NO160923B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av fysiologisk virksomt, vannopploeselig hemin-arginat og hemin-lysinat. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av fysiologisk virksomt, vannoppløselig hemin-

arginat eller hemin-lysinat for anvendelse ved fremstilling av tabletter eller kapsler, eller i ampuller for injeksjon efter rekonstituering, f.eks. med en steril saltoppløsning.

Hemin forekommer som pr.ostetisk gruppe i organismen i hemoglobin, i de fleste cytokromer og i visse enzymer. Syntesen av hemoglobin skjer i benmargen. Når heminholdige proteiner nedbrytes, frigjøres hemin som bare i liten utstrekning kan anvendes til syntese av nye heminproteiner under normale fysiologiske betingelser. Årsaken til nedbrytningen er at heminoksygenase nedbryter heminet til biliverdin, som i sin tur kan reduseres til bilirubin. Nativt, intakt hemoglobin fungerer forståelig nok ikke som substrat for heminoksygenase.

Defekter i hemoglobinsyntesen kan enten bero på forstyrrelser i syntesen av hemin eller i syntesen av globinkjedene. Forstyrrelsen ved dannelse av hemin kan bero på at a) en

for syntesen nødvendig komponent mangler, eller b) nedsatt funksjon hos et enzym som katalyserer syntesen.

a) Mangelen på jern er den faktor som kan begrense syntesen av hemin. Organismens daglige behov av jern (1-2 mg) opp-

nås i maten. En jernfattig kost eller eventuelt forekomst av jernbindende forbindelser i maten kan føre til jernmangel.

Også forstyrrelser i absorpsjonsmekanismen for jern kan

føre til jernmangel selv om maten skulle inneholde til-strekkelig jern. Uavhengig av årsaken til jernmangelen, leder denne før eller senere til jernmangelanemi.

Ved den sjeldent forekommende Bg-vitaminmangelen, absorbéres jern på normal måte av organismen, men tilgodegjørelse av dette i cellene er forhindret. Som en følge av dette oppstår en viss form for sideroblastanemier.

Ved behandling av jernmangelanemier anvender man enten

per oralt inntatte tabletter (f.éks. jernsulfat eller jern-glukonat) eller mer sjelden av injeksjonspreparater (jern-sorbitol). Når absorpsjonsmekanismen for jern er forstyrret, hjelper ikke de ovennevnte preparater i tablettform. Jernet

har ikke engang; evnen til å trenge inn i tarmslimhinnens celler. I motsetning til uorganisk jern absorberes hemin-jern, der jernet er bundet til hemin, av cellene i tarmens slimhinne og unngår i denne form absorpsjonsforstyrrelsen selv i slike tilfeller hvor resistens mot behandling fore-ligger. Således representerer heminjernet det eneste kjente alternativ til oral terapi i behandlingsresistente tilfeller. Heminjernets absorpsjon er også hos helt friske mennesker blitt funnet å være 4-5 ganger bedre enn for det uorganiske jern. (Suomen LSSkSrilehti 26/81, årg. 36, s. 2071-2072;

R. SeppSnen; H. Takkunen).

b) Syntesen av hemin er enzymatisk styrt. Hos de enzymer som katalyserer heminsyntesen, kan en nedsatt effekt fore-komme, enten arvelig betinget eller som følge av ytre om-stendigheter. En følge herav er alltid en nedsatt dannelse av hemin som kan ytre seg som en utvikling av et porfyri-sykdomsbilde, så som spesielle sideroblastanemier eller

utvikling av andre sykdomstilstander.

Porfyriene hører til den mest bemerkelsesverdige sykdoms-gruppen som oppstår som følge av en nedsatt funksjon av enzymer. Hos porfyripasientene oppsamles i organismen mellomprodukter, porfyringer, fra heminsyntesen. Disse utsondres i økende mengder også i urinen og avføringen. De fleste porfyritilstander ytrer seg i form av antall som kan være meget vanskelige å bekjempe.

I visse tilfeller viser den nedsatte funksjonen hos enzymer, som deltar i heminsyntesen, seg som sideroblastanemier av forskjellig type og ikke som porfyri. Man skiller også ved sideroblastanemier mellom nedarvede og ervervede former.

