NL9300131A - Werkwijze voor het fractioneren van zetmeel. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze voor het fractioneren van zetmeel.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het fractioneren van zetmeel waarbij gebruik wordt gemaakt van het enzym aardappelfosforylase.

De meeste zetmeelsoorten bestaan uit korrels waarin 2 typen glucosepolymeren voorkomen, namelijk amylose (15 tot 35 gew.% op de droge stof) en amylopectine (65 tot 85 gew.% op de droge stof). Amylose bestaat uit niet of weinig vertakte moleculen met een gemiddelde polymerisatiegraad van 1.000 tot 5.000 (afhankelijk van de zetmeelsoort). Amylopectine bestaat uit sterk vertakte moleculen met een gemiddelde polymerisatiegraad van 2.000.000. Amylose en amylopectine bezitten wezenlijk verschillende eigenschappen bij toepassing in waterige oplossingen en in gedroogde filmlagen. Amylose heeft goede gelerende en filmvormende eigenschappen. Amylopectine, daarentegen, heeft goede eigenschappen als verdikkingsmiddel, stabilisator en bindmiddel. Bovengenoemde eigenschappen van amylose en anylopectine komen in oplossingen en zetmeelfilms slechts gedeeltelijk tot gelding omdat amylose en amylopectine hierin in gemengde vorm aanwezig zijn. In deze oplossingen en films werken amylose en amylopectine elkaar min of meer tegen, waardoor hun goede eigenschappen als afzonderlijke fractie ten dele verloren gaan.

Al sinds 1940 zijn veel methoden ontwikkeld om amylose-bevattende zetmelen te scheiden in de fracties amylose en amylopectine. Deze werkwijzen worden met de term fractionering aangeduid. Door fractionering van zetmeel worden verrijkte amylose- en amylopectinefracties verkregen, die de meer specifieke eigenschappen bezitten welke in veel toepassingen gewenst worden.

Bekende methoden voor het fractioneren van zetmeel zijn chromatografische scheiding, uitlogen van amylose uit verstijfselde zetmeelkorrels, fractioneren met complexvormers, gefractioneerde precipitatie, fractioneren door uitzouten met magnesiumsulfaat en fractionering door retrogradatie. Deze methoden zijn beschreven door A.H. Young in het hoofdstuk "Fractionation of starch" in het boek van R.L. Whistler, J.N. Bemiller en E.F. Paschall (Eds.), Starch: Chemistry and Technology, Second Edition, 1984, Academic Press, p. 249-283. Geen van deze methoden bleek echter uiteindelijk economisch uitvoervoer te zijn.

Vanwege de specifieke eigenschappen van de door fractionering uit zetmeel verkregen fracties amylose en amylopectine, blijft er behoefte bestaan aan nieuwe werkwijzen voor het fractioneren van zetmeel. De uitvinding betreft een nieuwe werkwijze voor het fractioneren van zetmeel, waarbij men aardappelfosforylase laat inwerken op een waterige zetmeeloplossing, waarin tevens opgelost fosfaat aanwezig is, en de verkregen vaste amyloserijke fractie afscheidt van de resterende vloeibare fractie van de oplossing. De uitvinding is gebaseerd op het verrassende fenomeen, dat in een waterige zetmeeloplossing, waarin aardappelfosforylase en fosfaat aanwezig zijn, een goed separeerbaar vast amyloserijk produkt kan worden gevormd.

Onder zetmeel wordt hier verstaan een zetmeel met meer dan 15 gew.% amylose op de droge stof. Iedere variëteit van amylose-bevattend zetmeel kan volgens de uitvinding toegepast worden zoals aardappelzetmeel, maïszetmeel, tapiocazetmeel, tarwezetmeel, sagozetmeel, erwtenzetmeel en hoog-amylose-zetmeel. Bij voorkeur wordt aardappelzetmeel toegepast. Aardappelzetmeel bevat amylose met een relatief hoog molecuul-gewicht. Hoogmoleculaire amylose geeft sterkere en meer coherente films en coatings. Volgens de uitvinding kan men ook gemodificeerd zetmeel toepassen, dat verkregen is door chemische enzymatische en/of fysische modificatie van natief zetmeel. De term zetmeel als hierin gebruikt omvat tevens dergelijke gemodificeerde zetmelen.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt uitgevoerd in een waterig milieu. De toe te passen zetmeeloplossing kan aangemaakt worden door een waterige zetmeelsuspensie te verhitten boven de verstijfselingstemperatuur van het zetmeel, bijvoorbeeld met behulp van een stoomstraalinrichting (gewoonlijk aangeduid als jet-cooker). De toe te passen zetmeelconcentratie ligt bij voorkeur tussen 3 en 40 gew.% en liefst tussen 5 en 30 gew.%.

Aardappelfosforylase (EC 2.4.1.1.) komt voor in aardappelsap. Aardappelsap is een produkt dat vrijkomt bij de industriële produktie van aardappelzetmeel uit aardappelen.

