NO123377B

NO123377B -

Info

Publication number: NO123377B
Application number: NO2142/68A
Authority: NO
Inventors: S Arvidson
Original assignee: Furnes Jernstoeperi A S
Priority date: 1968-05-31
Filing date: 1968-05-31
Publication date: 1971-11-01
Also published as: DK122827B; SE346349B

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk middel. Process for the production of a new antibiotic agent.

Foreliggende oppfinnelse angår en The present invention relates to a

fremgangsmåte til fremstilling av et nytt antibiotisk middel, nemlig dihydroderivatet av novobiocin og av salter av denne forbindelse ved katalytisk hydrering av novobiocin henholdsvis av salter av novobiocin. method for the production of a new antibiotic agent, namely the dihydro derivative of novobiocin and of salts of this compound by catalytic hydrogenation of novobiocin and of salts of novobiocin respectively.

Novobiocin (det generelle navn for et Novobiocin (the generic name for a

antibiotisk middel, produsenten bruker be-tegnelsen «Cathomycin» for en kvalitet av dette produkt) fremstilles ved under regu-lerte betingelser å dyrke en tidligere ukjent art mikro-organisme som er gitt navnet Streptomyces spheroides. Denne mikroor-ganisme som ble isolert fra en jordbunns-prøve fra en gammel gressbevokset beite-mark i Vermont er blitt betegnet Streptomyces spheroides MA-318 i kultursamlin-gen hos Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. En levedyktig kultur av denne mi-kroorganisme er deponert i Fermentation section, The Northern Utilization Research Bureau, United States Department of Agri-culture i Peoria, Illinois, og innlemmet i dette instituts permanente kultursamling som NRRL 2449. antibiotic agent, the manufacturer uses the name "Cathomycin" for a quality of this product) is produced by cultivating under regulated conditions a previously unknown species of micro-organism which has been given the name Streptomyces spheroides. This microorganism, which was isolated from a soil sample from an old grassy pasture in Vermont, has been designated Streptomyces spheroides MA-318 in culture stock at Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. A viable culture of this microorganism is deposited in the Fermentation section, The Northern Utilization Research Bureau, United States Department of Agri-culture at Peoria, Illinois, and incorporated into this institute's permanent culture collection as NRRL 2449.

Vandige medier som er egnet for dyrkning av stammer av Streptomyces spheroides under aerobe betingelser for fremstilling av novobiocin er sagt i sin alminnelighet de medier som er egnet for fremstilling av andre antibiotiske midler ved dyrkning av andre organismer av familien Streptomyces. Slike medier inneholder kilder for assimilerbart kullstoff, som kullhydrater, for assimilerbart nitrogen som kornstøp-væske, kaseinhydrolysat, «distiller's solubles», eller lignende samt anorganiske salter deriblant spormetaller som kreves for mi-kroorganismens riktige metabolisme. Fortrinsvis holdes mediet på en temperatur av Aqueous media which are suitable for the cultivation of strains of Streptomyces spheroides under aerobic conditions for the production of novobiocin are, in general terms, the media which are suitable for the production of other antibiotic agents when cultivating other organisms of the Streptomyces family. Such media contain sources for assimilable carbon, such as carbohydrates, for assimilable nitrogen such as grain liquid, casein hydrolyzate, "distiller's solubles", or the like, as well as inorganic salts, including trace metals, which are required for the micro-organism's correct metabolism. Preferably, the medium is kept at a temperature of

24—28° C i det tidsrom, i alminnelighet fra omkring ett til syv døgn, i hvilket mi-kroorganismen dyrkes og der sørges for 24-28° C during the period of time, generally from around one to seven days, during which the micro-organism is cultivated and provision is made for

luftning for å oppnå optimal vekst av or-ganismen og dannelse av novobiocin. Dyrkede kulturvekster som er behandlet på denne måte har en aktivitet på omkring aeration to achieve optimal growth of the organism and formation of novobiocin. Cultivated crops that have been treated in this way have an activity of about

150—2000 novobiocinenheter som de vil bli 150—2000 novobiocin units as they will be

definert i det følgende, pr. ml og de faste stoffer i den dyrkede kulturvæske har en aktivitet av størrelsesorden 2,25 novobiocinenheter pr. mg fast stoff. Det antibiotisk virksomme materiale kan renses og utvinnes i renere tilstand ved hvilken som helst av flere fremgangsmåter. defined in the following, per ml and the solids in the cultivated culture liquid have an activity of the order of 2.25 novobiocin units per mg solid. The antibiotically active material can be purified and recovered in a purer state by any of several methods.

Således kan f. eks. den hele kulturvæske filtreres ved den pH-verdi den har ved oppsamlingen, i alminnelighet omkring 7,0—8,0. Filtratet kan så ekstraheres ved en pH-verdi innen det sure området, altså under omkring 7,0 med et i det vesentlige nøytralt, bare svakt po-lært, med vann ikke blandbart flytende organisk oppløsningsmiddel som er oppløselig i kold konsentrert svovelsyre og i kold sirupsaktig ortofosforsyre. Det erholdte ekstrakt i det organiske oppløsnings-middel kan derpå ekstraheres med en vandig alkalisk pufferoppløsning ved en pH-verdi på minst 8,5, hvorved man får en opp-løsning inneholdende novobiocinsalt i en vesentlig konsentrasjon. De to ekstrak-sjonstrinn kan gjentas i følgerekke hvorved man får en ennu mer konsentrert oppløs-ning fra hvilken novobiocinaktivt materiale kan utvinnes ved felning med syre. Det således erholdte produkt kan renses ved omkrystallisasjon fra en vandig sur alko-holoppløsning. Thus, e.g. the entire culture liquid is filtered at the pH value it has at the time of collection, generally around 7.0-8.0. The filtrate can then be extracted at a pH value within the acidic range, i.e. below about 7.0 with an essentially neutral, only weakly polar, water-immiscible liquid organic solvent which is soluble in cold concentrated sulfuric acid and in cold syrupy orthophosphoric acid. The extract obtained in the organic solvent can then be extracted with an aqueous alkaline buffer solution at a pH value of at least 8.5, thereby obtaining a solution containing novobiocin salt in a significant concentration. The two extraction steps can be repeated in sequence, whereby an even more concentrated solution is obtained from which novobiocin active material can be recovered by precipitation with acid. The product thus obtained can be purified by recrystallization from an aqueous acidic alcoholic solution.

Foruten Streptomyces spheroides NRRL 2449 kan andre novobiocinproduserende stammer av Streptomyces spheroides brukes for fremstilling av novobiocin, f. eks. mutanter av den beskrevne organisme. Slike mutanter kan være erholdt ved na-turlig utvalg, eller fremstillet ved hjelp av et mutasjonsmiddel, f. eks. ved bestråling med røntgenstråler, bestråling med ultrafiolette stråler, ved hjelp av nitrogensen-nepper og lign. Besides Streptomyces spheroides NRRL 2449, other novobiocin-producing strains of Streptomyces spheroides can be used for the production of novobiocin, e.g. mutants of the described organism. Such mutants can be obtained by natural selection, or produced using a mutation agent, e.g. by irradiation with X-rays, irradiation with ultraviolet rays, using nitrogen mustard and the like.

