NO146085B - Anordning for blaaseforming av hule plastgjenstander med konkav bunn - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til isolering av de nye alkaloider, leurosidin og leurocristin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolering av nye alkaloider og salter derav fra planter som hører til familien Apocynaceae.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer

en fremgangsmåte til isolering av alkaloidene leurosidin og/eller leurocristin i alt vesentlig i ren form, bestående i at alkaloidfraksjonen som inneholder ett av eller begge de nevnte alkaloider, ekstraheres fra plantemateriale av planter av familien Apocynaceae, leurosidin og/eller leurocristin adskilles kromatografisk fra de ledsagende alkaloider, og leurosidin og/eller leurocristin krystalliseres deretter i form av den frie base eller som et syreaddisjons-salt.

Alkaloidene leurosidin og/eller leurocristin isoleres fra planter av familien Apocynaceae som inneholder ett av eller begge de nevnte alkaloider ved at det ovenfor nevnte plantemateriale bringes i kontakt med vandig syre og et ikke-vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, det organiske lag som inneholder leurocristin og/ eller leurosidin alkaloidfraksjonen atskilles, og deretter frigjøres leurosidin og/eller leurocristin for de andre ledsagende alkaloider. A) Nevnte alkaloid leurosidin har de føl-gende kjemiske og fysiske egenskaper: a) elementæranalyse: C, 67,05; H, 7,34;

N, 6,24; O, 18,81

b) smeltepunkt = 208—211° C ukor.

c) optisk dreining, a 2D5 = + 55,8° (C

= 1 i kloroform)

d) logaritmiske dissosiasjonskonstan-

ter (pK.,) på 5,0 og 8,8 (bestemt i 33 prosent vandig dimethylformamid)

e) ultra violette absorbsj onsmaksima ved 214 og 265 m|x med innbøyninger ved

286, 295 og 310 mjj, (bestemt i ethanol), og

f) infrarøde absorpsjonsmaksima ved 2,89, 3,41, 5,74, 6,17, 6,64, 6,85, 6,97 7,28 7,50, 7,74, 8,15, 8,74, 8,84, 9,04, 9,15, 9,60, 9,89, 10,44, 10,86, 11,13 11,99 og 12,21 micron; og B) Nevnte alkaloid leuricristin har de føl-gende kjemiske og fysiske egenskaper: a) elementæranalyse: C: 66,73; H, 7,06;

N, 6,75; O, 19,44

b) smeltepunkt = 218—220° C ukor.

c) optisk dreining, a = + 17° (C =

1 i etylendiklorid)

d) logaritmiske dissosiasjonskonstan-ter (pKa) på 5,0 og 7,4 (bestemt i 33 prosent dimethylformamid) e) ultra violette absorpsj onsmaksima ved 220, 255 og 296 mu med innbøyninger ved 262 og 290 m|x (bestemt i ethanol), og f) infrarøde absorpsj onsmaksima ved 2,78, 2,90, 3,41, 5,74, 5,93, 6,24 6,67, 6,86, 6,97,

7,35, 7,53, 7,74, 8,15, 8,56, 8,75, 8,87, 9,07, 9,28, 9,70, 9,91, 10,45, 10,73, 10,86, 11,23, 11,74 og 12,02 micron.

Oppfinnelsen tilveiebringer to nye dimere alkaloider, leurosidin og leurocristin, som man får fra amorfe alkaloid-fraksjoner erholdt fra apocynaceaeplanter. Også inkludert innen rammen av foreliggende oppfinnelse er nevnte syreaddisjonssalter og de kvartære ammoniumderivater av leuricristin og leurosidin.

Leurocristin og leurosidin er nær be-slektede dimere alkaloider som har to in-dolring-systemer pr. molekyl. Alkaloidene i form av de frie baser er høytsmeltende krystallinske faste stoffer, leurosidin fri base smelter ved ca. 208—211° C under spaltning og leurocristin fri base smelter ved ca. 218—220° C med spaltning.

Tabell I nedenfor angir elementæranalyse og molekylvekt for leurocristin, leurosidin, og deres sulfatsalter.