Het aardappelsap bevat verder onder andere opgeloste eiwitten, peptiden, amiden, aminozuren, lipiden, citroenzuur, kalium en fosfaatzouten. Dit aardappelsap kan in principe volgens de uitvinding toegepast worden als bron van aardappelfosforylase en fosfaat. Bij voorkeur wordt dit aardappelsap echter zodanig verhit en/of aangezuurd, dat de opgeloste eiwitten coaguleren, zonder dat de aardappelfosforylase geïnactiveerd wordt. Daarna wordt het aardappelsap geklaard, waarbij het gecoaguleerde eiwitmateriaal en andere vaste componenten door filtreren of centrifugeren uit de oplossing verwijderd worden. Het aldus geklaarde aardappelsap is een relatief goedkope bron van aardappelfosforylase. Desgewenst kan uit dit geklaarde aardappelsap via bekende technieken aardappelfosforylase geïsoleerd worden en als gezuiverd preparaat toegepast worden. De toe te passen aardappelfosforylasepreparaten mogen slechts geringe hoeveelheden storende enzymen bevatten zoals alfa-amylase, fosfatase en/of vertakkingsenzym.

Bij de uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding is het noodzakelijk dat in de zetmeeloplossing tevens een opgeloste fosfaatverbinding aanwezig is. Als fosfaatverbinding kan een willekeurige in water oplosbare anorganische fosfaatverbinding of glucose-1-fosfaat toegepast worden. Aardappelsap bevat van nature zowel aardappelfosforylase als opgeloste fosfaatverbindingen en kan dus als bron voor beide produkten dienen, zonodig kan extra fosfaat aan het reactie-medium toegevoegd worden indien te weinig fosfaat in het aardappelsap aanwezig is. Het is ook mogelijk gezuiverde fosforylasepreparaten en fosfaatverbindingen als afzonderlijke componenten>aan de zetmeeloplossing toe te voegen. De te gebruiken hoeveelheid fosfaat kan door een deskundige aan de hand van eenvoudige proeven worden bepaald.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt bij voorkeur uitgevoerd bij pH-waarden die liggen tussen 5 en 9 en liefst tussen 6 en 8. Om de pH van het reactiemengsel op de gewenste pH te houden kan zonodig een buffer toegepast worden zoals acetaten, fosfaten of citraten. De toe te passen reactie-temperatuur ligt bij voorkeur tussen 0 en 60°C en liefst tussen 20 en 45°C. De reactietijd is niet gelimiteerd maar ligt bij voorkeur tussen 1 en 100 uur. De reactie wordt bij voorkeur onder steriele omstandigheden uitgevoerd en dan hoeft in principe geen conserveermiddel tegen microbiologisch bederf van de zetmeeloplossing te worden toegepast. Zo nodig kunnen evenwel volgens de desbetreffende regelgeving toegelaten conserveermiddelen in de te behandelen zetmeeloplossing worden opgenomen.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding kan men het reactiemengsel wel of niet roeren. Roeren heeft als voordeel dat een betere warmteoverdracht plaatsvindt. Het roeren heeft echter als nadeel dat slechts een kleine amylosevlok gevormd wordt, die moeilijk afscheidbaar is. Wanneer men niet roert ontstaat een grotere amylosevlok, die goed afscheidbaar is. Bovendien vindt in een niet-geroerd reactiemengsel een slechte zuurstofoverdracht plaats, hetgeen gunstig is voor het tegengaan van microbieel bederf. In het algemeen wordt de voorkeur gegeven aan een niet-geroerd reactiemengsel.

Bij toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding vormt zich in de zetmeeloplossing een vaste amyloserijke fase, die voor meer dan 40 gew.% (op de droge stof) uit amylose bestaat. Dit vaste produkt kan uit de oplossing afgescheiden worden bijvoorbeeld door filtreren, centrifugeren of separeren. Het afgescheiden amyloseprodukt kan daarna gewassen en gedroogd worden. Amyloseprodukten hebben goede eigenschappen als geleermiddel en filmvormer. Op grond van deze eigenschappen kunnen amyloseprodukten voor diverse toe- passingen met voordeel gebruikt worden, zoals beschreven is in de hiervoor vermelde publicatie van A.H. Young.

Nadat het vaste amyloserijke materiaal uit het reactiemedium is afgescheiden, resteert een amylopectine-oplossing, die als zodanig verder verwerkt kan worden tot zetmeelhydrolysaten. Het opgeloste amylopectine kan echter ook via bekende methoden uit de oplossing geïsoleerd worden, bijvoorbeeld door uitzouten met magnesiumsulfaat. Het is ook mogelijk om de amylopectine-oplossing te drogen. De verkregen amylopectineprodukten hebben goede eigenschappen als verdikkingsmiddel, bindmiddel en stabilisator. Op grond van deze eigenschappen kunnen amylopectineprodukten voor diverse toepassingen met voordeel gebruikt worden, zoals beschreven is in de hiervoor vermelde publicatie van A.H. Young.

