NO117986B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til frysetørring av ømfindtlige materialer.

Denne oppfinnelse vedrører frysetør-ring av ømfintlige materialer, særlig biologiske produkter.

Tørringen av mange sådanne materialer kan fremby vanskeligheter hvor

materialets natur er slik at det ødelegges eller skades ved vanlige tørreoperasjoner. I sådanne tilfelle kan man ofte anvende frysetørring da dette er en metode som i meget liten grad forårsaker skade på det materiale som man skal tørre. Fremgangs-måten omfatter frysning av det materiale som skal,tørres. Dette materiale kan være en oppløsning, en suspensjon eller et fuk-tik produkt. Etter frysningen sublimeres isen lirekte i vakuum.

Uttrykket «ømfintlige materialer» brukes her særlig om ømfintlige biologiske stoffer som f. eks. levende eller drepte organismer (f. eks. bakterier eller virus) enzymer, hormoner, ekstrakter av organer og lignende.

Eksempler på preparater som medfø-rer vanskeligheter ved tørringen er vaksiner. Således har man i forbindelse med vaksinering med Calmette og Guerin basiller (B. C. G. vaksinering) det problem å skaffe en vaksine sdm inneholder et tilstrekkelig stort antall levedyktige organismer på det tidspunkt vaksineringen skal foretas. Hittil har man for det meste utført vaksineringen med vandige suspensjoner av sådanne basiller, men slike suspensjoner må på grunn av hurtig tap av levedyktigheten kasseres etter omtrent åt-te uker. Eksport av vaksinesuspensjoner har således bare begrensede muligheter og fordelingen til klinikker og leger må fore-gå raskt. En annen alvorlig mangel ved vaksinen er at preparatet må innsprøytes før dets effektivitet, levedyktighetsgrad og frihet for forurensninger kan fastslås. Lignende vanskeligheter er vel kjent i forbindelse med andre biologiske produkter.

Anvendelse av frysetørring har ofte vært foreslått for å minske de vanskeligheter som er nevnt i forbindelse med B. C. G. vaksine, og der er herved oppnådd fordeler forutsatt at frysetørringen er ut-ført omhyggelig. Således viser det seg, 1. eks. ved frysetørring av vaksiner inneholdende levedyktige organismer, f. eks. B. C. G. vaksine, at den prosentvise del av bak-teriene som overlever frysetørringen har for en stor del vært avhengig av arten av det medWrn i hvilket bakteriecellene er suspendert for tørring. Hva angår B. C. G. vaksine har man tidligere foreslått f. eks. å frysetørre organismene i hesteserum, ge-latinoppløsning, glukoseoppløsning, lakto-seoppløsning, denaturert gelatinsuspensjon og i oppløsninger av andre stoffer som f. eks. gummi acacia og melk. I forsknings-arbeide utført av oppfinneren har det vist seg at mange av de hittil foreslåtte tørke-medier har visse mangler. Således er f. eks. ulempen ved animalske proteiner den at de har anafylaktogeniske egenskaper og kan derfor fremkalle skadelige reaksjoner hos de personer som preparatet skal gis ved innsprøytning. Brukes menneskeserum i stedet for hesteserum, har man ikke denne ulempe, men på den annen side finnes der en liten risiko for at slike preparater inneholder hepatitis virus. Sukkerarter med lav molekylvekt (glukose, laktose) medfører ingen av disse ulemper, men hal-den tekniske mangel at de i særlig grad holder tilbake vann og på denne måte gjør frysetørreprosessen relativt hasardiøs når det dreier seg om ømfintlige materialer. Dessuten vil mange tørremedier, f. eks. glukose, skille seg ut under frysetørringen og føre til et meget stygt produkt.

Det er nå funnet at vandige dekstran-oppløsninger er et særlig fordelaktig medium ved frysetørring av ømfintlige materialer av den omtalte art. Som det er vel kjent, er dekstran et polysakkarid med en meget høy molekylvekt og kan fremstilles f. eks. ved hjelp av fermentering i sukro-seholdig medium av flere arter av slekten Leuconostoc.

Bruken av dekstran er fordelaktig av følgende grunner: a) Det er i alminnelighet ikke anti-gent og kan injiseres med fullstendig sik-kerhet for pasientene. b) Det kan steriliseres ved behandling i autoklav og er helt stabilt (kfr. serum-protein som må steriliseres ved filtrering). c) I alminnelighet gir det likeså god beskyttelse for ømfintlige materialer som

hvilket som helst hittil foreslått frysetør-ringsmedium.

d) I alminnelighet gir det et godt produkt som lett kan rekonstitueres ved

tilsetning av vann så at der dannes en oppløsning eller suspensjon uten synlig klumpning.