I tillegg til deres likhet med hensyn til smeltepunkt og molekylvekt, danner begge de frie baser salter med passende anioner; f. eks. sulfatsalter med svovelsyre. Begge de frie baser danner i tillegg kvartære amoniumderivater ved reaksjon med alkyljodider som f. eks. methyljodid. Når det gjelder andre egenskaper enn dem som er angitt ovenfor, viser imidlertid leurosidin og leurocristin betaktelig forskjeller; leurosidin er f. eks. mer høyredreiende enn leurocristin, og har a 2D5 = + 55,8° (C 1 i kloroform), mens leurocristin har a y = + 17° (C = 1 i ethylendiklorid). Begge alkaloider har to titrerbare basiske grupper når de titreres i 33 prosent vandig dimethylformamid. pKa-verdiene for de basiske grupper i leurosidin er 5,0 og 8,8, mens de for leurocristin er 5,0 og 7,4. De ultraviolette absorpsj onsspektra i ethanol er også forskjellige. Spekteret for leurosidin har absorpsj onstopper ved 214 og 265 mu med innbøyninger på 286, 295 og 310 mu, mens spekteret for leurocristin har topper ved 220, 255 og 296 mu med innbøyninger ved 262 og 290 mu.

Tabell II angir de infrarøde absorpsj onsmaksima for alkaloidene bestemt 1 kloroformoppløsning.

Leurocristin og leurosidin kan isoleres fri for andre alkaloider på følgende måte: Blader, stammer, eller røtter, hvor for seg eller i blanding, av planter som hører til familien Apocynaceaa, hvilke planter er funnet å inneholde enten ett av eller begge de nye alkaloider, leurocristin og leurosidin, tørkes og males. Det tørkede, malte materiale fuktes med en fortynnet vandig syre, og det fuktede materiale ekstraheres med et ikke-vannblandbart organisk oppløs-ningsmiddel. De mer sterkt basiske alkaloider forblir i den faste fase, mens de svakt basiske alkaloider inkludert leurocristin og leurosidin så vel som leurosin og vincaleukoblastin ekstraheres til det organiske oppløsningsmiddel. Det organiske ekstrakt atskilles og konsentreres. Den svakt basiske alkaloidfraksjon ekstraheres fra det organiske konsentrat til vandig syre. Det sure, vandige ekstrakt atskilles og ekstraheres med et ikke-vannblandbart organisk opp-løsningsmiddel. Det sure, vandige lag gjø-res basisk, og leurisidin-leurocristin alkaloidfraksjon en ekstraheres deretter tilbake til et ikke-vannblandbart organisk oppløs-ningsmiddel. Dette ekstrakt utsettes for en kromatografisk atskillelsesprosess. Ved denen fremgangsmåte uttrekkes leurosin og vicaleukoblastin først selektivt med et svakt polart oppløsningsmiddel som f. eks. benzen eller eter. Den fraksjon som inneholder leurosidin og leurocristin, som er sterkere bun-det, uttrekkes deretter fra kromatografi-kolonnen med et noe mer polart oppløs-ningsmiddel som f. eks. kloroform eller methanol. Denne fraksjon rekromatografise-res slik at man får en ytterligere rensning og konsentrasjon av leurosidin og leuricristin. De rå alkaloider erholdes ved inndampning av hver kromatografifraksjon til tørrhet i vakuum. Det resulterende amorfe residum oppløses i et oppløsningsmiddel som f. eks. methanol eller ethanol. Leurosidin, hvis det er til stede, krystalliserer under disse betingelser og atskilles ved filtrering. Konsentrasjon og avkjøling av fil-tratet frembringer leurocristin, hvis dette er til stede, som en krystallinsk substans, som også atskilles ved filtrering. De alko-holiske oppløsninger fremstilt ved å opp-løse de ovenfornevnte amorfe residuer, kan alternativt behandles direkte med vandig eller ethanolsk svovelsyre, og således frembringe utfelling av leurocristinsulfat. Fil-trater fra hvilke leurosidin og leurocristin er atskilt som krystallinske alkaloidbaser kan også behandles på lignende måte slik at man får leurocristinsulfat.

Ved den ovenfornevnte fremgangsmåte kan andre syrer som f. eks. eddiksyre og sitronsyre og lignende, anvendes istedenfor vinsyre. Ikke-vannblandbare organiske orjoløsningsmidler som er egnet ved for-skiellige trinn i den ovenfornevnte prosess omfatter benzen, eter, ethylacetat. kloroform, ethylendiklorid, methylisobutylketon og lignende.

Leurocristin og leurosidin er effektive til å lette symptomene og minske smertene ved forskjellige ondartede sykdommer. Blant de sykdommer som med hell kan behandles, er Hodgkin's sykdom, akutt lymfo-cytisk leukemi, multipel myeloma, lymfo-sarcoma, astrocytoma og carcinoma i cer-vix og prostata. I mange tilfelle får man en bedring hos sykdommen ved Hodgkin's sykdom og leukemi og det er en tilbakegang i svulststørrelse og en opphøring av svulst-vekst ved carcinoma og sarcoma.

