NO137845B - Fremgangsm}te til fremstilling av et stabilt insulinpreparat med gunstig tids-virknings-profil - Google Patents

Description

Por fremstilling av insulinpreparater med depotvirkning har man hittil benyttet 2 veier: Enten satte man til insulinet ved siden av slnkioner depotlegemer som bis-(4-amino-kinaldin-6)-N,N'-urinstoff-hydroklorid, globin eller protamin, eller man anvendte,suspensjoner av krystallinsk eller amorf insulin.

Virkningen av krystallsuspensjonenes insulin inn-

trer langsomt og vedvarer ofte for' lenge. Virkningen av en suspensjon av amorft insulin inntrer derimot hurtig, men sluttes for tidlig.

Man har derfor også kombinert krystallisert og

amorft insulin for å oppnå en gunstig tids-virknings-profil.

Ved en slik kombinasjon må det imidlertid være sikret at det i løpet av lagringen ikke inntrer omdannelse av amorf til krystallinsk insulin. Dette- ble hittil hindret ved at det ble anvendt insuliner av forskjellige arter,, f.eks. krystallinsk storfe-insulin og amorft svine-insulin.

En slik kombinasjon har imidlertid den ulempe at

de også frembringer dannelsen av antilegemer mot disse to arter. Man har for noen år siden begynt med å anvende mono-type-insulin, fordi det da ved opptreden av immunologisk betinget insulin-resistens kan gåes over til en annen insulin som på forhånd ennå ikke var blitt anvendt, f.eks. storfe- til svine-insulin. Denne mulighet fjerner man ved anvendelsen av kombinasjoner av insuliner av forskjellig type.

Det er nå blitt funnet at man kan blande amorft des-fenylalanin Bl-insulin med komplette insulinkrystaller av samme type til en stabil kombinasjon uten at det inntrer en omdannelse av amorft til krystallinsk des-fenylalanin Bl -insulin (des-Phe RI-insulin). Selv i nærvær av sinkioner foregår ingen omdannelse.

Da des-fenylalanin- Bl-insulin har samme immunogene grupperinger som det tilsvarende komplette insulin, danner begge insuliner et tofaset (krystallinsk/amorft), stabilt system med de immunologiske egenskaper av en monotype-insulin.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av et stabilt insulinpreparat med gunstig tids-virknings-profil, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at det til en suspensjon av insulinkrystaller settes en suspensjon av amorft des-fenylalanin B1-insulin fra samme dyreart i et forhold mellom 60:40 og 80:20.

Hensiktsmessig innstilles denne suspensjon til en pH-verdi på 6,7 - 7,6, fortrinnsvis 7,0 - 7,4, og inneholder inntil 340 y/100 I.E. sinkioner. Det er ifølge oppfinnelsen foretrukket å anvende insulin av høy renhet.

Insulinkrystallene i suspensjonen har hensiktsmessig en enhetlig størrelse mellom 15 og 35/U. Krystallsuspensjonen kan ved siden av sinkionene som fordelaktig utgjør en konsentrasjon på 200 y/I.E. tilsvarende 80 mg/ml Zn, dessuten inneholde salter som natriumacetat, hensiktsmessig i en konsentrasjon på

0,1 - 0, 2%, eller natriumklorid, hensiktsmessig i en konsentrasjon på 0,5 - 1% og/eller konserveringsmidler som 4-hydroksy-benzosyré-metylester, hensiktsmessig i en konsentrasjon på ca. 0, 1%.

Sammensetningen av preparatet kan varieres innen

visse grenser. Forholdet mellom krystallisert insulin og amorft

Bl des-Phe -insulin bestemmer tidsvirknings-profilen. Det ligger mellom 60 :40 og 80:20 og utgjør fortrinnsvis 70:30 til 75:25. Preparatets samléde insulin-innhold bør hensiktsmessig utgjøre

HO - 80 I.E./ml.

B1

Des-Phe -insulin er allerede omtalt i litteraturen, imidlertid ble hittil dets evne til dannelse av stabile tofasede systemer med komplette insuliner av samme type hittil ikke- erkjent.

Preparatene fremstillet ifølge oppfinnelsen har lang-varig insulin-depotvirkning. Den er også etter ett års lagring ved 25°C uforandret med hensyn til dens fysikalske tilstand og den biologiske virkning.

Preparatene finner anvendelse, som depot-insulin ved behandling av diabetes mellitus. Den er spesielt egnet ved ny-innstilling av pasienter, når det skal hindres at det danner seg antilegemer overfor flere insulintyper.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.

Eksempel 1.

