NO134745B - - Google Patents

Abstract

Antibiotikum til bruk som vekstfremmende middel for husdyr.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et nytt antibio-t ikum.

Det hittilt ukjente antibiotikum, kalt "MYC 8003"

er av spesiell verdi på grunn av dets vekstfremmende egenskaper når det foreskrives husdyr. Det oppnås fra et kulturmedium av en mikroorganisme som nedenfor vil karakteriseres i detalj og som tilhører slekten Streptomyces• Mikroorganismen som fremstil-ler antibiotikumet er hittil ikke beskrevet, og en prøve på den er deponert i samlingen til "Central Bureau voor Schimmelcultures"

i Baarn, Nederland, hvor den er gitt nummeret CBS 190.69, hvor den er offentlig tilgjengelig. Den hittil ukjente mikroorganisme er blitt kalt Streptomyces ramocissimus.

Det antibiotiske stoff ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at det er et gult, saltdannende, svakt surt, fast stoff som inneholder elementene karbon, hydrogen, nitrogen og oksygen i mengder på 63,W, 7, 6%, 3, 5% hhv. 25,1$ (ved subtraksjon), har en molekylstruktur som omfatter tre likevektsdannende tautomere konfigurasjoner, har en optisk rotasjon [al^2, 2 på -60<o >( 1%- ig metanolisk oppløsning), er lite oppløselig i karbontetraklorid og benzen, men oppløselig i kloroform, metylisobutylketon, butylace-tat, etylacetat, metanol og alkaliske oppløsninger, viser en svakt positiv reaksjon i aromattesten, danner en rød farge med konsentrert svovelsyre, en mørk brun farge i Paulyreaksjonen, en mørk rød farge og uklarhet med jern(III)klorid, danner et bunnfall med bromvann, viser gassdannelse ved 135°C, ytterligere gassdannelse ved omkring 152°C og viser dekomponering ved l64-174°C, har absorbsjonsmaksima i den ultrafiolette delen av spekteret ved 233, 276, 286 og 327 nm, og i den infrarøde delen av spekteret ved 810, 860, 9^0, 980, 1090, 1215, 1355, 1^55, 1540,. 1650, 2930, 2970 og 3400 cm<-1>, og at det er fremstilt ved at den hittil

■■ <?>!$ ?■ ukjente mikroorganisme Strept<:>omyces ramocissimus. (.C.B.S. 190.69) . _.''.^/dyrkes i et vandig næringssubstrat; inneholdende assimilerbare"' v''1.1'kilder for karbon, nitrogen, og" uorganiske stoffer.

\"....^'. y;'' Antibiotikumet i henhold til oppfinnelsen er som ' £ nevnt ovenfor en svak syre, og det danner antibiotisk aktive "salter slik som natrium-, kalium-, ammonium- og aminsalter.

Det antibiotiske stoff er uoppløselig i dietyleter, petro.leumeter, vann og sure oppløsninger.

Stabilitet:

Forsøk har viet at over tidsrom på omkring 4 timer ved værelsestemperatur, så er det antibiotiske stoff når det er oppløst i 50%- ig vandig metanol, stabilt innen en pH-område på

fra 3-12.

Det faste antibiotikum, lagret ved 25°C og 37°C ved lave relative fuktigheter, viser ingen tap i aktivitet i minst 5 måneder. Det er stabilt i 3 måneder ved 25°C og 100$ relativ

fuktighet ag i 2 måneder 'ved 37°C og 100$ relativ fuktighet. Reaksjon på mulige funksjonelle grupper:

Det antibiotiske stoff har ikke et skarpt smelte-punkt eller smelteområde. Ved 135°C inntrer en gassutvikling, mens det antibiotiske stoff mykner. Ved omkring 152°C utvikles igjen gass. Ved l64-174°C er det antibiotiske stoff smeltet.

Det antibiotiske stoff viser et spesifikt spektrum med maksima ved bølgelengder på 233, 276, 286 og 327 nm. Ved forskjellige pH-verdier, oppnås det forskjellige spektra slik som vist i fig. 1 i den ledsagende tegning. I denne figur står den helt opptrukne linje for 13 mg/l oppløsning av det antibiotiske stoff i en blanding av like mengder metanol og vann, den stiplede linje står for en lignende oppløsning, bortsett fra at vannet er erstattet av 0,5N natriumhydroksyd, mens den prikkede linje står for en lignende oppløsning bortsett fra at vannet er erstattet av 0,5N hydroklorsyre.

