌後、水冷中で
１０℃まで冷却攪拌した。析出した尿素付加物を濾過後
、冷メタノール０．５βでケーキを洗浄した。

母液に再び尿素５００ｇを加え上記操作を繰り返した。

得られた母液を集め濃縮後、ヘキサン１βで抽出し尿素
非付加物３７ｇを得た。得られた尿素非付加物の脂肪酸
組成はエイコサペンクエン酸４６．１％、ｎ−５ドコサ
ペンタエン酸１．５％、ｎ−３ドコサペンタエン酸４．
９％、ドコサヘキサエン酸３１．２％、その他１６．３
％であった。

次いで尿素非付加物３５ｇをヘキサンに溶解し、スチレ
ン−ジビニルベンゼンの共重合体であるハイポーラス樹
脂（三菱化成工業■製ＨＰ−２０）を充填した中圧ガラ
スカラム（カラム径Ｘカラム長さ：　５　ｌＪＸ　５０
ｃｍ、充填容積１４１３ＣＪ）に付した。溶離液はアセ
トンを３０ｍｆ／分の流速で流し１フラクション５０ｍ
βずつ分画し、溶出液の一部を液体クロマトグラフィー
用屈折率検出器（山善社製）でモニターした。フラクシ
ョン番号４２以下（炭素数２０個以下の高度不飽和脂肪
酸）をカットし４２〜５３の区分を分取した。フラクシ
ョン番号４２〜５３の回収された溶質物は９．３ｇで回
収率２７％であった。

さらに回収された溶出物の炭素数２０個以上の高度不飽
和脂肪酸組成は、エイコサペンクエン酸０．８％、ｎ−
６ドコサペンタエン酸３．０％、ｎ−３ドコサペンタエ
ン酸９．８９１０、ドコサヘキサエン酸８６．１％であ
った。次いでこの溶出物９．０ｇを水酸化カリウム−エ
タノール溶液で加水分解し希塩酸で中和し脂肪酸８．２
ｇを得た。

得られた脂肪酸の１％メタノール溶液を調製し、全自動
分取型高性能液体クロマトグラフィー（東洋曹達工業社
製、　ＨＬＣ−８３７）に○ＤＳ（オクタデシル基を化
学結合させたシリカゲル）充填カラム（○Ｄ　Ｓ　−１
２０Ｔ、　　カラム径Ｘカラム長さ：５５ＩＩｍ×５Ｑ
ｃｍ、充填容量１４２５ＣＪ）を装着し、溶離液メタノ
ール／水（９０／１０　ｖ／ｖ）を３０ｍ１Ｚ分の速度
で流しながら１ハツチ当たり１０−を自動注入した。ピ
ーク検出は屈折率検出器および紫外部吸収スペクトル検
出器（検出波長２１０ｎｍ）を用いてモニターした。

第１図に示したクロマトグラムが得られ、溶剤流出後の
先頭成分（Ａ区分）をカントし第２成分を分画区分Ｂ、
第３成分を分画区分Ｃとしてフラクションコレクターを
用いて分取した。１ハツチサイクルは９０分で、原料溶
液を９０分毎に自動充填し３０サイクルで約４５時間を
要して、炭素数２２個以上の高度不飽和脂肪酸から、ｎ
−３ドコサペンク工ン酸３００ｍｇ、　ｎ　−６ドコサ
ペンタエン酸９０■を得た。

目的物の分画区分ＢおよびＣを三フッ化ホウ素メタノー
ル法でメチルエステル化し、キャピラリークロマトグラ
フィー（液相：カーボワックス２０Ｍ、２５ｍ、１８０
℃恒温、ヒューレソトバソカード社製、ＨＰ５８８０Ａ
）で脂肪酸組成を測定した。その結果、目的物の分画区
分Ｂはｎ−３ドコサペンク工ン酸９５％が得られ、同時
に分画区分Ｃからｎ−６ドコサペンク工ン酸８９％が得
られ、これらの区分にはメインピーク以外に数本の微小
ピークが認られた。

また、目的物の分画区分ＢおよびＣについて、ガスクロ
マトグラフィー・マススペクトロメトリー分析（ＧＣ−
ＭＳ　：　Ｅ　Ｉ法、７０ｅＶ）を行った。

第２図にｎ−３ドコサペンタエン酸のスペクトラムを示
した。これにはｎ−３ドコサペンタエン酸特有のｍ　／
　ｚ　＝　１４８のピークが認られた。また、第３図に
ｎ−５ドコサペンタエン酸のスペクトラムを示した。こ
れにはｎ−６ドコサペンタエン酸特有のｍ／２＝１５０
のピークが認られた。

