NO132644B - - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fremstilling ;

av zearalenon ved submers dyrkning av stammer av mikroorganismen Gibberella zeae i et omrort, luftet, vandig, flytende fermenteringsmedium som inneholder assimilerbare karbon-, nitrogen- og mineralkilder, og ikke inneholder vesentlige mengder sinkholdig gjærekstrakt.

Det har blitt funnet av Chester L. Keith, og som beskrevet

i den samtidig innleverte patentsoknad nr. 156/71,

at zearalenon effektivt vil kunne produseres i et omrort, g j ennomluftet, vandig,flytende fermenteringsmedium som inneholder assimilerbart karbon, nitrogen og mineralkilder ved submers dyrkning av en mikroorganisme av arten Gibberella zeae. Denne dyrkning skjer ved bruk av mikroorganismen Gibberella zeae (Schw.) Petch stamme 542 Keith ATCC 20273.

Strukturformelen for zearalenon er fblgende:

For denne oppfinnelse ble gjort, har forsokene med å fremstille zearalenon ved submers kultur-fermentering vært absolutt mislykket. En fordel med å anvende den submerse kultur-teknikken, og da sammenlignet med den statiske fermenteringen på et porost substrat, er at man kan anvende en mindre dyr fremstillings-fremgangsmåte og en billigere metode for gjen-vinning av zearalenon-produktet. Det angis at det er fordelaktig å tilsette en viss mengde gjær-ekstrakt til substratet, og på den måte oke produksjonen av zearalenon, såvel som til-setning av den nodvendige mengde assimilerbart karbon, nitrogen og mineraler.

Det har nå blitt funnet at gjær-ekstraktet kan erstattes med sink-kationer, f.eks. ved å anvende en ekstern kilde med vannloselig sink-forbindelse og enda oppnå en okt zearalenon-produksjon.

Oppfinnelsen vedrorer således en fremgangsmåte for fremstilling av zearalenon ved submers dyrkning av stammer av mikroorganismen Gibberella zeae i et omrort, luftet, vandig, flytende fermenteringsmedium som inneholder assimilerbare karbon-, nitrogen- og mineralkilder, og ikke inneholder vesentlige mengder sinkholdig gjærekstrakt, og fremgangsmåten karakteriseres ved at det som mikroorganisme anvendes Gibberella zeae (Schw.) Petch stamme 542 Keith ATCC 20273, og at det innarbeides i mediet fra 0,09 til 0,23 mikrogram kationisk sink pr. milliliter medium.

Hvis man, i overensstemmelse med en foretrukket utforelse av nærværende oppfinnelse, tilsetter en utbytteokende mengde av et enzym-hydrolysat av protein sammen med sink-forbindelsen til substratet, så vil i hovedsak all den utbytte-okningen som svarer til gjær-ekstraktet oppnås. En av fordelene med nærværende oppfinnelse er at vannloselige sinkforbindelser, som f.eks. sinksulfat, er relativt billige sammenlignet med samme mengde gjær-ekstrakt, som kan koste 1000 ganger mere.

Som eksempler på egnede eksterne kilder med sink-kationer, kan nevnes uorganiske og organiske vannloselige forbindelser, som

f.eks. sinksulfat, sink-klorid, sink-nitrat og sink-acetat.

Den totale'mengden sink-kationer, som anvendes i fermenterings-substratet, er minimal, vanligvis anvendes fra 0,09 til 0,23, fortrinnsvis fra 0,14 - 0,18 mikrogram (beregnet som sink-kationer) pr. milliliter substrat. Ved å anvende sink-sulfat f.eks., er den optimale konsentrasjonen funnet å være ca.

0,4 - 0,8 mikrogram ZnSO^.T^O pr. milliliter substrat.

Submerse, aerobe zearalenon-produserende kultur-stammer av Gibberella zeae typer er deponert i American Type Culture Collection (ATCC). De vil med stort utbytte kunne produsere zearalenon når de dyrkes i submerst, omrort, gjennomluftet, vandig, flytende fermenterings-substrat, som inneholder næ-ringsmidler som omfatter.assimilerbart karbon, nitrogen og mineraler. En av disse stammer er Gibberella zeae (Schw.)