Det nye antibiotiske middel novobiocin inneholder elementene kullstoff, hydrogen, nitrogen og oxygen forbundet til et stoff med den tilnærmede formel CsiNsiiNaOn ifølge de data man nu har for hånden. Novobiocinet reagerer som en sur organisk forbindelse med alkaliske reagenser og er lett oppløselig i sådanne, som f. eks. vandige oppløsninger av alkalimetallhydroksy-det, -karbonater og -bikarbonater. Det har to basebindende grupper og kan utfelles fra sine oppløsninger i alkali ved å surgjøre disse. Novobiocinet er oppløselig i de lavere alkanoler, i lavere alifatiske ketoner, eddiksyre, etylacetat, og dioksan. Det er uoppløselig eller bare lite oppløselig i eter, benzen, kloroform, kullstofftetraklorid, etylendiklorid, vann og saltsyre. The new antibiotic novobiocin contains the elements carbon, hydrogen, nitrogen and oxygen combined to form a substance with the approximate formula CsiNsiiNaOn according to the data now available. Novobiocin reacts as an acidic organic compound with alkaline reagents and is easily soluble in such, such as e.g. aqueous solutions of alkali metal hydroxides, carbonates and bicarbonates. It has two base-binding groups and can be precipitated from its solutions in alkali by acidifying these. Novobiocin is soluble in the lower alkanols, in lower aliphatic ketones, acetic acid, ethyl acetate, and dioxane. It is insoluble or only slightly soluble in ether, benzene, chloroform, carbon tetrachloride, ethylene dichloride, water and hydrochloric acid.

I det vesentlige rent novobiocin er erholdt i to krystallinske modifikasjoner, nemlig en modifikasjon som krystalliserer i form av rosetter og smelter ved omkring 152—154° c, og en annen modifikasjon med utseende som flate nåler og som smelter ved omkring 170—172° C. Hver av disse krystallinske modifikasjoner av novobiocin kan overføres til en såkalt normalisert form som kan være amorf eller submikrokrystal-linsk, ved å oppløse krystallene i aceton, raskt tilsette den erholdte oppløsning et relativt stort volum petroleter og oppsamle det herved utfelte normaliserte materiale ved filtrering. Substantially pure novobiocin is obtained in two crystalline modifications, namely a modification that crystallizes in the form of rosettes and melts at about 152-154°C, and another modification with the appearance of flat needles and that melts at about 170-172°C Each of these crystalline modifications of novobiocin can be transferred to a so-called normalized form, which can be amorphous or sub-microcrystalline, by dissolving the crystals in acetone, quickly adding a relatively large volume of petroleum ether to the resulting solution and collecting the thereby precipitated normalized material by filtration .

Vandige alkaliske oppløsninger og suspensjoner i mineraloljer av den normaliserte form av novobiocin viser karak-teristiske absorpsjonsspektra, den først-nevnte i emisjonsspektrets ultrafiolette områder og den sistnevnte i dettes infra-røde område. En oppløsning i det vesentlige rent novobiocin i 0,1 n vandig natrium-hydroksydoppløsning viser en karakteristisk absorpsjonstopp i det ultrafiolette område ved 3070 Å. Denne absorpsjonstopp er indikasjon på et i det vesentlige rent materiale med en spesifikk absorbsjonsevne på 600 målt ved den nevnte bølgelengde under anvendelse av en oppløsning inneholdende 1 g rent novobiocin pr. 100 ml oppløsning i en celle med absorbsjonsbane på 1 cm. En oppløsning av rent novobiocin i en 0,1 n oppløsning av saltsyre i vandig metanol viser en karakteristisk absorb-sjonstopp i det ultrafiolette område ved 1 pst. 3240 Å med E ^ cm 390. En suspensjon av i det vesentlige rent normalisert novobiocin i mineralolje viser karakteriske absorb-sjonstopper i det infrarøde område ved følgende bølgelengder uttrykt i mikroner, 5,8—6,0 (bredt), 6,10, 6,21, 6,30, 6,49, 6,63, 7,4—7,6 (bred avtrapning), 7,78, 7,96, 8,27 (svakt), 8,60 (avtrapning) 8,7 (avtrapning), 9,13, 9,40, 10,0—10,1 (bredt), 10,28, 10,60 (bredt) 12,0—12,30 (bredt), 12,60—12,75 (bredt) 13,07 og 13,39. Aqueous alkaline solutions and suspensions in mineral oils of the normalized form of novobiocin show characteristic absorption spectra, the former in the ultraviolet regions of the emission spectrum and the latter in its infrared region. A solution of substantially pure novobiocin in 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution shows a characteristic absorption peak in the ultraviolet region at 3070 Å. This absorption peak is indicative of a substantially pure material with a specific absorbance of 600 measured at the said wavelength using a solution containing 1 g of pure novobiocin per 100 ml of solution in a cell with an absorption path of 1 cm. A solution of pure novobiocin in a 0.1 N solution of hydrochloric acid in aqueous methanol shows a characteristic absorption peak in the ultraviolet region at 1% 3240 Å with E 2 cm 390. A suspension of substantially pure normalized novobiocin in mineral oil shows characteristic absorption peaks in the infrared region at the following wavelengths expressed in microns, 5.8-6.0 (broad), 6.10, 6.21, 6.30, 6.49, 6.63, 7.4 —7.6 (wide taper), 7.78, 7.96, 8.27 (weak), 8.60 (taper) 8.7 (taper), 9.13, 9.40, 10.0—10 .1 (broad), 10.28, 10.60 (broad) 12.0—12.30 (broad), 12.60—12.75 (broad) 13.07 and 13.39.

Novobiocinenhetene står i et visst forhold til den mikrobiologiske aktivitet av vesentlig rent krystallinsk novobiocin, idet den mikrobiologiske aktivitet av i det vesentlige rent krystallinsk novobiocin vil-kårlig er satt til 5,000 enheter pr. mg, be-stemt ved standard «cup-plate»-dif fu-sjonsmetoder under anvendelse av Bacil-lus subtilis ATTC 12,432, som prøveorga-nisme. The novobiocin units are in a certain relationship to the microbiological activity of essentially pure crystalline novobiocin, the microbiological activity of essentially pure crystalline novobiocin being arbitrarily set at 5,000 units per mg, determined by standard "cup-plate" diffusion methods using Bacillus subtilis ATTC 12,432, as test organism.

I korthet sagt dyrkes i denne metode en kultur av B. subtilis ATTC 12,432 på hjerne- og hjerteinfusjonsagarplater (Difco Manual, 9. utgave, sider 90, 91) i 24 timer ved 37° C og oppbevares derpå ved 5° C i tidsrom på ikke lengere enn en måned. For fremstilling av sporer dannes der et pod-ningsmedium ved å tilsette 5 ml sterilt destillert vann til en nylig dyrket plate av B. subtilis. Cellene skrapes under aseptiske betingelser fra platen, blandes godt og overføres til 50 ml sterilt destillert vann i en Erlenmeyer kolbe. 2 ml tilsettes som pod-ningsmedium i en Rouxkolbe inneholdende et medium bestående av 3 pst. soyabønne-mel, 0,2 pst. natriumklorid, 0,4 pst. «distil-lers' solubles», 0,8 pst. dekstrose og 2,0 pst. agar. Etter inkubasjon i 7 døgn ved 37° C suspenderes den erholdte bakteriekultur i 50 ml sterilt destillert vann og pasteurise-res ved 65° C i 30 minutter. 4 ml av denne sporesuspensjon i fortynning på 1 : 50 brukes pr. liter av et undersøkelsesmedium inneholdende 0,5 pst. pepton, 0,3 pst. kjøtt-ekstrakt, 0,3 pst. gjærekstrakt og 1,5 pst. agar samt med en pH-verdi på 5,9—6,1. Porsjoner på 15 ml av det podede medium fordeles i dype Petriskåler med flat bunn. Briefly, in this method a culture of B. subtilis ATTC 12,432 is grown on brain and heart infusion agar plates (Difco Manual, 9th edition, pages 90, 91) for 24 hours at 37°C and then stored at 5°C for a period of no longer than a month. For the production of spores, an inoculum medium is formed by adding 5 ml of sterile distilled water to a freshly cultured plate of B. subtilis. The cells are scraped under aseptic conditions from the plate, mixed well and transferred to 50 ml of sterile distilled water in an Erlenmeyer flask. 2 ml is added as inoculation medium in a Roux flask containing a medium consisting of 3 per cent soybean meal, 0.2 per cent sodium chloride, 0.4 per cent distillers' solubles, 0.8 per cent dextrose and 2 .0 percent agar. After incubation for 7 days at 37° C, the resulting bacterial culture is suspended in 50 ml of sterile distilled water and pasteurized at 65° C for 30 minutes. 4 ml of this spore suspension in a dilution of 1:50 is used per liter of a research medium containing 0.5% peptone, 0.3% meat extract, 0.3% yeast extract and 1.5% agar and with a pH value of 5.9-6.1. Portions of 15 ml of the inoculated medium are distributed in deep Petri dishes with a flat bottom.

