NO123377B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk middel.

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk middel, nemlig dihydroderivatet av novobiocin og av salter av denne forbindelse ved katalytisk hydrering av novobiocin henholdsvis av salter av novobiocin.

Novobiocin (det generelle navn for et

antibiotisk middel, produsenten bruker be-tegnelsen «Cathomycin» for en kvalitet av dette produkt) fremstilles ved under regu-lerte betingelser å dyrke en tidligere ukjent art mikro-organisme som er gitt navnet Streptomyces spheroides. Denne mikroor-ganisme som ble isolert fra en jordbunns-prøve fra en gammel gressbevokset beite-mark i Vermont er blitt betegnet Streptomyces spheroides MA-318 i kultursamlin-gen hos Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. En levedyktig kultur av denne mi-kroorganisme er deponert i Fermentation section, The Northern Utilization Research Bureau, United States Department of Agri-culture i Peoria, Illinois, og innlemmet i dette instituts permanente kultursamling som NRRL 2449.

Vandige medier som er egnet for dyrkning av stammer av Streptomyces spheroides under aerobe betingelser for fremstilling av novobiocin er sagt i sin alminnelighet de medier som er egnet for fremstilling av andre antibiotiske midler ved dyrkning av andre organismer av familien Streptomyces. Slike medier inneholder kilder for assimilerbart kullstoff, som kullhydrater, for assimilerbart nitrogen som kornstøp-væske, kaseinhydrolysat, «distiller's solubles», eller lignende samt anorganiske salter deriblant spormetaller som kreves for mi-kroorganismens riktige metabolisme. Fortrinsvis holdes mediet på en temperatur av

24—28° C i det tidsrom, i alminnelighet fra omkring ett til syv døgn, i hvilket mi-kroorganismen dyrkes og der sørges for

luftning for å oppnå optimal vekst av or-ganismen og dannelse av novobiocin. Dyrkede kulturvekster som er behandlet på denne måte har en aktivitet på omkring

150—2000 novobiocinenheter som de vil bli

definert i det følgende, pr. ml og de faste stoffer i den dyrkede kulturvæske har en aktivitet av størrelsesorden 2,25 novobiocinenheter pr. mg fast stoff. Det antibiotisk virksomme materiale kan renses og utvinnes i renere tilstand ved hvilken som helst av flere fremgangsmåter.

Således kan f. eks. den hele kulturvæske filtreres ved den pH-verdi den har ved oppsamlingen, i alminnelighet omkring 7,0—8,0. Filtratet kan så ekstraheres ved en pH-verdi innen det sure området, altså under omkring 7,0 med et i det vesentlige nøytralt, bare svakt po-lært, med vann ikke blandbart flytende organisk oppløsningsmiddel som er oppløselig i kold konsentrert svovelsyre og i kold sirupsaktig ortofosforsyre. Det erholdte ekstrakt i det organiske oppløsnings-middel kan derpå ekstraheres med en vandig alkalisk pufferoppløsning ved en pH-verdi på minst 8,5, hvorved man får en opp-løsning inneholdende novobiocinsalt i en vesentlig konsentrasjon. De to ekstrak-sjonstrinn kan gjentas i følgerekke hvorved man får en ennu mer konsentrert oppløs-ning fra hvilken novobiocinaktivt materiale kan utvinnes ved felning med syre. Det således erholdte produkt kan renses ved omkrystallisasjon fra en vandig sur alko-holoppløsning.

Foruten Streptomyces spheroides NRRL 2449 kan andre novobiocinproduserende stammer av Streptomyces spheroides brukes for fremstilling av novobiocin, f. eks. mutanter av den beskrevne organisme. Slike mutanter kan være erholdt ved na-turlig utvalg, eller fremstillet ved hjelp av et mutasjonsmiddel, f. eks. ved bestråling med røntgenstråler, bestråling med ultrafiolette stråler, ved hjelp av nitrogensen-nepper og lign.

Det nye antibiotiske middel novobiocin inneholder elementene kullstoff, hydrogen, nitrogen og oxygen forbundet til et stoff med den tilnærmede formel CsiNsiiNaOn ifølge de data man nu har for hånden. Novobiocinet reagerer som en sur organisk forbindelse med alkaliske reagenser og er lett oppløselig i sådanne, som f. eks. vandige oppløsninger av alkalimetallhydroksy-det, -karbonater og -bikarbonater. Det har to basebindende grupper og kan utfelles fra sine oppløsninger i alkali ved å surgjøre disse. Novobiocinet er oppløselig i de lavere alkanoler, i lavere alifatiske ketoner, eddiksyre, etylacetat, og dioksan. Det er uoppløselig eller bare lite oppløselig i eter, benzen, kloroform, kullstofftetraklorid, etylendiklorid, vann og saltsyre.

