NO124215B

NO124215B -

Info

Publication number: NO124215B
Application number: NO243668A
Authority: NO
Inventors: K Munakata; H Ito; T Oda; T Mori
Original assignee: Kowa Co
Priority date: 1967-06-21
Filing date: 1968-06-20
Publication date: 1972-03-20
Also published as: MY7300394A; AT280474B; NL146532B; BE716989A; CS158620B2; FR8296M; DK118071B; SE361326B; CH513974A; ES355239A1; GB1225047A; DE1767835A1; NL6808802A

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotisk stoff quintomycin eller dets komponenter quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D.

Oppfinnelsen angåir en fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotisk stoff quintomycin eller dets komponenter quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D, hvilken fremgangsmåte er av den art hvor en mikroorganisme dyrkes under aerobe betingelser i et medium inneholdende en karbonkilde og en nitrogenkilde og eventuelt en mineralkilde, hvoretter antibiotikumet utvinnes fra dyrkningsvæsken, og karakteristisk for fremgangsmåten er at det som mikroorganisme anvendes en stamme av arten Streptomyces lividus, og at det utvunne antibiotiske stoff, hvis onsket, deles opp i sine komponenter.

Ovennevnte sopp ble deponert under betegnelsen "Nr. 2230-N.^-

stamme" ved Fermentation Laboratory of Technical Institute,

2, 5, 4-chome, Inage-Higashi, Chiba-shi, Japan, under deponeringsnummer "Nr. 50 FLTI". Den samme sopp ble senere deponert under betegnelsen Streptomyces lividus ved American Type Cultur Collection, under deponeringsnummer "ATCC 21178".

Dat antibiotiske stoff ble forst betegnet "Nr. 2230-stoff" og senere kalt quintomycin. Av quintomycinets komponenter er quintomycin-A som har summeformlen C29H55N^°19'°9 ^ IV^- S pentahydroklorid har en spesifikk dreining [a]D = + 59 , quintomycin-B, som har summeformlen C 29H55N^°i8' 0<=* ^v:i-s pentahydroklorid har en spesifikk dreining [a]D = + 50°, og quintomycin-D, som har summeformlen c 23H45I*5<~>^3' °9 hvis pentahydroklorid har en spesifikk dreining [ct]D = + 36 , hittil ukjente antibiotiske stoffer, mens quintomycin-C synes å være et synonym for et kjent antibiotisk stoff paromomycin fremstilt av Streptomyces rimosus forma paromomycinus.

Hovedbestanddelene i det antibiotiske stoff quintomycin er de hittil ukjente antibiotiske forbindelser, quintomycin-B og quintomycin-A. Quintomycinet oppviser en hoy biologisk aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa, særlig quintomycin-B, og har en ytterst lav toksisitet overfor varmblodige dyr. De kjente antibiotiske stoffer med hoy biologisk aktivitet mot ovennevnte bakterier er ikke tilfredsstillende med hensyn til toksisiteten. Streptomyces lividus, som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, har folgende mikrobiologiske egenskaper. (I) Morfologi;

Streptomyces lividus n.sp. oppviser forst en lysegrå vekst på et syntetisk medium, slik som Czapek's glycerolagar, glucose-asparaginagar og kalsiummalatagar, og fargen endres deretter gradvis til morkeblå til sort. Det produseres intet loselig pigment, men i et sjeldent tilfelle dannes et loselig, lys rosa eller bringebærfarget pigment. Lufthyfem er korttog uregelmessig forgrenet i en enkel form. De dennede sporoforer er generelt rette, men i sjeldne tilfeller dannes boyelige lokker (virvler eller spiraler dannes ikke). Strukturen av sporeoverflaten sett i et elektronmikroskop er oval eller elip-tisk (0,2 x n; 3 -• 0,5 u) . (II) Dyrkningsegenskaper på forskjellige media;

Syntetiske media:

(Bemerk): G = vekst, A = luftmycelium, S = loselig pigment.

