NO146500B

NO146500B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk virksomme 4-n-substituerte derivater av fortimicin-b

Info

Publication number: NO146500B
Application number: NO773271A
Authority: NO
Inventors: Moriyuki Sato; Yasuki Mori
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1976-09-23
Filing date: 1977-09-23
Publication date: 1982-07-05
Also published as: NO147755C; GB1590881A; AU518301B2; DK419977A; SE7710684L; ES462603A1; NZ185238A; NO773271L; BE859014A; NO147755B; MX4815E; NO811755L; ES472271A1; JPS5350140A; NO146500C; PH17312A; GB1590882A; DE2742950C2; AR223453A1; FR2403349A1

Abstract

Analogifremgangsmåte til fremstilling av terapeutisk virksomme 4-N-substituerte derivater av fortimicin-B.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt en analogifremgangsmåte til fremstilling av 4-N-substituerte derivater av fortimicin-B og deres farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter.

Fortimicinene (A,B og C) er forbindelser som klassifi-

seres som pseudodisakkarider inneholdende 1,4-diaminocyklitol.

Disse forbindelsers fysikalske egenskaper og antibakterielle aktiviteter, samt fremgangsmåter til deres fremstilling ved gjæring, er beskrevet i US patentene nr. 3 931 400, 3 976 768

og 4 048 015.

De plane strukturformler for de kjente fortimiciner er angitt i ovennevnte US patenter. Som resultat av ytterligere undersøkelser har det vist seg at strukturformlene for fortimicin-B, fortimicin-A og fortimicin-C kan gjengis som følger:

Fortimicin-B

Fortimicin-A Fortimicin-C

Strukturene av fortimicin-A, -B og -C er beskrevet nedenfor:

1) Fortimicin- B

Resultater av massespektrumbestemmelse på fortimicin-B er: m/e 349(M<+> + 1), 348(M<+>), 331, 313, 305, 235, 217, 207, 143, 136. Det antas ut fra resultatene av massespektrumbestemmelsen at fortimicin-B har følgende delstrukturformel inneholdende purpurosamin-B:

Resultatene fra analysene av PMR-spektrum og CMR-spektrum for fortimicin-B i deuteriumoksyd er :

Fra disse data for PMR og CMR og spektrofotometriske data for kobberkomplekser av fortimicin-B, dietyltioacetal-derivat av purpurosamin-B-delen og metylglykosid-derivat fremstilt ifølge de konvensjonelle prosesser, er den absolutte struktur av fortimicin-B blitt bestemt til:

Andre fysikalske data for fortimicin-B er: Smeltepunkt: 101-103°C.

[a]p = +30,3° (c=l,0 vann)

Elementanalyse som C25H32N4°5"H2°

Beregnet: C 49,15 - H 8,80 - N 15,29

Funnet : C 49,35 - H 8,77 - N 15,38.

2) Fortimicin- A

Massespektrum: m/e 406 (M<+> + 1), 405(M<+>), 388, 370, 362, 292,

274, 263, 246, 143, 126

PMR (deuteriumoksyd): 6(ppm), 1,06(3H, d), 1,2-1,9 (4H, m),

~2,8 (1H, br), 2,86 (1H, m), 3,05 (3H, s), 3,44 (3H, s), ~3,5 (2H, br), 3,52 (2H, s), 3,88 (1H, q), 4,08 (1H, q), 4,16 (1H, t), 4,36 (1H, t), 4,84 (1H, d), 4,95 (1H, q).

CMR (deuteriumoksyd)Æ 6(ppm) 18,7, 27,1, 27,3, 32,3, 41,6, 50,2,

50,5, 52,5, 55,0, 56,4, 71,1, 73,0, 73,6, 75,1, 78,4, 100,1, 169,5.

Andre fysikalske data for fortimicin-A er:

Smeltepunkt: over 200°C (dek.)

[a]p = +26° (c=0,2, vann)

Elementanalyse som C^7H35N5°5

Beregnet: C 50,35 - H 8,70 - N 17,27

Funnet : C 50 , 23 - H 8,67 - N 17,49.

Fra de ovenstående data og den kjennsgjerning av hydrolyse av fortimicin-A gir fortimicinTB og glycin, er strukturen av fortimicin-A blitt bekreftet til å være 4-N-glycylfortimicin-B (la).

3) Fortimicin- C

Feltdesorptions-(FD) massespektrum<*>: m/e 449 (M +1), Massespektrum<**>: m/e 406, 387, 375, 325, 292, 274, 264, 246,

235, 228, 217, 207, 200, 143 . PMR (deuteriumoksyd): 6(ppm), 1,08 (3H, d) , 1,2-1,9 (4H, m), ~2,8 (1H, br), 2,85 (1H, m), 3,10 (3H, s), 3,43 (3H, s), ~3,5 (2H, br), 3,87 (1H, q), 4,00 og 4,04 (felles 2H, individuelt s), 4,07 (1H, q), 4,18 (1H, t), 4,38 (1H, t), 4,84 (1H, d), 4,92 (1H, q).

CMR (deuteriumoksyd): 6(ppm), 17,5, 26,3, 27,5, 32,5, 44,1, 50,0

51,1, 52,7, 55,5 56,4, 71,0, 72,7, 73,1, 73,4, 77,9, 99,1, 161,7, 172,7.

<*> Massespektrum. hvor M<+>kan forekomme.

<**> M<+> uteblir i ordinært massespektrum (EI-massespektrum)

Andre fysikalske data for fortimicin-C er:

Smeltepunkt: 153-157°C (dek.)

[a]^ = +84,3° (c=0,l, vann)

Elementanalyse som C^8H35N6°7"^<H>2°

Beregnet: C 45,00 - H 8,33 - N 17,50

Funnet : C 44,84 - H 8,19 - N 17,36.

Fra de ovenstående data og den kjennsgjerning at hydrolyse av fortimicin-C gir fortimicin-B og hydantoinsyre, er strukturen for fortimicin-C blitt bekreftet til å være 4-N-hydantoylforti-micin-B (Ilb). Fortimicin-A og -C er blitt fremstilt syntetisk fra fortimicin-B som vist i de etterfølgende eksempler, og

deretter er strukturen blitt bekreftet.

Fortimicinene (A,B og C) har alle antibakteriell aktivitet, men den antibakterielle aktivitet av B er ikke så god som av de andre faktorer, og A og C er litt ustabile under sterkt alkaliske betingelser. Derfor er det behov for forbindelser med mer uttalte egenskaper. •

Som resultat av forskjellige undersøkelser har det nå ifølge oppfinnelsen vist seg at visse 4-N-substituerende derivater av fortimicin-B har forøket antibakteriell aktivitet og god stabilitet, selv under sterkt alkaliske betingelser. Videre kan 4-N-alkyl-fortimicin-B-derivater anvendes som ut-gangsmaterialer for ytterligere modifiserte derivater, dvs. innføring av en eller flere andre grupper på amino- og/eller hydroksygruppen deri.

Ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles terapeutisk virksomme 4-N-substituerte derivater av fortimicin B representert ved den generelle formel:

hvor R 2 er en lavere-alkylgruppe, hydroksylaverealkylgruppe, aminolaverealkylgruppe eventuelt substituert med en hydroksygruppe, N-laverealkylaminolaverealkylgruppe.eventuelt substituert med en hydroksygruppe, eller aminolaverealkylaminolavere-alkylgruppe, og farmasøytisk akseptable ikke-toksiske syreaddisjonssalter derav. Forbindelsene med formel (I-b) fremstilles ifølge oppfinnelsen ved at man (a) reduserer karbonylgruppen i amid-karbonylgruppen i 4-N-substituert fortimicin B-derivater representert med den generelle formel: hvor R 2 har de samme betydninger som angitt ovenfor og syreaddisjonssalter derav, til en metylengruppe eller (b) fjerner den beskyttende gruppen i 4-N-substituerte derivater av fortimicin B representert ved formelen:

hvor R 3 er en aminobeskyttende gruppe og R' 2 har de samme betydninger som R 2 forutsatt at den frie hydroksygruppen i

2 2

R kan være beskyttet og den frie aminogruppen i R er beskyttet, og, om ønsket omdannelse av forbindelsen dannet ved metode (a) eller (b) til et farmasøytisk akseptabelt ikke-toksisk syreaddisjonssalt derav.

4-N-substituerte derivater av fortimicin-B som er av-ledet av forbindelsen med den generelle formel (IV) er eksempli-fisert i følgende tabell 1 sammen med deres fysikalske data.

Til sammenligning er også anført de fysikalske egenskaper for fortimicin-B og fortimicin-A.

I tabell 2 er angitt Rf-verdiene ved tynnsjiktskromatografi av disse forbindelser, utviklet på en silisiumdioksydgél-plate under anvendelse av forskjellige oppløsningsmidler. Til et utviklet lag ble det anvendt en silisiumdioksydgel-plate ("Merck DC-Fertigplatten Kieselgel 60 F 254") og farget med ninhydrin eller jod. De i tabellen angitte oppløsningsmiddel-systemer er som følger: J A: isopropanol/28% ammoniakkvann/kloroform

(volumforhold 2:1:1)

B: metanol/kloroform

(volumforhold 5:95)

C: metanol/kloroform

(volumforhold 1:9)

Den antibakterielle aktivitet (MIC) til forbindelsene ifølge oppfinnelsen er anført i tabell 3-1 og tabell 3-2. Mål-ingene ble utført ved agar-fortynningsmetoden under anvendelse av et medium med pH 8,0 eller the Japanese Antibiotic Medicament Standard under anvendelse av et medium med pH 7,2. Enhetene er yg/ml.