Seks sylindre av rustfritt stål anbringes på den podede agar. Hver annen sylinder, altså i det hele tre, fylles med en stan-dardoppløsning av novobiocin inneholdende 4 mikrogram novobiocin pr. ml. (Ekviva-lent med 20 novobiocinenheter pr. ml), og 3 sylindre fylles med den ukjente oppløs-ning som er fortynnet til omtrent det samme potensial med M/20 fosfatpufferoppløs-ning hvis pH-verdi er 6,0. En standard-kurve for hver dag fremstilles med rent novobiocin som er fortynnet til forskjellige konsentrasjoner varierende fra 2 til 16 mikrogram pr. ml. Six stainless steel cylinders are placed on the inoculated agar. Every other cylinder, i.e. in all three, is filled with a standard solution of novobiocin containing 4 micrograms of novobiocin per ml. (Equivalent to 20 novobiocin units per ml), and 3 cylinders are filled with the unknown solution which is diluted to approximately the same potential with M/20 phosphate buffer solution whose pH value is 6.0. A standard curve for each day is prepared with pure novobiocin diluted to different concentrations varying from 2 to 16 micrograms per day. ml.

Etter 18 timers inkubasjon ved 28° C måles diametrene av hemningssonene for den ukjente oppløsning og standardoppløs-ningen på hver plate. Den ukjente oppløs-nings potensial bestemmes fra en nomograf som er basert på graden av reaksjonen ved forskjellige konsentrasjoner, fastsatt fra standardkurven for hvert døgn. After 18 hours of incubation at 28° C, the diameters of the inhibition zones for the unknown solution and the standard solution are measured on each plate. The potential of the unknown solution is determined from a nomograph which is based on the degree of reaction at different concentrations, determined from the standard curve for each day.

Novobiocin er optisk aktivt a „ Novobiocin is optically active a „

27° C-l i ln NaOH-oppløsning) og 2,5 = 44° (C = 1 i pyridin). 27° C-1 in ln NaOH solution) and 2.5 = 44° (C = 1 in pyridine).

Novobiocin er aktivt særlig med hensyn til å forhindre vekst av gram-positive mikroorganismer, men viser også noen aktivitet mot gram-negative organismer. Det for-hindrer vekst av blandt andre følgende organismer: Novobiocin is particularly active in preventing the growth of gram-positive microorganisms, but also shows some activity against gram-negative organisms. It prevents the growth of, among others, the following organisms:

M. pyogenes var. albus M. pyogenes var. albus

M. pyogenes var. aureus M. pyogenes var. aureus

Diplococcus pneumoniae Corynebacterium ophtheriae type Diplococcus pneumoniae Corynebacterium ophtheriae type

gravis serious

Corynebacterium diphteriae type in-termedius Corynebacterium diphteriae type intermedius

Corynebacterium diphteriae type mitis Corynebacterium xerose, Corynebacterium renale Corynebacterium diphtheriae type mitis Corynebacterium xerose, Corynebacterium renale

Neisseria menintidis Neisseria menintidis

Sarcina lutea (VD) Sarcina lutea (VD)

M. pyogenes var. aureus, resistent mot aureomycin M. pyogenes var. aureus, resistent mot streptomycin-streptothricin. M. pyogenes var. aureus, resistent mot penicillin M. pyogenes var. aureus, resistant to aureomycin M. pyogenes var. aureus, resistant to streptomycin-streptothricin. M. pyogenes var. aureus, resistant to penicillin

Novobiocinsalter har også antibiotisk aktivitet. Således ble f. eks. natriumsaltet av novobiocin ved undersøkelse ved hjelp av agarstripe-fortynningsprøve funnet å forhindre vekst av forskjellige stammer av M pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria menigitidis (nr. 274), og Sarcina lutea (VD) ved konsentrasjoner under 0,5 mikro gr. pr. ml. Også andre mikroorganismer påvirkes i varirende grad av novobiocin eller dets salter. Novobiocin salts also have antibiotic activity. Thus, e.g. the sodium salt of novobiocin by agar strip dilution test found to prevent the growth of various strains of M pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria menigitidis (no. 274), and Sarcina lutea (VD) at concentrations below 0.5 micro gr. per ml. Other microorganisms are also affected to varying degrees by novobiocin or its salts.

Det ble nu funnet at når man lar novobiocin eller et salt av novobiocin reagere med hydrogen i nærvær av en passende hydreringskatalysator som definert i det følgende, reagerer hydrogenet i mengdeforholdet 1 mol pr. mol novobiocin eller novobiocinsalt slik at der dannes et dihydro-derivat av novobiocin med i det vesentlige kvantitativt utbytte. Dette derivat er en ny syntetisk kjemisk helhet. Det erholdte produkt er dihydronovobiocin, eller et salt av denne forbindelse, avhengig av det anvendte utgangsmateriale og av de betingelser under hvilke reaksjonen utføres. Dihydronovobiocin er omtrent like aktivt i antibiotisk henseende som selve novobiocinet, idet det i det vesentlige ren tilstand har en aktivitet på omkring 5000 novobiocinenheter pr. mg. Dihydronovobiocinet er like godt egnet for klinisk anvendelse som novobiocinet. It has now been found that when novobiocin or a salt of novobiocin is allowed to react with hydrogen in the presence of a suitable hydrogenation catalyst as defined below, the hydrogen reacts in the ratio of 1 mole per mol of novobiocin or novobiocin salt so that a dihydro-derivative of novobiocin is formed with essentially quantitative yield. This derivative is a new synthetic chemical entity. The product obtained is dihydronovobiocin, or a salt of this compound, depending on the starting material used and the conditions under which the reaction is carried out. Dihydronovobiocin is approximately as active in antibiotic terms as novobiocin itself, since in its essentially pure state it has an activity of around 5,000 novobiocin units per mg. Dihydronovobiocin is as suitable for clinical use as novobiocin.

Ved utførelsen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen oppløses novobiocin eller et novobiocinsalt i et passende oppløs-ningsmiddel som en lavere alkanol, en lavere alkansyre eller en vandig alkalisk opp-løsning i hvilken der er suspendert en passende hydreringskatalysator som definert i det følgende. Blandingen bringes så i hydrogenatmosfære ved atmosfæretrykk eller høyere trykk og rystes eller omrøres i et tidsrom som er tilstrekkelig til at omkring 1 mol hydrogen absorberes pr. mol novobiocin eller novobiocinsalt. When carrying out the method according to the invention, novobiocin or a novobiocin salt is dissolved in a suitable solvent such as a lower alkanol, a lower alkanoic acid or an aqueous alkaline solution in which a suitable hydration catalyst as defined below is suspended. The mixture is then brought into a hydrogen atmosphere at atmospheric pressure or higher pressure and shaken or stirred for a period of time that is sufficient for about 1 mole of hydrogen to be absorbed per mol of novobiocin or novobiocin salt.