Behandlingen av porfyrier har hittil basert seg nærmest på å unngå visse legemidler samt på å gi pasienten rikelig med karbohydrater ved selve sykdomsanfallet. Behandlings-resultatene har vært temmelig dårlige. Når årsaken til porfyriene er klarlagt, har man som behandling i alt økende omfang bégynt å anvende tilførsel av heminforbindelser

(hematin) intravenøst. Hematin har vært effektiv ved behandling av porfyrianfall, men har samtidig medført tromboflembitt hos over 50% av pasientene. Dette hematin er _ dessuten temmelig labilt og egner seg derfor ikke for fremstilling i industriell målestokk. Således finnes det ytterst få muligheter til effektivt å behandle porfyripasienter.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å komme frem

til en vannoppløselig heminforbindelse for behandling av anemi-tilfeller av forskjellig type der heminmolekylene inneholdende jern allerede er tilstede. Forbindelsen er tenkt anvendt spesielt ved porfyri der den normale produksjon av hemoglobin av forskjellige årsaker er forstyrret. Forbindelsen skal kunne gis peroralt i form av tabletter eller kapsler eller også i form av ampuller for injeksjon, hvorfor den bør være vannoppløselig.

Hemin, som er meget tungt oppløselig i vann, kan renfrem-stilles fra blod ved at man fra en vannoppløsning av hemolyserte erytrocytter ekstraherer heminet med en blanding av aceton-salt-syre eller eter-eddiksyre. En annen metode går ut på å ekstra-here heminet med aceton i nærvær av f.eks. histidyl-histidin. pilocarpin eller imidazol ved pH=7,0 (Int.J.Biochem, 1973,

4, 259-267; N.W. Wakid og K.Y. Helou; "Haem-Globin separations in aceton and the reduction of nitrite in human erythrocytes").

I PCT-patentansøkning 813749 (PCT/FI81/00026) beskrives

en metode for fremstilling av et vannoppløselig heminkonsentrat, hvis innhold av hemin er ca..40 vekt% og resten består av "blodsubstans" av ukjent natur. Dette produkt er tenkt å skulle anvendes i frysetørket form for å øke jerninnholdet i nærings-midler eller som legemiddel mot anemi. .Ulempen med denne metode er at man som sluttprodukt oppnår en blanding av hemin og "blodsubstans". Eftersom denne "blodsubstans" er uenhetlig er blandingen ikke egnet for injeksjon.

For behandling av porfyri har man hittil på sykehus anvendt en på stedet tilberedt blanding av hemin oppløst i en steril natriumkarbonatoppløsning (hematin). Denne oppløsning er ustabil, og fremstilling av et kommersielt produkt i større målestokk er derfor ikke mulig. Dessuten gir hematin tromboflebitt ved injeksjonsstedet i ca. 50% eller mer av tilfellene, sannsynligvis beroende på oppløsningens høye pH. Dette er en stor ulempe som i høy grad begrenser dets anvendelse.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en vannoppløselig heminforbindelse, nemlig hemin-arginat eller -lysinat, ved at man går ut fra et i vann tungtløselig, krystallinsk hemin og lar dette reagere med L-lysin eller L-arginin i en oppløsningsmiddelblanding inneholdende vann og aceton. Oppløsningsmiddelblandingen, dvs. forholdet organisk oppløsningsmiddel: vann er overraskende kritisk for å oppnå et medisinsk anvendelig produkt. Det kan konstanteres at vanninnholdet i oppløsningsmiddelblandingen er så lav (ca. 7%), at hverken hemin eller det forholdsvis lett oppløselige L-arginin løser seg deg deri. Reaksjonen skjer med god om-røring og med en fortløpende kontroll av oppløsningens pH.

Den herved dannede forbindelsen fraskilles og tørkes. Denne heminforbindelsen kan således oppnås i tørr form og er vann-oppløselig, hvilket fra medisinsk og farmasøytisk teknisk syns-punkt er av stor betydning.

Heminmolekylet inneholder to karboksylgrupper som kan reag€>re med L-lysinets eller L-argininets basiske aminogrupper.

Hemin-arginat, fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, ble oppløst i vann, og pH ble målt og sammenlignet med pH i en mekanisk blanding av hemin og L-arginin oppløst i vann i forskjellige tidsintervaller. Resultatene av pH-målingene er pre-sentert i Tabell 1.

Av pH-målingene fremgår det at hemin-arginatet og hemin-lysinatet har en stabil pH på ca. 8 i opptil 24 timer. Den mekaniske blandingens pH synker derimot meget saktig, sann-synligvis beroende på en meget langsom omsetning mellom heminets karboksylgrupper og L-aminosyrens aminogruppe, Således kan man ikke få et terapeutisk anvendelig produkt på denne måte. Man kan konstantere at heminarginatet og heminlysinatet, som fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse,' består av en kompleks forbindelse, der L-aminosyren har reagert- med heminets karboksylgrupper.