De i tabell 3-2 benyttede mikroorganismer og deres for-kortelser er anført nedenfor.

S.A.: Staphylococcus aureus KY4279 ATCC6538P

B.S.: Bacillus subtilis KY4273

E.C.: Escherichia coli KY4271 ATCC26

P.V.: Proteus vulgaris KY4277 ATCC6897

S.S.: Shigella sonnei KY4281 ATCC9290

S.T.: Slamonella typhosa KY4278 ATCC9992

K.P.: Klebsiella pneumoniae KY4275 ATCC10031

Identifikasjonsnumrene for forbindelsene i tabell 3-1 og 3-2 er de samme som i tabell 1.

Stabiliteten til 4-N-acylfortimicin-B-derivater ved vandige alkaliske-betingelser er liten. Hvis f.eks. fri fortimicin-A-base fikk stå i vandig oppløsning (pH 10) ved romtemperatur i 2 uker eller ved 100°C i 4 timer, ville den ned-brytes nesten fullstendig. Hvis 4-N-(y-amino-a-hydroksy-butyryl)fortimicin-B og 4-N-(6-amino-n-valeryl)fortimicin-B fikk stå i vandige oppløsninger (pH 10), ble de nesten fullstendig nedbrutt innen 1 time ved romtemperatur. Derfor er rensing av disse forbindelser under basiske betingelser (f.eks. søylekromatografi med "Amberlite CG-50" under eluering med ammoniakkvann) ikke praktisk.

I motsetning til instabiliteten av 4-N-acylfortimicin-B-derivater er 4-N-alkylfortimicin-B-derivater så stabile at det ikke skjer noen redbrytning, selv i vandig bariumhydroksyd-oppløsning ved tilbakeløpstemperatur i 18 timer. Derfor kan enhver type alkylsubstituenter innføres i 4-N-stillingen av fortimicin-B, selv om slike substituenter ikke kan innføres som acyl-typen i denne stilling på grunn av ovennevnte instabilitet.

Den i nedenstående tabell 1 nevnte formel I har følgende ■ struktur:

1 2 1

hvor R er en av gruppene -C•i-R eller -CH--R , hvor R er

0

alkyl med 2-8 C-atomer, hydroksyalkyl med 1-5 C-atomer, aminoalkyl med 2-8 C-atomer eller karbamoksyaminoalkyl med 3-9 C-atomer, og R 2 har den ovenfor angitte betydning.

Som det fremgår av de ovenstående data, utviser forbindelsene ifølge oppfinnelsen god antibakteriell aktivitet over-for forskjellige mikroorganismer og er derfor nyttige som antibakterielle midler eller antiseptika.

På lignende måte har de ikke-tosksiske syreaddisjonssalter av forbindelsene et bredt antibakterielt spektrum og er nyttige som antibakterielle midler osv. I den foreliggende sammenheng betyr betegnelsen "ikke-toksiske syreaddisjonssalter" mono-, di-, tri- og tetrasaltene oppnådd ved omsetning av 1 molekyl av forbindelsen med formelen (I-b) med 1-6 ekvivalenter farmasøytisk akseptable, ikke-toksiske syrer. Egnede syrer er uorganiske syrer, slik som svovelsyre, saltsyre, hydrogenbromidsyre, hydrogenjodidsyre, fosforsyre, karbonsyre, salpetersyre osv., og organiske syrer, slik som eddiksyre, fumarsyre, eple-syre, sitronsyre, mandelsyre, ravsyre, askorbinsyre osv., amino-syrer, slik som asparaginsyre osv., og lignende. Således inkluderer foreliggende fremgangsmåte også fremstilling av slike farmasøytisk akseptable ikke-toksiske syreaddisjonssalter.

Fremgangsmåten til fremstilling av de aktive ønskede forbindelsene kan generelt belyses ved hjelp av følgende prosess-diagram. Som vist syntetiseres forbindelsene via (1) trinn 1, trinn 2 og trinn 3, (2) trinn 1, trinn 5 og trinn 7 eller (3) trinn 1, trinn 2, trinn 6 og trinn 7.

Forbindelsen med formel (I-a) fremstilles via trinn 1 trinn 2 -♦ trinn 3. Den ønskede forbindelse med formel (I-b) syntetiseres via trinn 1 -» trinn 2 -+ trinn 3 trinn 4 eller via trinn 1 -» trinn 5 trinn 7 eller via trinn 1 -* trinn 2 trinn 6 -+ trinn 7.

Forbindelser med den generelle formel (I-b) er mer stabile under sterkt alkaliske betingelser enn forbindelsene med formel (I-a).

De enkelte trinn i den ovenstående prosess skal be-skrives mere detaljert nedenfor. Forbindelsene er betegnet med de generelle formler (Ia), (Ib), (II) ... (VII), noen ganger bare som forbindelsene (Ia), (Ib), (II ... (VII).

Trinn 1 - Syntese av forbindelser med formel (III) fra fortimicin- B: En forbindelse med formel (III) hvor et av hydrogen-atomene i aminogruppen bundet til karbonatomene i 1-, 2'- og 6'-stillingene av fortimicin-B er maskert av en aminomaskerende gruppe (R 3), kan fremstilles ved omsetning av fri fortimicin-B-base med en aminomaskerende reagens i et passende oppløsnings-middel. Til dette trinn kan anvendes aminomaskerende reagenser som vanligvis anvendes ved peptidsyntesen. Eksempler på egnede aminomaskerende reagenser er:

hvor R<5> og R<6> kan være like eller forskjellige og betyr H, OH, N0~, Cl, Br, I, 7alkyl med 1-5 karbonatomer, alkoksy med 1-5 karbonatomer; R er H, F, Cl, Br, I eller alkyl med 1-5 karbonatomer, og Y er Cl, Br eller I.

Egnede oppløsningsmidler for reaksjonen er dimetylformamid, dimetylacetamid, tetrahydrofuran, dioksan, 1,2-dimetoksyetan, metanol, etanol, aceton, vann eller blandinger derav. Blant disse oppløsningsmidler foretrekkes spesielt metanol.

Konsentrasjonen av fortimicin-B i reaksjonsblandingen

er hensiktsmessig 1-250 millimol/liter, og 10-100 millimol/liter er spesielt foretrukket. Konsentrasjonen av den aminomaskerende reagens er hensiktsmessig fra 4 millimol/liter til 1 mol/liter, idet 30-400 millimol/liter er spesielt foretrukket. Mengden av den ved reaksjonen benyttede aminomaskerende reagens er hensiktsmessig 1-5 mol, og særlig 3-4 mol, pr. mol fortimicin-B. I dette tilfelle er det ikke fordelaktig når mengden av den aminomaskerende reagens er over 5 mol,fordi hydrogenatomet i aminogruppen bundet til karbonatomet i 4-stilling av fortimicin-B også maskeres av den aminomaskerende gruppe, og utbyttet av den ønskede forbindelse med formel (III) nedsettes. På den annen side er det heller ikke fordelaktig at mengden av den aminomaskerende reagens er under 1 mol, fordi utbyttet av forbindelsen med formel (III) da nedsettes.

Reaksjonstemperaturen er 0-60°C og fortrinnsvis fra 0°C til romtemperatur. Under slike betingelser er reaksjonstiden vanligvis 2-18 timer.

Den ved den ovenfor omtalte prossess syntetiserte forbindelse med formel (III) kan anvendes direkte i de etterfølgende trinn som reaksjonsblanding eller kan isoleres og renses og deretter anvendes i det neste trinn.

Rensing og isolering av forbindelsen med formel (III)

fra reaksjonsblandingen kan gjennomføres ved følgende metode. Oppløsningsmidlet avdestilleres fra reaksjonsblandingen og det oppnås en rest. Resten utdrives med et organisk oppløsnings-middel, slik som kloroform eller etylacetat, til oppløsning av ekstraherbart materiale. Deretter underkastes det resulterende ekstrakt søylekromatografi på silisiumdioksydgel (f.eks. "Kieselgel 60"). Eluering utføres deretter med et organisk oppløsningsmiddel, slik som kloroform/metanol eller etylacetat/

etanol, og fraksjoner, som utviser en spesifikk Rf-verdi, oppsamles og konsentreres til tørrhet, hvorved det ønskede materiale oppnås i form at et hvitt pulver.

Den således oppnådde forbindelse med formel (III) kan anvendes som råmateriale for fremstilling av forbindelser med formlene (Ia) og (Ib) som er nyttige som antibakterielle midler osv.

Forbindelsen med formel (Ia) er ustabil under alkaliske betingelser og derfor er det ønskelig ved fremstillingen av forbindelsen med formel (III) å velge en aminomaskerende reagens som ikke krever alkaliske betingelser for fjerning av den maskerende, gruppe. Eksempler på aminomaskerende reagenser som tilfreds-stiller disse betingelser er:

5 6

hvor R , R og Y har den ovenfor angitte betydning.