(III) Biologiske egenskaper:

(IV) Utnyttelse av karbonkilder: Tabellen fortsettes:

Klassifikasjonen ifolge Bergey<1>s "Manual of Determinative Bacteriology", 7. utgave, viser at den nye sopp som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, ligner Streptomyces gedanensis i folgende henseender: Psykrofil til mesofil vekst, intet loselig pigment produsert i organiske media, den proteo-lytiske virkning er sterk, vekst på syntetiske media er mork til sort til nesten blåsort, luftmyceliet er hvitt til grått. Streptomyces gedanensis i potetmedium viser imidlertid en kremfarget til brunlig vekst og produserer intet luftmycelium og loselig pigment, mens Streptomyces lividus oppviser en morkegrå eller gråligsort vekst med et svakt luftmycelium og produserer vanligvis intet loselig pigment, skjont den i et sjeldent tilfelle kan oppvise en svak rosa farge. På stivel-sesmediet oppviser Streptomyces gedanensis én gulaktig til kremfarget vekst, og Streptomyces lividus oppviser en lysegrå til morkeblå eller sort vekst. Streptomyces gedanensis viser seg å være negativ ved peptonisering av melk og nitratreduk-sjon, mens Streptomyces lividus viser seg å være positiv i begge disse tilfeller.

Som stamme som oppviser en psykrofil til mesofil vekst og ikke produserer noe loselig pigment, har man Streptomyces griseolus som oppviser en musegrå vekst på syntetiske media, produserer et hvitt til grått luftmycelium og danner rette sporoforer, samt Streptomyces fasciculies som danner kosteformede sporoforer. Sammenligning av disse to stammene med Streptomyces lividus som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, har gitt folgende resultat. På næringsagar oppviser Streptomyces griseolus en brunlig vekst med en glatt overflate, produserer et matt, dypgrått luftmycelium og intet loselig pigment, mens Streptomyces lividus oppviser en rynket, fuktig gulbrun vekst og produserer intet loselig pigment og nesten intet luftmycelium. I et potetmedium oppviser Streptomyces griseolus en kremfarget til sort vekst, danner et luftmycelium med hvitt til gronlig skjær og produserer et brunt til sort loselig pigment, mens Streptomyces lividus oppviser en morkegrå til gråligsort vekst, danner et svakt luftmycelium og produserer intet loselig pigment, skjont den i et sjeldent tilfelle kan oppvise en svak rosa farge. I gelatin danner Streptomyces griseolus en gulaktig, fnokket hinne eller et bunnfall, og danner et hvitt til svakt brunt luftmycelium, mens Streptomyces lividus oppviser en lysegrå vekst, men produserer intet luftmycelium eller loselig pigment. I melk oppviser Streptomyces griseolus en rikelig lyserod hinnevekst og langsom koagulering, mens Streptomyces lividus vokser i flote, på overflaten og koagulerer ikke melk.

Streptomyces fasciculus oppviser en god lav-lignende vekst og danner et luftmycelium som er fargelost med et morkegrått pudderaktig eller floyelslignende utseende, mens Streptomyces lividus oppviser en lysegrå til morkeblå eller sort vekst, og danner et hvitt eller gråhvitt luftmycelium som er kort og ikke så rikelig. I et melkemedium viser Streptomyces fasciculus seg å være positiv både ved koayulasjon og peptonisering, og oppviser en god vekst på cellulose, mens Streptomyces lividus viser seg å være positiv bare ved peptonisering i melke-mediet, og gror ikke på et cellulosemedium.

Under henvisning til S.A. Waksman, "The Actinomycetes", bind

2, vil sammenligning av karakteristiske egenskaper av forskjellige Streptomycesarter indikere at Streptomyces lividus ikke tilhorer noen av disse. Streptomyces intermedius, Streptomyces parvullus, Streptomyces craterifer og Stieptomyces cellulosae som tilhorer Cinereusserien, kan imidlertid sies å være lik Streptomyces lividus ved at spiraldannelsen er positiv eller negativ, melamin er negativ og luftmyceliet er hvitt til grått.

I næringsagar oppviser Streptomyces craterifer en fargelos vekst, og i stivelseagar oppviser den en spredt, tynn og fargelos vekst og danner intet luftmycelium. I et potetmedium oppviser Streptomyces craterifer en kremfarget vekst og danner et hvitt til lysegrått luftmycelium. På den annen side oppviser Streptomyces lividus en god vekst som er rynket, fuktig gulbrun i næringsagar, oppviser en god, lysegrå til morkeblå eller sort vekst, og danner et floyelsaktig, hvitt eller lysegrått luftmycelium i stivelseagar, og oppviser en morkegrå vekst i potetmedium.