For å utforske det mest egnede molforhold mellom- de to " reaksjonskomponenter samt den mest egnede oppløsriingsmiddel-blanding ble følgende forsøk med hemin og arginin foretatt.

Krystallinsk hemin og L-arginiri får under kraftig omrøring reagere i molforholdene 1:2 og 1:3 i en oppløsningsmiddelblanding bestående av et organisk oppløsningsmiddel og vann i forskjellige mengdeforhold. De herved dannede felhinger frafiltrerés, vaskes og tørkes.

Vannoppløseligheten bestemmes ved at ca. 1,0 g av hemin-arginatet fra hvert forsøk oppløses i 50 ml destillert vann med kraftig omrøring i 1 time.

Oppløsningene sentrifugeres ved ca. 3500 omdreininger

pr. minutt. Residuet vaskes med 10 ml "destillert vann og 10

ml aceton, tørkes og veies. Den uoppløselige'resten består ■ hovedsakelig av ureagert hemin. Resultatene er angitt i den nedenstående Tabell 2.

Det tjæreaktige stoff som oppstår ved visse forsøk var umulig å få i tørr pulverform.

Av forsøkene fremgår at det mest fordelaktige molforhold hemin: arginin er 1:3 med oppløsningsmiddelblandingen aceton: vann (volumforhold 15ri).

For å undersøke: hvilken effekt heminforbindelsene har

på vevet omkring venen ved infusjon, ble de infusert i doser på 5 mg/kg i ørevenen på California White kaniner. Som sammen-ligningsstoff ble anvendt en heminkarbonatoppløsning av konven-sjonell type (hematin)).

Efter infusjon aiv heminarginatoppløsningen forble vevet omkring venen helt normalt, dvs. ingen steril inflammasjon (tromboflebitt) ble fremkalt.

På samme måte forholdt seg ørevenen og omgivende vev

ved infusjon av tilsv/airende heminlysinatoppløsning. Forbind-elsene forårsaker således ikke tromboflembitt ved infusjon.

Da en heminkarbonatoppløsning ble infusert på tilsvarende måte, ble venens omgivende vev rødt og irritert, dvs. en tydelig steril inflammasjon {(tromboflebitt) oppstod. Ennu tre døgn efter infusjonen av heminkarbonatoppløsningen forelå en klar tromboflebitt.

Når man ønsker å bestemme hvor fysiologiske eller kroppsegne de forskjellige vannoppløselige heminforbindelsene er, benytter man seg av heminoksygenase-enzymets evne til å nedbryte de aktuelle forbindelser. Kroppens eget substrat for heminoksygenase utgjøres av metemalbumin som nedbrytes derav til biliverdin som senere reduseres videre ved innvirkning av biliverdinreduktase til bilirubin. Således nedbrytes det overskudd av hemin i organismen som denne ikke kan tilgode-gjøre seg, ved innvirkning av i første hand heminoksygenase til bilirubin og nær beslektede forbindelser, som derefter utsondres på vanlig måte. Reaksjonskjedens tidsbestemmende, "rate limiting", enzym er således heminoksygenase.

Ved de enzymatiske analyser som er utført for å undersøke bl.a. heminarginatets og heminlysinatets evne til å fungere som substrat for heminoksygenase, ble det som sammenlignings-substrat anvendte metemalbuminets aktivitet satt lik 100. Heminarginatet og heminlysinatet gav da en aktivitet lik 106. Andre hemin-amin derivater der amindelen bestod av f.eks. di-etanolamin, etylamin, cykloheksylamin og piperidin, oppviste aktivitetsverdier på henholdsvis 13, 21, 31 og 78. Av oven-stående forsøk kan man trekke den slutning at heminarginatet og heminlysinatet oppfører seg i organismen overfor heminoksygenase som normale, fysiologiske, kroppsegne forbindelser.

Forsøk med dyr.

Porfyri ble fremkalt hos Sprague-Dawley rottehanner (180-250 g) ved subkutan infusjon av 300 mg/kg 2-allyl-2-isopropyl-acetamid (AIA) i tre på hverandre følgende dager. En annen gruppe rotter ble behandlet med AIA og med hemin-L-argini-kompleksoppløsning, fremstilt ifølge eksempel 3 ved intra-peritoneal administrering av 10 mg/kg av nevnte oppløsning i tre på hverandre følgende dager.