Forbindelsen med formel (Ib) er stabil under både sure og alkaliske betingelser, og når forbindelsen med formel (III) anvendes som råmateriale for fremstilling av forbindelsen med formel (Ib), kan enhver aminomaskerende reagens anvendes.

Trinn 2- Fremstilling av forbindelse ( IV) fra forbindelse ( III): Forbindelse (IV) oppnås ved acylering av forbindelse (III) med et vanlig acyleringsmiddel i et passende oppløsnings-middel. Det herved benyttede acyleringsmiddel omfatter karboksylsyrer med den generelle formel (VI), R COOH, hvor R er alkyl, hydroksyalkyl, karbamoylaminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, N-alkylaminohydroksyalkyl, substituert aminoalkyl (hvor substituenten er en aminomaskerende gruppe), substituert amino-hydroksyalkyl (hvor substituenten er en aminomaskerende gruppe), substituert aminometylkarbonylaminoalkyl (hvor substituenten er en aminomaskerende gruppe), i hvilke grupper den aminomaskerende gruppe kan være lik eller forskjellig fra nevnte gruppe R 3, eller derivater av karboksylsyrer, som er funksjonelt ekvivalente med disse, dvs. syreanhydrider av karboksylsyrene med den generelle formel (VI), aktive estere av nevnte karboksylsyrer med en forbindelse valgt blant fortrinnsvis

eller syrehalogenider osv. av nevnte karboksylsyrer.

Når det her anvendte acyleringsmiddel inneholder en

fri aminogruppe, er det nødvendig å maskere aminogruppen med en passende aminomaskerende gruppe ifølge kjente metoder. Selv-følgelig foretrekkes det å benytte de samme maskerende grupper som de aminomaskerende grupper il-, 2'- og 6<1->stillingene av forbindelsen (III). Aminogruppene maskeres på samme måte som i nevnte trinn 1.

Den benyttede konsentrasjon av forbindelsen (III) er i området 1-250 mM, fortrinnsvis 10-100 mM. Det anvendes like mange eller flere mol av acyleringsmidlet som av forbindelsen (III) . Når et syreanhydrid anvendes som acyleringsmiddel, fore- ; trekkes det å benytte 1-5 mol av syreanhydridet pr. mol av forbindelsen (III). Når en aktiv ester anvendes som acyleringsmiddel, foretrekkes det å benytte 1-1,5 mol av den aktive ester pr. mol av forbindelsen (III).

Egnede oppløsningsmidler er dimetylformamid, dimetylacetamid, tetrahydrofuran, dioksan, 1,2-dimetoksyetan, metanol, etanol, vann og blandinger derav. Det benyttes fortrinnsvis tetrahydrofuran, samme hvilket acyleringsmiddel som anvendes.

Reaksjonen gjennomføres ved en temperatur i området 0-70°C, fortrinnsvis fra 0°C til romtemperatur, i fra 15 minutter til 20 timer, og fortrinnsvis 1-18 timer.

Foruten den ovenfor omtalte metode kan en DCC-metode eller lignende anvendes på acyleringstrinnet.

Således dannes forbindelse (IV) i reaksjonsoppløsningen og reaksjonsoppløsningen som sådan kan anvendes til fremstilling av forbindelse (Ia), eller forbindelsen (IV) kan isoleres og deretter anvendes til fremstillingen av forbindelse (Ia).

Isolering og rensing av forbindelsen (IV) fra reak-sjonsoppløsningen utføres ved først å avdestillere oppløsnings-midlet fra reaksjonsoppløsningen. Resten blandes med et organisk oppløsningsmiddel, slik som kloroform og etylacetat, for å ekstrahere de oppløselige deler. Ekstraktet underkastes deretter søylekromatografi under anvendelse av en søyle fylt med silisiumdioksydgel, slik som "Kieselgel 60". Elueringen utføres ved hjelp av et organisk oppløsningsmiddelsystem bestående av kloroform/metanol, etylacetat/etanol osv., og fraksjoner inneholdende forbindelsen IV oppsamles. Deretter oppsamles opp-løsningsmidlet for oppnåelse av forbindelsen (IV).

Trinn 3 - Fremstilling av forbindelse ( Ia) fra forbindelse ( IV)

Den maskerende gruppe R i aminogruppen hos den i

trinn 2 fremstilte forbindelse (IV), fjernes på kjent måte for oppnåelse av forbindelse (Ia). Hvis f.eks. den maskerende gruppe er en benzyloksykarbonylgruppe kan den fjernes ved kata-lytisk hydrogenolyse i nærvær av en metallkatalysator bestående av palladiumkarbon, platina, rodium osv. og i' nærvær av en syre, slik som saltsyre, hydrogenbromidsyre og eddiksyre, i et oppløsningsmiddel bestående f.eks. av vann, tetrahydrofuran, dimetylacetamid, dimetylformamid, lavere alkoholer, dioksan, etylenglykoldimetyleter eller kombinasjoner derav, fortrinnsvis i metanol ved romtemperatur og atmosfæretrykk, mens det føres hydrogengass gjennom reaksjonsblandingen.

Vanligvis benyttes 1-10 vekt-% av metallkatalysatoren beregnet på forbindelsen (IV), og konsentrasjonen av forbindelsen (IV) er vanligvis 1-200 mM, fortrinnsvis omkring 50 mM.

Syren tilsettes til reaksjonsblandingen slik at pH-verdien holdes på 4 eller under dette. Avslutningen av reaksjonen påvises ved opphør av karbondioksyd-utviklingen eller ved tynnsjiktskromatografi eller lignende.

Når den maskerende gruppe er en tertiær butoksykarbonyl-gruppe, kan den fjernes i nærvær av saltsyre eller trifluor-eddiksyre i et ikke-vandig oppløsningsmiddel, f.eks. diklormetan, kloroform, trikloretylen og etylacetat. I dette tilfelle benyttes forbindelsen (IV) i en konsentrasjon på 1-200 mM, fortrinnsvis omkring 50 mM, og det benyttes en ekvivalent mengde eller mer av syren. Fullførelsen av reaksjonen påvises ved tynnsjiktskromatografi eller lignende.

Når den maskerende gruppe er en trifenylmetylgruppe, kan den fjernes ved behandling med eddiksyre eller trifluoreddik-syre på kjent måte; og når den maskerende gruppe er en orto-nitrofenylsulfenylgruppe, kan den fjernes ved behandling med eddiksyre eller saltsyre på kjent måte.

Utskillelse og rensing av det ønskede produkt utføres

på kjent måte ved anvendelse av en ioneutvekslerharpiks, silisiumdioksydgel-søylekromatografi eller lignende. Reaksjonsblandingen kan f.eks. ved en metode hvor man anvender ioneutvekslerharpiks, om nødvendig, filtreres, og det resulterende filtrat inndampes til tørrhet. Resten oppløses i vann og etter innstilling av pH-verdien til omkring 6 med alkali, f.eks. natriumhydroksyd, føres den resulterende oppløsning gjennom en søyle av f.eks. "Amberlite CG-50" (ammoniumsaltform) for adsorpsjon av det ønskede produkt. Deretter elueres søylen med en passende konsentrasjon av ammoniakkoppløsning for å oppdele eluatet i fraksjoner. Fraksjonene med antibakteriell aktivitet kombineres og inndampes for fjerning av oppløsningsmidlet. Det ønskede produkt oppnås som et pulver.

Trinn 4 - Fremstilling av forbindelse ( Ib) fra forbindelse ( Ia)

Den i trinn 3 fremstilte forbindelse (Ia) eller fortimicin-A og fortimicin-C fremstilt ved kjente metoder, reduseres i et passende oppløsningsmiddel i nærvær av et reduksjonsmiddel for omdannelse av karbonylgruppen i amidgruppen til en metylengruppe ved romtemperatur eller et oppløsningsmiddels tilbake-løpstemperatur, hvorved forbindelse (Ib) oppnås.

Som oppløsningsmiddel er f.eks. tetrahydrofuran, dioksan og dietyleter hensiktsmessig. Som reduksjonsmiddel anvendes et overskudd, vanligvis 10 ganger eller mer, av f.eks. litiumaluminiumhydrid eller diboran.

Rensing av det ønskede produkt utføres f.eks. med ioneutvekslerharpiks på følgende måte: Etter at overskuddet av reduksjonsmiddel i reaksjonsblandingen er dekomponert med etylacetat, vann eller lignende, avdestilleres det meste av opp-løsningsmidlet under forminsket trykk. Resten i halvfast til-stand blandes med vann for ekstraksjon av vannoppløselige komponenter, og det resulterende ekstrakt underkastes søylekromato-grafi i en søyle fylt med svakt sur ioneutvekslerharpiks (f.eks. "Amberlite CG-50"). Søylen vaskes med vann og elueres deretter med ammoniakkvann. Fraksjoner inneholdende forbindelse (Ib) oppsamles og ammoniakken fjernes ved avdampning, hvorved forbindelsen (Ib) oppnås som et hvitt pulver.

Utskillelsen og rensingen kan også gjennomføres ved andre kjente metoder, slik som silisiumdioksydgel-kromatografi.