Streptomyces cellulosae vokser godt i cellulose og koagulerer hurtig melk, i syntetiske media oppviser den en gul eller si-trongul vekst. Dette er ting som gjor den forskjellig fra Streptomyces lividus.

Streptomyces parvullus er forskjellig fra Streptomyces lividus i at den danner sporoforer som snor seg i lange, lukkede spiraler, oppviser en gul vekst i syntetiske media, produserer et gult loselig pigment i gelatin, produserer et brunt loselig pigment og rikelig grått luftmycelium i melk, og oppviser en meget langsom peptonisering.

Streptomyces lividus som anvendes ved fremgangsmåten ifolge

oppfinnelsen, er også forskjellig fra Streptomyces intermedius ved at sistnevnte oppviser en god, olivengronn vekst på cellulose, en foldet brun til gronnbrun vekst og produserer et oli-vengront loselig pigment på et potetmedium, og oppviser langsom flytendegjoring av og produserer et gronnbrunt loselig pigment i gelatin.

Med unntagelse av Streptomyces griseolus, Streptomyces cellulosae og Streptomyces parvullus produserer de ovennevnte kjente stammer ikke noen antibiotiske stoffer.

Det skal nå vises til sopp av slekten Streptomyces som produserer antibiotiske stoffer tilhorende aminocyklitolgruppen. I henhold til Waksman oppviser Streptomyces fradiae en tynn, glatt, fargelos, under tiden orangegul substratvekst på syntetiske media og danner et lyserodt, skjellrodt eller lakserodt luftmycelium. Dette er forskjellig fra Streptomyces lividus som anvendes i henhold til oppfinnelsen. Waksman's klassifi-kasjon indikerer også at Streptomyces albogriseolus oppviser en lyserod til purpurrod vekst på et potetmedium og at sporo-forene danner spiraler. Folgelig er den forskjellig fra Streptomyces lividus, Streptomyces rimosus, Streptomyces paromomy-ceticus, Streptomyces christomyceticus, Streptomyces kanamyceticus og Streptomyces pulveraceus somalle oppviser en gul eller kremfarget til brun vekst, og oppviser ikke morkegrå til morkeblå eller sort vekst som Streptomyces lividus.

Folgelig er den quintomycinproduserende stamme som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, blitt identifisert som en ny stamme tilhorende slekten Streptomyces.

For referanseformål vil detaljene ved de mikrobiologiske egenskapene til stammene tilhorende slekten Streptomyces som produserer antibiotiske stoffer tilhorende aminocyklitolgruppen, bli gjengitt nedenfor under avsnittene (I) til (VI). De mikrobiologiske egenskapene til stammer tilhorende andre slek-ter som produserer antibiotiske stoffer tilhorende aminocyklitolgruppen er også gitt under avsnittene (VII) og (VIII).

De ovennevnte soppers utnyttelse av karbonkildene, med unntagelse av (IV), er vist nedenfor sammen med lignende data for den hittil ukjente Streptomyces lividus som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen. Forskjellige stoffer kjent på dyrkningsområdet kan brukes som karbon- og nitrogenkilder. Eksempler på karbonkilder er stivelse, glukose, glycerol, maltose, inositol, fruktose, dextrin, sakkarose og galaktose. Som nitrogenkilde kan nevnes gjæreks-trakt, polypepton, torrgjær, kjottekstrakt, maisstopevæske, soyabonnemel, uorganiske nitrater og ammoniumsalter.

Eksempler på mineraler er natriumklorid, dikaliumhydrogenfosfat, magnesiumsulfat, jernsulfat, kalsiumklorid, kalsiumkarbo-nat, kalsiumhydroksyd, jernklorid, sinksulfat og koboltklorid.

Dyrkningen kan utfores under aerobe forhold enten i et fast dyrkningsmedium eller i et flytende medium. Det er foretrukket å utfore dyrkningen i et flytende medium. Ved dyrkning i flytende medium kan kjente antiskummemidler som flytende paraffin, fete oljer og silikonoljer brukes.