Petch stamme 542 Keith ATCC 20273. I substratet anvendes fortrinnsvis destillert vann, avionisert vann, eller springvann, som er oppvarmet til koking og derefter filtrert. Gjennomluft-ning av substratet utfores fortrinnsvis ved å boble luft gjen-nom det, fortrinnsvis steril luft, og fortrinnsvis med en ha-stighet tilsvarende ca. 0,25 til 2 volumdeler luft, pr. vol inn-del substrat pr. minutt (beregnet ved atmosfærisk trykk). Substratets temperatur holdes fortrinnsvis ved ca. 20 til 28°C, fortrinnsvis ved ca. 21 - 24°C. I lopet av det forste fermenterings-stadiet, f.eks. for zearalenon-produksjonen har star-tet, er det foretrukket ikke å la temperaturen overstige 24°C. Det er fordelaktig å omrore substratet, for derved å disper-gere luft som gjores tilgjengelig for mikroorganismen, og dette kan utfores ved hjelp av en eller annen egnet metode, f.eks. ved omroring med ca. 200 - 500 omdr./min. i en 20

liter gjæringsbeholder.

Den assimilerbare karbon-kilden i fermenterings-substratet er helst glukose, d.v.s. glukose av reagens-kvalitet, cerelose som er en hvit, krystallisert ren glukose, er egnet. Egnede, men mindre foretrukkede som karbonkilder er andre karbohydrater som ikke har en ugunstig innvirkning på zearalenon-produksjonen, som f.eks. xylose, fructose, sucrose og galactose. Xylose virker bedre når den blandes med glukose (f.eks. i forholdet 7,5 vekts-deler xylose og 22,5 vekts-deler glukose) enn når den anvendes alene som karbon-kilde. Hvis onsket, kan en del glukose, f.eks. opptil 50 vekts-%, erstattes med glycerol.

En alternativ glukose-kilde for fermenterings-substratet er f.eks. stivelse, som under prosess-betingelsene vil omdannes til glukose. Mengden assimilerbar karbon-kilde, som anvendes i fermenterings-substratet, må være tilstrekkelig for mikroorganisme-reduksjonen, hvorved zearalenon produseres, f.eks.

i tilfelle av glukose vil vanligvis mengden være ca. 20 - ca. 40, fortrinnsvis ca. 25 - 35 g glukose pr. 100 cc substrat.

Den assimilerbare nitrogen-kilden i fermenterings-substratet kan enten være uorganisk eller organisk, men fortrinnsvis anvendes organisk forbindelse. Ammoniakk-utviklerde, noytråe forbindelser, som lett hydrolyseres, er vanligvis egnede. jEksémpel på egnede nitrogen-utviklende forbindelser er urea, asparagin, ammoniumsalter, såsom ammoniumnitrat og ammonium-fumarat, glutamin, glycin, ammonium-hydroksyd og et protein-hydrolysat som Shef f ield' s "nz Amine Type HD'.' Den foretrukkede nitrogen-kilden er urea, og denne anvendes vanligvis i en mengde på ca. 0,2 - 0,8 g, fortrinnsvis ca. 0,3 - 0,7 .g pr. 100 cc fermenterings-substrat.

I fermenterings-substratet1tilsatt mineral som næringsmiddel omfatter elementene, jern, fosfor, kalium, svovel og magnesium, fortrinnsvis i vannloselig form. Mengdene av de forskjellige mineralene kan variere betydelig, og mineralene skal forekomme i et mengdeforhold som er tilstrekkelig for å garantere god vekst av mikroorganismene. Virkningsfulle mengder av disse elementene, beregnet som fritt element, ligger i området fra ca. 0,001 - 1 g pr. 100 cc substrat. Foretrukkede kilder for ,-disse elementer omfatter dikaliumfosfat (dvs. K2HP04), magnesiumsulfat (dvs. tilfort som MgS04. 7^0) ,

og kaliumklorid. Som kilde for jern, svovel og fosfor, kan man anvende det tidligere nevnte "NZ-amin Type A". Kaliumklorid er et salt som kan oke det osmotiske tykket, og som senere skal diskuteres. Den foretrukkede mengde anvendt di-

kaliumfosfat er ca. 0,05 - 0,3 g pr. 100 cc substrat, og den foretrukkede, mengde magnesiumsulfat (beregnet som MgS04.7H,,0)

er ca. 0,025 til 0,2 g pr. 100 cc substrat. Jern er en spesielt onsket ingrediens i substratet når karbonkilden er glukose av reagenskvalitet.