Trinn 5 - Fremstilling av forbindelse ( V) fra forbindelse ( III)

Forbindelse (V) kan fremstilles ved omsetning av forbindelse (III) med en forbindelse med den generelle formel (VII), R C^X, hvor R har den ovenfor angitte betydning og X er klor, brom, jod, en metansulfonylestergruppe eller en p-toluen-sulfonylestergruppe, i et passende oppløsningsmiddel for alky-lering av forbindelse (III). Den i reaksjonsblandingen benyttede konsentrasjon av forbindelse (III) er i området 1-250 mM/ liter, fortrinnsvis 10-100 mM/liter. Den benyttede mengde av forbindelsen (VII) er 0,5-2 mol, fortrinnsvis 0,8-1,2 mol pr. mol av forbindelse (III) .

Egnede oppløsningsmidler er metanol, etanol, propanol, butanol, tetrahydrofuran, aceton eller blandinger derav, og fortrinnsvis benyttes etanol.

Reaksjonen gjennomføres i et temperaturområde på 0-120°C, fortrinnsvis 10-80°C, i 2-24 timer, fortrinnsvis 10-20 timer. Det oppnådde ønskede produkt kan anvendes som sådant i neste reaksjon uten isolering eller kan først isoleres og renses på følgende måte: Etter fullføring av reaksjonen avdestilleres opp-løsningsmidlet fra reaksjonsblandingen og resten oppløses i

et organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat og kloroform. Etter vasking av den organiske oppløsning med vann og tørking,

avdampes oppløsningsmidlet. Deretter underkastes resten silisiumdioksydgel-søylekromatografi under anvendesle av f.eks. "Kieselgel 60". Deretter utføres eluering med et organisk oppløsnings-middel, slik som kloroform/metanol, etylacetat/etanol osv., og fraksjoner inneholdende forbindelse (V), kontrollert ved Rf-verdier, oppsamles. Deretter fjernes oppløsningsmidlet ved destillasjon, hvorved forbindelse (V) oppnås som et hvitt pulver.

Trinn 6 - Fremstilling av forbindelse ( V) fra forbindelse ( IV)

Forbindelse (V) kan oppnås ved reduksjon av den i trinn 2 fremstilte forbindelse (IV) i nærvær av et reduksjonsmiddel

for omdannelse av karbonylgruppen i amidgruppen til en metylengruppe i et passende ikke-vandig oppløsningsmiddel ved romtemperatur eller ved oppløsningsmidlets tilbakeløpstemperatur.

Egnede oppløsningsmidler for dette trinn omfatter bl.a. tetrahydrofuran, dioksan, dietyleter og kombinasjoner derav.

Som reduksjonsmiddel kan f.eks. anvendes diboran, litiumaluminiumhydrid. Ved denne reaksjon anvendes forbindelse (IV) i en konsentrasjon på 1-250 mM, fortrinnsvis 10-100 mM, og vanligvis anvendes 10 ganger eller flere ekvivalenter av reduksjonsmidlet. Reaksjonen er vanligvis fullført i løpet av fra 10 minutter til 18 timer.

Når aminogruppen i den i- dette trinn benyttede forbindelse (IV) er maskert av en benzyloksykarbonylgruppe, foretrekkes det å anvende diboran som reduksjonsmiddel fordi karbonylgruppen i amidgruppen omdannes til metylengruppen uten å skade benzyloksykarbonylgruppen i forbindelse (IV). Herved kan forbindelse (V) oppnås i godt utbytte. (W.V. Curran and R.B. Angier: J. Org. Chem., 31, 3867 (1966)).

2'

Når R i den anvendte forbindelse (IV) har en maskert aminogruppe i dette trinn 6, dannes lignende forbindelser foruten forbindelse (V), avhengig av den maskerte gruppe, reaksjons-betingelsene og reduksjonsmidlet. Det vil si at når diboran anvendes som reduksjonsmiddel og den maskerende gruppe på den maskerte aminogruppe i R 2 1 på forbindelsen (IV) er en benzyloksykarbonylgruppe eller en t-butyloksykarbonylgruppe, oppnås forbindelse (V) og forbindelser hvori den maskerende gruppe på aminogruppen i R 2 ' i forbindelsen (V) er redusert til en metyl-gruppe. Hvis reaksjonstiden er kort, dannes hovedsakelig den førstnevnte, og hvis reaksjonstiden er lang, forøkes utbyttet av den sistnevnte.

Reaksjonsproduktet kan anvendes som råmateriale for

trinn 7 som det er uten isolering av forbindelsen (V). Alterna-tivt kan forbindelse (V) isoleres på følgende måte: Oppløsnings-midlet avdestilleres fra reaksjonsblandingen og deretter blandes resten med vann for å nedbryte det resterende hydrid. Deretter tilsettes et organisk oppløsningsmiddel, slik som etylacetat eller kloroform, for å ekstrahere de oppløselige komponenter. Etter fraskillelse av det vandige lag, vaskes det organiske lag med vann, tørkes over vannfritt natriumsulfat og oppløsnings-midlet avdestilleres. Resten oppløses i et organisk oppløsnings-middel, slik som kloroform og det ønskede produkt oppnås ved silisiumdioksydgel-søylekromatografi.

Når det er involvert to sluttprodukter kan disse to produkter oppnås hver for seg ved fraksjonering av eluatene og om nødvendig, ved endring av elueringsoppløsningsmidlet.

Trinn 7 - Fremstilling av forbindelse ( Ib) fra forbindelse ( V)

I dette trinn fjernes den aminomaskerende gruppe R<3>

i det i trinn 5 eller 6 oppnådde 1,2',6'-tri-N-maskert-4-N-alkyl(eller substituert alkyl)fortimicin-B (forbindelse (V))

ved den kjente metode basert på trinn 3, hvorved forbindelse (V) anvendes i stedet for forbindelse (IV) for oppnåelse av 4-N-alkyl(eller substituert alkyl)fortimicin-B- (forbindelse (Ib)).

Syreaddisjonssalter av den således fremstilte forbindelse (I) kan oppnås ved følgende metode: Forbindelsen oppløses først i vann og blandes deretter med en syre. Deretter tilsettes et oppløsningsmiddel som er i stand til å senke oppløseligheten av forbindelsen (I), f.eks. etanol, for dannelse av et bunnfall. Bunnfallet fradestilleres og tørkes, hvor-etter det oppnås et hvitt eller grått pulver av syreaddisjons-saltet av forbindelsen (I).

ED,.q og LD^q for noen av forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er omtalt nedenfor.

1) ED50

Ved dette forsøk anvendes en gruppe bestående av fem mus av ddY-stamme. De nedenfor angitte mikroorganismer innpodes i hvert dyr. En time etter innpodningen oppløses prøveforbindelsen i destillert vann til injeksjon og injiseres intraperitonealt på prøvedyrene ved én innsprøytning. Prøvedyrene iakttas en uke etter injeksjonen og ED5Q utregnes ifølge Behrens-Karber's metode. De oppnådde resultater er følgende:

2) ^50

Ved dette forsøk ble det benyttet en gruppe bestående

av fem mus av ddY-stamme. Prøveforbindelser oppløst i 0,2 ml destillert vann til injeksjon, injiseres intravenøst i hvert dyr i løpet av 10 sekunder. LD5ø utregnet ifølge Behrens-Karber's metode. De oppnådde resultater er følgende:

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes i far-masøytiske preparater som, som aktiv bestanddel inneholder minst én av forbindelsene ifølge oppfinnelsen som utviser antimikrobiell aktivitet, sammen med den farmasøytiske bærer eller det farmasøytiske f ortynningsmiddel. Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan inngis oralt eller parenteralt, dvs. intra-muskulært, intravenøst eller subkutant, eller ved rektalinn-givning og kan sammensettes i doseringsformer som er egnet til hver inngivningsvei.

Faste doseringsformer til oral inngivning inkluderer kapsler, tabletter, piller, pulvere og granulater. I slike faste doseringsformer blandes den aktive forbindelse med minst ét inert fortynningsmiddel, slik som sakkarose, laktose eller stivelse. Slike doseringsformer kan også, ifølge normal praksis, omfatte ytterligere stoffer foruten inerte fortynningsmidler, f.eks. glittemidler, slik som magnesiumstearat. I tilfelle av kapsler , tabletter og piller kan doseringsformene også omfatte puffermidler. Tabletter og piller kan dessuten fremstilles med enteriske belegg.

Flytende doseringsformer for oral inngivning inkluderer farmasøytisk akseptable emulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer inneholdende alminnelig benyttede inerte fortynningsmidler, slik som vann. Foruten inerte fortynningsmidler kan slike preparater også inneholde tilsetningsstoffer, slik som befuktningsmidler, emulgerings- og suspenderingsmidler og søtningsstoffer, aromastoffer og parfymer.

Preparater for parenteral inngivelse inkluderer sterile, vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige oppløsningsmidler eller medier er propylenglykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, slik som olivenolje,og injiserbare organiske estere, slik som etyloleat. Slike doseringsformer kan også inneholde tilsetningsstoffer, slik som konserverings-, befuktnings-, émulgerings-

og dispergeringsmidler. De kan f.eks. steriliseres ved filtrering gjennom et bakterietilbakeholdende filter ved inkorporering av steriliseringsmidler i preparatene, ved bestråling av preparatene eller ved oppvarming av preparatene. De kan også fremstilles i form av faste preparater som kan oppløses i sterilt vann eller et annet sterilt injiserbart medium, umiddelbart før bruk.