Dyrkningstemperaturen ligger på 20 - 39°C, fortrinnsvis mellom 25 og 37°C. Det anbefales å utfore dyrkningen med pH i dyrk-ningsmediet regulert til 6,6 - 7,5, fortrinnsvis 7,0 + 0,3. Dyrkningstiden er vanligvis, minst 2 dager. Eksempelvis vil en periode på 2 dager til 2 uker, eller 2 dager til 1 uke, være tilstrekkelig. Om onsket er en lengere dyrkningstid mulig, men ikke nodvendig. Når produksjoner; av quintomycin i dyrkningsvæsken har nådd en tilstrekkelig mengde, fortrinnsvis når den har nådd maksimum, stoppes dyrkningen, og quintomycinet utvinnes av dyrkningsvæsken. Utvinningen kan utfores enten ved å adsorbere dyrkningsvæsken på en adsorbent og så eluere med et egnet elueringsmiddel, eller utvinningen kan skje ved ekstraksjon med et egnet opplosningsmiddel. Den forstnevnte fremgangsmåte foretrekkes. Når adsorbsjonsprosessen anvendes, settes en egnet adsorbent til dyrkningsvæsken for å adsorbere det onskede produkt under omroring, og etter fj erning av den resterende dyrkningsvæsken med myceliet, underkastes adsor-benten elueringsoperasjonen. Det er også mulig å sette en adsorbent til dyrkningsvæsken hvorfra myceliet er fjernet på egnet måte, for eksempel ved filtrering eller sentrifugering, og deretter folge den samme fremgangsmåte. Eventuelt kan den myceliefri væsken fores gjennom en kolonne pakket med et egnet adsorberingsmiddel, "hvoretter den underkastes den samme be-handling som ovenfor.

Hvilket som helst fast adsorpsjonsmiddel som adsorberer det onskede produkt og hvorfra dette produkt kan elueres med en egnet elueringsvæske, kan brukes i den ovennevnte adsorpsjons-prosess, men bruken av kationvekslere foretrekkes. Spesielt foretrukket er bruken av svakt sure kationvekslerharpikser. Spesielle eksempler på kationvekslere er "Amberlite IRC-50", "Amberlite IRC-84", "Amberlite CG-50" og karboksymetylcellulose. Foruten disse er andre faste adsorpsjonsmidler som cellulosepulver, aktivt karbon, aluminiumoksydgel, silikagel og aluminiumoksyd/silisiumoksydgel brukbare.

Som elueringsvæske foretrekkes vandige opplosninger av syrer, slik som uorganiske og organiske syrer, og vandige opplosninger av alkalier, som f.eks. natriumhydroksyd, ammoniakk og ammoniumsalter.

Nevnte syrer omfatter mineralsyrer som klorhydrogensyre, svovelsyre og fosforsyre, og lavere alifatiske syrer som eddiksyre og maursyre. Det anbefales at disse syrer brukes i form av vandige opplosninger som har en konsentrasjon på omkring 0,1 - 1,0-n. Eksempler på ovennevnte alkaliske materi-aler er natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, ammoniakk og ammoniumformiat. Det foretrekkes at disse alkalier brukes i konsentrasjoner på omkring 0,1 - 3,O-n. Av de nevnte er bruken av mineralsyrer eller vandig ammoniakk å anbefale.

pH i det oppnådde eluat reguleres om onsket til en verdi i

nærheten av noytralpunktet, og ved å fjerne væskeinnholdet ved den lavest mulige temperatur, kan det onskede quintomycin opp-nås som et fast pulver. Fjerningen av væskeinnholdet kan utfores på hvilken som helst kjent måte. F.eks. ved frysetørk-ing eller spraytorking. Hvis operasjonen utfores ved den lavest mulige temperatur, kan også oppvarmning under redusert trykk anvendes. Dessuten kan vakuumtorking anvendes under

slike betingelser at det dannes et stabilt salt som hydrokloridet eller natriumsaltet. Envidere kan quintomycinet i eluatet omdannes til et fast pulver ved å ekstrahere eluatet med et egnet opplosningsmiddel med etterfolgende fjerning av opp-losningsmidlet ved lavest mulig temperatur.

Når aktivt karbon brukes som adsorpsjonsmiddel, brukes en vandig opplosning av en syre som elueringsvæske. I dette tilfelle foretrekkes det å bruke aceton og lavere alifatiske alkoholer som metanol og etanol, regulert til pH mindre enn 5, fortrinnsvis mindre enn 4, ved siden av de nevnte syrer.