Hos de AIA-behandlede rotter øket den daglige utsondring av porfobilinogen (PGB) i urinen fra middelverdien på 0,08 pmol (grenseverdier 0,05-0,13) til 6,79 pmol (grenseverdi 3,91-12,70), og den daglige utsondring i urinen av delta-aminolevulinsyre (ALA) økes fra 0,20 pmol (grenseverdi 0,16-0,23) til 7,77 pmol (grenseverdier 2,49-11,50). Hos rotter som var behandlet med AIA og hemin-L-argininkompleksoppløsning ifølge eksempel 3 var på den.-annen side økningen i utsondringen i urinen liten av PGB (0,28 pmol/dag, grenseverdier 0,09-0,45) og av ALA

(0,51 pmol/24 t, grenseverdier 0,23-0,82).

Aktiviteten av delta-aminolevulinsyre-syntase (ALAS) i erytrocytter (3,97 pmol ALA/t/10<6> reticulocytter, grenseverdier 2,23-6,06) og i lever (15,4 pmol ALA/mg protein/t, grenseverdier 12,5-17,1) hos de AIA behandlede rottene var tydelig høyere enn tilsvarende verdier (1,42 pmol ALA/t/10^ reticulocytter, grenseverdier 0,82-1,72) og 11,5 pmol ALA/mg protein/t, grenseverdier 9,8-13,7) hos rotter behandlet med AIA og hemin-L-arginatkompleksoppløsning fremstilt ifølge eksempel 3.

Heme-oksygenase (HO) aktiviteten minsker i de fleste

av de AIA behandlede rottene til et ikke målbart nivå, mens HO-aktiviteten hos rotter som er behandlet med AIA og hemin-L-arginatkompleksoppløsning var 16,2 pmol/min/mg protein, grenseverdier 9,3-29,3).

Den porfyrinogene effekten av AIA behandlingen kunne

også oppheves ved intramuskulær administrering av hemin-L-arginin-kompleksoppløsning fremstilt ifølge eksempel 3 i doser på 10 ml/kg kroppsvekt. En eneste intravenøs injeksjon på 20 mg/kg kroppsvekt fremkalte samme antiporfyrinogene effekt.

Undersøkelser har vist at dette hemin-L-arginat-preparat er mer effektiv og klart bedre enn det ålment anvendte héma-tinet.

Forsøk med pasienter.

Den biokjemiske virkningen av det stabile og lettoppløselige heminderivatetet, fremstilt ifølge eksempel 3, ble undersøkt hos 10 pasienter med akutt hepatisk porfyri i sykdommens symptomløse fase. ,

Seks. pasienter med akutt intermittent porfyri (AIP) ble gitt hemin-L-arginatoppløsning 2 mg eller 3 mg/kg/dag i fire på hverandre .følgende dager i perifere vener. Under behandlingen sank utsondringen av porfobilinogen i urinen i middeltall fra 194 . (grenseverdier 60-465) pmol/24 t til 17,2 (grenseverdier 7,1-30) pmol/24 t, og det samme for delta-amino-levulinsyre fra 133 (grenseverdier 47-281) pmol/24 t til 13,8 (grenseverdier 8,1-23,4) pmol/24 t.

Hos fire pasienter med porfyria variegata sank den fekale protoporfyrinmengden i middeltall fra 650 (grenseverdier 193-1140) nmol/g/dag tørrvekt til 89 nmol/g/dag tørrvekt (grenseverdier 62^-103) og koproporfyrin fra 232 (grenseverdier 102-360) til 23 (grenseverdier 8,5-40) nmol/g tørrvekt, ved administrering av hemin-L-arginatoppløsning i en mengde på 3 mg/kg/dag i fire dager.

Hos to pasienter med AIP ble gitt tre behandlinger med hemin-L-arginatoppløsning på 3 eller 4 mg/kg/dag i tre eller fire dager ved akutt anfall. Hos en 21-årig kvinne opphørte buk-symptomene ved den andre behandlingsdagen i to tilfeller. Hos en 43-årig mann med buksmerter og perifer neuropati opp-hørte buksmertene og en forbedring av neuropatien kunne konstateres efter den siste av fire på hverandre følgende infusjoner av hemin-L-arginatoppløsning.