I fermenterings-substratet tilsettes fortrinnsvis^ ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, produksjonsokende mengder av et protein-hydrolysat, dvs. et : érizym-hydrolysat av protein, fortrinnsvis et enzym-hydrolysat av kasein, som f.eks. Sheffield<1>s "NZ Amine Type A"og Amber's"echV Sheffield"N-Z-Amine Type

AM er et panereas-hydrolysat av kasein, som inneholder alle aminosyrene i form av blandede aminosyrer og peptider, og som forekommer i kasein. Hydrolysatet forekommer fortrinnsvis i substratet i et mengdeforhold som tilsvarer minst.0,1 g, f.eks. ca. 0,1 - 2 g pr. 100 cc substrat. Det mest foretrukkede hydrolysatet er"NZ Amine Type A<*>.' Mindre foretrukkede erstatninger for hydrolysatet er vitamin-fri kasein og kaseinet selv. Bruk av enzym-hydrolysat, f .eks. "NZ Amine Type A'^ har vist seg å

være spesielt anvendelig når den anvendte karbonkilden er en dekstrose av reagens-kvalitet.

Vekst-fremmendé mengder av animalske aminosyrer, dvs. ca.

0,1 - 0,3 g pr. 100 cc substrat av biff-ekstrakt, som f.eks. Difco's kjbtt-ekstrakt, kan også tilsettes substratet.

En skum-inhibitor, fortrinnsvis en som ikke har uheldig innvirkning på produksjonen av zearalenon, tilsettes med fordel fermenterings-substratet. De som har vist seg minst skadelige av inhibitorene med hensyn til zearalenon-produksjonen er silikon-skum-inhibitorer, dvs."Antifoam lo" (en ikke-ionisk silikon-emulsjon som inneholder ca. 10% fast silikon, General Electric Co. produkt). Andre effektive inhibitorer, men

som reduserer zearalenon-utbyttet noe, omfatter maisolje, svine-fett-olje, mineral-olje og fettalkoholer som lauryl-alkohol.

Salter som oker det osmotiske trykket kan også tilsettes fermenterings-substratet. Eksempler på slike salter er alkalimetall-saltene, dvs. natriumacetat, natriumcitrat, natrium-succinat, natriumklorid og kaliumklorid. Mest foretrukket er alkalimetall-halogenidene, dvs. natriumklorid og kaliumklorid, og disse forekommer fortrinnsvis i en mengde som tilsvarer ca. 1 - 4 g pr. 100 cc substrat.

Zearalenon-utbyttene og utnyttelsen av karbon-kilden synes å

bli forbedret når substratet steriliseres i autoklav, f.eks.

.ca. 10 - 30 minutter for et volum på 3 liter og ved et trykk på ca. 0,7 - 1,4 kg/cm med damp for inokuleringen.

Det er ifolge nærværende oppfinnelse fordelaktig å la fermenterings-prosessen fortsette til hovedsakelig all assimilerbar karbon er oppbrukt, hvilket vanligvis tar fra ca. 5-23 dager og for substratet blir gjenstand for utvinning av zearalenon. Zearalénon-utvinningen kan foretas ifolge en egnet fremgangsmåte, f.eks. ved å filtrere substratet, oppslemning av filterkaken med en vandig alkalisk losning som opploser zearale.nonet, filtrere oppslerahingen,surgjore filtratet for å bunnfelle zearalenon, og derefter utvinne det bunnfelte zearalenonet. Den nevnte metode er beskrevet i f.eks. norsk soknad nr. 3753/68..

Utgangs-pH i fermenterings-substratet vil vanligvis være ca.