Når utvinning av quintomycinet fra dyrkningsvæsken utfores ved opplosningsmiddelekstraksjon, brukes hoyere fettsyrer som lau-rinsyre og stearinsyre som hjelpemiddel. Som opplosningsmiddel kan brukes med vann ikke-blandbare alkoholer, fortrinnsvis n-butanol eller isobutanol og amylalkohol. Alkohollaget fraskilles ved dekantering eller på annen kjent separeringsmåte, og alkoholen fordampes ved lavest mulig temperatur. Her er spraytorking å foretrekke ved siden av oppvarmning under redusert trykk.

Som ovenfor nevnt, foretrekkes det at quintomycinet fremstilt

i henhold til oppfinnelsen utvinnes ved adsorpsjon med etter-følgende eluering eller ved opplosningsmiddelekstraksjon. Men sålenge som quintomycinet i dyrkningsvæsken ikke odelegges, kan det brukes hvilken som helst fremgangsmåte for utvinning av et fast materiale opplost i en dyrkningsvæske.

Det oppnådde nye antibiotiske stoff quintomycin er et hvitt til gråhvitt fast stoff og kan brukes som antibiotikum på en rekke områder, eller om onsket, etter at det er blitt renset ved gjentatte anvendelser av de ovennevnte utvinningsmetoder. Det oppnådde quintomycin kan, om onsket, skilles i fire antibiotiske stoffer, nemlig som for nevnt quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D. Quintomycin-A, quintomycin-B og quintomycin-D er nye stoffer. Quintomycinet som anvendes i henhold til oppfinnelsen består for en over-

veiende del av quintomycin-B.

Måter å skille quintomycinet på i de fire bestanddeler vil nå bli beskrevet.

Når quintomycinet fraskilt dyrkningsvæsken på nytt loses i vann, eller elueres med en vandig opplosning av en syre eller et alkali som ovenfor nevnt, kan det ved kromatografi skilles i quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D når pH i elueringsvæsken holdes på fra 6,2 til 12, med eller uten regulering.

Både kationvekslere og anionvekslere er brukbare. F.eks. ved bruken av en kolonne av en kationveksler, fortrinnsvis en svakt sur kationveksler, slik som "Amberlite IRC-50", "Amberlite IRC-84", "Amberlite CG-50", karboksymetylcellulose og "CM-Sephadex", vil en vandig opplosning av quintomycinet regulert til pH 6,2 - 12 adsorberes i kolonnen, fulgt av utvinning ved bruken av en vandig opplosning av ammoniumformiat som elueringsvæske, idet quintomycinet fraskilles på en trinnvis måte eller ved gradientmetoden.

I henhold til gradientmetoden, under operasjonsbetingelsene gitt i eksempel 4 nedenfor, elueres quintomycin-A i delene 45 - 50, quintomycin-B i delene 53 - 58, quintomycin-C i delene 80 - 90, hvoretter quiiitomycin-D elueres. I henhold til den trinnvise metoden elueres quintomycin-A forst ved hjelp av 0,1-n vandig ammoniakk og så quintomycin-B ved hjelp av vandig ammoniakk av samme normalitet. Quintomycin-C elueres ved hjelp av 0,15-n vandig ammoniakk og quintomycin-D med 0,3-n vandig ammoniakk.

Det er også mulig å skille en vandig opplosning av quintomycin under anvendelse av en anionveksler, fortrinnsvis en sterkt basisk anionveksler, slik som "Dowex 1x2 - OH type" eller "Amberlite 400", og eluering med vann, hvorved quintomycin-D, quintomycin-C, quintomycin-B og quintomycin-A elueres i rekke-folge .

Hver av de adskilte komponenter kan ytterligere renses ved kromatografi under bruken av aktivt karbon, aluminiumoksyd eller cellulose som kolonne, og aceton eller lavere alkoholer syret med en mineralsyre som klorhydrogensyre, svovelsyre og salpetersyre, eller en lavere alifatisk syre som eddiksyre som elueringsvæske. De kan også renses ved å omdanne de til deres pikratsalter eller Reinecke's salter, eller omdanne de til pas-sende uorganiske salter ved en saltutveksling.