Blant de hydreringskatalysatorer som er egnet for anvendelse i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er kataly-satormasser av edelmetallene platina, pal-ladium, rutenium og rodium, oksyder av disse edelmetaller og hydreringskatalysatorer og metallmasser bestående av findelt nikkel eller kobolt, som Raney-nikkel eller Raney-kobolt. Katalysatorene kan brukes med eller uten bærer og med eller uten promotor. I alminnelighet går hydreringsreaksjonen raskere med platina enn med de nevnte andre edelmetallkatalysa-torer eller oksyder av disse metaller ved anvendelse av samme katalysatormengder. Videre kan akseptable reaksjonshastigheter oppnås ved lavere trykk og temperaturer ved anvendelse av katalysatorer bestående av eller inneholde edelmetaller eller oksyder av disse metaller enn ved anvendelse av katalysatorer på metallbasis som Raney-nikkel eller Raney-kobolt. Among the hydrogenation catalysts which are suitable for use in the method according to the present invention are catalyst masses of the noble metals platinum, palladium, ruthenium and rhodium, oxides of these noble metals and hydrogenation catalysts and metal masses consisting of finely divided nickel or cobalt, such as Raney nickel or Raney -cobalt. The catalysts can be used with or without a carrier and with or without a promoter. In general, the hydrogenation reaction proceeds faster with platinum than with the aforementioned other noble metal catalysts or oxides of these metals when using the same amounts of catalyst. Furthermore, acceptable reaction rates can be achieved at lower pressures and temperatures when using catalysts consisting of or containing noble metals or oxides of these metals than when using metal-based catalysts such as Raney nickel or Raney cobalt.

Ved anvendelse av edelmetaller eller edle metallers oksyder som hydreringskatalysator foregår reaksjonen med tilfredsstillende hastighet med vanlig romtemperatur og ved lave trykk, dvs. trykk som ikke er vesentlig høyere enn atmosfæretrykk. Med andre hydreringskatalysatorer som Raney nikkel, Raney kobolt og lignende, kan der med fordel brukes noe høyere temperaturer f. eks. omkring 100° C eller høy-ere, men ikke over omkring 150° C, og noe høyere trykk, f. eks. fra omkring 70 til 154 kg/cm<2>. Den tid som kreves for å fullføre reaksjonen kan forkortes ved å utføre den ved økede trykk. Reaksjonen foregår tilfredsstillende ved vanlig romtemperatur, men der kan om ønskes brukes høyere temperaturer som imidlertid ikke bør over-stige omkring 150° C. I alminnelighet er den anvendte katalysator ikke kritisk for reaksjonens forløp men reduksjonshastig-heten økes eller minskes med økning henholdsvis minskning av katalysatormengden. When noble metals or noble metal oxides are used as a hydrogenation catalyst, the reaction takes place at a satisfactory rate at normal room temperature and at low pressure, i.e. pressure which is not significantly higher than atmospheric pressure. With other hydration catalysts such as Raney nickel, Raney cobalt and the like, somewhat higher temperatures can be advantageously used, e.g. about 100° C or higher, but not above about 150° C, and somewhat higher pressure, e.g. from about 70 to 154 kg/cm<2>. The time required to complete the reaction can be shortened by carrying it out at elevated pressures. The reaction takes place satisfactorily at normal room temperature, but if desired, higher temperatures can be used which, however, should not exceed around 150° C. In general, the catalyst used is not critical for the course of the reaction, but the reduction rate is increased or decreased with an increase or decrease in the amount of catalyst.

Det er mulig å bruke urene konsentra-ter av novobiocin eller novobiocinsalter som utgangsmaterialer, men det foretrek-kes å bruke i det vesentlige rene utgangsmaterialer, når sådanne er tilgjengelige. Alkalimetallsalter av novobiocin som mononatriumsaltet er tilfredsstillende for anvendelse som utgangsmaterialer i fremgangsmåten. It is possible to use impure concentrates of novobiocin or novobiocin salts as starting materials, but it is preferred to use essentially pure starting materials, when such are available. Alkali metal salts of novobiocin such as the monosodium salt are satisfactory for use as starting materials in the process.

Det oppløsningsmiddel som brukes som reaksjonsmedium i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et hvilket som helst flytende medium som er i stand til å oppløse novobiocin eller det novobiocinsalt som brukes som utgangsmateriale og som ikke griper inn i novobiocinets hydrering. Blant de oppløsningsmidler som kan brukes og som er funnet å være tilfredsstillende er alkaliske vandige oppløs-ninger som vandige natriumhydroksydopp-løsninger eller vandige kaliumhydroksyd-oppløsninger, samt lavere alkanoler, som metanol eller etanol og lavere alkansyrer, som iseddik. The solvent used as reaction medium in the method according to the present invention can be any liquid medium which is capable of dissolving novobiocin or the novobiocin salt used as starting material and which does not interfere with the hydration of novobiocin. Among the solvents which can be used and which have been found to be satisfactory are alkaline aqueous solutions such as aqueous sodium hydroxide solutions or aqueous potassium hydroxide solutions, as well as lower alkanols, such as methanol or ethanol, and lower alkanoic acids, such as glacial acetic acid.

Efter fullførelse av reduksjonen, dvs. efter at en ekvimolekylær mengde hydrogen og novobiocin eller novobiocinsalt har reagert med hverandre fjernes katalysatoren fra reaksjonsblandingen ved filtrering og reaksjonsproduktet bestående av dihydronovobiocin isoleres, fortrinsvis ved å fordampe oppløsningsmidlet fra filtratet i vakuum. Dihydronovobiocinet i form av en fri syre kan fåes ved hydrering av novobiocin eller den kan fremstilles fra saltene ved å la en oppløsning av vedkommende salt reagere med en syre som en av de vanlige mineralsyrer, f. eks. svovelsyre. Dihydronovobiocinet skiller seg ut fra opp-løsningen, mens saltet av den syre som brukes forblir i oppløsningen og den først-nevnte kan skilles fra den sistnevnte ved filtrering. After completion of the reduction, i.e. after an equimolecular amount of hydrogen and novobiocin or novobiocin salt have reacted with each other, the catalyst is removed from the reaction mixture by filtration and the reaction product consisting of dihydronovobiocin is isolated, preferably by evaporating the solvent from the filtrate in vacuo. The dihydronovobiocin in the form of a free acid can be obtained by hydration of novobiocin or it can be prepared from the salts by allowing a solution of the salt in question to react with an acid such as one of the usual mineral acids, e.g. sulfuric acid. The dihydronovobiocin separates out from the solution, while the salt of the acid used remains in the solution and the former can be separated from the latter by filtration.

Likeledes kan salter av dihydronovobiocin fåes som sådanne ved å bruke et novobiocinsalt som utgangsmateriale for hydreringsreaksjonen, og/eller ved å utføre hydreringen i et passende basisk vandig medium. Alternativt kan dihydronovobiocin i form av den fri syre ved enkel dobbelt omsetning med passende baser overføres til sine enbasiske eller tobasiske salter. På denne måte kan man få alkalimetallsalter av dihydronovobiocin som f. eks. natriumsaltet og kaliumsaltet, jordalkalimetallsal-ter som kalsiumsalter og kvartære nitro-genholdige basiske salter som ammonium-salter og salter med organiske aminer. Eksempler på organiske aminer som dan-ner salter med dihydronovobiocin er kinin, prokain, guanidin, noformicin, N-benzyl-(3-fenyletylamin, N,N-dibenzyletylendiamin, cykloheksylamin, N-etylpiperidin, trietyl-amin, dicykloheksylamin, arginin, histidin og lysin. Likewise, salts of dihydronovobiocin can be obtained as such by using a novobiocin salt as starting material for the hydration reaction, and/or by carrying out the hydration in a suitable basic aqueous medium. Alternatively, dihydronovobiocin in the form of the free acid can be transferred to its monobasic or dibasic salts by simple double reaction with suitable bases. In this way, alkali metal salts of dihydronovobiocin can be obtained, e.g. the sodium salt and the potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salts and quaternary nitrogen-containing basic salts such as ammonium salts and salts with organic amines. Examples of organic amines that form salts with dihydronovobiocin are quinine, procaine, guanidine, noformicin, N-benzyl-(3-phenylethylamine, N,N-dibenzylethylenediamine, cyclohexylamine, N-ethylpiperidine, triethylamine, dicyclohexylamine, arginine, histidine and lysine.