Preparater til rektal inngivelse er fortrinnsvis suppositorier, som foruten det aktive stoff kan inneholde eksipienter, slik som kakaosmør eller suppositorievoks.

Doseringen av aktive bestanddeler i preparatene kan varieres, men det er nødvendig at mengden av de aktive bestanddeler er slik at det oppnås en egnet doseringsform. Den valgte dosering avhenger av den ønskede terapeutiske virkning, inn-givningsveien og den ønskede varighet av behandlingen.

Oppfinnelsen belyses nærmere i de etterfølgende eksemp-

ler .

Eksempel 1

2,0 g (4 , 9 millimol) fortimicin-A ble suspendert i 200 ml tetrahydrofuran og det ble tilsatt 2,0 g (53 , 0 millimol) litiumaluminiumhydrid. Den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakeløpstempera-tur under omrøring i k6 timer. Etter fullføring av reaksjonen ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og det ble tilsatt dråpevis 30 ml etylacetat for å nedbryte overskuddet av litiumaluminiumhydrid. Etylacetatet ble fjernet under forminsket trykk. Til resten ble det tilsatt 50 ml vann og uoppløselig materiale ble fjernet ved filtrering. Filtratet og vaskevannet ble kombinert. Oppløsningsmidlet ble fjernet fra den kombinerte oppløsning under forminsket trykk og deretter ble det tilsatt 200 ml mettet vandig bariumhydroksydoppløsning til konsentratet og oppløsningen ble oppvarmet under tilbakeløp i I time.

Den resulterende oppløsning fikk lov å stå til avkjøling og ble deretter nøytralisert ved tilsetning av tørris. Deretter ble oppløsningen filtrert og filtratet satt på en søyle pakket med 100 ml "Amberlite CG-50" (NH^<+->form). Etter påfyllingen ble det benyttet kOO ml vann og 600 ml 0,3N ammoniakkvann for vasking av søylen og deretter ble eluering utført med 0,5N ammoniakkvann. Eluatet ble oppsamlet i 20 ml fraksjoner. Frak-- sjonene nr. 6-20 som inneholdt forbindelser med en Rf-verdi på 0,4l i oppløsningsmiddelsystem A i tabell 2, ble oppsamlet og konsentrert for oppnåelse av 608 mg hvitt pulver. Forbindelsens fysikalske egenskaper er angitt nedenfor.

Massespektrum m/e (M<+> + l), jkl, 282, 278, 250, 143, 126.

PMR (deuteriumoksyd): 6(ppm) 1,02 (3H, d)

1,2-1,9 (4h, m)

2,38 (3H, s)

2,4 (1H, br)

2,70 (4H, s)

2,76 (1H, m)

3,09 (1H, q)

3,16 (1H, t)

3,40 (3H, s)

^ 3,5 (1H, br)

3,74 (1H, t)

3,85 (1H, q)

4,06 (1H, q)

4,16 (1H, q)

4,92 (1H, d)

CMR (deuteriumoksyd), S(ppm): 18,6

27,0

27,3

39,2

40,6

50, 3

50,5

54,9

57,5

58,0

60,7

71,3

71,8

75,1

76,9

80, 6

100,6

Fra de ovenstående data ble forbindelsene identifisert som 4-N-(2-aminoetyl)fortimicin-B. Utbytte 32,7$.

I 2 ml vann ble det oppløst 390 mg (1,0 millimol) av det ovenfor oppnådde 4-N-(2-aminoetyl)-fortimicin-B og oppløsningen ble innstilt til pH 2 med 5N svovelsyre. Den resulterende opp-løsning ble tilsatt dråpevis til 20 ml etanol og etter frafil-trering av det resulterende bunnfall ble det oppnådd 637 mg (0 ,91omillimol) 4-N-(2-aminoetyl)fortimicin-B-sulfat.

/§7^<5> = +77,8° (c=l,0, vann)

Element. - analyse som C.oHooN_0c.2-A-H-SO, .CoH_0H.Ho0

l/J/55 2 4 25 2

Funnet : C 32,55 - H 7,19 - N 9,93

Beregnet : C 32,56 - H 7,21 - N 9,99.

Eksempel 2

200 mg (0,49 millimol) fortimicin-A ble suspendert i 10 ml tetrahydrofuran og det ble tilsatt 10 ml aven tetrahydrofuranoppløsning inneholdende 1 mol/liter diboran (10,0 millimol). Den resulterende

blanding ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer. Etter fullfør-ing av reaksjonen ble det tilsatt 1 ml vann for å nedbryte overskudd av diboran. Den resulterende blanding ble konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Deretter ble det tilsatt 20 ml 80$> hydrazinoppløsning til resten og reaksjonsblandingen ble oppvarmet under tilbakeløp i 16 timer og deretter konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Det resulterende konsentrat, oppløst i 10 ml vann og innstilt til pH 6 med IN saltsyre, ble satt på en søyle pakket med 10 ml "Amberlite CG-50" (NH<+>^-form).

Etter påfyllingen ble det benyttet 50 ml vann og 90 ml 0,3N ammoniakkvann for vasking av søylen og deretter ble eluering utført med 0,5N ammoniakkvann. Eluatet ble oppsamlet i 2 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 9-36 ble kombinert og konsentrert for oppnåelse av 146 mg hvitt pulver. Pulverets fysikalsk-kjemiske egenskaper var identiske med egenskapene for den i eksempel 18 oppnådde forbindelse. Forbindelsen ble således identifisert som 4-N-(2-aminoetyl) f ortimicin-B. Utbytte 75,5$>.

Eksempel 3

Metodene fra eksempel 2 ble gjentatt med den unntagelse

at det ble benyttet 0,5 millimol av hver av de i den følgende tabell A anførte 4-N-acyl(eller substituert-acyl)fortimicin-B-forbindelser istedenfor fortimicin-A.

Fra de respektive fysikalske egenskaper ble de således oppnådde produkter identifisert som følger:

(1) Forbindelsens navn

(2) Mengde

(3) Utbytte

(4) Fysikalske egenskaper fra det oppnådde pulver.

Eksempel 3- 1

(1) 4-N-etylfortimicin-B

(2) 125 mg (0,33 millimol)

(3) 66%

(4) Massespektrum:

m/e 377.(M<+> + l), 376 (M<+>), 359, 344, 327, 314, 299, 286, 273, 263, 235, 217, 215, 202, 143, 114

PMR (deuteriumoksyd):

S(<p>pm): 1,02 (3H, d)

1,08 (3H, t)

1,2-1,9 (4H, m)

2,40 (3H, s)

2,6-3,0 (4H, m)

3,12 (1H, q)

3,18 (1H, t)

3,42 (3H, s)

3,40 (1H, br)

3,74 (1H, t)

3,85 (1H, q)

4,08 (1H, q).

4,17 (1H, t)

4,92 (1H, d).

Eksempel 3- 2

(1) 4-N-(n-propyl)fortimicin-B

(2) 136 mg (0,35 millimol)

(3) 70%

(4) Massespektrum:

m/e 390 (M<+>), 373, 361, 358, 344, 341, 328, 287, 277, 249, 231, 229, 219, 202, 143, 128

Eksempel 3- 3

(1) 4-N-(n-butyl)fortimi cin-B

(2) 137 mg (0,34 millimol)

(3) 68%

(4) Massespektrum:

m/e 404 (M<+>), 372, 361, 342, 301, 291, 286, 263, 219, 202, 143, 142

Eksempel 3- 4

(1) 4-N-(n-pentyl)fortimicin-B

(2) 167 mg (0,40 millimol)

(3) 80$

(4) Massespektrum:

m/e 419 (M<+> + 1), 418 (m<+>), 386, 369, 361, 356, 344, 331, 326, 315, 305, 277, 259, 219, 207, 202, 156, 143

Eksempel 3- 5

(1) 4-N-(3-aminopropyl)fortimicin-B

(2) 117 mg (0,29 millimol)

(3) 58%

(4) Massespektrum:

m/e 406 (M<+> + 1), 373, 338, 328, 292, 264, 231, 228, 219, 202, 196, 172, 143, 126, 100, 89, 58

PMR (deuteriumoksyd):

8>(ppm): 1,04 (3H, d)

1,2-1,9 (6II, m)

2,42 (3H, s)

2,5-3,0 (6H, m)

3,14 (1H, q)

3,20 (1H, t)

3.** (3H..) ,46500

~ 3,4 (lH, m)

3,79 (1H, t)

3,88 (1H, q) 4,06 (1H, q)

4,18 (1H, t)

4,94 (1H, d)

Sulfat: /a7^3 = +71,9° (c=l,0, vann)

Elementanalyse som C .^H^N^O^ • 2 , 5H2S02+ • C^H^OH• 2H20 Funnet : C 32,04 - H 7,80 - N 8,99 Beregnet : C 31,99 - H 7,52 - N 9,33-Eksempel 3- 6 (1) 4-N-(4-aminobutyl)fortimicin-B