I det vesentlige rent novobiocin er erholdt i to krystallinske modifikasjoner, nemlig en modifikasjon som krystalliserer i form av rosetter og smelter ved omkring 152—154° c, og en annen modifikasjon med utseende som flate nåler og som smelter ved omkring 170—172° C. Hver av disse krystallinske modifikasjoner av novobiocin kan overføres til en såkalt normalisert form som kan være amorf eller submikrokrystal-linsk, ved å oppløse krystallene i aceton, raskt tilsette den erholdte oppløsning et relativt stort volum petroleter og oppsamle det herved utfelte normaliserte materiale ved filtrering.

Vandige alkaliske oppløsninger og suspensjoner i mineraloljer av den normaliserte form av novobiocin viser karak-teristiske absorpsjonsspektra, den først-nevnte i emisjonsspektrets ultrafiolette områder og den sistnevnte i dettes infra-røde område. En oppløsning i det vesentlige rent novobiocin i 0,1 n vandig natrium-hydroksydoppløsning viser en karakteristisk absorpsjonstopp i det ultrafiolette område ved 3070 Å. Denne absorpsjonstopp er indikasjon på et i det vesentlige rent materiale med en spesifikk absorbsjonsevne på 600 målt ved den nevnte bølgelengde under anvendelse av en oppløsning inneholdende 1 g rent novobiocin pr. 100 ml oppløsning i en celle med absorbsjonsbane på 1 cm. En oppløsning av rent novobiocin i en 0,1 n oppløsning av saltsyre i vandig metanol viser en karakteristisk absorb-sjonstopp i det ultrafiolette område ved 1 pst. 3240 Å med E ^ cm 390. En suspensjon av i det vesentlige rent normalisert novobiocin i mineralolje viser karakteriske absorb-sjonstopper i det infrarøde område ved følgende bølgelengder uttrykt i mikroner, 5,8—6,0 (bredt), 6,10, 6,21, 6,30, 6,49, 6,63, 7,4—7,6 (bred avtrapning), 7,78, 7,96, 8,27 (svakt), 8,60 (avtrapning) 8,7 (avtrapning), 9,13, 9,40, 10,0—10,1 (bredt), 10,28, 10,60 (bredt) 12,0—12,30 (bredt), 12,60—12,75 (bredt) 13,07 og 13,39.

Novobiocinenhetene står i et visst forhold til den mikrobiologiske aktivitet av vesentlig rent krystallinsk novobiocin, idet den mikrobiologiske aktivitet av i det vesentlige rent krystallinsk novobiocin vil-kårlig er satt til 5,000 enheter pr. mg, be-stemt ved standard «cup-plate»-dif fu-sjonsmetoder under anvendelse av Bacil-lus subtilis ATTC 12,432, som prøveorga-nisme.

I korthet sagt dyrkes i denne metode en kultur av B. subtilis ATTC 12,432 på hjerne- og hjerteinfusjonsagarplater (Difco Manual, 9. utgave, sider 90, 91) i 24 timer ved 37° C og oppbevares derpå ved 5° C i tidsrom på ikke lengere enn en måned. For fremstilling av sporer dannes der et pod-ningsmedium ved å tilsette 5 ml sterilt destillert vann til en nylig dyrket plate av B. subtilis. Cellene skrapes under aseptiske betingelser fra platen, blandes godt og overføres til 50 ml sterilt destillert vann i en Erlenmeyer kolbe. 2 ml tilsettes som pod-ningsmedium i en Rouxkolbe inneholdende et medium bestående av 3 pst. soyabønne-mel, 0,2 pst. natriumklorid, 0,4 pst. «distil-lers' solubles», 0,8 pst. dekstrose og 2,0 pst. agar. Etter inkubasjon i 7 døgn ved 37° C suspenderes den erholdte bakteriekultur i 50 ml sterilt destillert vann og pasteurise-res ved 65° C i 30 minutter. 4 ml av denne sporesuspensjon i fortynning på 1 : 50 brukes pr. liter av et undersøkelsesmedium inneholdende 0,5 pst. pepton, 0,3 pst. kjøtt-ekstrakt, 0,3 pst. gjærekstrakt og 1,5 pst. agar samt med en pH-verdi på 5,9—6,1. Porsjoner på 15 ml av det podede medium fordeles i dype Petriskåler med flat bunn.