Det nye antibiotiske stoff fremstilt i henhold til oppfinnelsen har nye og nyttige antibiotiske aktiviteter som er nevnt i begynnelsen av foreliggende beskrivelse. Disse vil bli mer detaljert behandlet nedenfor.

(1) Karakt er i st ika:

Quintomycin-A, quintomycin-B og quintomycin-D er basiske stoffer. En fri base, et hydroklorid og et sulfat av hvert av disse stoffer er hvite ikke-krystallinske pulvere.

(2) Opploselighet:

Quintomycin-A, quintomycin-B og quintomycin-D er i form av fri base, hydroklorid og sulfat opploselig i vann, i en vandig opplosning av et alkalimetallhydroksyd, lavere alifatiske syrer og mineralsyrer. De er loselig i metylalkohol i form av fri base, men er tungt opploselig eller uopploselig i C^- eller hoyere alifatiske alkoholer, ketoner og estere.

(3) Fargereaksj on:

Quintomycin-A, quintomycin-B og quintomycin-D viser seg å være positiv i Molisch's reaksjon, Elson-Morgan's reaksjon, Aber-halden's reaksjon (ninhydrinreaksjon) og Bilé's reaksjon, viser en dyp purpurrod farge i Tollen's reaksjon, og er negativ i Fehling's reaksjon, Benedicfs reaksjon, Biuret's reaksjon, Ehrlich's reaksjon og Sakaguchi's reaksjon.

Quintomycin-A og quintomycin-B oppviser purpurfarge i skatol-reaksjonen, mens quintomycin-D ikke gjor det.

(4) Stabilitet:

Quintomycin-A, quintomycin-B og quintomycin-D er i vandig l-n klorhydrogensyreoppldsning ustabile ved opphetning til 100°C i 30 minutter, men er stabile ved romtemperatur. De er stabile i l-n natriumhydroksydoppldsning både ved opphetning til 100°C i 30 minutter og ved romtemperatur.

(5) Rf-verdi:

R^-verdien, bestemt ved aluminiumoksyd-tynnlagskromatografi ved bruk av ovre lag av opplosningsmiddelblandingen kloroform/metanol/17 % vandig ammoniakk (volumforhold 2:1:1) som fremkal-lingsvaeske, er 0,23 for quintomycin-A, 0,50 for quintomycin-B og 0,75 for quintomycin-D. Noen kjente antibiotika har folgende R^-verdier bestemt ved ovennevnte fremgangsmåte, kanamycin (produkt av Streptomyces kanamyceticus) 0,755 paromomycin (produkt av Streptomyces rimosus forma paromomycinus) 0,705 neomycin (produkt av Streptomyces fradiae eller Streptomyces albogriseolus) 0,74; og gentamycin (produkt av Micromonospora echinospora) 0,81.

Rj-verdien bestemt ved papirkromatografi under bruk av metanol/ 3 % vandig NaCl-opplosning (volumforhold 2:1) som fremkallings-væske og "Toyo" filterpapir nr. 51A (fremstilt av Toyo Filter Paper Co., Ltd., Japan) er 0,25 for quintomycin-A og 0,27 for quintomycin-B. Rf-verdien bestemt for noen kjente antibiotika ved denne fremgangsmåte er som folger: kanamycin 0,36, parao-momycin 0,31, neomycin 0,20 og for gentamycin 0,53.

Andre egenskaper av de antibiotiske stoffer fremstilt i henhold til oppfinnelsen er vist i den folgende tabell sammen med slike for andre kjente antibiotiske stoffer.

Oppfinnelsen vil i det folgende bli ytterligere belyst ved hjelp av eksempler.