(2) 75 mg (0,18 millimol)

(3) 35%

(4) Massespektrum:

m/e 240 (M<+> + l), 419 (M<+>), 370, 352, 342, 306, 278, 219, 210, 207, 186, 157, 143, 103, 72

PMR (deuteriumoksyd):

6(ppm): 1,02 (3H, d)

1,2-1,9 (8H, m)

2,42 (3H, s)

2,5-3,0 (6H, m)

3,06 (1H, t)

3,09 (1H, t)

3,44 (3H, s)

~3,4 (1H, m)

3,78 (1H, q)

3,86 (1H, q)

4,04 (1H, q)

4,16 (1H, t)

4,93 (1H, d)

Eksempel 3- 7 '

(1) 4-N-(5-aminopentyl)f ortimicin-B

(2) 22 mg (0,05 millimol)

(3) 10%

(4) Massespektrum:

m/e 434 (M<+> + 1), 433 (M<+>), 384, 366, 320, 292, 271, 224, 219, 171, 143, 126, 117, 89, 86

PMR (deuteriumoksyd):

S(ppm): 1,04 (3H, d)

1,2-1,9 (10H, m)

2,44 (3H, s)

2,5-3,0 (6H, m)

3,14 (1H, t)

3,20 (1H, t)

3,40 (1H, m)

3,44 (3H, s)

3,80 (1H, t)

3,84 (1H, q)

4,07 (1H, q) 4,16 (1H, t)

4,96 (1H, d)

Sulfat /§7D = +67,3 (c=l,0, vann)

Eksempel 3- 8

(1) 4-N-(6-aminoheksyl)fortimicin-B

(2) 147 mg (0,33 millimol)

(3) 66%

(4) Massespektrum:

m/e 448 (M<+> + l), 447 (M<+>), 429, 402, 398, 38O, 370, 36I, 334, 320, 306, 288, 285, 238, 222, 219, 199, 185, 143, 131, 126, 112, 98

PMR (deuteriumoksyd):

6(ppm): 1,02 (3H, s)

1,2-1,9 (12H, m)

2,40 (3H, s)

2,5-3,0 (6H, m)

3,12 (1H, t)

3,16 (1H, t)

3,43 (3H, s)

3,4 (1H, m)

3,73 (1H, t)

3,84 (1H, q)

4,04 (1H, q)

4,14 (1H, t)

4,86 (1H, d)

21°

Sulfat /§7D = +71,3 (c=l,0, vann)

Elementanalyse som C2 1 H^^O ' 2 , 5^50^ • C^H^OH' 2H20

Funnet : C 35,74 - H 7,77 - N 8,78 Beregnet: C 35,65 - H 7,80 - N 9,04

Eksempel 3- 9

(1) 4-N-(2-hydroksyetyl)fortimicin-B

(2) 106 mg (0,27 millimol)

(3) 54%

(4) Massespektrum:

m/e 393 (M<+> + l), 374, 361, 344, 331, 279, 259, 251, 235, 219, 207, 202, 143, 130, 126, 100, 97, 86

PMR (deuteriumoksyd):

S>(<pp>m): 1,01 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, m)

2,44 (3H, s)

2,78 (2H, t)

2,4-3,0 (2H, m)

3,14 (1H, t)

3,18 (1H, t)

~3,4 (1H, m)

3,44 (1H, s)

3,64 (2H, t)

3,76 (1H, t)

3,87 (1H, q)

4,06 (1H, q)

4,16 (1H, t)

4,96 (1H, d)

24°

Sulfat /«7p = +77,4 (c=l,0, vann)

Eksempel 3- 10

(1) 4-N-/2-(2-aminoetyl)aminoetyl7fortimicin-B

(2) 121 mg (0,28 millimol)

(3) 57%

(4) Massespektrum:

m/e 435 (M<+> + l), 417, 404, 36I, 344, 219, 143, 126, 100

PMR (deuteriumoksyd):

6(<p>pm): 1,00 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, m)

2,40 (3H, s)

2,6-3,0 (10H, m)

3,08 (1H, q)

3,16 (1H, t)

3,40 (3H, s)

3,4 (1H, m)

3,74 (1H, t)

3,86 (1H, q)

4,08 (1H, q)

4,16 (1H, t)

4,94 (1H, d)

Eksempel 4

a) Fremstilling av 1, 2', 6'- tri- N- benzyloksykarbonyl- fortimicin- B

1,8 g (5,2 millimol) fortimicin-B og 3 ml trietylamin

ble oppløst i 100 ml metanol og det ble dråpevis tilsatt en opp-løsning av 4,0 g (16,0 millimol) N-(benzyloksykarbonyloksy) succinimid i 50 ml tetrahydrofuran under omrøring og isavkjøling (3-5°C) i et tidsrom på 1,5 timer. Etter fullførelse av til-setningen ble oppløsningen omrørt i 2 timer under isavkjøling (3-5°C) og deretter ble oppløsningsmidlet avdampet under forminsket trykk. Resten (fast materiale) ble oppløst i 200 ml kloroform og den resulterende oppløsning ble vasket suksessivt med 100 ml hver av en vandig 5% natriumhydrogenkarbonatoppløsning og vann. Etter vaskingen ble kloroformoppløsningen tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Den resulterende faste rest ble deretter opp-løst i en liten mengde kloroform, og kloroformoppløsningen ble tilført en søyle pakket med 200 g silisiumdioksydgel ("Kieselgel 60"). I dette trinn ble elueringen utført med et blandet oppløsningsmiddel av metanol og kloroform (volumforhold 3:97) og eluatet ble opptatt i 60 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 23-50 inneholdende forbindelser med en Rf-verdi på 0,47 i oppløsningsmiddelsystem C i tabell 2, ble kombinert. Disse fraksjoner ble konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Som resultat ble det oppnådd 2,3 g hvitt pulver.

Smeltepunkt: 79-82°C.

PMR-spektrum (metanol-d4): 6 (ppm) 1,02 (3H, d)

1,2-1,6 (4H, m)

2,30 (3H, s)

2,90 (1H, t)

3,42 (3H, s)

3,5-4,0 (8H, m)

5,02 (6H, s)

5,36 (1H, d)

7,24 (15H, s)

[a]£ +20,3 (c=l,0, metanol)

Elementanalyse som C3 9H5oN4°n:

Funnet: C 62,68 - H 6,93 - N 7,17

Beregn.: C 62,38 - H 6,71 - N 7,46.

Fra de ovenfor angitte data ble det bekreftet at det oppnådde produkt var 1,2',6'-tri-N-benzyloksykarbonyl-fortimicin-B (3,1 millimol, utbytte 59,6%).

b) Fremstilling av 1,2<1>,6<1->tri-N-benzyloksykarbonyl-4-N-etylfortimicin- B

151 mg (0,20 millimol) 1,2',6'-tri-N-benzyloksykarbonylfortimicin-B oppløst i 10 ml etanol og 0,02 ml (0,25 millimol) etyljodid. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet under til-bakeløp i 17 timer og deretter konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Det resulterende konsentrat ble oppløst i 20 ml etylacetat og det ble tilsatt 10 ml av en vandig 5% natriumhydrogenkarbonatoppløsning i 10 ml vann. Etter omrysting ble etylacetatlaget skilt fra ved hjelp av en skilletrakt, tørket over vannfritt natriumsulfat og deretter konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Den faste rest ble oppløst i en liten mengde kloroform og kloroformoppløsningen ble satt på en søyle, pakket med 25 g silisiumdioksydgel /"Kieselgel 60"/. I dette trinn ble elueringen utført med et blandet oppløsnings-middel av metanol og kloroform (volumforhold 2:98) og eluatet ble oppsamlet i 6 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 29-5^, som inneholdt forbindelser med en Rf-verdi på 0,49 i oppløsningsmiddel-system C i tabell 2, ble kombinert og konsentrert til tørrhet under forminsket trykk, hvorved det ble oppnådd 30 mg hvitt pulver.

Forbindelsens fysikalske egenskaper er som følger:

PMR (metanol-d^):

6(ppm): 1,08 (3H, t)

1,02 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, m)

2,48 (3H, s)

2,90 (2H, q)

3,43 (3H, s)

5,02 (6H, s)

7,28 (15H, s)

c) Fremstilling av 4- N- etylfortimicin- B- hydroklorid

30 mg (0,039 millimol) 1,2',6'-tri-N-benzyloksykarbonyl-(4-N-etyl)fortimicin-B, fremstilt i b) ovenfor, ble oppløst i 10 ml 0,1N saltsyre/metanol-oppløsning og det ble tilsatt omkring 2 mg palladium-kull. Deretter ble hydrogengass boblet gjennom reaksjonsblandingen ved romtemperatur under atmosfæretrykk i 8 timer. Etter fullføring av hydrogeneringsreaksjonen ble katalysatoren fjernet ved filtrering og oppløsningsmidlet fjernet fra filtratet under forminsket trykk. Som resultat ble det oppnådd 21 mg hvitt pulver.

Den oppnådde forbindelses fysikalske egenskaper var identiske med egenskapene til den forbindelse som ble fremstilt i eksempel 3-1, og den ble således identifisert som 4-N-etylfortimicin-B-hydroklorid. Utbytte 97%.