Dihydronovobiocinsalter kan om ønskes renses ved omkrystallisasjon efter konven-sjonelle metoder. Således kan de f. eks. oppløses i den minst mulige mengde av en lavere alkanol som metanol eller etanol og oppløsningen delvis inndampes hvorved det rensede krystallinske materiale skiller seg ut. Det kan også tilsettes et oppløsnings-middel som aceton til den alkoholiske opp-løsning inntil denne begynner å bli uklar, hvorpå det utskilte rensede, krystallinske produkt kan utvinnes efter henstand. If desired, dihydronovobiocin salts can be purified by recrystallization according to conventional methods. Thus, they can e.g. is dissolved in the smallest possible amount of a lower alkanol such as methanol or ethanol and the solution is partially evaporated whereby the purified crystalline material separates. A solvent such as acetone can also be added to the alcoholic solution until it starts to become cloudy, after which the separated, purified, crystalline product can be recovered as required.

Som nevnt i det foregående synes novobiocin å ha formelen CsiH;m;N:>Oii ifølge de nu foreliggende data. Det følger herav at dihydronovobiocin som har to hydrogen-atomer mere pr. molekyl enn novobiocin forsøksvis kan gis formelen ChiHmsN^Oh. Den nøyaktige natur og kjemiske struktur av novobiocinets og dihydronovobiocinets molekyler er ikke hittil helt ut klargjort, men det antas på grunnlag av kjemiske eksperimentelle studier at novobiocinmole-kyler inneholder en benzenring med en di-metylallyl sidekjede som har formelen: -CH2. CH : C(CHa)-. Denne sidekjede over-føres som et resultat av den hydrerings-reaksjon som brukes ved fremstilling av dihydronovobiocin til en dimetylpropyl-sidekjede, med formelen -CH2 . CH2 . CH(CH3)2, som substituenten i dihydronovobiocinets benzenring. As mentioned above, novobiocin appears to have the formula CsiH;m;N:>Oii according to the currently available data. It follows from this that dihydronovobiocin, which has two more hydrogen atoms per molecule than novobiocin can tentatively be given the formula ChiHmsN^Oh. The exact nature and chemical structure of the molecules of novobiocin and dihydronovobiocin have not yet been fully elucidated, but it is assumed on the basis of chemical experimental studies that novobiocin molecule coolers contain a benzene ring with a dimethylallyl side chain which has the formula: -CH2. CH : C(CHa)-. This side chain is transferred as a result of the hydrogenation reaction used in the production of dihydronovobiocin to a dimethylpropyl side chain, with the formula -CH 2 . CH2. CH(CH3)2, as the substituent in the dihydronovobiocin's benzene ring.

Den kjensgjernnig at hydrogen reagerer med novobiocin i nærvær av en passende hydreringskatalysator så at der dannes en ny kjemisk enhet og den kjensgjerning at denne reaksjon foregår mellom ekvimolekylære mengdeforhold av hydrogen og novobiocin kan fastslåes ved å utføre reaksjonen under anvendelse av hydrogen-iso-topen deuterium i stedet for vanlig hydrogen og bestemme reaksjonsproduktets deu-teriuminnhold ved analyse. Dette kan ut-føres som følger: Omkring 515 mg novobiocin og 71 ml natriumhydroksydoppløsning tilsettes til en blanding av 50 mg platinaoksyd og 10 ml deuteriumoksyd i deuteriumatmosfære i et passende hydreringsapparat. Blandingen omrøres under et deuteriumtrykk som er ganske lite høyere enn atmosfæretrykk i et tidsrom på omkring to timer. Der tilsettes omkring 35 mg ytterligere natriumhydr-oksyd for å sikre fullstendig oppløsning av novobiocinet og dessuten 50 mg platinaoksyd. For å senke oppløsningens hydrogen-ionekonsentrasjon og derved forsinke hy-drolysen tilsettes omkring 0,5 ml etylacetat hvorpå omrøringen av blandingen under deuteriumatmosfæren fortsettes i et ytterligere tidsrom på omkring 9 timer. Blandingen filtreres derpå for å fjerne katalysatoren og filtratet sur gjøres ved tilsetning av saltsyre hvorved der utfelles deuterium-isologen av dihydronovobiocin. Dette stoff oppsamles, vaskes med vann og tørres. Ved analyse finnes det at dette produkt inneholder 5,0 vekt pst. deuterium (beregnet verdi 5,6 pst.). The fact that hydrogen reacts with novobiocin in the presence of a suitable hydrogenation catalyst to form a new chemical entity and the fact that this reaction takes place between equimolecular proportions of hydrogen and novobiocin can be established by performing the reaction using the hydrogen isotope deuterium instead of ordinary hydrogen and determine the deuterium content of the reaction product by analysis. This can be carried out as follows: About 515 mg of novobiocin and 71 ml of sodium hydroxide solution are added to a mixture of 50 mg of platinum oxide and 10 ml of deuterium oxide in a deuterium atmosphere in a suitable hydration apparatus. The mixture is stirred under a deuterium pressure which is quite a bit higher than atmospheric pressure for a period of about two hours. About 35 mg of additional sodium hydroxide is added to ensure complete dissolution of the novobiocin and also 50 mg of platinum oxide. In order to lower the hydrogen ion concentration of the solution and thereby delay the hydrolysis, about 0.5 ml of ethyl acetate is added, after which stirring of the mixture under the deuterium atmosphere is continued for a further period of about 9 hours. The mixture is then filtered to remove the catalyst and the filtrate is acidified by the addition of hydrochloric acid, whereby the deuterium isolog of dihydronovobiocin is precipitated. This substance is collected, washed with water and dried. On analysis, it is found that this product contains 5.0 weight percent deuterium (calculated value 5.6 percent).

Nærværet av deuterium i produktet viser at det er en ny kjemisk forbindelse som er forskjellig fra novobiocinutgangsmate-rialet og fastslår at addisjon av hydrogen finner sted når novobiocin underkastes hydrering i nærvær av en hydreringskatalysator som definert i det foregående. Det mengdeforhold i hvilket deuterium deltar i reaksjonen og er tilstede i reaksjonsproduktet fastslår at reaksjonskomponentene reagerer i ekvimolekylære mengdeforhold. Biologisk undersøkelse av denne deuterium-isolog av dihydronovobiocin viser at denne forbindelse har i det vesentlige samme grad av antimikrobiologisk aktivitet som novobiocin og dihydronovobiocin og at den er aktiv innen i det vesentlige samme bakteriespekteret som novobiocin og dihydronovobiocin . The presence of deuterium in the product shows that it is a new chemical compound different from the novobiocin starting material and establishes that addition of hydrogen takes place when novobiocin is subjected to hydrogenation in the presence of a hydrogenation catalyst as defined above. The quantity ratio in which deuterium participates in the reaction and is present in the reaction product establishes that the reaction components react in equimolecular quantity ratios. Biological examination of this deuterium isologue of dihydronovobiocin shows that this compound has essentially the same degree of antimicrobial activity as novobiocin and dihydronovobiocin and that it is active within essentially the same bacterial spectrum as novobiocin and dihydronovobiocin.