EKSEMPEL 1

Streptomyces lividus- (Streptomyces nr. 2230-N^) stamme ble fermentert i et medium sterilisert og justert til pH 7,0, hvilket medium besto av 0,5 % stivelse, 2,0 % soyabonnemel,

0,1 % dikaliumhydrogenfosfat, 0,05 % magnesiumsulfat og 0,3 % natriumklorid, og ble for-dyrket ved 27°C i omkring 50 timer. Deretter ble 100 - 150 ml av den for-dyrkede fermenteringsvæske tilsatt til 10 liter av samme dyrkningsmedium, og dyrkningen ble utfort ved 27°C under omroring med en hastighet av 250 omdreininger pr. minutt under gjennomstrømning av sterilisert luft med en hastighet av 10 liter pr. minutt. I lopet av 40 timer, pH i fermenteringsvæsken var 7,2 - 7,4, nådde produksjonen av quintomycin ("Nr. 2230-stoff") et maksimu. Fermenteringsvæsken ble filtrert under bruk av "Celite" som fil-treringshjelpemiddel og ga 9,2 liter filtrert fermenteringsvæske. Filtratet ble omrort i 10 minutter sammen med 300 ml "Amberlite IRC-50"-harpiks (type H), hvorunder de aktive komponenter ble fullstendig adsorbert av harpiksen. Harpiksen ble pakket i en kolonne og grundig vasket med vann. Quintomycin ble utvunnet ved eluering med 0,5-n klorhydrogensyre. De aktive komponenter ble oppsamlet og nøytralisert med en 10-n natriumhydroksydoppldsning for å regulere pH til 7,6 - 7,8. Deretter ble de adsorbert i en kolonne pakket med aktivt karbon for rensning, vasket med 0,01 % vandig ammoniakk og så med vann, og eluert med en 0,0 2-n klorhydrogensyre/metanol-blanding (volumforhold 1:1). Metanol ble fjernet ved destillasjon under redusert trykk. Etterfølgende frysetørking ga quintomycin-A og quintomycin-B kompleks i form av hydrokloridet med 1 g utbytte.

EKSEMPEL 2

En fermenteringsvæske oppnådd som i eksempel 1 ble fort gjennom "Amberlite IRC-50"-harpiks (type NH^) pakket i en kolonne og de aktive komponenter ble fullstendig adsorbert av harpiksen. Harpiksen ble grundig vasket med vann og eluert med 10-n vandig ammoniakk for utskillelse av aktive komponenter. Disse ble oppsamlet og behandlet med 2-n klorhydrogensyre for regulering av pH til 6 - 7,8. Rensning ble utfort som i eksempel 1.

EKSEMPEL 3

Streptomyces lividus-stammen ble dyrket i et medium sterilisert og justert til pH 6,8, hvilket medium besto av 0,5 % stivelse, 0,05 % glukose, 2,0 % soyabonnemel, 0,2 % pepton, 0,05 % magnesiumsulfat, 0,1 % dikaliumhydrogenfosfat og 0,3 % natriumklorid, og ble for-dyrket ved 35°C i ca. 50 timer. Deretter ble 300 - 400 ml av den for-dyrkede fermenteringsvæske tilsatt til lo liter av samme medium, og dyrkningen fortsatt ved 35°C under omroring med en hastighet av 200 omdreininger pr. minutt under gjennomstrømning av sterilisert luft med en hastighet av 14 liter pr. minutt. Etter 96 timers forlop, mens pH i kultur-væsken lå på 7,8 - 8,2, nådde produksjonen av quintomycin et maksimum. Fermenteringsvæsken ble omrort i 10 minutter sammen med 100 ml svakt sur ionevekslerharpiks, "Amberlite IRC-84"

(NH^-type), hvorunder de aktive komponenter ble fullstendig adsorbert av harpiksen. Etter fjerning av myceliet og resterende fermenteringsvæske ved dekantering, ble ionevekslerharpik-sen, hvori de aktive komponentene var adsorbert, pakket i en kolonne og grundig vasket med vann med etterfølgende eluering med 2,O-n vandig ammoniakk. De aktive komponenter ble oppsamlet og konsentrert, hvoretter de ble adsorbert i en kolonne av storrelse 30 x 2400 mm pakket med en svakt sur kationveksler-harpiks for bruk til kromatografi. En pigmentdel ble eluert med O,08-n vandig ammoniakk, hvoretter ble eluert med 0,1-n vandig ammoniakk. Eluering med 0,1-n vandig ammoniakk ga forst quintomycin-A og deretter quintomycin-B. Deretter ble det eluert med 0,15-n vandig ammoniakk som ga quintomycin-C. En-delig ga eluering med 0,3-n vandig ammoniakk quintomycin-D.

Konsentrering og frysetorking ga rent quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D som frie baser med et utbytte av henholdsvis 650 mg, 4.200 mg, 40 mg og 120 mg.