Et tynnsjiktskromatogram av det antibiotiske stoff viser at dette består av tre forbindelser som danner et ekvili-brium. Kromatogrammet, utviklet med en blanding av 12 deler aceton, 8 deler etylacetat og 1 del vann, på et silicagelsub-strat, er vist på fig. 2, hvor den prikkede linje viser start-linjen.

I.R.-spektret for det antibiotiske stoff er

vist i fig. 3. Hovedabsorbsjonen ligger ved 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1455, 1540, 1650, 2930, 2970, 3400 cm<-1.>

Molekylvektbestemmelsen ble utført ved hjelp av isoterm destillasjon. To oppløsninger, en av det antibiotiske stoff i aceton og den andre av azobenzen (som referanse) i aceton, ble anbragt separat i et lukket og evakuert system. På grunn av forskjellen i damptrykk over oppløsningen, beveger damp-en seg inntil det er oppnådd en likevekt når oppløsningene har samme molaritet. Fremgangsmåten ble utført ved en konstant temperatur på 23°C. Den beregnede molekylvekt for det antibiotiske stoff var 714. En oppløsning av det antibiotiske stoff i 50$~ig vandig MeOH titret med 0,1N NaOH gir en nøytraliserings-ekvivalent på 817.

Den mikrobiologiske aktivitet av det antibiotiske preparat overfor flere mikroorganismer er bestemt ved hjelp av en vanlig fortynningsfremgangsmåte. Resultatene er gitt i den følgende tabell. hvor ') indikerer penicillinaseprodusent, '') indikerer nylig isolert hospitalstamme. Tabellen viser at det antibiotiske stoff har en høy aktivitet mot Mycoplasma gallisepticum, men så og si ingen aktivitet mot-flere human-patogene mikroorganismer. Det er ingen aktivitet mot Mycoplasma gallisepticum invivo.

Den ovenfor angitte tabell viser at antibiotikumet ifølge oppfinnelsen ikke har noen vesentlig aktivitet mot patogene mikroorganismer, noe som betyr at det ikke er interessant til anvendelse for bekjempelse av sykdommer hos mennesker eller dyr. Det er heller ikke ment til dette bruk.

Tabellen representerer imidlertid et supplement hva angår antibiotikumets egenskaper i tillegg til de fysikalske og kjemiske egenskaper.

Giftigheten av det antibiotiske stoff er studert på forskjellige dyr. Den akutte giftighet er meget lav; en dosering på 1000 mg/kg i.p. dreper ikke mus, oral foreskrivning til rotter og kyllinger med konsentrasjoner på opptil 0, 1% i foret i 2 måneder resulterer ikke i noen uønsket farmakologisk virkning.

Det hittil ukjente antibiotiske stoff i henhold til foreliggende oppfinnelse, er funnet å være spesielt bruk-bart som vekstfremmende middel for husdyr, f.eks. storfe, griser og fjærfe. Det vekstfremmende middel kan foreskrives på vanlig måte, f.eks. som et additiv i dyrefor.

Mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) som produserer det antibiotiske stoff i' henhold til foreliggende oppfinnelse karakteriseres ved følgende beskrivelse, hvor det, til bestemmelse, er brukt "Systematik der Streptomy-ceten" av R. Hiitter (1957) og "International Journal of Syste-matic Bacteriology" (1968), bind 18, nr. 2) ved bruk av de regler for beskrivelse som er foreskrevet av "The International Streptomyces Project" (heretter forkortet til ISP).

A. Det vegetative mycelium

Veksten på de fleste vekstmedia er god, og hyfene er enkelte ganger opptil 3-4 mikron brede. Koloniene har det karakteristiske utseende for Actinomycetes og dannes som lær-lignende noe lagdelte kolonier. Vanligvis er fargen på koloniene ikke meget karakteristisk da den varierer fra i det vesent-lige fargeløs over lett grått og lett beige til lett gul, unn-tågen på media hvor koloniene farges brune til mørkebrune ■ på grunn av dannelsen av melanin (maltpepton-agar, hjerne-hjerte-infusj ons-agar). B. ■ Luftmyceliet

