NO134745B

NO134745B -

Info

Publication number: NO134745B
Application number: NO3031/71A
Authority: NO
Inventors: C Vos; J Den Admirant
Original assignee: Koninklijke Gist Spiritus
Priority date: 1970-08-14
Filing date: 1971-08-13
Publication date: 1976-08-30
Also published as: CH554416A; IE36056L; IL37500A0; DK130885B; LU63715A1; BE771331A; SE396881B; NL7111168A; NL144985B; SE387658B; NO134745C; TR18758A; YU35376B; ES394218A1; JPS5124599B1; AU3235171A; DE2140674B2; AT312800B; GB1325200A; ZA715410B

Abstract

Antibiotikum til bruk som vekstfremmende middel for husdyr.Antibiotic for use as a growth promoter for livestock.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et nytt antibio-t ikum. The present invention relates to a new antibiotic.

Det hittilt ukjente antibiotikum, kalt "MYC 8003" The hitherto unknown antibiotic, called "MYC 8003"

er av spesiell verdi på grunn av dets vekstfremmende egenskaper når det foreskrives husdyr. Det oppnås fra et kulturmedium av en mikroorganisme som nedenfor vil karakteriseres i detalj og som tilhører slekten Streptomyces• Mikroorganismen som fremstil-ler antibiotikumet er hittil ikke beskrevet, og en prøve på den er deponert i samlingen til "Central Bureau voor Schimmelcultures" is of particular value due to its growth-promoting properties when prescribed to livestock. It is obtained from a culture medium of a microorganism which will be characterized in detail below and which belongs to the genus Streptomyces• The microorganism which produces the antibiotic has not been described so far, and a sample of it has been deposited in the collection of the "Central Bureau voor Schimmelcultures"

i Baarn, Nederland, hvor den er gitt nummeret CBS 190.69, hvor den er offentlig tilgjengelig. Den hittil ukjente mikroorganisme er blitt kalt Streptomyces ramocissimus. in Baarn, the Netherlands, where it is given the number CBS 190.69, where it is publicly available. The previously unknown microorganism has been named Streptomyces ramocissimus.

Det antibiotiske stoff ifølge oppfinnelsen karakteriseres ved at det er et gult, saltdannende, svakt surt, fast stoff som inneholder elementene karbon, hydrogen, nitrogen og oksygen i mengder på 63,W, 7, 6%, 3, 5% hhv. 25,1$ (ved subtraksjon), har en molekylstruktur som omfatter tre likevektsdannende tautomere konfigurasjoner, har en optisk rotasjon [al^2, 2 på -60<o >( 1%- ig metanolisk oppløsning), er lite oppløselig i karbontetraklorid og benzen, men oppløselig i kloroform, metylisobutylketon, butylace-tat, etylacetat, metanol og alkaliske oppløsninger, viser en svakt positiv reaksjon i aromattesten, danner en rød farge med konsentrert svovelsyre, en mørk brun farge i Paulyreaksjonen, en mørk rød farge og uklarhet med jern(III)klorid, danner et bunnfall med bromvann, viser gassdannelse ved 135°C, ytterligere gassdannelse ved omkring 152°C og viser dekomponering ved l64-174°C, har absorbsjonsmaksima i den ultrafiolette delen av spekteret ved 233, 276, 286 og 327 nm, og i den infrarøde delen av spekteret ved 810, 860, 9^0, 980, 1090, 1215, 1355, 1^55, 1540,. 1650, 2930, 2970 og 3400 cm<-1>, og at det er fremstilt ved at den hittil The antibiotic substance according to the invention is characterized by the fact that it is a yellow, salt-forming, slightly acidic, solid substance containing the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen in amounts of 63.W, 7.6%, 3.5% respectively. 25.1$ (by subtraction), has a molecular structure comprising three equilibrium-forming tautomeric configurations, has an optical rotation [al^2, 2 of -60<o >( 1% methanolic solution), is slightly soluble in carbon tetrachloride and benzene, but soluble in chloroform, methyl isobutyl ketone, butyl acetate, ethyl acetate, methanol and alkaline solutions, shows a weak positive reaction in the aromatic test, forms a red color with concentrated sulfuric acid, a dark brown color in the Pauly reaction, a dark red color and turbidity with iron(III) chloride, forms a precipitate with bromine water, shows gas formation at 135°C, further gas formation at about 152°C and shows decomposition at 164-174°C, has absorption maxima in the ultraviolet part of the spectrum at 233, 276, 286 and 327 nm, and in the infrared part of the spectrum at 810, 860, 9^0, 980, 1090, 1215, 1355, 1^55, 1540,. 1650, 2930, 2970 and 3400 cm<-1>, and that it has been produced by the so far

■■ <?>!$ ?■ ukjente mikroorganisme Strept<:>omyces ramocissimus. (.C.B.S. 190.69) . _.''.^/dyrkes i et vandig næringssubstrat; inneholdende assimilerbare"' v''1.1'kilder for karbon, nitrogen, og" uorganiske stoffer. ■■ <?>!$ ?■ unknown microorganism Strept<:>omyces ramocissimus. (.C.B.S. 190.69) . _.''.^/grown in an aqueous nutrient substrate; containing assimilable"' v''1.1' sources of carbon, nitrogen, and" inorganic substances.