6,1 - 7,2, fortrinnsvis ca. 6,2 - 7,0. Under fermenterings-prosessen synker pH og vanligvis synker det til ca. 3,4 - 4,0, som oftest til ca. 3,6 - 3,7, i lopet av 2 - 4 dager. Substratets pH forblir derefter uforandret under fermenterings-prosessen, hvis man da ikke tilsetter substratet pH-regulerende midler. Heldigvis kan relativt få forurensende organismer formere seg ved pH-verdier under ca. 4. Folgende eksempler

skal illustrere nærværende oppfinnelse.

EKSEMPEL I

Flere forsoks-serier ble foretatt med sink-sulfat som ble tilsatt fermenterings-substratet, som beskrives nedenfor,

i mengder fra 0,05 - 0,23 mikrogram (beregnet som sink-kationer)

pr. milliliter substrat.

Podestoffet for forsokene ble fremstilt i det nedenfor

beskrevne inokulerings-substratet. I hvert tilfelle ble 100 ml inokulerings-substrat tilsatt en 500 ml Erlenmeyer-flaske,

og flasken ble lukket med bomulls-propp og behandlet i en autoklav 15 minutter ved 1 kg/cm <2>damp-trykk.

Det forste trinnet av en to-trinns inokulering besto av

inokulering med 5 ml av en myceHe-suspensjon eller 5 ml av en spore-suspensjon av ATCC 20273. Efter 24 timers inkubering ved 30°C

ved hjelp av en roterende -rystemaskin, ble 5 ml av podestoffet fra det forste trinnet overfort til en flaske nr. 2, og som inneholdt samme substrat. Det andre trinnet, hvorved mikroorganismene fikk gro ved 30°c i en roterende ryste-maskin,

var ferdig til bruk efter 20-22 timer.

Fermenterings-substratet, 100 ml i 500 ml Erlenmeyer-flasker

som var lukket med to melke-filter-skiver, ble behandlet i autoklav 10 minutter ved 1 kg/cm 2 trykk. 5 ml av podestoffet fra det andre trinnet ble anvendt. Efter 12 - 14 dager ble flaskenes innhold undersokt ved hjelp av ultra-fiolett-spektrofotometri, hvorved 2 36 mu avlesninger ble anvendt,

for beregninger.

Resultatene fra forsokene vises på to forskjellige måter i tabellene Ia og Ib. I tabell Ia angis hver styrke-bestemmelse som prosent av den styrken som erholdes ved et forsbk av den serie som anvender 0,1 g gjær-ekstrakt pr. lOO cc substrat i stedet for sink-sulfat i substratet. I tabell Ib angis styrke-bestemmelsen i prosent av den hoyeste styrken som er oppnådd ved forsok ifolge disse seriene.

EKSEMPEL II

I 5 forsok Jole det tilsatt 0,3 g "NZ Amin A" pr. 100 cc substrat til et fermenterings-substrat som inneholdt 0,14 mikrogram sink-kationer pr. milliliter substrat i likhet med eksempel I. Zearalenon-titrene var gjennomsnittlig 34% hoyere enn de som inneholdt sink-kationer uten "NZ Amine A".

EKSEMPLENE III til V

I hovedsak samme fremgangsmåte og betingelser ble anvendt som i eksempel II, bortsett fra at sink-klorid, sink-nitrat og sink-acetat ble brukt i stedet for sink-sulfat. Tilsvarende resultater ble oppnådd.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av zearalenon ved submers dyrkning av stammer av mikroorganismen Gibberella zeae i et omrort, luftet, vandig,flytende fermenteringsmedium som inneholder assimilerbare karbon-, nitrogen- og mineralkilder, og ikke inneholder vesentlige mengder sinkholdig gjærekstrakt, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Gibberella zeae (Schw.) Petch stamme 542 Keith ATCC 20 27 3, og at det innar-be ides i mediet fra 0,09 til 0,23 mikrogram kationisk sink pr. milliliter medium.

2. Fremgangsmåte etter krav 1, karakterisert ved at fermenteringsmediet også inneholder et enzymhydrolysat av kasein i en mengde på minst 0,1 g pr. 100 cm^ medium.