På de fleste media, er luftmyceliet nesten ikke eller ikke synlig makroskopisk, og hyfene har en bredde på omkring 1 mikron slik det er vanlig for streptomyceter. På noen media, slik som gjærekstrakt-maltekstraktagar, havremelagar og spesielt uorganisk salt-stivelsesagar, dannes imidlertid luft-mycelium i overflod. Til å begynne med er et slikt mycelium hvitt, med det blir mørkegrått ved god utvikling, og det bygges opp fra ofte heller korte, irregulært forgrenede hyfer med sporekjeder på kortsideakser i form av enkle løkker eller primitive viklinger med ikke mer enn 2, 3 eller 4 vindinger (seksjon: Spira). Noen ganger, spirer to, tre eller fire av disse viklinger som pseudokrans fra så og si det samme sted på hovedaksen. Andre sporekjeder spirer som primitive viklinger direkte fra substratmycelium (på en måte lik Retinaculum-Apertum). I tillegg er mange nesten kuleformede legemer ofte synlige i luftmyceliet, sannsynligvis på grunn av et antall sporer fra en primitiv vikling omgitt av en væskefilm.

C. Conidier

I de spirallignende hyfer, dannes det strenger på oftest over ti, noe elliptiske conidier. Overflatene av conidi-ene er glatt. Størrelsen er heller variabel, men den gjennomsnittelige størrelse er omkring 0,9 til 1,3 y.

D. Temperaturens innflytelse på veksten

Veksten er langsom ved 20°O, moderat ved 26°C, god ved 30°C, optimal ved 37°C og middels god ved 40°C. Veksten stopper over 40°C. (Mesophyl).

E. Fysiologiske egenskaper

De fysiologiske egenskaper er som vist i den følgende tabell II.

I tabellene III og IV er det gitt en oversikt over veksten og utseende av mikroorganismen Streptomyces ramocissimus på et antall substrater.

En sammenligning av egenskapene og de karakteristiske trekk ved Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 med de til beslektede stammer av Streptomyces, f.eks. Streptomyces tendae CBS 432.59, Streptomyces tendae CBS 565.68 og Stremptomyces collinus Ist 301 (ETH 24.318), ved dyrkning på media anbefalt av ISP ved 30° og 37°C, gjør det tydelig at Streptomyces ramocissimus er forskjellig fra de tidligere kjente stammer av Streptomyces.

Luftmyceliet til Streptomyces collinus, kan, under egnede omstendigheter, gro til utpreget lange, delvis forgrenede hyfer som ligger mer eller mindre horisontalt over kolonien, langs hvilke det gror korte, vanligvis løkkeformede sporeCkjeder. Dette er i stor motsetning til luftmyceliet hos Streptomyces ramocissimus som er tydelig kort og høyst irregulært forgrenet. Fargen til de to mycelia er også meget forskjellige. Luftmyceliet hos Streptomyces ramocissimus er grått til mørkegrått, mens det til Streptomyces collinus vanligvis er hvitt, lett gult eller kremfarget til kun lett gråfarget, og substratmycelium, spesielt dyrket på "Basal mineral salts agarmedia", til hvilke det er tilsatt forskjellige karbonforbindelser, er hovedsakelig grått for Streptomyces ramocissimus mens det' til Streptomyces collinus er lett brunt, brunrødt eller sogar egg-gult. Forskjellene opptrer også i de forskjellige egenskaper ved nitratreduk-sjon, flytendegjøring av gelatin, mengden av stivelseshydrolyse 'og dekomponering av kalsiumsalt og oksalsyre. Disse forskjeller indikerer at mikroorganismen ikke kan grupperes under Streptomyces collinus.

Forskjellene mellom Streptomyces ramocissimus og de to ovenfor nevnte Streptomyces tendae er mindre enn mellom Streptomyces ramocissimus og Streptomyces collinus. For eksempel