Eksempel 5

a) Fremstilling av tetra- N- benzyloksykarbonylfortimicin- A

I 10 ml tetrahydrofuran ble det oppløst 230 mg (1,1

millimol) N-benzyloksykarbonylglycin, 148 mg (1,1 millimol) 1-hydroksybenzotriazol og 227 mg (1,1 millimol) N,N<1->dicyklo-heksylkarbodiimid, og reaksjonsblandingen ble omrørt under is-avkjøling (3-5°C) i 1 time. Deretter ble det tilsatt 750 mg (1,0 millimol) 1,2',6'-tri-N-benzyloksykarbonylfortimicin-B, fremstilt på samme måte som i eksempel 4a). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Deretter ble uoppløselig materiale fjernet ved filtrering, og oppløsnings-midlet fjernet'fra filtratet under forminsket trykk. Det resulterende filtrat, oppløst i en liten mengde (2 ml) kloroform, ble tilfart en soivl p nalckpt mprl ^f) rr <; i 1 i e i irairl i nlrwHrrtal

Eluering ble utført med et blandet oppløsningsmiddel av kloroform/metanol (volumforhold 98:2) og eluatet ble opptatt i 6 ml fraksjoner.

Fraksjonene nr. 24-40 som inneholdt forbindelser med en Rf-verdi på 0,66 i oppløsningsmiddelsystem B i tabell 2, ble kombinert. Disse fraksjoner ble konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Som resultat ble det oppnådd 612 mg av et hvitt pulver med følgende PMR-spektraldata (metanol-d4):

6 (ppm) 1,12 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, br)

2,98 og 3,06 (3H felles, s, hver for seg)

3,33 (3H, s)

3,2-4,5 (11H, br)

4,95 (1H, d)

5,02 (8H, s)

7,20 (20H, s).

Det ble således bekreftet at produktet var tetra-N-benzyloksykarbonylfortimicin-A (0,67 millimol, utbytte 67%).

b) Fremstilling av tetra-N-benzyloksykarbonyl-[4-N-(2-aminoetyl)-fortimicin- B ]

942 mg (1,0 millimol) tetra-N-benzyloksykarbonylfortimicin-A, oppnådd på samme måte som beskrevet i a) ovenfor, ble oppløst i 10 ml tetrahydrofuran og det ble tilsatt 10 ml diboran i tetrahydrofuran (konsentrasjon 1 mol/liter). Deretter ble den resulterende blanding omrørt i 2 timer ved romtemperatur.

Etter fullføring av reaksjonen ble det tilsatt 1 ml vann til reaksjonsblandingen for å nedbryte ethvert overskudd av diboran og reaksjonsblandingen ble konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Det resulterende konsentrat ble oppløst i 20 ml etylacetat og deretter ble 10 ml 5% vandig natriumhydrogen-karbonatoppløsning tilsatt. Etter omrysting av den resulterende blanding ble etylacetatlaget fraskilt og vasket to ganger med 10 ml vann. Etylacetatlaget ble deretter tørket over vannfritt natriumsulfat og konsentrert til tørrhet under forminsket trykk. Det resulterende konsentrat, oppløst i en liten mengde kloroform, ble påsatt en søyle pakket med kO g silisiumdioksydgel ("Kieselgel 60").

Elueringen ble utført med et blandet oppløsningsmiddel av metanol/kloroform (volumforhold 2:98) og eluatet ble oppsamlet i 6 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 6-19» som inneholdt forbindelser med en Rf-verdi på 0,70 i oppløsningsmiddelsystem C i tabell 2, ble kombinert og konsentrert under forminsket trykk for oppnåelse av 318 mg hvitt pulver.

Forbindelsens fysikalske egenskaper er anført nedenfor. PMR-spektrum (metanol-d^):

6(<p>pm): 1,08 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, m)

2,35 (3H, s)

3,34 (3H, s)

5,02 (8H, s)

Fra de ovenfor angitte data ble forbindelsen identifisert som tetra-benzyloksykarbony1-/5-N-(2-aminoety1)fortimicin- Bj.

En ytterligere eluering ble utført med 250 ml av et blandet oppløsningsmiddel av metanol/kloroform (volumforhold 1:9)

for oppnåelse av fraksjoner inneholdende forbindelsen med en Rf-verdi på 0,15 i oppløsningsmiddelsystem C i tabell 2. Fraksjonene ble konsentrert under forminsket trykk for oppnåelse av 266 mg hvitt pulver.

Pulverets fysikalske egenskaper er anført nedenfor. PMR-spektrum (metanol-d^):

S(ppm): 1,08 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, m)

2,37 (3H, s)

2,42 (3H, s)

3,40 (3H, s)

5,08 (6H, s)

7,28 og 7,34 (15H, total, s)

Fra de ovenfor angitte data ble forbindelsen identifisert som 1,2<1>,6'-tri-N-benzyloksykarbonyl-4-N-(2-metylamino-etyl)-fortimicin-B.

c) Fremstilling av 4- N-( 2- aminoetyl) fortimicin- B

310 mg (0,33 millimol) tetra-N-benzyloksykarbonyl-[4-N-(2-aminoetyl)fortimicin-B], fremstilt i b) ovenfor, ble opp-løst i 20 ml 0,1N saltsyre/metanol-oppløsning og det ble tilsatt omkring 20 mg 10% palladium-kull. Deretter ble hydrogengass bob-

let gjennom reaksjonsblandingen ved romtemperatur under atmosfæretrykk i 18 timer. Etter fullføring av hydrogeneringsreaksjonen ble katalysatoren fjernet ved filtrering og oppløsnings-midlet fjernet fra filtratet under forminsket trykk. Det resulterende konsentrat oppløst i 5 ml vann, ble satt på en søyle pakket med "Amberlite CG-50" (NH^<+->form) etter å være innstilt til pH 6 med IN natriumhydroksydoppløsning. Etter påfyllingen ble 50 ml vann og 100 ml 0,3N ammoniakkvann anvendt for vasking av søylen og deretter ble eluering med 0,5N ammoniakkvann ut-ført. Eluatet ble oppsamlet i 5 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 6-43, som inneholdt forbindelsen med en Rf-verdi på 0,41 i opp-løsningsmiddelsystem A i tabell 2, ble kombinert og konsentrert for oppnåelse av 123 mg hvitt pulver.

Den oppnådde forbindelses fysikalske egenskaper var identiske med egenskapene til den forbindelse som ble fremstilt i eksempel 1 og den ble således identifisert som 4-N-(2-aminoetyl ) f ortimicin-B. Utbytte 94%.

Eksempel 6

261 mg (0,32 millimol) 1,2',6'-tri-N-benzyloksykarbonyl-4-N-(2-metylaminoetyl)fortimicin-B, fremstilt i eksempel 5c), ble oppløst i 15 ml 0,IN saltsyre/metanol-oppløsning og omkring 20 mg 10% palladium-kull ble tilsatt. Deretter ble hydrogengass boblet gjennom reaksjonsblandingen ved romtemperatur under atmosfæretrykk i 17 timer. Etter fullføring av hydrogeneringsreaksjonen ble katalysatoren fjernet ved filtrering, og opp-løsningsmidlet fjernet fra filtratet under forminsket trykk.

Det resulterende konsentrat oppløst i 5 ml vann og innstilt til pH 6 med IN natriumhydroksydoppløsning, ble satt på en søyle pakket med 10 ml "Amberlite CG-50" (NH^+-form). Etter påfyllingen ble det benyttet 50 ml vann og 90 ml 0,3N ammoniakkvann for vasking av søylen og deretter ble eluering utført med 0,5N ammoniakkvann. Eluatet ble oppsamlet i 5 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 6-18, som inneholdt forbindelsen med en Rf-verdi på 0,4'3 i oppløsningsmiddelsystem A i tabell 2, ble kombinert og konsentrert for oppnåelse av 92 mg hvitt pulver.

Den oppnådde forbindelses fysikalske egenskaper er an-ført nedenfor.

Massespektrum:

m/e 406 (M<+> + 1), 375, 355, 296, 292, 264, 219, 143, 136, .

100.

PMR (deuteriumoksyd): 6(ppm): 1,02 (3H, d)

1,2-1,9 (4H, m) 2,12 (3H, s) 2,41 (3H, s) 2,5-3,0 (6H, m) 3,08 (1H, q) 3,16 (1H, t)

rs<y> 3,4 (1H, m)

3,41 (3H, s) 3,73 (1H, t) 3,84 (1H, q) 4,05 (1H, q) 4,15 (1H, t) 4,92 (1H, d)

CMR (deuteriumoksyd): g(ppm): 18,6

27,0 27, 3 35,6 40,6 49,1 50,4 50, 5 54,7 54,9 57,4 60,5 71,3 71,8 75,2 76,7 80,5 100,6.

Sulfat /§7D = +68,0 (c=l,0, vann)

Fra de ovenfor angitte data ble forbindelsen identifisert som 4-N-/2-(metylaminoetyl|7-fortimicin-B.