Når leurocristin, leurosidin, deres syreaddisjonssalter og deres kvartære ammoniumderivater anvendes terapevtisk, administreres de generelt til den syke person i doser som varierer fra ca. 0,01 til ca. 10 mg/ kg kroppsvekt. Særlig leurocristin, for-trinsvis i form av sulfatsalt, frembringer en terapevtisk effekt ved forskjellige sykdommer, inkludert store svulster, når det administreres i dosemengder som varierer fra 0,01 til 0,2 mg/kg. Legemidlet administreres vanligvis intravenøst men det kan også administreres på andre måter, inkludert oralt.

De følgende eksempler skal tjene til å illustrere oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1.

Isolering av leurocristin og leurosidin

fra 90 pst. blader.

800 kg Vinca rosea — planter bestående % v ca. 90 pst. blader og 10 pst. stammer ble <f>uktet med 540 liter 2 pst. vandig vinsyre. De fuktede blader ble ekstrahert ved hjelp v omrøring med fem 4000-liter porsjoner benzen. Benzenekstraktene ble kombinert og ble konsentrert i vakuum til et volum på ".a. 500 liter. 1,070 liter 2 pst. vandig vinsyre ble tilsatt til benzenkonsentratet og det ?i en værende av benzenen ble fjernet ved hielp av vakuum-dampdestillasion. Det su-re, vandige konsentrat ble filtrert for å <f>1erne uoppløselig materiale, og dets surhetsgrad ble deretter justert til en pH-verdi på ca. 3 ved tilsetning av 28 pst. vandig ammoniakk. Den sure oppløsning ble ekstrahert med to 540-liter porsjoner ben-den. Benzenekstraktene ble atskilt og fjernet. Surheten av den vandige oppløsning ble justert til en pH-verdi på rundt 8.5 til

9.0. igien ved tilsetning av 28 pst. vandig ammoniakk. Den basiske oppløsning ble ekstrahert med to 540-liter porsjoner ben-7en. og benzenekstraktene ble atskilt og kombinert. De kombinerte ekstrakter ble tørket og konsentrert i vakuum til et vo-!um på ca. 15 liter. Benzenkonsentratet ble ri elt i tre like porsjoner, som hver for seg ble kromatografert over 40 kg porsjoner av deaktivert aluminiumoxyd. Hver 40 kg por-sion av aluminiumoxyd var deaktivert ved hjelp av 7,5 liter vann og 347 ml iseddik.

Tabell III som følger, gjengir de resul-tater man fikk ved denne innledende kro-matografiske atskillelse. I tabellen angir spalte 1 nummere på fraksjonen, spalte 2 uttrekningsmidlet eller blanding av slike, og spalte 3 det alkaloid som hovedsakelig ble erholdt fra vedkommende fraksjon.

Leurocristin og leurosidin var blant de alkaloider som var til stede i fraksjonene 47—52.

Vincaleukoblastin ble erholdt som et krystallinsk sulfatsalt fra fraksjonene 43— 45. Den resulterende moderlut ble kombinert med fraksjonene 47—52. De kombinerte fraksjoner ble tørket og ble deretter helt langsomt under omrøring opp i en oppløsning av 336 gram sitronsyre og 16 liter vann. Denne oppløsnings surhetsgrad ble justert til en pH-verdi på ca. 4,4 ved hjelp av 28 pst. vandig ammoniakk, og oppøsningen be deretter ekstrahert med to 16-liter porsjoner benzen. Benzenekstraktene ble kombinert; de kombinerte ekstrakter ble tørket ved hjelp av vannfritt natriumsulfat og ble konsentrert til tørrhet i vakuum. Surheten av det vandige lag ble deretter justert til en pH-verdi på ca. 7,0 ved hjelp av 28 pst. vandig ammoniakk, og den resulterende oppløsning ble igjen ekstrahert med to 16-liter porsjoner benzen. Benzenekstraktene ble kombinert; de kombinerte ekstrakter ble tørket ved hjelp av vannfritt natriumsulfat, og oppløsnings-midlene ble fjernet ved inndampning i vakuum, og man fikk igjen en blanding av alkaloider som et residum. 40 gram av de gjenværende alkaloider ble oppløst i 300 ml benzen, og den resulterende oppløsning ble kromatografert over 1335 gram aluminiumoxyd som var delvis deaktivert ved behandling med 80 ml vann og 4 ml eddiksyre.