. viser fargen til luftmyceliet hos Streptomyces ramocissimus kun en liten forskjell i forhold til det hos Streptomyces tendae, mens sporekjedene ofte er bøyet til haker eller sløyfer. Sporekjedene til den undersøkte Streptomyces tendae, er imidlertid vanligvis lenger enn det til Streptomyces ramocissimus. Sporekjedene til Streptomyces tendae stiger vanligvis direkte opp fra agaren, selvom dette også noen ganger er observert med spore-kj edene til Streptomyces ramocissimus, så er sporekjedene til denne stamme, vanligvis arrangert som monopodiale sidegrener langs

korte lufthyfer. En mere viktig taksonomisk forskjell ligger i dannelsen av et melanoidalt pigment på I.S.P.-media 6 og 7 (henholdsvis melaninmedium i henhold til Shinobu og Peptongjær-ekstraktagar). De undersøkte Streptomyces tendae-stammer danner ikke noe brunt pigment på disse media, mens Streptomyces ramocissimus er erklært melaninpositiv. Andre forskjeller i fysiologiske egenskaper ble observert ved de følgende egenskaper:

På grunnlag av de ovenfor nevnte forskjeller, er det tydelig at Streptomyces ramocissimus ikke hører til Streptomyces tendae.

I henhold til et trekk ved den foreliggende oppfinnelse, fremstilles det hittil ukjente antibiotikum ved den fremgangsmåte som omfatter aerobdyrking av mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69)-i et vandig næringsmed-ium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske stoffer, og separering av det antibiotiske stoff som er dannet under dyrkingen. Fermentering av mikroorganismen kan utføres i et vandig medium som inneholder de vanlige karbon-, nitrogen-, fo^sfor-, kalsium-, jern-, svovel-, magnesium-, kalium-, vitamin- og sporelementkilder, slik som media som inneholder sukkerroemelasse, maltpasta, jordnøttmel, laktose, po-tet-stivelse, maisstøpevæske og gjærekstrakt.

Separeringen av det antibiotiske stoff fra kulturmediet kan utføres på forskjellige måter. For eksempel kan kulturfiltratet ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel for det antibiotiske stoff, slik som butanol, kloroform eller helst metylisobutylketon, hvorved det antibiotiske stoff samles i den organiske fase, og som kan bunnfelles ved konsentrasjon eller tilsetning av et dårlig oppløsningsmiddel for det antibiotiske stoff, slik som petroleumeter. pH-verdien for en optimal ekstraksjon er omkring 5-8. Rensning av det antibiotiske stoff

'kan utføres ved kromatografi på en A120^-kolonne, fordelingskromatografi og/eller motstrømsekstraksjon ved bruk av metylisobutylketon, etylacetat eller 1:1-blandingen av etylacetat og dietyleter som mobil fase, og buffere av bikarbonat, fosfat eller borat som stasjonær fase.

Por praktisk anvendelse som fortilsetning for husdyr, kan produktet som er isolert fra kulturmediet ved ekstraksjon og bunnfelling brukes uten ytterligere rensning.

Det følgende eksempel viser fremstillingen av

det antibiotiske stoff samt salter av dette i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Eksempel

I 2£)00 liter av et medium som inneholder 20 g maltpasta, 10 g gjærekstrakt og 5 g kornstøpevæskefaststoffer

pr. liter, fermenteres mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) ved en pH på omkring 7 under aggitering og beluft-ning. Etter fermenteringen, blandes kulturmediet med omkring 2% dikalit som filterhjelpemiddel, og blandingen ble filtrert. Filtratet ble surgjort med 8N svovelsyre til pH 6,0, og ekstra-hert to ganger med 1/5 av dets volum metylisobutylketon, og emulsjonen dannet på denne måte, ble brutt med "Hyflo Supercel" filterhjelpemiddel. De organiske væsker ble blandet og konsentrert til omkring 1 liter ved fordampning under redusert trykk og fordampning i en rotasjonsfordamper. Det dannede konsentrat 'ble langsomt tilsatt til 5 liter petroleumeter (kokepunktsområde 40-60°C), og det dannede bunnfall ble filtrert av ved hjelp av

et glassfilter (D 3), vasket med frisk petroleumeter og tørket. Det ble oppnådd et gjennomsnittelig utbytte på 78 g av et gul-farget pulver.

Ved bruk av fordelingskromatografi, ble det renset 2 g av det rå antibiotiske stoff (i syreform). Den stasjonære fase som ble brukt besto av "Hyflo", impregnert med en 0,1 molar Na2CO^/NaHC02-buffer ved pH 11, og den mobile fase besto av en blanding av petroleumeter og butylacetat. Det ble oppnådd et utbytte på 0,828 g av det rensede antibiotiske stoff med det tidligere nevnte fysikokjemiske egenskaper.