\"....^'. y;'' Antibiotikumet i henhold til oppfinnelsen er som ' £ nevnt ovenfor en svak syre, og det danner antibiotisk aktive "salter slik som natrium-, kalium-, ammonium- og aminsalter. "....^'. y;'' The antibiotic according to the invention is, as ' £ mentioned above, a weak acid, and it forms antibiotically active "salts such as sodium, potassium, ammonium and amine salts.

Det antibiotiske stoff er uoppløselig i dietyleter, petro.leumeter, vann og sure oppløsninger. The antibiotic substance is insoluble in diethyl ether, petroleum ether, water and acidic solutions.

Stabilitet: Stability:

Forsøk har viet at over tidsrom på omkring 4 timer ved værelsestemperatur, så er det antibiotiske stoff når det er oppløst i 50%- ig vandig metanol, stabilt innen en pH-område på Experiments have shown that over a period of about 4 hours at room temperature, the antibiotic substance, when dissolved in 50% aqueous methanol, is stable within a pH range of

fra 3-12. from 3-12.

Det faste antibiotikum, lagret ved 25°C og 37°C ved lave relative fuktigheter, viser ingen tap i aktivitet i minst 5 måneder. Det er stabilt i 3 måneder ved 25°C og 100$ relativ The solid antibiotic, stored at 25°C and 37°C at low relative humidities, shows no loss of activity for at least 5 months. It is stable for 3 months at 25°C and 100$ relative

fuktighet ag i 2 måneder 'ved 37°C og 100$ relativ fuktighet. Reaksjon på mulige funksjonelle grupper: humidity ag for 2 months 'at 37°C and 100$ relative humidity. Reaction to possible functional groups:

Det antibiotiske stoff har ikke et skarpt smelte-punkt eller smelteområde. Ved 135°C inntrer en gassutvikling, mens det antibiotiske stoff mykner. Ved omkring 152°C utvikles igjen gass. Ved l64-174°C er det antibiotiske stoff smeltet. The antibiotic substance does not have a sharp melting point or melting range. At 135°C, gas evolution occurs, while the antibiotic substance softens. At around 152°C, gas is developed again. At 164-174°C, the antibiotic substance is melted.

Det antibiotiske stoff viser et spesifikt spektrum med maksima ved bølgelengder på 233, 276, 286 og 327 nm. Ved forskjellige pH-verdier, oppnås det forskjellige spektra slik som vist i fig. 1 i den ledsagende tegning. I denne figur står den helt opptrukne linje for 13 mg/l oppløsning av det antibiotiske stoff i en blanding av like mengder metanol og vann, den stiplede linje står for en lignende oppløsning, bortsett fra at vannet er erstattet av 0,5N natriumhydroksyd, mens den prikkede linje står for en lignende oppløsning bortsett fra at vannet er erstattet av 0,5N hydroklorsyre. The antibiotic substance shows a specific spectrum with maxima at wavelengths of 233, 276, 286 and 327 nm. At different pH values, different spectra are obtained as shown in fig. 1 in the accompanying drawing. In this figure, the solid line represents a 13 mg/l solution of the antibiotic substance in a mixture of equal amounts of methanol and water, the dashed line represents a similar solution, except that the water has been replaced by 0.5N sodium hydroxide, while the dotted line represents a similar solution except that the water is replaced by 0.5N hydrochloric acid.

Et tynnsjiktskromatogram av det antibiotiske stoff viser at dette består av tre forbindelser som danner et ekvili-brium. Kromatogrammet, utviklet med en blanding av 12 deler aceton, 8 deler etylacetat og 1 del vann, på et silicagelsub-strat, er vist på fig. 2, hvor den prikkede linje viser start-linjen. A thin-layer chromatogram of the antibiotic substance shows that it consists of three compounds that form an equilibrium. The chromatogram, developed with a mixture of 12 parts acetone, 8 parts ethyl acetate and 1 part water, on a silica gel substrate, is shown in fig. 2, where the dotted line shows the start line.