De to grupper antibiotiske stoffer novobiocin og dets salter på den annen side kan neppe skilles fra hverandre ved vanlig kjemiske analyse, heller ikke kan de lett skilles fra hverandre ved vanlig fysikalske målinger som absorbsjon i emisjonsspektrets infrarøde eller ultrafiolette områder, men medlemmene av de to grupper kan lett skilles fra hverandre ved papirkromato-grafi og ved den måte de forholder seg på overfor visse kjemiske reagenser, særlig perjod-syre. The two groups of antibiotic substances novobiocin and its salts, on the other hand, can hardly be separated from each other by ordinary chemical analysis, nor can they be easily separated from each other by ordinary physical measurements such as absorption in the infrared or ultraviolet regions of the emission spectrum, but the members of the two groups can be easily separated from each other by paper chromatography and by the way they react to certain chemical reagents, especially periodic acid.

I den førstnevnte adskillelsesmetode anvendes hensiktsmessig den fremgangsmåte som er kjent som reversfasepapirkro-matografi og hvor kaprylalkohol utgjør den stasjonære fase og en vandig oppløsning utgjør den bevegelige fase. In the first-mentioned separation method, the method known as reverse phase paper chromatography is suitably used and where caprylic alcohol forms the stationary phase and an aqueous solution forms the mobile phase.

Et ark filterpapir (Whatman nr. 1) behandles slik at vannet fjernes fra papiret. Behandlingen består i å tørre papiret ved A sheet of filter paper (Whatman no. 1) is treated so that the water is removed from the paper. The treatment consists of drying the paper with wood

110° C under høyt vakuum (1 mm Hg) natten over. Papiret behandles derpå for å forhindre at det påny absorberer vann. 110° C under high vacuum (1 mm Hg) overnight. The paper is then treated to prevent it from absorbing water again.

Denne behandling består i at papiret dyppes i en blanding av en silikonvæske (som Dow Corning 200 Fluid) med en viskositet på 12 500 og etyleter i mengdeforholdet 5 g silikonvæske til 100 ml etyleter og derpå This treatment consists of the paper being dipped in a mixture of a silicone fluid (such as Dow Corning 200 Fluid) with a viscosity of 12,500 and ethyl ether in the ratio of 5 g of silicone fluid to 100 ml of ethyl ether and then

tørre papiret i luften i 10 minutter. Papiret air dry the paper for 10 minutes. The paper

kan i denne tilstand oppbevares i en eksi-kator inntil det skal . brukes. Ved papirets anvendelse påføres flekker av novobiocin-og dihydronovobiocin forbindelsene nær papirstrimlens ene ende, hvorpå papiret dyppes i en blanding av kaprylalkohol og metanol i mengdeforhold 1 volumdel kaprylalkohol til 5 volumdeler metanol. Etter dypningen legges papiret mot filtrer-papir for å fjerne overskudd av væske, og henges deretter opp i en lukket sylinder med den ende hvor forbindelsene ble påført øverst. Denne ende av papirstrimlen dykkes ned i en vandig oppløsning av natriumfosfat (0,1 M) ved en pH-verdi på 8,4. En ytterligere mengde av den samme oppløsning etterlates med frittliggende overflate ved den lukkede sylinderbunn så at enhver til-bøyelighet hos oppløsningen til å fordampe fra papirstrimlen når den beveger seg nedover denne blir minst mulig. can be kept in this state in an incinerator until it is to . is used. When using the paper, spots of the novobiocin and dihydronovobiocin compounds are applied near one end of the paper strip, after which the paper is dipped in a mixture of caprylic alcohol and methanol in a ratio of 1 part by volume of caprylic alcohol to 5 parts by volume of methanol. After dipping, the paper is placed against filter paper to remove excess liquid, and then suspended in a closed cylinder with the end where the compounds were applied at the top. This end of the paper strip is immersed in an aqueous solution of sodium phosphate (0.1 M) at a pH value of 8.4. A further quantity of the same solution is left with exposed surface at the closed cylinder bottom so that any tendency of the solution to evaporate from the paper strip as it travels down it is minimized.

Når den bevegelige (vandige) fase beveger seg nedover papirstrimlen går novobiocinet raskere enn dihydronovobiocinet. I løpet av 6 timer beveger oppløsningsmid-delfronten seg omkring 18 cm og gir en tilfredsstillende adskillelse av de to forbin-deiser. De to flekkers adskilte stillinger er synlige på papiret når det betraktes i ultrafiolette stråler. I et forsøk som varte natten over (omkring 17 timer) beveget oppløsningsmiddelfronten seg omkring 45 cm, og der var tilsvarende større adskillelse mellom de to flekkers stillinger. As the mobile (aqueous) phase moves down the paper strip, the novobiocin moves faster than the dihydronovobiocin. In the course of 6 hours, the solvent front moves about 18 cm and provides a satisfactory separation of the two compounds. The separate positions of the two spots are visible on the paper when viewed in ultraviolet rays. In an experiment that lasted overnight (about 17 hours), the solvent front moved about 45 cm, and there was a correspondingly greater separation between the positions of the two spots.

Uttrykket kvantitativt beveger novobiocin seg med en Rf på 0,30. Når man set-ter novobiocinets bevegelighet lik 1,0 har dihydronovobiocin en bevegelighet på 0,68. Expressed quantitatively, novobiocin moves with an Rf of 0.30. When you set the mobility of novobiocin equal to 1.0, dihydronovobiocin has a mobility of 0.68.

I den annen metode til å skille novobiocin og dets salter på den annen side, altså ved reaksjon med perjodsyre forbrukes pr. mol et molekyl mere av dette reagens av novobiocin sammenlignet med den mengde av dette reagens som forbrukes ved reaksjon av samme molekylære dihydronovobiocin. Dette kan lett vises som følger: Oppløsninger av kjente mengder av novobiocin og dihydronovobiocin i dioksan behandles med et kjent overskudd av per jodsyre i vann. Man lar oppløsningen stå natten over. Overskuddet av perjodsyre i hver tilfelle bestemmes ved filtrering med standard natriumarsenitoppløsning. For-skjellen mellom den herved funne over-skuddsmengde og den mengde perjodsyre som var tilstede ved forsøkenes begynnelse viser i hvert av tilfellene den mengde perjodsyre som er forbrukt av hver av forbindelsene. Det finnes da at novobiocin for-bruker omkring 1 mol perjodsyre mere enn dihydronovobiocin for hvert mol av disse antibiotiske midler. In the second method to separate novobiocin and its salts on the other hand, i.e. by reaction with periodic acid, per mol one more molecule of this reagent of novobiocin compared to the amount of this reagent consumed by the reaction of the same molecular dihydronovobiocin. This can be easily shown as follows: Solutions of known amounts of novobiocin and dihydronovobiocin in dioxane are treated with a known excess of per iodic acid in water. The solution is left to stand overnight. The excess of periodic acid in each case is determined by filtration with standard sodium arsenite solution. The difference between the excess amount thus found and the amount of periodic acid that was present at the start of the experiments shows in each case the amount of periodic acid that has been consumed by each of the compounds. It is then found that novobiocin consumes about 1 mole of periodic acid more than dihydronovobiocin for each mole of these antibiotic agents.

Novobiocin og dets salter på den ene side og dihydronovobiocin og dets salter på den annen side er også forskjellige med hensyn til aktivitet mot visse mikroorganismer. Dette vil fremgå fra de sammen-lignende data som er oppført i nedenstå-ende tabell 1, og som er funnet ved in vitro-forsøk utført ved standardseriefortynning-operas joner: Novobiocin and its salts on the one hand and dihydronovobiocin and its salts on the other hand also differ in their activity against certain microorganisms. This will be apparent from the similar data listed in table 1 below, which was found in in vitro experiments carried out using standard serial dilution operations:

Det vil av denne tabell sees at dihydronovobiocin minst er like aktivt og i de fleste tilfelle mere aktivt enn novobiocin mot for-søks-mikroorganismen, særlig mot viktige sykdomsvekkende typer, samt viser en mere enn to ganger bedre aktivitet enn novobiocin mot to av disse mikroorganismer, nemlig C. pseudotuberculosis 545 og C. pseudo-diphterificum 259. It will be seen from this table that dihydronovobiocin is at least as active and in most cases more active than novobiocin against the test microorganism, especially against important disease-causing types, and shows more than two times better activity than novobiocin against two of these microorganisms , namely C. pseudotuberculosis 545 and C. pseudo-diphterificum 259.