En bestemt mengde av det antibiotiske stoff ble oppløst i vann under tilsetning av 0,1N natriumhydroksyd til pH 9 inntil det ble oppnådd en mettet oppløsning. Oppløsningen ble filtrert og fordampet azeotropt under tilsetning av butanol, og den butanoliske rest ble samlet i en liten mengde vannfri butanol (in vacuo ved omkring 45°C). Til den omrørte oppløs-ning ble det dråpevis tilsatt petroleumeter inntil alt saltet var bunnfelt. Bunnfallet ble filtrert av, vasket og tørket for å gi natriumsaltet av det antibiotiske stoff.

Det kan frembringes dyreforstoffer i en form til bruk ved foring av storfe, griser og fjærfe, supplementert med en andel av det antibiotiske stoff eller et salt, f.eks. natriumsalt av dette. Det antibiotiske stoff eller saltet av dette kan også dispergeres i eller blandes med enhver egnet inert fysiolo-gisk uskadelig bærer eller fortynningsmiddel som kan foreskrives oralt til et dyr, og som er ikke-reaktivt med det antibiotiske stoff og ikke skadelig for dyrene ved oral foreskrivning.. Det antibiotiske stoff eller salt av dette kan hensiktsmessig inn-arbeides i for, bærer eller fortynningsmiddel ved konvensjonelle metoder slik som maling, omrøring eller rysting. Vanligvis er mengden av antibotisk stoff eller salt av-dette i et dyrefor omkring 5 ppm til 20 ppm, beregnet på vekten av foret, for å gi tilfredsstillende vekstfremmende virkning.

Det følgende viser den vekstfremmende virkning av det antibiotiske stoff.

Slaktekyllinger gis det antibiotiske stoff i form av det natriumsalt som er oppnådd i eksempelet, i en blanding med en bestanddel av foret (hvetemel), hvor mengden av antibiotisk stoff i foret (beregnet på forvekten) er slik som spesifisert i den følgende tabell, som gir vekten av kyllingene etter 3, 5 og 7 uker.

Tabellen viser at en økning av veksten hos kyllingene oppnås ved foreskrivning av det antibiotiske stoff. En forbedring i foromdanningsgraden på fra omkring 3~5$ nås for kyllingene i løpet av 7 uker når foret inneholder 5~20 ppm antibiotikum.

Natriumsaltet av det antibiotikum som ble oppnådd

i eksempelet, ble foreskrevet griser i form av en blanding med en forbestanddel (hvetemel). Mengden av antibiotikum tilstede i foret (beregnet på vekten av foret), er gitt nedenfor i tabell VI, hvor den gjennomsnittelige relative vekt av grisene etter 6 og 12 uker er gitt.

Tabellen viser en vekstfremmende virkning av det antibiotiske stoff i henhold til foreliggende oppfinnelse.

Claims (1)

1. Antibiotikum til bruk som vekstfremmende middel for husdyr, kalt MYC-8003, karakterisert ved at det er et gult, saltdannende, svakt surt, fast stoff som inneholder elementene karbon, hydrogen, nitrogen og oksygen i mengder på 63,8$, 7,6$, 3,5$ hhv. 25,1$ (ved subtraksjon), har en molekylstruktur som omfatter tre likevektsdannende tautomere konfigurasjoner, har en optisk rotasjon [a]^2 på -60° (l$-ig metanolisk oppløsning), er lite oppløselig i karbontetraklorid og benzen, men oppløselig i kloroform, metylisobutylketon, butylacetat, etylacetat, metanol og alkaliske oppløsninger, viser en svakt positiv reaksjon i aromattesten, danner en rød farge med konsentrert svovelsyre, en mørk brun farge i Paulyreaksjonen,

   en mørk rød farge.og uklarhet med jern(III)klorid, danner et

   bunnfall med bromvann, viser gassdannelse ved 135°C, ytterligere gassdannelse ved omkring 152°C og viser dekomponering ved 164-174°C, har absorbsjonsmaksima i den ultrafiolette delen av spekteret ved 233,276,286cg327nm> og i den infrarøde delen av spekteret ved 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1-455, 1540, 1650, 2930, 2970 og 3400 cm<-1>, og at det er fremstilt ved at den hittil ukjente mikroorganisme Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) dyrkes i et vandig næringssubstrat inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske stoffer.