I.R.-spektret for det antibiotiske stoff er The I.R. spectrum of the antibiotic substance is

vist i fig. 3. Hovedabsorbsjonen ligger ved 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1455, 1540, 1650, 2930, 2970, 3400 cm<-1.>shown in fig. 3. The main absorption is at 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1455, 1540, 1650, 2930, 2970, 3400 cm<-1.>

Molekylvektbestemmelsen ble utført ved hjelp av isoterm destillasjon. To oppløsninger, en av det antibiotiske stoff i aceton og den andre av azobenzen (som referanse) i aceton, ble anbragt separat i et lukket og evakuert system. På grunn av forskjellen i damptrykk over oppløsningen, beveger damp-en seg inntil det er oppnådd en likevekt når oppløsningene har samme molaritet. Fremgangsmåten ble utført ved en konstant temperatur på 23°C. Den beregnede molekylvekt for det antibiotiske stoff var 714. En oppløsning av det antibiotiske stoff i 50$~ig vandig MeOH titret med 0,1N NaOH gir en nøytraliserings-ekvivalent på 817. The molecular weight determination was carried out using isothermal distillation. Two solutions, one of the antibiotic substance in acetone and the other of azobenzene (as a reference) in acetone, were placed separately in a closed and evacuated system. Because of the difference in vapor pressure across the solution, the vapor moves until an equilibrium is reached when the solutions have the same molarity. The procedure was carried out at a constant temperature of 23°C. The calculated molecular weight for the antibiotic substance was 714. A solution of the antibiotic substance in 50% aqueous MeOH titrated with 0.1N NaOH gives a neutralization equivalent of 817.

Den mikrobiologiske aktivitet av det antibiotiske preparat overfor flere mikroorganismer er bestemt ved hjelp av en vanlig fortynningsfremgangsmåte. Resultatene er gitt i den følgende tabell. hvor ') indikerer penicillinaseprodusent, '') indikerer nylig isolert hospitalstamme. Tabellen viser at det antibiotiske stoff har en høy aktivitet mot Mycoplasma gallisepticum, men så og si ingen aktivitet mot-flere human-patogene mikroorganismer. Det er ingen aktivitet mot Mycoplasma gallisepticum invivo. The microbiological activity of the antibiotic preparation against several microorganisms is determined using a common dilution method. The results are given in the following table. where ') indicates penicillinase producer, '') indicates newly isolated hospital strain. The table shows that the antibiotic substance has a high activity against Mycoplasma gallisepticum, but hardly any activity against several human-pathogenic microorganisms. There is no activity against Mycoplasma gallisepticum in vivo.

Den ovenfor angitte tabell viser at antibiotikumet ifølge oppfinnelsen ikke har noen vesentlig aktivitet mot patogene mikroorganismer, noe som betyr at det ikke er interessant til anvendelse for bekjempelse av sykdommer hos mennesker eller dyr. Det er heller ikke ment til dette bruk. The above table shows that the antibiotic according to the invention has no significant activity against pathogenic microorganisms, which means that it is not interesting for use in combating diseases in humans or animals. It is also not intended for this use.

Tabellen representerer imidlertid et supplement hva angår antibiotikumets egenskaper i tillegg til de fysikalske og kjemiske egenskaper. However, the table represents a supplement regarding the properties of the antibiotic in addition to the physical and chemical properties.

Giftigheten av det antibiotiske stoff er studert på forskjellige dyr. Den akutte giftighet er meget lav; en dosering på 1000 mg/kg i.p. dreper ikke mus, oral foreskrivning til rotter og kyllinger med konsentrasjoner på opptil 0, 1% i foret i 2 måneder resulterer ikke i noen uønsket farmakologisk virkning. The toxicity of the antibiotic substance has been studied in different animals. The acute toxicity is very low; a dosage of 1000 mg/kg i.p. does not kill mice, oral administration to rats and chickens at concentrations up to 0.1% in the feed for 2 months does not result in any undesirable pharmacological effect.

Det hittil ukjente antibiotiske stoff i henhold til foreliggende oppfinnelse, er funnet å være spesielt bruk-bart som vekstfremmende middel for husdyr, f.eks. storfe, griser og fjærfe. Det vekstfremmende middel kan foreskrives på vanlig måte, f.eks. som et additiv i dyrefor. The hitherto unknown antibiotic substance according to the present invention has been found to be particularly useful as a growth-promoting agent for livestock, e.g. cattle, pigs and poultry. The growth-promoting agent can be prescribed in the usual way, e.g. as an additive in animal feed.

Mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) som produserer det antibiotiske stoff i' henhold til foreliggende oppfinnelse karakteriseres ved følgende beskrivelse, hvor det, til bestemmelse, er brukt "Systematik der Streptomy-ceten" av R. Hiitter (1957) og "International Journal of Syste-matic Bacteriology" (1968), bind 18, nr. 2) ved bruk av de regler for beskrivelse som er foreskrevet av "The International Streptomyces Project" (heretter forkortet til ISP). The microorganism Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) which produces the antibiotic substance according to the present invention is characterized by the following description, where, for determination, "Systematik der Streptomy-ceten" by R. Hiitter (1957) and "International Journal of Systematic Bacteriology" (1968), Vol. 18, No. 2) using the rules of description prescribed by "The International Streptomyces Project" (hereafter abbreviated to ISP).

A. Det vegetative mycelium A. The vegetative mycelium

Veksten på de fleste vekstmedia er god, og hyfene er enkelte ganger opptil 3-4 mikron brede. Koloniene har det karakteristiske utseende for Actinomycetes og dannes som lær-lignende noe lagdelte kolonier. Vanligvis er fargen på koloniene ikke meget karakteristisk da den varierer fra i det vesent-lige fargeløs over lett grått og lett beige til lett gul, unn-tågen på media hvor koloniene farges brune til mørkebrune ■ på grunn av dannelsen av melanin (maltpepton-agar, hjerne-hjerte-infusj ons-agar). B. ■ Luftmyceliet Growth on most growth media is good, and the hyphae are sometimes up to 3-4 microns wide. The colonies have the characteristic appearance of Actinomycetes and are formed as leather-like somewhat layered colonies. Usually the color of the colonies is not very characteristic as it varies from essentially colorless to light gray and light beige to light yellow, except for the haze on the media where the colonies are colored brown to dark brown ■ due to the formation of melanin (malt peptone agar , brain-heart-infusion ons-agar). B. ■ The aerial mycelium

På de fleste media, er luftmyceliet nesten ikke eller ikke synlig makroskopisk, og hyfene har en bredde på omkring 1 mikron slik det er vanlig for streptomyceter. På noen media, slik som gjærekstrakt-maltekstraktagar, havremelagar og spesielt uorganisk salt-stivelsesagar, dannes imidlertid luft-mycelium i overflod. Til å begynne med er et slikt mycelium hvitt, med det blir mørkegrått ved god utvikling, og det bygges opp fra ofte heller korte, irregulært forgrenede hyfer med sporekjeder på kortsideakser i form av enkle løkker eller primitive viklinger med ikke mer enn 2, 3 eller 4 vindinger (seksjon: Spira). Noen ganger, spirer to, tre eller fire av disse viklinger som pseudokrans fra så og si det samme sted på hovedaksen. Andre sporekjeder spirer som primitive viklinger direkte fra substratmycelium (på en måte lik Retinaculum-Apertum). I tillegg er mange nesten kuleformede legemer ofte synlige i luftmyceliet, sannsynligvis på grunn av et antall sporer fra en primitiv vikling omgitt av en væskefilm. On most media, the aerial mycelium is almost absent or not visible macroscopically, and the hyphae are about 1 micron wide as is common for streptomycetes. However, on some media, such as yeast extract-malt extract agar, oat agar and especially inorganic salt-starch agar, aerial mycelium is formed in abundance. At first such a mycelium is white, but it becomes dark gray with good development, and it is built up from often rather short, irregularly branched hyphae with spore chains on short lateral axes in the form of simple loops or primitive whorls of no more than 2, 3 or 4 turns (section: Spira). Sometimes, two, three or four of these whorls sprout as pseudo whorls from more or less the same place on the main axis. Other spore chains germinate as primitive whorls directly from substrate mycelium (in a manner similar to Retinaculum-Apertum). In addition, many almost globular bodies are often visible in the aerial mycelium, probably due to a number of spores from a primitive whorl surrounded by a liquid film.

C. Conidier C. Conidia

I de spirallignende hyfer, dannes det strenger på oftest over ti, noe elliptiske conidier. Overflatene av conidi-ene er glatt. Størrelsen er heller variabel, men den gjennomsnittelige størrelse er omkring 0,9 til 1,3 y. In the spiral-like hyphae, strings of usually more than ten, somewhat elliptical conidia are formed. The surfaces of the conidia are smooth. The size is rather variable, but the average size is around 0.9 to 1.3 y.

D. Temperaturens innflytelse på veksten D. The influence of temperature on growth

Veksten er langsom ved 20°O, moderat ved 26°C, god ved 30°C, optimal ved 37°C og middels god ved 40°C. Veksten stopper over 40°C. (Mesophyl). Growth is slow at 20°O, moderate at 26°C, good at 30°C, optimal at 37°C and moderately good at 40°C. Growth stops above 40°C. (Mesophyll).

E. Fysiologiske egenskaper E. Physiological properties

De fysiologiske egenskaper er som vist i den følgende tabell II. The physiological characteristics are as shown in the following table II.