Det er også funnet at dihydronovobiocin i sammenligning med novobiocin er be-merkelsesverdig mere aktivt in vivo mot infeksjoner med Proteus sp. Micrococcus pyogenes var. aureus Smith, Streptococcus. It has also been found that dihydronovobiocin in comparison with novobiocin is remarkably more active in vivo against infections with Proteus sp. Micrococcus pyogenes var. aureus Smith, Streptococcus.

pyogenes og Diplococcus pneumoniae som er erythromycinresistent således som det pyogenes and Diplococcus pneumoniae which are erythromycin-resistant thus like that

fremgår av de data som er oppført i neden-stående tabell. appears from the data listed in the table below.

Uttrykket dihydronovobiocinsalt som det her brukes betegner salter i hvilke anionen er anionen av dihydronovobiocin i form av fri syre forbundet med en eller høyst to kationer av gruppen bestående av alkalimetallkationene, de ikke giftige jord-alkalimetallkationer, ammoniumkationer og kationene av kvaternære nitrogenhol-dige organiske baser og miner. The term dihydronovobiocin salt as used here denotes salts in which the anion is the anion of dihydronovobiocin in the form of free acid associated with one or at most two cations from the group consisting of the alkali metal cations, the non-toxic alkaline earth metal cations, ammonium cations and the cations of quaternary nitrogenous organic bases and mines.

I det følgende beskrives som eksempler noen utførelsesformer for oppfinnelsen. In the following, some embodiments of the invention are described as examples.

Eksempel 1: Example 1:

I et passende hydreringsapparat om-røres i hydrogenatmosfære en oppløsning av omkring 15,8 mg novobiocin i 25 ml metanol med 50 mg platinaoksyd-katalysator. - Hydreringskaret inneholdende blandingen rystes kontinuerlig i et tidsrom på 3 timer under hvilket der opprettholdes et hydrogentrykk på omkring 2,8 kg/cm<2> og en temperatur på omkring 25° C i blandingen i karet. Opptagelsen av hydrogen måles og når en ekvimolekylær mengde hydrogen beregnet på novobiocinet er absorbert, åpnes apparatet og blandingen i karet filtreres for å fjerne katalysatoren. Filtratet inndampes derpå til tørrhet i vakuum. Når residuet underkastes mikrobiologisk under-søkelse finner man at det har en aktivitet som er i det vesentlige lik novobiocin-utgangsmaterialets aktivitet. Dette produkt er det nye syntetiske, antibiotiske middel dihydronovobiocin og det har de egenskaper og den antibiotiske aktivitet som er angitt i det foregående. In a suitable hydration apparatus, a solution of about 15.8 mg of novobiocin in 25 ml of methanol is stirred in a hydrogen atmosphere with 50 mg of platinum oxide catalyst. - The hydrogenation vessel containing the mixture is shaken continuously for a period of 3 hours, during which a hydrogen pressure of around 2.8 kg/cm<2> and a temperature of around 25° C are maintained in the mixture in the vessel. The absorption of hydrogen is measured and when an equimolecular amount of hydrogen calculated for the novobiocin has been absorbed, the apparatus is opened and the mixture in the vessel is filtered to remove the catalyst. The filtrate is then evaporated to dryness in vacuo. When the residue is subjected to microbiological examination, it is found that it has an activity which is substantially similar to the activity of the novobiocin starting material. This product is the new synthetic antibiotic agent dihydronovobiocin and it has the properties and antibiotic activity stated above.

Eksempel 2: Example 2:

En oppløsning av omkring 28,4 mg novobiocin i 10 ml renset iseddik anbringes i et kar passende for hydrering og omrøres i dette med 27,5 mg platinaoksydkatalysa-tor i hydrogenatmosfære ved et trykk som er ganske lite høyere enn atmosfæretrykk og ved en temperatur på omkring 25° C, i et tidsrom på omkring 3 timer. Ved måling av hydrogenopptagelsen observeres det at en i det vesentlige ekvimolekylær mengde hydrogen i forhold til novebiocinutgangs-materialet absorberes. Katalysatoren fjernes og oppløsningen inndampes til tørrhet i vakuum. A solution of about 28.4 mg of novobiocin in 10 ml of purified glacial acetic acid is placed in a vessel suitable for hydration and stirred in this with 27.5 mg of platinum oxide catalyst in a hydrogen atmosphere at a pressure which is quite a bit higher than atmospheric pressure and at a temperature of about 25° C., for a period of about 3 hours. When measuring the hydrogen uptake, it is observed that an essentially equimolecular amount of hydrogen in relation to the novebiocin starting material is absorbed. The catalyst is removed and the solution is evaporated to dryness in vacuo.

Ved undersøkelse av en oppløsning av residuet i metanol observeres maksima ved bølgelengder på 2450 Å og 3250 Å. Ved sur-gj øring av metanoloppløsningen til en pH-verdi på omkring 2,0 observeres det en topp ved 3250 Å, og i en basisk metanoloppløs-ning med en pH-verdi på omkring 10,0— 11,0 observeres maksima ved 3050—3100 A. Produktet er dihydronovobiocin som beskrevet i det foregående. When examining a solution of the residue in methanol, maxima are observed at wavelengths of 2450 Å and 3250 Å. When acidifying the methanol solution to a pH value of around 2.0, a peak is observed at 3250 Å, and in a basic methanol solution -ning with a pH value of around 10.0-11.0 is observed maximally at 3050-3100 A. The product is dihydronovobiocin as described above.

Eksempel 3: Example 3:

Omkring 25,0 mg platinaoksyd suspenderes i 20 ml metanol og reduseres med hydrogen i et passende hydreringsapparat. En oppløsning av omkring 66,0 mg novobiocin i 4 ml metanol tilsettes til suspen-sjonen av platinakatalysatoren i metanol og blandingen omrøres i omkring 44 minutter i hydrogenatmosfære med et trykk som er ganske lite høyere enn atmosfæretrykk og ved en temperatur på omkring 25° C. Opptagelsen av hydrogen måles om-hyggelig og man finner at den er ekviva-lent med en mol hydrogen pr. mol novo-biocinutgangsmateriale. Etter fraskillelse av katalysatoren inndampes oppløsningen i vakuum, hvorved man får dihydronovobiocin som et blekgult pulver. Dette produkt har den mikrobiologiske aktivitet som er beskrevet i det foregående. About 25.0 mg of platinum oxide is suspended in 20 ml of methanol and reduced with hydrogen in a suitable hydration apparatus. A solution of about 66.0 mg of novobiocin in 4 ml of methanol is added to the suspension of the platinum catalyst in methanol and the mixture is stirred for about 44 minutes in a hydrogen atmosphere at a pressure rather slightly higher than atmospheric pressure and at a temperature of about 25° C. The absorption of hydrogen is carefully measured and it is found that it is equivalent to one mole of hydrogen per mol novo biocin starting material. After separation of the catalyst, the solution is evaporated in vacuum, whereby dihydronovobiocin is obtained as a pale yellow powder. This product has the microbiological activity described above.