Tromboflebitt kunne ikke konstateres hos noen av de por-fyriske pasienter efter totalt 51 infusjoner. Ingen andre bivirkninger eller abnorme forandringer i blodkjemien, innbefattet koagulasjonsstudier, kunne konstateres. Det kan trekkes den slutning at det nye hemin-arginat-preparatet er sikkert og effektivt ved behandling av akutt hepatisk porfyri.

Oppfinnelsen illustreres best ved følgende utførelses-eksempler.

Eksempel 1

6,52 g krystallinsk hemin (0,01 mol) og 3,48 g krystallinsk L-arginin (0,02 mol) i et dekanterglass forsynt med mekanisk rører og inneholdende en oppløsningsmiddelblanding bestående av 300 ml aceton og 20 ml vann ble omrørt kraftig i 10-15 timer. Det dannede produkt ble frafiltrert og vasket med aceton og tørket.

Utbyttet av heminarginat = 9,5 g (95 %). Den uløselig resten

som ble bestemt i henhold til den tidligere bestemte forsøks-metode utgjorde 0,14 g, svarende til 1,4%.

Eksempel 2

6,52 g krystallinsk hemin (0,01 mol) og 4,36 g krystallinsk L-arginin (0,025 mol) i et dekanterglass forsynt med mekanisk rører og inneholdende en oppløsningsmiddelblanding bestående av 300 ml aceton og 20 ml vann ble omrørt kraftig i 10-15 timer. Det dannede produkt ble frafiltrert og vasket med aceton og tørket.

Utbyttet av heminarginat = 11,1 g (ca. 100%). Den uløselige resten som ble bestemt i henhold til den tidligere bestemte forsøksmetode utgjorde 0,042 g, svarende til 0,42%.

Eksempel 3

6,52 g krystallinsk hemin (0,01 mol) og 5,23 g krystallinsk L-arginin (0,03 mol) i et dekanterglass forsynt med mekanisk rører og inneholdende en oppløsningsmiddelblanding bestående av 300 ml aceton og 20 ml vann ble omrørt kraftig i 10-15 timer. Det dannede produkt ble frafiltrert og vasket med aceton og tørket.

Utbyttet av heminarginat = 12,0 g (~102%) . Den uløselige resten som ble bestemt i henhold til den tidligere bestemte forsøks-metode utgjorde 0,001 g, svarende til 0,01%.

Eksempel 4

6,52g krystallinsk hemin (0,01 mol) og 6,10 g krystallinsk L-arginin (0,035 mol) i et dekanterglass forsynt med mekanisk rører og inneholdende en oppløsningsmiddelblanding bestående av 300 ml aceton og 20 ml vann ble omrørt kraftig i 10-15 timer. Det dannede produkt ble frafiltrert og vasket med aceton og tørket.

Utbyttet av heminarginat = 12,0 g (95%). Den uløselige resten som ble bestemt i henhold til den tidligere bestemte forsøks-metode utgjorde 0,0005 g, svarende til 0,005%.

Eksempel 5

6,52 g krystallinsk hemin (0,01 mol) og 4,39 g krystallinsk L-lysin (0,03 mol) i ett dekanterglass forsynt med mekanisk rører og inneholdende en oppløsningsmiddelblanding bestående av 300 ml aceton og 20 ml vann ble omrørt kraftig i 10-15 timer. Det dannede produkt ble frafiltrert og vasket med aceton og tørket.

Utbyttet av hemin-lysinat = 10,8 g (99%). Den uløselige resten som ble bestemt i henhold til den tidligere bestemte forsøks-metode utgjorde 0,020 g, svarende til 0,28%.

Av eksempel 3 fremgår at molforholdet hemin: arginat

(1:3) er det mest fordelaktige eftersom utbyttet av heminarginat er høyt samtidig som den uløselige resten er ytterst minimal.

Claims (3)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av fysiologisk virksomt, vannoppløselig hemin-arginat og hemin-lysinat, spesielt for behandling av porfyri, karakterisert ved at krystallinsk hemin får reagere med L-arginin eller L-lysin, ved romtemperatur og under kraftig omrøring i 10-15 timer i en oppløsningsmiddelblanding bestående av et organisk oppløsningsmiddel og vann, fortrinnsvis aceton og vann, hvorved det dannes en kompleks forbindelse bestående av henholdsvis hemin-arginat og hemin-lysinat.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et molforhold hemin: L-arginin på 1:1 - 1:4, fordelaktig 1:3.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et molforhold hemin: L-lysin på 1:1 - 1:4, fordelaktig 1:3.