Bruken av en dekstranoppløsning som medium ved frysetørring av biologiske produkter er særlig fordelaktig ved tørring av vaksiner, hormoner, virus-suspensjoner og lignende. Det har vist seg at særlig gode resultater oppnås ved tørring av vaksiner når man bruker vandig dekstran som tør-remedium og at mange mangler ved andre medier blir redusert i betydelig grad. Ved vaksiner som inneholder levedyktige organismer har man dessuten funnet at de resulterende preparater har en særlig lang levetid og lett kan prøver før bruken så at man unngår en stor fare som er for-bundet f. eks. med flytende vaksiner.

Oppfinnelsen består i en fremgangsmåte til frysetørring av ømfintlige materialer av den omtalte art ved hvilken det ømfintlige materiale som skal tørres til-blandes en, vandig dekstranoppløsning og den resulterende blanding frysetørres.

Ifølge oppfinnelsen er de ømfintlige materialer som skal frysetørres levende eller drepte organismer, særlig levende eller drepte bakterier eller virus eller enzymer.

Det materiale som skal tørres, kan og-så være en vaksine, særlig en sådan som

inneholder basiiler av typen Calmette og Guerin.

Som det er vel kjent, kan polysakkari-der som går under navnet dekstran ha meget varierende molekylvekt, og det er således alminnelig for farmasøytisk bruk, f. eks. som blodplasmasubstitutter, å frak-sjonere dekstranet for å skille en fraksjon innen et spesielt molekylvektområde. Særlig kan injisering av molekyler med meget høy molekylvekt være uønsket. For opp-finnelsens øyemed foretrekkes det å bruke dekstran med en molekylvekt i området fra 10,000 til 100,000, hensiktsmessig fra 30,000 til 50,000. Gode resultater har man f. eks. oppnådd ved frysetørring av vaksiner under bruk av dekstran med en molekylvekt på omtrent 30,000.

Det anvendte dekstran bør helst være saltfattig. Det foretrekkes at det vandige materiale som skal tørres inneholder fra 1 til 10 vekt/vol pst. dekstran. Bruken av mindre enn 1 pst. har tendens til å gi dår-lige resultater, mens bruken av imere enn 10 pst. gjør det vandige materiale for vis-kositet til å kunne håndteres bekvemt. Det har f. eks. vist seg ved tørringen av vaksiner at tilsetning av 6 pst. dekstran til det vandige materiale som skal tørres, gir gode resultater.

For så meget som mulig å unngå klumning eller sammenklebning av det tørrede produkt når det påny suspenderes eller oppløses i vann, er det å foretrekke at suspensjonen eller oppløsningen som skal frysetørkes, inneholder et passende fuktemiddel. Når produktet er bestemt til å inn-tas som medisin, bør fuktemidlet være ikke giftig, hvorved forståes at det ikke må frembringe giftvirkninger når vaksinen gis. Ved «passende» forståes at fuktemidlet ikke må influere på kvaliteten av det produkt som skal tørre. Mange fuktemidler inneholder frie fettsyrer eller er ustabile, idet de danner frie fettsyrer i vandige oppløsninger, og da fettsyrer vir-ker drepende på mange organismer, særlig på B. C. G., ville sådanne fuktemidler væ-re uhensiktsmessige ved tørring av levedyktige vaksiner. Det fuktemiddel som

brukes må derfor være stabilt, fritt for

fettsyre og ikke i seg selv skadelig for det

produkt man skal tørre. I alminnelighet foretrekkes ikke-ioniske fuktemidler.

Det har vist seg at fuktemidler av klassen polyetylenoksyder er hensiktsmes-sige for øyemedet, og f. eks. har det fuktemiddel som er kjent under navn Triton W. R. 1339 vist seg å være særlig hensiktsmessig ved tilberedelsen av frysetørrede B. C. G. vaksiner. Således gir f. eks. 1 del av dette fuktemiddel i 4000 deler suspensjons-produkter gode resultater.

Frysetørringsoperasjonen selv kan utfø-res på hvilken som helst hensiktsmessig måte. Materialet som skal tørres, kan således anbringes i en hensiktsmessig beholder som kjøles til en lav temperatur, f. eks. ved bruk av et fast CO:>/aceton-bad, inntil det vandige materiale er helt gjen-nomfrosset. Beholderne blir da evakuert til et meget lavt trykk og vann fordampes i sådan utstrekning at resten i beholderne forblir frossen. Prosessen fortsettes om nødvendig med økning av vakuumet inntil det ønskede restfuktighetsinnhold er oppnådd.