Eksempel 7

(i) I 20 ml tetrahydrofuran ble det oppløst 557 mg (2,2 millimol) L-(-)-y-benzyloksykarbonylamino-a-hydroksysmørsyre og 297 mg (2,2 millimol) 1-hydroksybenzotriazol, og reaksjonsblandingen ble omrørt under isavkjøling (3-5°C). Deretter ble det tilsatt 454 mg (2,2 millimol) N,N<1->dicykloheksylkarbodiimid og etter omrøring under isavkjøling (3-5°C) i 1 time ble det tilsatt 1,52 g (2,0 millimol) 1,2',6<1->tri-N-benzyloksykarbonyl-fortimicin-B, fremstilt på samme måte som i eksempel 4a). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 16 timer. Utfelt uoppløselig materiale ble fjernet ved filtrering og oppløsningsmidlet ble fjernet fra filtratet under forminsket trykk. Det resulterende konsentrat oppløst i en liten mengde (2ml) kloroform, ble tilført en søyle pakket med 100 g silisiumdioksydgel. I dette trinn ble det benyttet 350 ml av et blandet oppløsningsmiddel av metanol og kloroform (volumforhold 2:98) for vasking av søylen og elueringen ble også utført med samme oppløsningsmiddel. Eluatet ble opptatt i 15 ml fraksjoner. Fraksjonene nr. 15-45, som inneholdt forbindelser med en Rf-verdi på 0,78 i oppløsningsmiddelsystem B i tabell 2, ble kombinert. Disse fraksjoner ble konsentrert for oppnåelse av 792 mg av et hvitt pulver med følgende PMR-data (metanol-d^), 6(ppm),

1,12 (3H, d)

1,2-2,0 (4H, br)

3,03 (3H, s)

3,33 (3H, s)

5,05 (8H, s)

7,26 (20H, s).

Det ble således bekreftet av produktet var tetra-N-benzyloksykarbonyl-{4-N-[L-(-)-y-amino-a-hydroksybytyryl] fortimicin-B} (0,8 millimol, utbytte 40%).

(ii) På lignende måte og under anvendelse av de i tabell B angitte N-benzyloksykarbonylderivater ble de i tabell B anførte forbindelser (IV) fremstilt, idet det ble benyttet ekvimolare mengder av N-benzyloksykarbonylderivatene i stedet for L-(-)-y-benzyloksy-karbonylamino-a-hydroksy-smørsyre.

De samme metoder som i eksempel 4a) ble gjentatt under anvendelse av de i tabell E angitte tetra-N-benzyloksykarbonyl-(4-N-substituert-acylfortimicin-B)-derivater istedenfor tetra-N-benzyloksykarbonylfortimicin-A for oppnåelse av de i tabell

C angitte forbindelser (v).

(iii) Metodene fra eksempel 6 ble gjentatt med den unntagelse at de i tabell D angitte tetra- eller tri-N-benzyloksykarbonyl-(4-N-substituert-alkylfortimicin-B)derivater ble benyttet istedenfor det i eksempel 6 benyttede tetra-N-benzyloksykarbonyl-/5-(-(2-aminoetyl)fortimicin-B7-

Fra de respektive fysikalske egenskaper av de således oppnådde produkter, ble forbindelsene identifisert som angitt nedenfor: (l) forbindelsens navn og (2) det oppnådde pulvers fysikalske egenskaper.

Eksempel ( iv)- 1

(1) 4-N-/{s) -4-amino-2-fiydroksybutyl7f ortimicin-B

(2) Massespektrum:

m/e 436 (M<+> + l), 417, 400, 387, 361, 344, 330, 322, 294,

259, 245, 235, 219, 207, 202, 143, 126, 119, 100.

CMR (deuteriumoksyd):

S(ppm): 18,6, 27,0, 27,3, 37,7, 38,2, 40,4, 50,3, 50,5, 54,9, 57,3, 61,5, 67,7, 70,1, 71,7, 75,2, 76,5, 80,5, 100,6.

Sulfat /§7p3 = 78,6° (c=l,0, vann)

Elementanalyse som C^H^ 1 N^O^ * 2 , 5H2SO^ • CgH^OH* 3H"20

Funnet : C 32,62 - H 7,84 - N 8,64

Beregnet : C 32,30 - H 7,49 - N 8,97.

Eksempel ( iv)- 2

(1) 4-N-/'[S) -4-metylamino-2-hydroksybutyl7f ortimicin-B

(2) Massespektrum:

m/e 450 (M<+> + l), 431, 400, 388, 374, 370, 361, 344, 336, 330, 308, 259, 245, 219, 207, 202, 143, 133, 126, 100.

CMR (deuteriumoksyd):

6(pPm): 18,6, 27,1, 27,3, 34,4, 35,4, 40,4, 48,0, 50,3, 50,5, 54,9, 57,3, 61,5, 61,8, 67,4, 68,0, 70,8, 71,7, 75,2 76,5, 80,5, 100,6.

Sulfat /§7p = +77,5 (c=l,0, vann)

Elementanalyse som C2QH^ 3® 5° £ ' 2 , 5H"2S0^ • CgH^OH-H20

Funnet : C 34,82 - H 7,44 - N 9,22

Beregnet : C 34,65 - H 7,65 - N 8,93-

Eksempel ( iv)- 3

(1) 4-N-/'[R,S)-4-amino-2-hydroksybutyl7fortimicin-B

(2) Massespektrum:

m/e 436 (M<+> + l), 417, 400, 387, 36I, 344, 330, 322, 294, 259, 245, 235, 219, 207, 202, 143, 126, 119, 100

Sulfat /§7^ = +92,5° (c=0,2, vann)

Elementanalyse som C1^H^1N^Og.2,5H20.C2H^0H.4H20

Funnet : C 31,44 - H 7,98 - N 8,48

Beregnet : C 31,57 - H 7,57 - N 8,76.

Eksempel ( iv)- 4

(1) 4-N-/IR,S)-4-metylamino-2-hydroksybutyl7fortimicin-B (2) Massespektrum: m/e 450 (m<+> + 1), 431, 4oo, 388, 374, 370, 361, 344, 336, 330, 308, 259, 207, 202, 143, 133, 126, 100.

Eksempel ( iv)- 5

(1) 4-N-/^S)- 3-amino-2-hydroksypropyl7fortimicin-B

(2) Massespektrum:

m/e 422 (M<+> + l), 403, 391, 361, 344, 330, 308, 280, 259, 249, 231, 219, 207, 202, 159, 143, 126, 105, 100.

Sulfat /§7^<3> = +86,5° (c=0,2, vann)

Elementanalyse som C^H^N^Og . 2 , 5H2SO^ . C2H,_0H'H20

Funnet : C 32,85 - H 6,93 - N 9,23

Beregnet : C 32,87 - H 7,1? - N 9,58.

Eksempel ( iv)- 6

(1) 4-N-/{S)-3-mety1amino-2-hydroksypropyl7fortimicin-B

(2) Massespektrum:

m/e 436 (M<+> + 1), 417, 403, 391, 373, 361, 344, 330, 322, 313, 294, 219, 207, 202, 143, 126, 119, 99

Sulfat /§7p3 = 74,5° (c=0,2, vann)

Elementanalyse som C-^H^ 1 N5°5 ' 2 , 5H2S0^ • CgH^OH- 3H20

Funnet : C 32,48 - H 7,40 - N 8,71

Beregnet: C 32,30 - H 7,49 - N 8,97.

Eksempel ( iv)- 7

( 1) 4-N-/'(s ) -5-amino-2-hydroksypentyl7f ortimicin-B

(2) Massespektrum:

m/e 450 (M<+> + 1), 431, 387, 361, 344, 336, 330, 313, 308, 259, 219, 207, 202, 143, 133, 126, 100

Sulfat /§7^ +75,5° (c=0,2, vann)

Elementanalyse som C^H^N^Og • 2 , 5^30^ • CgH^OH*HgO

Funnet : C 34,78 - H 7,72 - N 8,98

Beregnet : C 34,82 - H 7,44 - N 9,22.

?

Claims

Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk virksomme 4-N-substituerte derivater av fortimicin B representert ved den generelle formel:

hvor R 2er en lavere-alkylgruppe, hydroksylaverealkylgruppe, aminolaverealkylgruppe eventuelt substituert med en hydroksygruppe, N-laverealkylaminolaverealkylgruppe eventuelt substituert med en hydroksygruppe eller aminolaverealkylaminolavere-alkylgruppe, og farmasøytisk akseptable ikke-toksiske syre-addis jonssalter derav, karakterisert ved at man (a) reduserer karbonylgruppen i amid-karbonylgruppen i 4-N-substituert fortimicin B-derivater representert med den generelle formel:

hvor R 2 har de samme betydninger som angitt ovenfor og syre-addis jonssalter derav, til en metylengruppe eller (b) fjerner den beskyttende gruppen i 4-N-substituerte derivater av fortimicin B representert ved formelen:

hvor R 3 er en aminobeskyttende gruppe og R<1><2>har de samme betydninger som R~ forutsatt at den frie hydroksygruppen i 2 2 R kan være beskyttet og den frie aminogruppen i R er be

skyttet,

og, om ønsket, omdannelse av forbindelsen dannet ved metode (a) eller (b) til et farmasøytisk akseptabelt ikke-toksisk syre-addis jonssalt derav.