実施例２実施例１で得られた炭素数２２個以上の高度不飽和脂肪
酸原料を１重量％を含むメタノール溶液に調整し、全自
動分取型高性能液体クロマトグラフィー（東洋曹達工業
社製、ＨＬ　Ｃ−８３７）に０ＤＳ（オクタデシル基を
化学結合させたシリカゲル）充填カラム（ＯＤ　Ｓ　−
１２０Ｔ、カラム径×カラム長さ：　５５ｍ　Ｘ　６０
ｃｍ、充填容量１４２５ｃｎ＋）を装着し、溶離液メタ
ノール−水（８０／２０　ｖ／ｖ）を流速５０１１／分
で１ハツチ当たり１０璽朧を自動注入した。ピーク検出
は、屈折率検出器および紫外部吸収スペクトル検出器（
検出波長２０５ｎｍ）を用いてモニターした。

溶剤流出後の先頭成分（Ａ区分）をカントし、第２成分
を分画区分Ｂ、第３成分を分画区分Ｃとしてフラクショ
ンコレクターを用いて分取したつ１ハツチサイクルは２
４０分で、原料溶液を２４０分毎に自動充填し、３０サ
イクルで約１３０時間を要して、炭素数２２個以上の高
度不飽和脂肪酸から、ｎ−３ドコサベンクエン酸２５０
■、ｎ−５ドコサペンタエン酸８０■を得た。

目的物の分画区分ＢおよびＣを三フッ化ホウ素メタノー
ル法でメチルエステル化し、キャピラリーガスクロマト
グラフィー（液相：カーボヮソクス２０Ｍ、２５ｍ、１
８０°Ｃ恒温、ヒューレソトパソカード社製、ＨＰ５８
８０Ａ）で脂肪酸組成を測定した。

その結果、目的物の分画区分Ｂはｎ−３ドコサペンク工
ン酸９４％が得られ、同時に分画区分Ｃからｎ−６ドコ
サペンク工ン酸９０％が得られ、これらの区分にはメイ
ンピーク以外に数本の微小ピークが認られた。

また、目的物の分画区分ＢおよびＣについて、ＧＣ−Ｍ
Ｓ分析を行い、実施例１と同様のスペクトラムが得られ
た。

比較例１実施例１において、最終工程で溶離液としてメタノール
（９９％）を用い、その流速を３０−７分、２０ｍ１／
分、ｌＱｍｆ／分とした以外は、実施例１と同様に実施
した。

得られたクロマトグラムは、流速を変えても、溶剤流出
後の先頭成分（ドコサヘキサエン酸）と第２成分（ｎ−
３ドコサペンタエン酸）および第３成分（ｎ−６ドコサ
ペンタエン酸）が重複して流出し、ドコサヘキサエン酸
にマスクされてｎ−３ドコサペンタエン酸とｎ−５ドコ
サヘンクエン酸が分離できなかった。

比較例２実施例１において最終工程で溶離液としてメタノール−
水（６０／４０　ｖ／ｖ）を用いた以外は、実施例１と
同様に実施した。１バッチサイクル１２時間以上かけて
も、目的物を分取することができなかった。

比較例３実施例１において中間工程の炭素数２０以下の成分を除
去する工程を省略した以外は、実施例１と同様に実施し
た。その結果、得られたクロマトグラムは、炭素数２０
の高度不飽和脂肪酸と炭素数２２のドコサペンタエン酸
とが重複するため、ｎ−３ドコサペンタエン酸およびｎ
−５ドコサペンタエン酸は、全く分離不可能であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１において得られたクロマトグラムで
ある。第２図は、実施例１において得られたｎ−３ドコサペン
タエン酸のＧＣ−ＭＳ−スペクトル図である。第３図は、実施例１において得られたｎ−５ドコサペン
タエン酸のＧＣ−ＭＳ−スペクトル図である。

Claims

【特許請求の範囲】

ドコサペンタエン酸含有脂質から高度不飽和脂肪酸また
はそのエステルを濃縮し、次いでその濃縮物から逆相分
配クロマトグラフィーにより炭素数２０個以下の成分を
除去して炭素数２２個を主成分とする分画を得、さらに
逆相分配クロマトグラフィーにおいて５〜３０容量％の
水を含むメタノールを溶離液として用い分画することを
特徴とするドコサペンタエン酸またはそのエステルの濃
縮分離方法。