I tabellene III og IV er det gitt en oversikt over veksten og utseende av mikroorganismen Streptomyces ramocissimus på et antall substrater. Tables III and IV give an overview of the growth and appearance of the microorganism Streptomyces ramocissimus on a number of substrates.

En sammenligning av egenskapene og de karakteristiske trekk ved Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 med de til beslektede stammer av Streptomyces, f.eks. Streptomyces tendae CBS 432.59, Streptomyces tendae CBS 565.68 og Stremptomyces collinus Ist 301 (ETH 24.318), ved dyrkning på media anbefalt av ISP ved 30° og 37°C, gjør det tydelig at Streptomyces ramocissimus er forskjellig fra de tidligere kjente stammer av Streptomyces. A comparison of the properties and characteristics of Streptomyces ramocissimus CBS 190.69 with those of related strains of Streptomyces, e.g. Streptomyces tendae CBS 432.59, Streptomyces tendae CBS 565.68 and Streptomyces collinus Ist 301 (ETH 24.318), when cultured on the media recommended by ISP at 30° and 37°C, makes it clear that Streptomyces ramocissimus is different from the previously known strains of Streptomyces.

Luftmyceliet til Streptomyces collinus, kan, under egnede omstendigheter, gro til utpreget lange, delvis forgrenede hyfer som ligger mer eller mindre horisontalt over kolonien, langs hvilke det gror korte, vanligvis løkkeformede sporeCkjeder. Dette er i stor motsetning til luftmyceliet hos Streptomyces ramocissimus som er tydelig kort og høyst irregulært forgrenet. Fargen til de to mycelia er også meget forskjellige. Luftmyceliet hos Streptomyces ramocissimus er grått til mørkegrått, mens det til Streptomyces collinus vanligvis er hvitt, lett gult eller kremfarget til kun lett gråfarget, og substratmycelium, spesielt dyrket på "Basal mineral salts agarmedia", til hvilke det er tilsatt forskjellige karbonforbindelser, er hovedsakelig grått for Streptomyces ramocissimus mens det' til Streptomyces collinus er lett brunt, brunrødt eller sogar egg-gult. Forskjellene opptrer også i de forskjellige egenskaper ved nitratreduk-sjon, flytendegjøring av gelatin, mengden av stivelseshydrolyse 'og dekomponering av kalsiumsalt og oksalsyre. Disse forskjeller indikerer at mikroorganismen ikke kan grupperes under Streptomyces collinus. The aerial mycelium of Streptomyces collinus can, under suitable circumstances, grow into distinctly long, partly branched hyphae which lie more or less horizontally above the colony, along which short, usually loop-shaped chains of spores grow. This is in great contrast to the aerial mycelium of Streptomyces ramocissimus, which is distinctly short and highly irregularly branched. The color of the two mycelia is also very different. The aerial mycelium of Streptomyces ramocissimus is gray to dark gray, while that of Streptomyces collinus is usually white, slightly yellow or cream-colored to only slightly gray-colored, and the substrate mycelium, especially grown on "Basal mineral salts agar media", to which various carbon compounds are added, is mainly gray for Streptomyces ramocissimus, while for Streptomyces collinus it is light brown, brown-red or even egg-yellow. The differences also appear in the different properties of nitrate reduction, liquefaction of gelatin, the amount of starch hydrolysis and decomposition of calcium salt and oxalic acid. These differences indicate that the microorganism cannot be grouped under Streptomyces collinus.

Forskjellene mellom Streptomyces ramocissimus og de to ovenfor nevnte Streptomyces tendae er mindre enn mellom Streptomyces ramocissimus og Streptomyces collinus. For eksempel The differences between Streptomyces ramocissimus and the two Streptomyces tendae mentioned above are smaller than between Streptomyces ramocissimus and Streptomyces collinus. For example

. viser fargen til luftmyceliet hos Streptomyces ramocissimus kun en liten forskjell i forhold til det hos Streptomyces tendae, mens sporekjedene ofte er bøyet til haker eller sløyfer. Sporekjedene til den undersøkte Streptomyces tendae, er imidlertid vanligvis lenger enn det til Streptomyces ramocissimus. Sporekjedene til Streptomyces tendae stiger vanligvis direkte opp fra agaren, selvom dette også noen ganger er observert med spore-kj edene til Streptomyces ramocissimus, så er sporekjedene til denne stamme, vanligvis arrangert som monopodiale sidegrener langs . the color of the aerial mycelium of Streptomyces ramocissimus shows only a slight difference compared to that of Streptomyces tendae, while the spore chains are often bent into hooks or loops. The spore chains of the examined Streptomyces tendae, however, are usually longer than that of Streptomyces ramocissimus. The spore chains of Streptomyces tendae usually rise directly from the agar, although this has also sometimes been observed with the spore chains of Streptomyces ramocissimus, the spore chains of this strain are usually arranged as monopodial lateral branches along