Seks sylindre av rustfritt stål anbringes på den podede agar. Hver annen sylinder, altså i det hele tre, fylles med en stan-dardoppløsning av novobiocin inneholdende 4 mikrogram novobiocin pr. ml. (Ekviva-lent med 20 novobiocinenheter pr. ml), og 3 sylindre fylles med den ukjente oppløs-ning som er fortynnet til omtrent det samme potensial med M/20 fosfatpufferoppløs-ning hvis pH-verdi er 6,0. En standard-kurve for hver dag fremstilles med rent novobiocin som er fortynnet til forskjellige konsentrasjoner varierende fra 2 til 16 mikrogram pr. ml.

Etter 18 timers inkubasjon ved 28° C måles diametrene av hemningssonene for den ukjente oppløsning og standardoppløs-ningen på hver plate. Den ukjente oppløs-nings potensial bestemmes fra en nomograf som er basert på graden av reaksjonen ved forskjellige konsentrasjoner, fastsatt fra standardkurven for hvert døgn.

Novobiocin er optisk aktivt a „

27° C-l i ln NaOH-oppløsning) og 2,5 = 44° (C = 1 i pyridin).

Novobiocin er aktivt særlig med hensyn til å forhindre vekst av gram-positive mikroorganismer, men viser også noen aktivitet mot gram-negative organismer. Det for-hindrer vekst av blandt andre følgende organismer:

M. pyogenes var. albus

M. pyogenes var. aureus

Diplococcus pneumoniae Corynebacterium ophtheriae type

gravis

Corynebacterium diphteriae type in-termedius

Corynebacterium diphteriae type mitis Corynebacterium xerose, Corynebacterium renale

Neisseria menintidis

Sarcina lutea (VD)

M. pyogenes var. aureus, resistent mot aureomycin M. pyogenes var. aureus, resistent mot streptomycin-streptothricin. M. pyogenes var. aureus, resistent mot penicillin

Novobiocinsalter har også antibiotisk aktivitet. Således ble f. eks. natriumsaltet av novobiocin ved undersøkelse ved hjelp av agarstripe-fortynningsprøve funnet å forhindre vekst av forskjellige stammer av M pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria menigitidis (nr. 274), og Sarcina lutea (VD) ved konsentrasjoner under 0,5 mikro gr. pr. ml. Også andre mikroorganismer påvirkes i varirende grad av novobiocin eller dets salter.

Det ble nu funnet at når man lar novobiocin eller et salt av novobiocin reagere med hydrogen i nærvær av en passende hydreringskatalysator som definert i det følgende, reagerer hydrogenet i mengdeforholdet 1 mol pr. mol novobiocin eller novobiocinsalt slik at der dannes et dihydro-derivat av novobiocin med i det vesentlige kvantitativt utbytte. Dette derivat er en ny syntetisk kjemisk helhet. Det erholdte produkt er dihydronovobiocin, eller et salt av denne forbindelse, avhengig av det anvendte utgangsmateriale og av de betingelser under hvilke reaksjonen utføres. Dihydronovobiocin er omtrent like aktivt i antibiotisk henseende som selve novobiocinet, idet det i det vesentlige ren tilstand har en aktivitet på omkring 5000 novobiocinenheter pr. mg. Dihydronovobiocinet er like godt egnet for klinisk anvendelse som novobiocinet.

Ved utførelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppløses novobiocin eller et novobiocinsalt i et passende oppløs-ningsmiddel som en lavere alkanol, en lavere alkansyre eller en vandig alkalisk opp-løsning i hvilken der er suspendert en passende hydreringskatalysator som definert i det følgende. Blandingen bringes så i hydrogenatmosfære ved atmosfæretrykk eller høyere trykk og rystes eller omrøres i et tidsrom som er tilstrekkelig til at omkring 1 mol hydrogen absorberes pr. mol novobiocin eller novobiocinsalt.