Det skal nevnes at det ved tilberedelsen av frysetørrede vaksiner fra levende organismer, f. eks. B. C. G., er mulig å tør-re produktet for fullstendig å derved drepe den organisme som det er viktig å holde i live i tilstrekkelig stort antall. På den annen side må der ikke bli igjen for meget vann i det 'frysetørrede produkt, da ødeleggelse (tap av levedyktighet) i så fall vil finne sted ved lagring. Det er derfor ønskelig å tørke vaksinen i en sådan utstrekning at den er så tørr som mulig, uten at der foregår noe vesentlig tap av levedyktigheten.

Mengden av restfuktighet i produktet kontrolleres ved a) effektiviteten av fryse-tørreapparatet (dvs. kondensatortemperatur og vakuumgrad), b) behandlingstiden og c) tørkemediets natur. Bruken av dekstran overensstemmende med oppfinnelsen medfører at det er særlig lett å «overtørre» produktet, og det er hensiktsmessig å kon-trollere mengden av restfuktighet ved i dekstranmediet å føre inn et eller annet indifferent stoff som i sterk grad holder tilbake vann, f. eks. glukose som i passende konsentrasjon vil muliggjøre at den optimale mengde fuktighet opprettholdes under de tørkebetingelser som brukes. Det har f. eks. med et vakuum av 0,05—0,1 mm Hg og en kondensatortemperatur av —70° C vist seg ved eksperimenter at omtrent 0,7 pst. glukose tilsatt til 10 pst. dekstran-oppløsning gir den optimale levedyktighet. Den optimale mengde glukose ved andre betingelser kan lett fastslåes ved forsøk.

Det er også mulig å holde tilbake den nødvendige mengde restfuktighet i en vaksine som inneholder dekstran alene (ikke glukose) som tørkemedium ved å stanse tørkningen når det optimale vanninnhold er nådd. Analytisk kontroll av produktet og kontroll av apparatet kan imidlertid være for brysomt til å være praktisk og den alternative metode som er nevnt foran er å foretrekke. At bruken av dekstran som tørkemiddel muliggjør oppnåelsen av materialer med særlig lavt fuktighetsinnhold er allikevel meget ønskelig i mange tilfelle, f. eks. ved tørring av vaksiner som ikke inneholder levedyktige organismer.

I det følgende beskrives som eksempler noen utførelsesformer for oppfinnelsen.

Eksempel 1.

Frysetørring av B. C. G. vaksine.

Et forut bestemt antall av levedyktige B. C. G. organismer samles fra en suspensjon av fysiologisk saltoppløsning, kultur-medium eller annen vandig væske ved sentrifugering. Cellene blir deretter påny suspendert i en 6 vekt/volum-pst.'s opp-løsning av dekstran i 5 pst. vandig glukose-oppløsning som inneholder 1 del Triton W. R. 1339 pr. 4000 deler. Der tilsettes tilstrekkelig oppløsning til å gi et kjent antall bakterier pr. ml. Suspensjonen fylles deretter på passende beholdere (f. eks. ampuller) som avkjøles inntil suspensjonen fryser. Mens ampullene ennå er frosne, overføres de til en frysetørremaskin hvor vann under et trykk av 0,05—0,1 mm Hg og en kondensatortemperatur av —70° C fordampes fra den frosne suspensjon i en sådan utstrekning at den forblir frosset. Prosessen fortsettes, om nødvendig ved i det siste trin å overføre til et mere virksomt vakuumsystem inntil det resterende fuktighetsinnhold er meget lavt (mindre enn 0,5 vektprosent). Ampullene blir derpå for-seglet i evakuert tilstand eller etter å være fylt med en indifferent gass (f. eks. nitrogen). Ikke mindre enn 10 pst. av B. C. G. cellene bør overleve frysetørreprosessen.

Eksempel 2.

Frysetørring av drepte bakterievaksiner ( f. eks. H. pertussis- vaksine).

Celler av H. pertussis drept på en eller annen brukbar måte (f. eks. ved behandling med natriumetyl-kvikksølvtiosali-cylat, formalin, varme etc.) fraskilles i en sentrifuge og suspenderes påny i en opp-løsning av 6 vekt/volum-pst. dekstran i fysiologisk saltoppløsning. Suspensjonen fylles etter standardiseringen til et bestemt antall celler pr. ml på passende beholdere (glassflasker, ampuller etc.) og frysetør-res etter en innledende frysning på samme måte som B. C. G. vaksine.

Eksempel 3.

Frysetørring av virus.