korte lufthyfer. En mere viktig taksonomisk forskjell ligger i dannelsen av et melanoidalt pigment på I.S.P.-media 6 og 7 (henholdsvis melaninmedium i henhold til Shinobu og Peptongjær-ekstraktagar). De undersøkte Streptomyces tendae-stammer danner ikke noe brunt pigment på disse media, mens Streptomyces ramocissimus er erklært melaninpositiv. Andre forskjeller i fysiologiske egenskaper ble observert ved de følgende egenskaper: short aerial hyphae. A more important taxonomic difference lies in the formation of a melanoid pigment on I.S.P. media 6 and 7 (melanin medium according to Shinobu and Peptongjær extract agar, respectively). The examined Streptomyces tendae strains do not form any brown pigment on these media, while Streptomyces ramocissimus is declared melanin positive. Other differences in physiological characteristics were observed in the following characteristics:

På grunnlag av de ovenfor nevnte forskjeller, er det tydelig at Streptomyces ramocissimus ikke hører til Streptomyces tendae. On the basis of the above-mentioned differences, it is clear that Streptomyces ramocissimus does not belong to Streptomyces tendae.

I henhold til et trekk ved den foreliggende oppfinnelse, fremstilles det hittil ukjente antibiotikum ved den fremgangsmåte som omfatter aerobdyrking av mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69)-i et vandig næringsmed-ium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske stoffer, og separering av det antibiotiske stoff som er dannet under dyrkingen. Fermentering av mikroorganismen kan utføres i et vandig medium som inneholder de vanlige karbon-, nitrogen-, fo^sfor-, kalsium-, jern-, svovel-, magnesium-, kalium-, vitamin- og sporelementkilder, slik som media som inneholder sukkerroemelasse, maltpasta, jordnøttmel, laktose, po-tet-stivelse, maisstøpevæske og gjærekstrakt. According to a feature of the present invention, the hitherto unknown antibiotic is produced by the method which comprises aerobic cultivation of the microorganism Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) in an aqueous nutrient medium containing assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic substances, and separation of the antibiotic substance formed during cultivation. Fermentation of the microorganism can be carried out in an aqueous medium containing the usual carbon, nitrogen, phosphorous, calcium, iron, sulphur, magnesium, potassium, vitamin and trace element sources, such as media containing sugar beet molasses , malt paste, groundnut flour, lactose, potato starch, corn slurry and yeast extract.

Separeringen av det antibiotiske stoff fra kulturmediet kan utføres på forskjellige måter. For eksempel kan kulturfiltratet ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel for det antibiotiske stoff, slik som butanol, kloroform eller helst metylisobutylketon, hvorved det antibiotiske stoff samles i den organiske fase, og som kan bunnfelles ved konsentrasjon eller tilsetning av et dårlig oppløsningsmiddel for det antibiotiske stoff, slik som petroleumeter. pH-verdien for en optimal ekstraksjon er omkring 5-8. Rensning av det antibiotiske stoff The separation of the antibiotic substance from the culture medium can be carried out in different ways. For example, the culture filtrate can be extracted with an organic solvent for the antibiotic substance, such as butanol, chloroform or preferably methyl isobutyl ketone, whereby the antibiotic substance is collected in the organic phase, and which can be precipitated by concentration or the addition of a poor solvent for the antibiotic substance, such as petroleum ether. The pH value for an optimal extraction is around 5-8. Purification of the antibiotic substance

'kan utføres ved kromatografi på en A120^-kolonne, fordelingskromatografi og/eller motstrømsekstraksjon ved bruk av metylisobutylketon, etylacetat eller 1:1-blandingen av etylacetat og dietyleter som mobil fase, og buffere av bikarbonat, fosfat eller borat som stasjonær fase. 'can be carried out by chromatography on an A120^ column, partition chromatography and/or countercurrent extraction using methyl isobutyl ketone, ethyl acetate or the 1:1 mixture of ethyl acetate and diethyl ether as mobile phase, and buffers of bicarbonate, phosphate or borate as stationary phase.

Por praktisk anvendelse som fortilsetning for husdyr, kan produktet som er isolert fra kulturmediet ved ekstraksjon og bunnfelling brukes uten ytterligere rensning. For practical use as a pre-addition for livestock, the product isolated from the culture medium by extraction and sedimentation can be used without further purification.

Det følgende eksempel viser fremstillingen av The following example shows the production of

det antibiotiske stoff samt salter av dette i henhold til foreliggende oppfinnelse. the antibiotic substance and salts thereof according to the present invention.