Blant de hydreringskatalysatorer som er egnet for anvendelse i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kataly-satormasser av edelmetallene platina, pal-ladium, rutenium og rodium, oksyder av disse edelmetaller og hydreringskatalysatorer og metallmasser bestående av findelt nikkel eller kobolt, som Raney-nikkel eller Raney-kobolt. Katalysatorene kan brukes med eller uten bærer og med eller uten promotor. I alminnelighet går hydreringsreaksjonen raskere med platina enn med de nevnte andre edelmetallkatalysa-torer eller oksyder av disse metaller ved anvendelse av samme katalysatormengder. Videre kan akseptable reaksjonshastigheter oppnås ved lavere trykk og temperaturer ved anvendelse av katalysatorer bestående av eller inneholde edelmetaller eller oksyder av disse metaller enn ved anvendelse av katalysatorer på metallbasis som Raney-nikkel eller Raney-kobolt.

Ved anvendelse av edelmetaller eller edle metallers oksyder som hydreringskatalysator foregår reaksjonen med tilfredsstillende hastighet med vanlig romtemperatur og ved lave trykk, dvs. trykk som ikke er vesentlig høyere enn atmosfæretrykk. Med andre hydreringskatalysatorer som Raney nikkel, Raney kobolt og lignende, kan der med fordel brukes noe høyere temperaturer f. eks. omkring 100° C eller høy-ere, men ikke over omkring 150° C, og noe høyere trykk, f. eks. fra omkring 70 til 154 kg/cm<2>. Den tid som kreves for å fullføre reaksjonen kan forkortes ved å utføre den ved økede trykk. Reaksjonen foregår tilfredsstillende ved vanlig romtemperatur, men der kan om ønskes brukes høyere temperaturer som imidlertid ikke bør over-stige omkring 150° C. I alminnelighet er den anvendte katalysator ikke kritisk for reaksjonens forløp men reduksjonshastig-heten økes eller minskes med økning henholdsvis minskning av katalysatormengden.

Det er mulig å bruke urene konsentra-ter av novobiocin eller novobiocinsalter som utgangsmaterialer, men det foretrek-kes å bruke i det vesentlige rene utgangsmaterialer, når sådanne er tilgjengelige. Alkalimetallsalter av novobiocin som mononatriumsaltet er tilfredsstillende for anvendelse som utgangsmaterialer i fremgangsmåten.

Det oppløsningsmiddel som brukes som reaksjonsmedium i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et hvilket som helst flytende medium som er i stand til å oppløse novobiocin eller det novobiocinsalt som brukes som utgangsmateriale og som ikke griper inn i novobiocinets hydrering. Blant de oppløsningsmidler som kan brukes og som er funnet å være tilfredsstillende er alkaliske vandige oppløs-ninger som vandige natriumhydroksydopp-løsninger eller vandige kaliumhydroksyd-oppløsninger, samt lavere alkanoler, som metanol eller etanol og lavere alkansyrer, som iseddik.

Efter fullførelse av reduksjonen, dvs. efter at en ekvimolekylær mengde hydrogen og novobiocin eller novobiocinsalt har reagert med hverandre fjernes katalysatoren fra reaksjonsblandingen ved filtrering og reaksjonsproduktet bestående av dihydronovobiocin isoleres, fortrinsvis ved å fordampe oppløsningsmidlet fra filtratet i vakuum. Dihydronovobiocinet i form av en fri syre kan fåes ved hydrering av novobiocin eller den kan fremstilles fra saltene ved å la en oppløsning av vedkommende salt reagere med en syre som en av de vanlige mineralsyrer, f. eks. svovelsyre. Dihydronovobiocinet skiller seg ut fra opp-løsningen, mens saltet av den syre som brukes forblir i oppløsningen og den først-nevnte kan skilles fra den sistnevnte ved filtrering.

Likeledes kan salter av dihydronovobiocin fåes som sådanne ved å bruke et novobiocinsalt som utgangsmateriale for hydreringsreaksjonen, og/eller ved å utføre hydreringen i et passende basisk vandig medium. Alternativt kan dihydronovobiocin i form av den fri syre ved enkel dobbelt omsetning med passende baser overføres til sine enbasiske eller tobasiske salter. På denne måte kan man få alkalimetallsalter av dihydronovobiocin som f. eks. natriumsaltet og kaliumsaltet, jordalkalimetallsal-ter som kalsiumsalter og kvartære nitro-genholdige basiske salter som ammonium-salter og salter med organiske aminer. Eksempler på organiske aminer som dan-ner salter med dihydronovobiocin er kinin, prokain, guanidin, noformicin, N-benzyl-(3-fenyletylamin, N,N-dibenzyletylendiamin, cykloheksylamin, N-etylpiperidin, trietyl-amin, dicykloheksylamin, arginin, histidin og lysin.