Eksempel 4: Example 4:

En oppløsning av omkring 15,0 g av mononatriumsaltet av novobiocin i 400 ml metanol anbringes i et passende hydrer-ingskar og oppløsningen tilsettes 100 mg platinaoksyd. Blandingen rystes i et tids- A solution of about 15.0 g of the monosodium salt of novobiocin in 400 ml of methanol is placed in a suitable hydration vessel and 100 mg of platinum oxide is added to the solution. The mixture is shaken for a time

rom på omkring 50 minutter i hydrogenatmosfære og ved en temperatur på om- room for about 50 minutes in a hydrogen atmosphere and at a temperature of around

kring 25° C. Karet åpnes derpå, blandin- around 25° C. The vessel is then opened, mixing

gen tas ut og katalysatoren fraskilles ved filtrering. Filtratet inndampes til tørrhet i vakuum. Det erholdte produkt er mononatriumsaltet av dihydronovobiocin og dets aktivitet er i det vesentlige den samme som aktiviteten av det dihydronovobiocinpro- gen is taken out and the catalyst is separated by filtration. The filtrate is evaporated to dryness in vacuo. The product obtained is the monosodium salt of dihydronovobiocin and its activity is essentially the same as that of the dihydronovobiocin pro-

dukt man får ved å gå frem som angitt i foregående eksempel. skill you get by proceeding as indicated in the previous example.

Eksempel 5: Example 5:

En oppløsning av omkring 1,12 g novo- A solution of about 1.12 g of novo-

biocin i 20 ml metanol omrøres med 25 mg platinaoksyd i hydrogenatmosfære ved en temperatur på 25° C og i et tidsrom på omkring 36 minutter. Opptagelsen av hy- biocin in 20 ml of methanol is stirred with 25 mg of platinum oxide in a hydrogen atmosphere at a temperature of 25° C and for a period of about 36 minutes. The admission of hy-

drogen observeres og det finnes at den er et mol hydrogen pr. mol anvendt novobiocin-utgangsmateriale. Blandingen filtreres for å fjerne katalysatoren og filtratet inndampes til tørrhet. Residuet som består av dihydronovobiocin oppløses i den minst mulige mengde aceton og den erholdte oppløsning tilsettes petroleter (kokepunkt 30—60° C) hvorved dihydronovobiocin ut- the drug is observed and it is found that it is one mole of hydrogen per moles of novobiocin starting material used. The mixture is filtered to remove the catalyst and the filtrate is evaporated to dryness. The residue consisting of dihydronovobiocin is dissolved in the smallest possible amount of acetone and the resulting solution is added to petroleum ether (boiling point 30-60° C), whereby dihydronovobiocin

felles fra oppløsningen som et bunnfall som oppsamles vaskes med petroleter og tørres. separate from the solution as a precipitate which is collected, washed with petroleum ether and dried.

Dette produkt er optisk aktivt: ™ This product is optically active: ™

= — 27° (C = 1,68 i 2,5 N NaOH-oppløs- = — 27° (C = 1.68 in 2.5 N NaOH soln.

ning). ning).

Ved titreringskurver finnes det at dette produkt som novobiocin har to basebin- Titration curves show that this product as novobiocin has two base bins

dende grupper. Absorbsjonsspektret i det infrarøde område for dette syntetiske anti- dende groups. The absorption spectrum in the infrared region of this synthetic anti-

biotiske middel ligner likeledes de tilsva- biotic agents are likewise similar to the corresponding

rende data man får ved undersøkelse av novobiocin. relevant data obtained when examining novobiocin.

Eksempel 6: Example 6:

Omkring 12,5 g (0,019 mol) av mononatriumsaltet av novobiocin oppløses i 200 About 12.5 g (0.019 mol) of the monosodium salt of novobiocin is dissolved in 200

ml metanol, hvorved man får en uklar opp- ml of methanol, whereby a cloudy solution is obtained

løsning. Denne oppløsning omrøres med omkring 3 g Raney nikkel i 5 minutter. Oppløsningen filtreres derpå, vaskes med 50 ml metanol, vaskevannet blandes med filtratet og den resulterende klare oppløs- solution. This solution is stirred with about 3 g of Raney nickel for 5 minutes. The solution is then filtered, washed with 50 ml of methanol, the washing water is mixed with the filtrate and the resulting clear solution

ning underkastes hydrering i nærvær av en platinakatalysator inntil absorbsjonen av hydrogen opphører. Man finner at 0,019 ning is subjected to hydrogenation in the presence of a platinum catalyst until the absorption of hydrogen ceases. One finds that 0.019

mol hydrogen er obsorbert. Katalysatoren fjernes ved filtrering, filtratet inndampes til tørrhet i vakuum og residuet oppløses i omkring 15 ml etanol. Den erholdte opp-løsning tilsettes aceton til begynnende uklarhet, hvorpå man lar oppløsningen stå natten over ved vanlig romtemperatur. Det krystallinske bunnfall av mononatriumsal- moles of hydrogen are absorbed. The catalyst is removed by filtration, the filtrate is evaporated to dryness in vacuo and the residue is dissolved in about 15 ml of ethanol. Acetone is added to the solution obtained until it becomes cloudy, after which the solution is left overnight at normal room temperature. The crystalline precipitate of monosodium salt-

tet av dihydronovobiocin som herved dan- of dihydronovobiocin, which thereby form-

nes fjernes ved filtrering, vaskes med ace- nes are removed by filtration, washed with ace-

ton og tørres. Det har de i det foregående angitte egenskaper hos dihydronovobiocin- ton and dry. The aforementioned properties of dihydronovobiocin have

ets mononatriumsalt. et's monosodium salt.

Eksempel 7: Example 7:

En vandig oppløsning av dihydronovobiocinets mononatriumsalt blandes med et ganske lite molært overskudd av prokain-hydroklorid oppløst i vann. Det i vann uoppløselige prokainsalt av dihydronovo- An aqueous solution of the monosodium salt of dihydronovobiocin is mixed with a rather small molar excess of procaine hydrochloride dissolved in water. The water-insoluble procaine salt of dihydronovo-

biocin som herved utfelles frafiltreres, vas- The biocin that is thereby precipitated is filtered off, washed

kes med vann og tørres. rinse with water and dry.

Eksempel 8: Example 8:

En oppløsning av 2,0 novobiocin i 50 A solution of 2.0 novobiocin in 50

ml metanol tilsettes omkring en halv teskje Raney nikkel-hydrerings-katalysator (ek-vivalent med omkring 3 til 4 g, beregnet på tørrstoff). Blandingen rystes i et tidsrom på to timer i en hydreringsbombe ved et hydrogentrykk på 154 kg/cm<2> og ved 100° C. Bomben avkjøles derpå og hydrogen-trykket avlastes. Metanoloppløsningen filtreres for å fjerne katalysatoren og filtratet inndampes i vakuum hvorved man får 1,8 g dihydronovobiocin som et fast residum. ml of methanol is added to about half a teaspoon of Raney nickel hydrogenation catalyst (equivalent to about 3 to 4 g, calculated on dry matter). The mixture is shaken for a period of two hours in a hydrogen bomb at a hydrogen pressure of 154 kg/cm<2> and at 100° C. The bomb is then cooled and the hydrogen pressure is relieved. The methanol solution is filtered to remove the catalyst and the filtrate is evaporated in vacuo, whereby 1.8 g of dihydronovobiocin is obtained as a solid residue.

Dette materialet har dihydronovobiocinets egenskaper som angitt i det foregående. This material has the properties of dihydronovobiocin as indicated above.

Claims

1. Process for the production of a new synthetic antibiotic agent, characterized by allowing novobiocin or a salt of novobiocin react with hydrogen in a molar ratio of 1:1 and in the presence of a hydrogenation catalyst, whereby the dihydronovobiocin or dihydronovobiocin salt thus obtained is recovered from the reaction mixture.

2. Process according to claim 1, characterized in that novobiocin or the monosodium salt of novobiocin dissolved in a lower alkanol, preferably methanol, is allowed to react with hydrogen at essentially ordinary room temperature and at a pressure that quite slightly exceeds usual that atmospheric pressure, in the presence of a noble metal hydrogenation catalyst.