EKSEMPEL 4

150 g quintomycin-kompleks oppnådd i eksempel 1 ble lost i ca. 40 ml destillert vann og oppløsningen adsorbert i en kolonne med diameter 1 cm pakket med 30 ml karboksymetyl-"Sephadex C-25" (NH^-type) etterfulgt av vasking med vann. Eluering ble foretatt med 200 ml 0,05-n vandig ammoniakk og 200 ml 1,0-n vandig ammoniakk etter gradientmetoden med en hastighet av

25 ml/time. Eluatet ble utvunnet suksessivt i deler, hver på

4 ml. Quintomycin-A ble eluert i delene 45 - 50, quintomycin-B i delene 53 - 58, og quintomycin-C i delene 88 - 90. Fortsatt eluering med vandig ammoniakk av konsentrasjon 1,0 eller mer ga quintomycin-D. Frysetorking ga rent quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D som frie baser med et utbytte av henholdsvis 31 mg, 49 mg, spor og 18 mg.

EKSEMPEL 5

150 g quintomycin-kompleks oppnådd i eksempel 1 ble lost i 40 ml destillert vann og opplosningen ble adsorbert i en kolonne med diameter 1 cm pakket med 30 ml karboksymetyl-"Sephadex C-25" (NH^-type) pufret med ammoniumformat, fulgt av vasking med vann. Eluering ble utfort med 200 ml 0,5 mol ammoniumformiatopplosning og 200 ml 3,0 mol ammoniumformiatopplosning etter gradientmetoden med en hastighet av 25 ml/time. Eluatet ble utvunnet i deler, hver på 3 ml. Quintomycin-A ble eluert i delene 29 - 37, quintomycin-B i delene 40 - 45, og quintomycin-C i delene 78 - 80. Fortsatt eluering med 3,0 mol ammoniumformiatopplosning ga quintomycin-D. Frysetorking ga rent quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D som frie baser med utbytte henholdsvis 35 mg, 56 mg, spor og 19 mg.

EKSEMPEL 6

150 g quintomycin-kompleks oppnådd i eksempel 1 ble lost i 40 ml destillert vann. Opplosningen ble justert til pH 7,0

med 0,1-n vandig ammoniakk og fullstendig adsorbert i "Amberlite CG-50" (NH^-type) pakket i en kolonne med diameter 1 cm. Ved bruk av 200 ml 0,02-n vandig ammoniakk og 200 ml 1,0-n vandig ammoniakk ble eluering utfort etter gradientmetoden med en hastighet av 25 ml/time. Eluatet ble suksessivt utvunnet i deler, hver på 3 ml. Quintomycin-A ble eluert i delene 29 -

35, quintomycin-B i delene 40 - 50 og quintomycin-C i delene 88 - 92. Fortsatt eluering med 1,0-n vandig ammoniakk ga quintomycin-D. Frysetorking ga rent quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D som frie baser med utbytte henholdsvis 33 mg, 5 2 mg, spor og 16 mg.

EKSEMPEL 7

Frie baser av quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D oppnådd i eksempel 3 ble hver lost i metanol. Tilsetning av 2-n svovelsyre til de resulterende metanolopp-losninger forte til utfelling av et sulfat av hvert quintomycin. Bunnfallet ble grundig vasket med metanol-aceton og det ble oppnådd rent sulfat av hvert quintomycin.

Frie baser av quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D ble lost i metanol og syret med 2-n klorhydrogensyre. Tilsetning av aceton til hver av metanolopplosningene forte til utfelling av hydroklorid av hvert quintomycin. Bunnfallet ble grundig vasket med aceton-eter hvorved ble oppnådd rent pentahydroklorid av hvert quintomycin.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av et antibiotisk stoff quintomycin eller dets komponenter quintomycin-A, quintomycin-B, quintomycin-C og quintomycin-D, hvilken fremgangsmåte er av den art hvor en mikroorganisme dyrkes under aerobe betingelser i et medium som inneholder en karbonkilde og en nitrogenkilde og eventuelt en mineralkilde, hvoretter antibiotikumet utvinnes fra dyrkningsvæsken, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes en stamme av arten Streptomyces lividus, og at det utvunne antibiotiske stoff, hvis onsket, deles opp i sine komponenter.