Dihydronovobiocinsalter kan om ønskes renses ved omkrystallisasjon efter konven-sjonelle metoder. Således kan de f. eks. oppløses i den minst mulige mengde av en lavere alkanol som metanol eller etanol og oppløsningen delvis inndampes hvorved det rensede krystallinske materiale skiller seg ut. Det kan også tilsettes et oppløsnings-middel som aceton til den alkoholiske opp-løsning inntil denne begynner å bli uklar, hvorpå det utskilte rensede, krystallinske produkt kan utvinnes efter henstand.

Som nevnt i det foregående synes novobiocin å ha formelen CsiH;m;N:>Oii ifølge de nu foreliggende data. Det følger herav at dihydronovobiocin som har to hydrogen-atomer mere pr. molekyl enn novobiocin forsøksvis kan gis formelen ChiHmsN^Oh. Den nøyaktige natur og kjemiske struktur av novobiocinets og dihydronovobiocinets molekyler er ikke hittil helt ut klargjort, men det antas på grunnlag av kjemiske eksperimentelle studier at novobiocinmole-kyler inneholder en benzenring med en di-metylallyl sidekjede som har formelen: -CH2. CH : C(CHa)-. Denne sidekjede over-føres som et resultat av den hydrerings-reaksjon som brukes ved fremstilling av dihydronovobiocin til en dimetylpropyl-sidekjede, med formelen -CH2 . CH2 . CH(CH3)2, som substituenten i dihydronovobiocinets benzenring.

Den kjensgjernnig at hydrogen reagerer med novobiocin i nærvær av en passende hydreringskatalysator så at der dannes en ny kjemisk enhet og den kjensgjerning at denne reaksjon foregår mellom ekvimolekylære mengdeforhold av hydrogen og novobiocin kan fastslåes ved å utføre reaksjonen under anvendelse av hydrogen-iso-topen deuterium i stedet for vanlig hydrogen og bestemme reaksjonsproduktets deu-teriuminnhold ved analyse. Dette kan ut-føres som følger: Omkring 515 mg novobiocin og 71 ml natriumhydroksydoppløsning tilsettes til en blanding av 50 mg platinaoksyd og 10 ml deuteriumoksyd i deuteriumatmosfære i et passende hydreringsapparat. Blandingen omrøres under et deuteriumtrykk som er ganske lite høyere enn atmosfæretrykk i et tidsrom på omkring to timer. Der tilsettes omkring 35 mg ytterligere natriumhydr-oksyd for å sikre fullstendig oppløsning av novobiocinet og dessuten 50 mg platinaoksyd. For å senke oppløsningens hydrogen-ionekonsentrasjon og derved forsinke hy-drolysen tilsettes omkring 0,5 ml etylacetat hvorpå omrøringen av blandingen under deuteriumatmosfæren fortsettes i et ytterligere tidsrom på omkring 9 timer. Blandingen filtreres derpå for å fjerne katalysatoren og filtratet sur gjøres ved tilsetning av saltsyre hvorved der utfelles deuterium-isologen av dihydronovobiocin. Dette stoff oppsamles, vaskes med vann og tørres. Ved analyse finnes det at dette produkt inneholder 5,0 vekt pst. deuterium (beregnet verdi 5,6 pst.).

Nærværet av deuterium i produktet viser at det er en ny kjemisk forbindelse som er forskjellig fra novobiocinutgangsmate-rialet og fastslår at addisjon av hydrogen finner sted når novobiocin underkastes hydrering i nærvær av en hydreringskatalysator som definert i det foregående. Det mengdeforhold i hvilket deuterium deltar i reaksjonen og er tilstede i reaksjonsproduktet fastslår at reaksjonskomponentene reagerer i ekvimolekylære mengdeforhold. Biologisk undersøkelse av denne deuterium-isolog av dihydronovobiocin viser at denne forbindelse har i det vesentlige samme grad av antimikrobiologisk aktivitet som novobiocin og dihydronovobiocin og at den er aktiv innen i det vesentlige samme bakteriespekteret som novobiocin og dihydronovobiocin .

De to grupper antibiotiske stoffer novobiocin og dets salter på den annen side kan neppe skilles fra hverandre ved vanlig kjemiske analyse, heller ikke kan de lett skilles fra hverandre ved vanlig fysikalske målinger som absorbsjon i emisjonsspektrets infrarøde eller ultrafiolette områder, men medlemmene av de to grupper kan lett skilles fra hverandre ved papirkromato-grafi og ved den måte de forholder seg på overfor visse kjemiske reagenser, særlig perjod-syre.