Eksempel Example

I 2£)00 liter av et medium som inneholder 20 g maltpasta, 10 g gjærekstrakt og 5 g kornstøpevæskefaststoffer In 2£)00 liters of a medium containing 20 g of malt paste, 10 g of yeast extract and 5 g of grain liquor solids

pr. liter, fermenteres mikroorganismen Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) ved en pH på omkring 7 under aggitering og beluft-ning. Etter fermenteringen, blandes kulturmediet med omkring 2% dikalit som filterhjelpemiddel, og blandingen ble filtrert. Filtratet ble surgjort med 8N svovelsyre til pH 6,0, og ekstra-hert to ganger med 1/5 av dets volum metylisobutylketon, og emulsjonen dannet på denne måte, ble brutt med "Hyflo Supercel" filterhjelpemiddel. De organiske væsker ble blandet og konsentrert til omkring 1 liter ved fordampning under redusert trykk og fordampning i en rotasjonsfordamper. Det dannede konsentrat 'ble langsomt tilsatt til 5 liter petroleumeter (kokepunktsområde 40-60°C), og det dannede bunnfall ble filtrert av ved hjelp av per litres, the microorganism Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) is fermented at a pH of around 7 under agitation and aeration. After the fermentation, the culture medium is mixed with about 2% dicalite as a filter aid, and the mixture is filtered. The filtrate was acidified with 8N sulfuric acid to pH 6.0, and extracted twice with 1/5 of its volume of methyl isobutyl ketone, and the emulsion thus formed was broken with "Hyflo Supercel" filter aid. The organic liquids were mixed and concentrated to about 1 liter by evaporation under reduced pressure and evaporation in a rotary evaporator. The concentrate formed was slowly added to 5 liters of petroleum ether (boiling point range 40-60°C), and the precipitate formed was filtered off using

et glassfilter (D 3), vasket med frisk petroleumeter og tørket. Det ble oppnådd et gjennomsnittelig utbytte på 78 g av et gul-farget pulver. a glass filter (D 3), washed with fresh petroleum ether and dried. An average yield of 78 g of a yellow-colored powder was obtained.

Ved bruk av fordelingskromatografi, ble det renset 2 g av det rå antibiotiske stoff (i syreform). Den stasjonære fase som ble brukt besto av "Hyflo", impregnert med en 0,1 molar Na2CO^/NaHC02-buffer ved pH 11, og den mobile fase besto av en blanding av petroleumeter og butylacetat. Det ble oppnådd et utbytte på 0,828 g av det rensede antibiotiske stoff med det tidligere nevnte fysikokjemiske egenskaper. Using partition chromatography, 2 g of the crude antibiotic substance (in acid form) was purified. The stationary phase used consisted of "Hyflo", impregnated with a 0.1 molar Na 2 CO 2 /NaHCO 2 buffer at pH 11, and the mobile phase consisted of a mixture of petroleum ether and butyl acetate. A yield of 0.828 g of the purified antibiotic substance with the previously mentioned physicochemical properties was obtained.

En bestemt mengde av det antibiotiske stoff ble oppløst i vann under tilsetning av 0,1N natriumhydroksyd til pH 9 inntil det ble oppnådd en mettet oppløsning. Oppløsningen ble filtrert og fordampet azeotropt under tilsetning av butanol, og den butanoliske rest ble samlet i en liten mengde vannfri butanol (in vacuo ved omkring 45°C). Til den omrørte oppløs-ning ble det dråpevis tilsatt petroleumeter inntil alt saltet var bunnfelt. Bunnfallet ble filtrert av, vasket og tørket for å gi natriumsaltet av det antibiotiske stoff. A certain amount of the antibiotic substance was dissolved in water with the addition of 0.1N sodium hydroxide to pH 9 until a saturated solution was obtained. The solution was filtered and azeotroped with the addition of butanol, and the butanol residue was collected in a small amount of anhydrous butanol (in vacuo at about 45°C). Petroleum ether was added dropwise to the stirred solution until all the salt had settled to the bottom. The precipitate was filtered off, washed and dried to give the sodium salt of the antibiotic substance.