A. Fremstilling av sink- insulin- krystallsuspensjpn.

l6 g rent krystallinsulin med en minsteaktivitet på 25 I.E./mg beregnet på tørrstoff oppløses i 750 ml 0,02 N salt-syre, som inneholder 0,013% sinkioner i form av sinkklorid. Til denne insulinoppløsning settes 250 ml av en oppløsning som inneholder 0,95% iseddik og 2, 8% natriumklorid. Den klare blanding gjøres deretter kimfri ved sterilfiltrering ved hjelp av membran-sjikt. Til den sterile filtrerte oppløsning settes så meget av en steril 4 N natronlut at det oppnås en pH-verdi mellom 5,^ og 5,6. Den dannede amorfe sinkinsulinsuspensjon omrøres kort under sterile betingelser ved værelsestemperatur og plasseres deretter i kjøleskap ved 4 til 7°C for krystallisering.

Etter maksimalt 36 - 40 timer har det dannet seg jevnt formede rhomboedriske krystaller av sinkinsulin av enhetlig størrelse mellom 18 til 30^u. Krystallene avslynges i sterile begere med lavt turtall, idet eventuelt ennå tilstedeværende små amorfe mengder adskilles. Det frasentrifugerte krystallisat sus-penderes deretter igjen i 1 liter av en steril pufret, nøytral insulinfortynningsoppløsning (sammensetning se tabell 1) (stam-suspensj on ) .

natronlut til pH 7 , H

steril filtreres

Bestemmelse av insulinkrystallinnholdet i stamsuspensjonen.

For bestemmelse av insulinkrystallinnholdet i stamsuspensjonen uttas fra krystallsuspensjonen etter intens gjennom-blanding ved hjelp av en magnetrører 4 ganger hver gang 1 ml (helpipette) og innholdet av insulin bestemmes etter.følgende metoder. 1. Gravimetrisk etter tørkning med aceton og eter og utveining,

2. etter oppløsning av krystallene spektrofotometrisk i UV

ved 280 m7u,

3. Ved bestemmelse av N-innholdet.

Fremstilling av depotkomponenter som inneholder 40 I. E./ ml.

Under hensyn til insulininnholdet i stamsuspensjonen innstilles ved ytterligere tilsetning den sterile fortynningsopp-løsning til det ønskede insulininnhold på 40 I.E./ml.

Utbytte maksimalt 10 liter.

B: Fremstilling av de amorfe komponenter av des-fenylalanin<Bl>

insulin..

——————^ - ——. , , ,

6,304 g des-fenylalanin -insulin oppløses i 3,5 liter av en oppløsningsvæske av den i tabell 2 gjengitte sammensetning.

Den klare oppløsning av des-phe-insulin avkimes deretter ved hjelp av membranfilter og innstilles på et volum på

3,9 liter ved tilsetning av 400 ml oppløsningsvæske, som etter des-phe-insulinfiltrering ble sendt gjennom samme sterilfilter. Ved tilsetning av 4 N steril natronlut innstilles.en pH-verdi på 7,4 (forbruk 13,6 ml). Ved ytterligere tilsetning av 34 ml av en steril, nøytral insulinfortynningsoppløsning bringes det til et sluttvolum på 4,948 liter og innstilles således på et insulin-innhold på 40 I.E./ml, på grunnlag av en aktivitet av des-phe-utgangsinsulin på 25 I.E./mg.

C. Fremstilling av den påfyilingsferdige depottilberedning.

Ved blanding av den krystallholdige, etter punkt A fremstilte depotkomponent med den ifølge B fremstilte komponent,

Bl

som inneholder amorft des-phe -insulin, i volumforhold 70:30

får man et preparat som inneholder 28 I.E. krystallinsk og 12 I.E. amorf komponent, sammenlagt 40 I.E. insulin i ml. Suspensjonen fylles sterilt i småflasker på hver 10 ml.

Eksempel 2.

Man blander 60 deler av den ifølge punkt A fremstilte komponent med 40 deler av den ifølge punkt B fremstilte komponent og får et preparat som inneholder 24 I.E. krystallinsk komponent og 16 I.E. amorf komponent, tilsammen 40 I.E. insulin pr. ml.

Suspensjonen fylles sterilt i småflasker på hver 10 ml.

Eksempel 3-

Man blander 75 deler av den ifølge pUnkt A fremstilte komponent med 25 deler av den ifølge punkt B fremstilte komponent og får et preparat som inneholder 30 I.E. krystallinsk komponent og 10 I.E. amorf komponent, tilsammen 40 I.E. insulin pr. ml. Suspensjonen fylles steril i småflasker på hver 10 ml. Eksempel 4.

Man blander 80 deler av den ifølge A fremstilte komponent med 20 deler av den ifølge B fremstilte komponent, og får et preparat som inneholder 32 I.E. krystallinsk komponent og 8 I.E. amorf komponent, tilsammen 40 I.E. insulin pr. ml. Suspensjonen fylles steril på småflasker på hver 10 ml.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et stabilt insulinpreparat med gunstig tids-virknings-profil, karakterisert ved at det til en suspensjon av insulin- Bl krystaller settes en suspensjon av amorf des-fenylalanin insulin fra samme dyreart i et forhold mellom 60:40 og 80:20.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes insuliner av høy renhet.