I den førstnevnte adskillelsesmetode anvendes hensiktsmessig den fremgangsmåte som er kjent som reversfasepapirkro-matografi og hvor kaprylalkohol utgjør den stasjonære fase og en vandig oppløsning utgjør den bevegelige fase.

Et ark filterpapir (Whatman nr. 1) behandles slik at vannet fjernes fra papiret. Behandlingen består i å tørre papiret ved

110° C under høyt vakuum (1 mm Hg) natten over. Papiret behandles derpå for å forhindre at det påny absorberer vann.

Denne behandling består i at papiret dyppes i en blanding av en silikonvæske (som Dow Corning 200 Fluid) med en viskositet på 12 500 og etyleter i mengdeforholdet 5 g silikonvæske til 100 ml etyleter og derpå

tørre papiret i luften i 10 minutter. Papiret

kan i denne tilstand oppbevares i en eksi-kator inntil det skal . brukes. Ved papirets anvendelse påføres flekker av novobiocin-og dihydronovobiocin forbindelsene nær papirstrimlens ene ende, hvorpå papiret dyppes i en blanding av kaprylalkohol og metanol i mengdeforhold 1 volumdel kaprylalkohol til 5 volumdeler metanol. Etter dypningen legges papiret mot filtrer-papir for å fjerne overskudd av væske, og henges deretter opp i en lukket sylinder med den ende hvor forbindelsene ble påført øverst. Denne ende av papirstrimlen dykkes ned i en vandig oppløsning av natriumfosfat (0,1 M) ved en pH-verdi på 8,4. En ytterligere mengde av den samme oppløsning etterlates med frittliggende overflate ved den lukkede sylinderbunn så at enhver til-bøyelighet hos oppløsningen til å fordampe fra papirstrimlen når den beveger seg nedover denne blir minst mulig.

Når den bevegelige (vandige) fase beveger seg nedover papirstrimlen går novobiocinet raskere enn dihydronovobiocinet. I løpet av 6 timer beveger oppløsningsmid-delfronten seg omkring 18 cm og gir en tilfredsstillende adskillelse av de to forbin-deiser. De to flekkers adskilte stillinger er synlige på papiret når det betraktes i ultrafiolette stråler. I et forsøk som varte natten over (omkring 17 timer) beveget oppløsningsmiddelfronten seg omkring 45 cm, og der var tilsvarende større adskillelse mellom de to flekkers stillinger.

Uttrykket kvantitativt beveger novobiocin seg med en Rf på 0,30. Når man set-ter novobiocinets bevegelighet lik 1,0 har dihydronovobiocin en bevegelighet på 0,68.

I den annen metode til å skille novobiocin og dets salter på den annen side, altså ved reaksjon med perjodsyre forbrukes pr. mol et molekyl mere av dette reagens av novobiocin sammenlignet med den mengde av dette reagens som forbrukes ved reaksjon av samme molekylære dihydronovobiocin. Dette kan lett vises som følger: Oppløsninger av kjente mengder av novobiocin og dihydronovobiocin i dioksan behandles med et kjent overskudd av per jodsyre i vann. Man lar oppløsningen stå natten over. Overskuddet av perjodsyre i hver tilfelle bestemmes ved filtrering med standard natriumarsenitoppløsning. For-skjellen mellom den herved funne over-skuddsmengde og den mengde perjodsyre som var tilstede ved forsøkenes begynnelse viser i hvert av tilfellene den mengde perjodsyre som er forbrukt av hver av forbindelsene. Det finnes da at novobiocin for-bruker omkring 1 mol perjodsyre mere enn dihydronovobiocin for hvert mol av disse antibiotiske midler.

Novobiocin og dets salter på den ene side og dihydronovobiocin og dets salter på den annen side er også forskjellige med hensyn til aktivitet mot visse mikroorganismer. Dette vil fremgå fra de sammen-lignende data som er oppført i nedenstå-ende tabell 1, og som er funnet ved in vitro-forsøk utført ved standardseriefortynning-operas joner:

Det vil av denne tabell sees at dihydronovobiocin minst er like aktivt og i de fleste tilfelle mere aktivt enn novobiocin mot for-søks-mikroorganismen, særlig mot viktige sykdomsvekkende typer, samt viser en mere enn to ganger bedre aktivitet enn novobiocin mot to av disse mikroorganismer, nemlig C. pseudotuberculosis 545 og C. pseudo-diphterificum 259.