En konsentrert suspensjon av influensa-

virus tilberedes etter en passende metode (f. eks. av eggkulturer eller av et homo-

genat av lungen av mus som på forhånd er infisert med viruset). Denne konsen-

trerte suspensjon tilsettes tre volumdeler av en oppløsning inneholdende 10 pst. dek-

stran og 6 pst. glukose, og væskene blandes.

Suspensjonen fylles deretter på passende

beholdere (f. eks. 2 ml ampuller) og fryses i en dypfrysemaskin ved —60° C. Ampulle-

ne blir mens de ennå er frosne, overført til et frysetørreapparat hvor frysetørre-

prosessen fortsettes som forklart i eksem-

pel 1. Overleveringen av viruspartiklene under frysetørkeprosessen fremgår av de-

res evne til å infisere befruktede hønseegg eller mus etter at virussuspensjonen er dannet påny ved tilsetning av vann.

Eksempel 4.

Frysetørring av enzymer.

Enzymet deoksyribonuclease isoleres

fra kulturfiltrater av visse stammer av Streptomyces albus ved hjelp av vanlige

operasjoner. I uren tilstand ødelegges en-

zymet raskt ved lagring i oppløsning. Det holdes derfor hensiktsmessig frysetørret.

Til det rå kulturfiltrat som inneholder deoksyribonuclease tilsettes dekstranpul-

ver så at man får en 5 vekt/volum-psfs oppløsning. Dekstranet oppløses ved for-

siktig rystning så at man unngår skum-

ning (hvilken ville forårsake inaktivering av anzymet) og oppløsningen overføres til en passende beholder, f. eks. en rund kol-

be og fryses ved —60° C i en dypfryser.

Kolben inneholdende den ennå frosne opp-

løsning forbindes med en frysetørrema-

skin. Frysetørringen utføres deretter som i eksempel 1 og man får et tørt produkt med et fuktighetsinnhold på 0,5 pst. og inne-

holdende aktivt enzym.

Denne metode har også vært brukt for

oppløsninger av rå eller renset protein-

ase, peptidase og ribonuclease.

Eksempel 5.

Frysetørring av Streptomyces grisens

sporer.

70 ml av en kultur med sporer av Streptomyces griseus fortynnes med 10 ml

av en steril oppløsning (4 vekt/vol-pst.)

av rå, ikke avbygget bakterielt dekstran så

at den endelige dekstrankonsentrasjon er 0,5 vekt/vol pst. Denne blanding fylles på

sterile ampuller i mengder av 2,5 ml. Am-

pullene fryses hurtig ved å neddykkes i en blanding av lett petroleum og fast kull-

dioksyd og tørres i en tørreinnretning un-

der et vakuum av 50 uHg i 48 timer. Tørr nitrogen tilføres til tørreapparatet, bom-

ullspropper trykkes ned og en ytterligere tørring utføres over fosforpentoksyd un-

der et vakuum av 50 (.iHg i fire dager. Til-

slutt ledes tørr nitrogen igjen inn i tørre-

apparatet før ampullene forsegles.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte ved frysetørring av ømfintlige materialer, spesielt biologiske produkter karakterisert ved at materiale-

ne blandes med en vandig oppløsning av dekstran og den resulterende blanding fry-setørres til ønsket fuktighetsinnhold.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 eller 2, karakterisert ved at de ømfintlige materialer som skal tørres er levende eller drepte organismer eller enzymer.

3. Fremgangsmåte ifølge en av de foregående påstander, karakterisert ved at materialene som skal tørres er levende eller drepte bakterier eller virus.

4. Fremgangsmåte ifølge en av de foregående påstander, karakterisert ved at det materiale som skal tørres er en vaksine.

5. Fremgangsmåte ifølge en av de foregående påstander, karakterisert ved at det materiale som skal tørres er et vaksine-preparat som inneholder levedyktige organismer av Calmette- og Guerin-typen.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at det anvendte dekstran har en molekylvekt hovedsakelig innen området mellom 10,000 og 100,000, fortrinsvis innen området fra 30,000 til 50,000.

7. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at den vandige blanding som skal tørres inneholder fra 1 til 10 pst. dekstran.

8. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at et passende fuktemiddel in-korporeres i den vandige blanding som skal tørres.

9. Fremgangsmåte ifølge påstand 9,karakterisert ved at fuktemidlet er ikke ionisk. i

10. Fremgangsmåte ifølge hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at den vandige blanding som skal tørres, inneholder en indifferent sub-stans som i sterk grad fastholder vann, hvorved fuktighetsinnholdet i det produkt som skal tørres kan reguleres.