Kromatogrammet ble fremkalt ved å anvende det samme uttrekningsmiddel eller blandinger derav, som ble anvendt i tabell III. Tabell IV angir resultatet av dette kro-matograf.

De fraksjoner som ble uttrukket ved hjelp av benzen-kloroform (1:1) og benzen-kloroform (1:3) ble funnet å inneholde leurosidin og leurocristin.

Hver kromatografifraksjon som inneholdt leurosidin og/eller leurocristin ble inndampet til tørrhet i vakuum og det gjenværende alkaloidmaterialet ble kry-stallisert fra methanol. Leurosidin, når til stede, ble utfelt som en første krystallinske fraksjon, og leurocristin ble erholdt ved konsentrering og avkjøling av moderluten fra leurosidinkrystallisasj onen. Leurocristinsulfat ble også erholdt fra moderluten fra den direkte krystallisasjon av leurocristin fri base ved å anvende fremgangs-måten som angitt i eksempel 3 nedenfor.

Den ovenfornevnte atskillelse ble gjen-tatt med den unntagelse at blandingen av 90 pst. Vinca rosea-blader ble fuktet med 32 liter vandig ammoniakk og 560 liter vann. Etterat den opprinnelige sure, vandige oppløsning var ekstrahert ved en pH-verdi på 3, ble oppløsningens surhet justert til pH = 5, og ekstraheringen med benzen for å fjerne de ønskede alkaloider ble utført ved denne pH-verdi istedenfor ved pH = 8,5 som i det ovenfornevnte eksempel. Alkaloidene som ble ekstrahert ved pH = 5, ble kromatografert som angitt ovenfor slik at man fikk leurocristin og leurosidin.

Som man ville anta, er det mulig, ved å anvende et stort overskudd av aluminiumoxyd, å benytte bare den kromatogra-fiske atskillelsesprosess istedenfor de to som av praktiske grunner ble benyttet i eksemplet ovenfor. Uttrykket «kromatografisk atskillelsesprosess» som her anvendt, betyr atskillelse av alkaloidbaser ved hjelp av selektiv uttrekning enten det anvendes 1, 2 eller endog 10 separate kromatografi-prosesser for å fjerne de medfølgende for-urensninger før uttrekningen av de ønskede alkaloider.

Ved den ovenfornevnte kromatografis-ke atskillelsesprosess, ble det anvendt benzen-kloroform-oppløsningsmiddelsyste-mer for å uttrekke leurosidin-leurocristin-alkaloidfraksjonen selektivt. Det er tidli-gere bestemt at anvendelsen av dette opp-løsningsmiddelsystem ga en god atskillelse av de ønskede alkaloider fra ledsagende alkaloider i løpet av en rimelig tid. For å bestemme det optimale uttrekningsmiddel-system, ble det utført en eksperimentell kromatografisk atskillelse i liten måle-stokk, ved hvilken alkaloidblandingen ble anbrakt på en kolonne fremstilt av deaktivert aluminiumoxyd, og en gruppe uttrek-ningsmidler ble ført gjennom kolonnen i rekkefølge ordnet etter økende uttrek-ningsevne. En nyttig liste over slike uttrek-nngsmidler basert på økende dielektrisitetskonstant, kan finnes i en artikkel av Jacques og Mathieu-BuZi Soc. Chem. Fran-ce, (1946), 94—98.

Som det er vanlig ved de fleste kro-matografiske atskillelser, er det uttrekningsmiddel som faktisk benyttes, ikke kri-tisk. I henhold til tabell IV ovenfor, ble f. eks. de ønskede alkaloider, leurocristin og leurosidin, uttrukket ved hjelp av et benzen-kloroform (1 : 3) oppløsningsmiddel-system. Rent benzen eller et benzen-kloroform (3:1) opløsningsmiddelsystem ville sannsynligvis ha gitt en tilsvarende atskillelse, men den nødvendige tid for å oppnå den samme atskillelsesgrad ville økes vesentlig. Generelt uttrekker et oppløsnings-middel med lavere dielektrisitetskonstant langsommere, men gir en bedre atskillelsesgrad, mens et oppløsningsmiddel med en høy dielektrisitetskonstant gir en rask, men mindre selektiv uttrekning.