Det er også funnet at dihydronovobiocin i sammenligning med novobiocin er be-merkelsesverdig mere aktivt in vivo mot infeksjoner med Proteus sp. Micrococcus pyogenes var. aureus Smith, Streptococcus.

pyogenes og Diplococcus pneumoniae som er erythromycinresistent således som det

fremgår av de data som er oppført i neden-stående tabell.

Uttrykket dihydronovobiocinsalt som det her brukes betegner salter i hvilke anionen er anionen av dihydronovobiocin i form av fri syre forbundet med en eller høyst to kationer av gruppen bestående av alkalimetallkationene, de ikke giftige jord-alkalimetallkationer, ammoniumkationer og kationene av kvaternære nitrogenhol-dige organiske baser og miner.

I det følgende beskrives som eksempler noen utførelsesformer for oppfinnelsen.

Eksempel 1:

I et passende hydreringsapparat om-røres i hydrogenatmosfære en oppløsning av omkring 15,8 mg novobiocin i 25 ml metanol med 50 mg platinaoksyd-katalysator. - Hydreringskaret inneholdende blandingen rystes kontinuerlig i et tidsrom på 3 timer under hvilket der opprettholdes et hydrogentrykk på omkring 2,8 kg/cm<2> og en temperatur på omkring 25° C i blandingen i karet. Opptagelsen av hydrogen måles og når en ekvimolekylær mengde hydrogen beregnet på novobiocinet er absorbert, åpnes apparatet og blandingen i karet filtreres for å fjerne katalysatoren. Filtratet inndampes derpå til tørrhet i vakuum. Når residuet underkastes mikrobiologisk under-søkelse finner man at det har en aktivitet som er i det vesentlige lik novobiocin-utgangsmaterialets aktivitet. Dette produkt er det nye syntetiske, antibiotiske middel dihydronovobiocin og det har de egenskaper og den antibiotiske aktivitet som er angitt i det foregående.

Eksempel 2:

En oppløsning av omkring 28,4 mg novobiocin i 10 ml renset iseddik anbringes i et kar passende for hydrering og omrøres i dette med 27,5 mg platinaoksydkatalysa-tor i hydrogenatmosfære ved et trykk som er ganske lite høyere enn atmosfæretrykk og ved en temperatur på omkring 25° C, i et tidsrom på omkring 3 timer. Ved måling av hydrogenopptagelsen observeres det at en i det vesentlige ekvimolekylær mengde hydrogen i forhold til novebiocinutgangs-materialet absorberes. Katalysatoren fjernes og oppløsningen inndampes til tørrhet i vakuum.

Ved undersøkelse av en oppløsning av residuet i metanol observeres maksima ved bølgelengder på 2450 Å og 3250 Å. Ved sur-gj øring av metanoloppløsningen til en pH-verdi på omkring 2,0 observeres det en topp ved 3250 Å, og i en basisk metanoloppløs-ning med en pH-verdi på omkring 10,0— 11,0 observeres maksima ved 3050—3100 A. Produktet er dihydronovobiocin som beskrevet i det foregående.

Eksempel 3:

Omkring 25,0 mg platinaoksyd suspenderes i 20 ml metanol og reduseres med hydrogen i et passende hydreringsapparat. En oppløsning av omkring 66,0 mg novobiocin i 4 ml metanol tilsettes til suspen-sjonen av platinakatalysatoren i metanol og blandingen omrøres i omkring 44 minutter i hydrogenatmosfære med et trykk som er ganske lite høyere enn atmosfæretrykk og ved en temperatur på omkring 25° C. Opptagelsen av hydrogen måles om-hyggelig og man finner at den er ekviva-lent med en mol hydrogen pr. mol novo-biocinutgangsmateriale. Etter fraskillelse av katalysatoren inndampes oppløsningen i vakuum, hvorved man får dihydronovobiocin som et blekgult pulver. Dette produkt har den mikrobiologiske aktivitet som er beskrevet i det foregående.

Eksempel 4:

En oppløsning av omkring 15,0 g av mononatriumsaltet av novobiocin i 400 ml metanol anbringes i et passende hydrer-ingskar og oppløsningen tilsettes 100 mg platinaoksyd. Blandingen rystes i et tids-

rom på omkring 50 minutter i hydrogenatmosfære og ved en temperatur på om-

kring 25° C. Karet åpnes derpå, blandin-

gen tas ut og katalysatoren fraskilles ved filtrering. Filtratet inndampes til tørrhet i vakuum. Det erholdte produkt er mononatriumsaltet av dihydronovobiocin og dets aktivitet er i det vesentlige den samme som aktiviteten av det dihydronovobiocinpro-

dukt man får ved å gå frem som angitt i foregående eksempel.