Det kan frembringes dyreforstoffer i en form til bruk ved foring av storfe, griser og fjærfe, supplementert med en andel av det antibiotiske stoff eller et salt, f.eks. natriumsalt av dette. Det antibiotiske stoff eller saltet av dette kan også dispergeres i eller blandes med enhver egnet inert fysiolo-gisk uskadelig bærer eller fortynningsmiddel som kan foreskrives oralt til et dyr, og som er ikke-reaktivt med det antibiotiske stoff og ikke skadelig for dyrene ved oral foreskrivning.. Det antibiotiske stoff eller salt av dette kan hensiktsmessig inn-arbeides i for, bærer eller fortynningsmiddel ved konvensjonelle metoder slik som maling, omrøring eller rysting. Vanligvis er mengden av antibotisk stoff eller salt av-dette i et dyrefor omkring 5 ppm til 20 ppm, beregnet på vekten av foret, for å gi tilfredsstillende vekstfremmende virkning. Animal precursors can be produced in a form for use when feeding cattle, pigs and poultry, supplemented with a proportion of the antibiotic substance or a salt, e.g. sodium salt thereof. The antibiotic substance or salt thereof may also be dispersed in or mixed with any suitable inert physiologically innocuous carrier or diluent that can be prescribed orally to an animal, and which is non-reactive with the antibiotic substance and not harmful to the animals when administered orally .. The antibiotic substance or salt thereof can be suitably incorporated into the carrier, carrier or diluent by conventional methods such as grinding, stirring or shaking. Usually, the amount of antibiotic substance or salt thereof in an animal feed is about 5 ppm to 20 ppm, calculated on the weight of the feed, to give a satisfactory growth-promoting effect.

Det følgende viser den vekstfremmende virkning av det antibiotiske stoff. The following shows the growth-promoting effect of the antibiotic substance.

Slaktekyllinger gis det antibiotiske stoff i form av det natriumsalt som er oppnådd i eksempelet, i en blanding med en bestanddel av foret (hvetemel), hvor mengden av antibiotisk stoff i foret (beregnet på forvekten) er slik som spesifisert i den følgende tabell, som gir vekten av kyllingene etter 3, 5 og 7 uker. Broilers are given the antibiotic substance in the form of the sodium salt obtained in the example, in a mixture with a component of the feed (wheat flour), where the amount of antibiotic substance in the feed (calculated on the basis of the initial weight) is as specified in the following table, which gives the weight of the chicks after 3, 5 and 7 weeks.

Tabellen viser at en økning av veksten hos kyllingene oppnås ved foreskrivning av det antibiotiske stoff. En forbedring i foromdanningsgraden på fra omkring 3~5$ nås for kyllingene i løpet av 7 uker når foret inneholder 5~20 ppm antibiotikum. The table shows that an increase in the growth of the chickens is achieved by prescribing the antibiotic substance. An improvement in the preformation rate of around 3~5% is achieved for the chickens within 7 weeks when the feed contains 5~20 ppm antibiotic.

Natriumsaltet av det antibiotikum som ble oppnådd The sodium salt of the antibiotic obtained

i eksempelet, ble foreskrevet griser i form av en blanding med en forbestanddel (hvetemel). Mengden av antibiotikum tilstede i foret (beregnet på vekten av foret), er gitt nedenfor i tabell VI, hvor den gjennomsnittelige relative vekt av grisene etter 6 og 12 uker er gitt. in the example, pigs were prescribed in the form of a mixture with a precursor (wheat flour). The amount of antibiotic present in the feed (calculated on the weight of the feed) is given below in Table VI, where the average relative weight of the pigs after 6 and 12 weeks is given.

Tabellen viser en vekstfremmende virkning av det antibiotiske stoff i henhold til foreliggende oppfinnelse. The table shows a growth-promoting effect of the antibiotic substance according to the present invention.

Claims

Antibiotic for use as a growth promoter for livestock, called MYC-8003, characterized in that it is a yellow, salt-forming, slightly acidic, solid containing the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen in amounts of 63.8$, 7.6 $, 3.5$ respectively. 25.1$ (by subtraction), has a molecular structure comprising three equilibrium-forming tautomeric configurations, has an optical rotation [a]^2 of -60° (l$-ig methanolic solution), is slightly soluble in carbon tetrachloride and benzene, but soluble in chloroform, methyl isobutyl ketone, butyl acetate, ethyl acetate, methanol and alkaline solutions, shows a weak positive reaction in the aromatic test, forms a red color with concentrated sulfuric acid, a dark brown color in the Pauly reaction,

a dark red color.and turbidity with ferric chloride, forms a

precipitation with bromine water, shows gas formation at 135°C, further gas formation at about 152°C and shows decomposition at 164-174°C, has absorption maxima in the ultraviolet part of the spectrum at 233,276,286cg327nm> and in the infrared part of the spectrum at 810, 860, 940, 980, 1090, 1215, 1355, 1-455, 1540, 1650, 2930, 2970 and 3400 cm<-1>, and that it is produced by growing the previously unknown microorganism Streptomyces ramocissimus (CBS 190.69) in an aqueous nutrient substrate containing assimilable sources of carbon, nitrogen and inorganic substances.