En annen faktor som kontrollerer val-get av uttrekningsmiddel ved en kromatografisk atskillelse, er aktivitetsgraden for aluminiumoxydet. Ved den ovenfornevnte kromatografi ble det f. eks. anvendt et aluminiumoxyd deaktivert med eddiksyre og vann. Bruken av mer aktivt aluminiumoxyd ville enten kreve en lengre uttrekningstid for det samme oppløsningsmiddelsystem, eller bruken av et oppløsningsmiddelsystem med en høyere dielektrisitetskonstant. På same måte ville bruken av et mindre aktivt aluminiumoxyd bety at man trengte et opp-løsningsmiddelsystem med en lavere dielektrisitetskonstant for å uttrekke leurosidin og leurocristin i løpet av samme tid med samme renhetsgrad.

Eksempel 2.

Fremstilling av sulfatsalter.

1 gram leurosidin ble oppløst i 30 ml aceton. En oppløsning som inneholdt 5 ml 1 pst. vandig svovelsyre og 42 ml vann, ble

tilsatt til acetonoppløsningen av alkaloidet. Den resulterende blanding ble inndampet

til tørrhet i vakuum. Residuet som besto av leurosidinsulfat, ble oppløst i vannfri ethanol under oppvarmning. Avkjøling av den ethanolske oppløsning resulterte i krystallinsk leurosidinsulfat med smeltepunkt

på ca. 237—245° C. Det var et tap av opp-løsningsmiddel i området 201—212° C.

Leurocristinsulfat ble fremstilt på helt analog måte fra leurocristin fri base. For-bindelsen smeltet ved ca. 273—281° C etter omkrystallisering fra ethanol. Det var et tap av oppløsningsmiddel i området 210— 232° C.

Eethanol kan anvendes istedenfor vann ved blandingen med 1 pst. vandig svovelsyre i den ovenfornevnte fremgangsmåte.

Andre salter av leurocristin og leurosidin som f. eks. fosfatet, nitratet, hydro-kloridet, hydrobromidet, benzoatet, succi-natet, tartratet og lignende fremstilles ved å anvende den riktige syre istedenfor svovelsyre i det ovenfornevnte eksempel.

Eksempel 3.

Fremstilling av Methiodider av Leurosidin og Leurocristin.

0,001 mol leurocristin ble oppløst i ca. 10 ml benzen. 0,002 ekvivalenter methyliodid ble tilsatt til benzenoppløsningen og den resulterende blanding ble holdt ved romtemperatur i ca. 5 timer, og i løpet av denne tid ble det utfelt krystallinsk leurocristinmethiodid. Blandingen ble avkjølt i ca. 2 timer for å frembringe ytterligere utfelling av leurocristinmethiodid. Bunnfal-let ble atskilt ved filtrering og ble omkry-stallisert fra ethanol. Leurocristinmethiodid fremstilt på denne måte, smeltet ved ca. 226—232° C.

Analyse: Funnet: I, 13,08.

Leurosidinmethiodid ble fremstilt ved å substituere leurosidin for leurocristin i den ovenfornevnte fremgangsmåte. Leurosidinmethiodid smeltet under spaltning ved ca. 198—216° C etter omkrystallisering fra ethanol. Det var et tap av oppløsningsmid-del ved ca. 173—178° C.

Analyse: Funnet: 1,13,05.

Andre kvartære salter av leurosidin og leurocristin fremstilles ved å substituerte andre alkyl- og aralkylhalogenider, -sulfa-ter osv. for methyliodid i de ovenfornevnte fremgangsmåter. Blant de forbindelser som således kan substitueres er de følgende. Benzylklorid, p-nitrobenzylbromid, ethyl-iodid, dimethylsulfat, propylbromid, butyl-iodid, m-klorfenethyliodid, o-ethoxybenzyl-klorid og lignende.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til isolering av de terapevtisk aktive alkaloider leurosidin og/ eller leurocristin eller syreaddisjonssalter eller kvaternære ammoniumforbindelser derav, karakterisert ved at alkaloidfraksjonen som inneholder en eller begge nevnte alkaloider, ekstraheres fra plantemateriale av familien Apocynaceae, leurisidin og/eller leurocristin adskilles kromatografisk fra sine ledsagende alkaloider, og deretter krystalliseres nevnte leurosidin og/eller leurocristin enten i form av fri base, salt eller kvartær forbindelse.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at plantemateri-alet bringes i kontakt med en vandig, svak syre og et ikke-vannblandbart organisk oppløsningsmiddel, og det organiske lag som inneholder alkaloid-fraksjonen, adskilles, de svakt basiske alkaloider i den organiske fase, ekstraheres med vandig syre og det vandige ekstrakt gjøres alkalisk, og de svakt basiske alkaloider ekstraheres derfra med et ikke-vannblandbart organisk opp-løsningsmiddel, og deretter utsettes de svakt basiske alkaloider for kromatografisk adskillelse.