Eksempel 5:

En oppløsning av omkring 1,12 g novo-

biocin i 20 ml metanol omrøres med 25 mg platinaoksyd i hydrogenatmosfære ved en temperatur på 25° C og i et tidsrom på omkring 36 minutter. Opptagelsen av hy-

drogen observeres og det finnes at den er et mol hydrogen pr. mol anvendt novobiocin-utgangsmateriale. Blandingen filtreres for å fjerne katalysatoren og filtratet inndampes til tørrhet. Residuet som består av dihydronovobiocin oppløses i den minst mulige mengde aceton og den erholdte oppløsning tilsettes petroleter (kokepunkt 30—60° C) hvorved dihydronovobiocin ut-

felles fra oppløsningen som et bunnfall som oppsamles vaskes med petroleter og tørres.

Dette produkt er optisk aktivt: ™

= — 27° (C = 1,68 i 2,5 N NaOH-oppløs-

ning).

Ved titreringskurver finnes det at dette produkt som novobiocin har to basebin-

dende grupper. Absorbsjonsspektret i det infrarøde område for dette syntetiske anti-

biotiske middel ligner likeledes de tilsva-

rende data man får ved undersøkelse av novobiocin.

Eksempel 6:

Omkring 12,5 g (0,019 mol) av mononatriumsaltet av novobiocin oppløses i 200

ml metanol, hvorved man får en uklar opp-

løsning. Denne oppløsning omrøres med omkring 3 g Raney nikkel i 5 minutter. Oppløsningen filtreres derpå, vaskes med 50 ml metanol, vaskevannet blandes med filtratet og den resulterende klare oppløs-

ning underkastes hydrering i nærvær av en platinakatalysator inntil absorbsjonen av hydrogen opphører. Man finner at 0,019

mol hydrogen er obsorbert. Katalysatoren fjernes ved filtrering, filtratet inndampes til tørrhet i vakuum og residuet oppløses i omkring 15 ml etanol. Den erholdte opp-løsning tilsettes aceton til begynnende uklarhet, hvorpå man lar oppløsningen stå natten over ved vanlig romtemperatur. Det krystallinske bunnfall av mononatriumsal-

tet av dihydronovobiocin som herved dan-

nes fjernes ved filtrering, vaskes med ace-

ton og tørres. Det har de i det foregående angitte egenskaper hos dihydronovobiocin-

ets mononatriumsalt.

Eksempel 7:

En vandig oppløsning av dihydronovobiocinets mononatriumsalt blandes med et ganske lite molært overskudd av prokain-hydroklorid oppløst i vann. Det i vann uoppløselige prokainsalt av dihydronovo-

biocin som herved utfelles frafiltreres, vas-

kes med vann og tørres.

Eksempel 8:

En oppløsning av 2,0 novobiocin i 50

ml metanol tilsettes omkring en halv teskje Raney nikkel-hydrerings-katalysator (ek-vivalent med omkring 3 til 4 g, beregnet på tørrstoff). Blandingen rystes i et tidsrom på to timer i en hydreringsbombe ved et hydrogentrykk på 154 kg/cm<2> og ved 100° C. Bomben avkjøles derpå og hydrogen-trykket avlastes. Metanoloppløsningen filtreres for å fjerne katalysatoren og filtratet inndampes i vakuum hvorved man får 1,8 g dihydronovobiocin som et fast residum.

Dette materialet har dihydronovobiocinets egenskaper som angitt i det foregående.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt syntetisk antibiotisk middel, karakterisert ved at man lar novobiocin eller et salt av novobiocin reagere med hydrogen i molforholdet 1:1 og i nærvær av en hydreringskatalysator, hvorved man utvinner det herved erholdte dihydronovobiocin henholdsvis dihydronovobiocin-salt fra reak-sj onsblandingen.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at man lar novobiocin eller mononatriumsaltet av novobiocin opp-løst i en lavere alkanol, fortrinsvis meta-noi, reagere med hydrogen ved i det vesentlige vanlig romtemperatur og ved et trykk som ganske lite overstiger vanlig at mosfæretrykk, i nærvær av en edelmetall-hydreringskatalysator.