De uitvinding wordt verder toegelicht door de volgende voorbeelden. In deze voorbeelden worden een aantal begrippen en bepalingsmethoden gebruikt die hierna toegelicht worden. De opbrengst is gedefinieerd als de totale hoeveelheid droge stof van de afgescheiden amyloserijke fractie. Onder amyloserijke fractie worden de afgescheiden zetmeelprodukten verstaan met een amylosegehalte van meer dan 40 gew.% op de droge stof. Het uitgangsmateriaal aardappelzetmeel heeft een amylosegehalte van ongeveer 23 gew.%. Het amylose-gehalte van de zetmeelprodukten wordt bepaald door middel van gelpermeatiechromato-grafie (GPC) en door bepaling van de jodiumblauw-waarde. Onder zuiverheid van de amyloserijke fractie wordt verstaan het amylose-gehalte in gewichtprocent berekend op de droge stof. Onder zuiverheid van de verrijkte amylopectinefractie wordt verstaan het amylopectine-gehalte in gewichtsprocenten berekend op de droge stof. Het molecuulgewicht van de in de afgescheiden amylosefractie aanwezige airylosemoleculen wordt bepaald door middel van gelpermeatiechromatografie (GPC). De vertakkingsgraad van de zetmeelprodukten wordt bepaald door eerst de zetmeelmoleculen te onttakken met isoamylase en vervolgens het reducerend vermogen van het onttakte zetmeelhydrolysaat te bepalen.

Voorbeeld 1 a) Bereiding van het enzvmpreoaraat 3,4 kg aardappelen (ras Bintje) werden gewassen en in aanwezigheid van 0,1% (w/w) natriumbisulfiet gehakseld. De gehakselde aardappelen werden met een sapcentrifuge gehomogeniseerd en gescheiden in 2 fracties, namelijk aardappelsap enerzijds en zetmeel + vezels anderzijds. Het aardappelsap werd vervolgens gecentrifugeerd. Het heldere supernatant (aangeduid als SI) werd aan een warmtebehandeling onderworpen in een buisreactor, die op een temperatuur van 54°C werd gehouden. Het supernatant Sl werd door deze buisreactor gepompt met een verblijftijd van 15 minuten. Vervolgens werd het gevormde eiwitneerslag door centrifugatie uit de vloeistof verwijderd. De resterende heldere vloeistof-fase wordt aangeduid als S2. De fosforylase-activiteit in Sl en S2 bedroeg respectievelijk 5,4 units/ml en 3,4 units/ml. De amylase-activiteit in Sl en S2 bedroeg respectievelijk 1,623 units/ml en 0,014 units/ml.

b) Fra.ctionering in aanwezigheid van anorganisch fosfaat zonder roeren.

3125 g aardappelzetmeel (20 gew.% vocht) werd in water opgeroerd tot een suspensie van 20 liter. De zetmeelsuspensie werd verstijfseld door middel van een jet-cooker bij 120°C. De verkregen zetmeeloplossing werd gekoeld tot 37°C. Onder roeren werd enzympreparaat toegevoegd (304 ml S2; 50 units fosforylase per liter reactiemengsel). De concentratie in water-oplosbaar anorganisch fosfaat in het mengsel werd ingesteld op 20 micromol per liter. De pH van het reactie-mengsel werd met verdund zoutzuur ingesteld op 7,0. Het reactiemengsel werd zonder roeren gedurende 20 uur op een temperatuur van 30°C gehouden. Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende 24 uur bij 4°C bewaard. De ontstane vaste amyloserijke fractie werd door middel van centrifugeren (Beekman, type J2-21M/E, Rotor JA-14), gedurende 10 minuten bij 5.000 rpm an kamertemperatuur, afgescheiden van de vloeibare fase. Het amyloseprodukt werd vervolgens tweemaal gewassen met gedemineraliseerd water en gecentrifugeerd. De opbrengst gedroogd amyloseprodukt bedroeg 333 g, overeenkomend met 13 gew.% van het aardappelzetmeel (op de droge stof). In de resterende vloeistof is de verrijkte amylopectinefractie opgelost.

De geïsoleerde amyloserijke fractie en de opgeloste verrijkte amylopectinefractie werden gekarakteriseerd door middel van GPC, jodiumkleur en vertakkingsgraad. De amyloserijke fractie had een zuiverheid van 75%. De vertakkingsgraad van de amyloserijke fractie bedroeg 0,19 mol-%. Het molecuul-gewicht van de amylosemoleculen bedroeg 340.000 Dalton (gewichtsgemiddelde). De verrijkte amylopectinefractie had een zuiverheid van 96%. De vertakkingsgraad van de amylopectinefractie bedroeg 3,5 mol-%.

Voorbeeld 2

Volgens dit voorbeeld wordt gefractioneerd in aanwezigheid van in water oplosbaar anorganisch fosfaat in een geroerde reactor. 250 g aardappelzetmeel (20 gew.% vocht) werd opgeroerd met water tot een suspensie van 2 liter. De zetmeel-suspensie werd verstijfseld door middel van een jet-cooker bij 120°C. De zetmeeloplossing werd gekoeld tot 37°C. Onder roeren werden vervolgens 31 ml enzympreparaat S2 (verkregen volgens voorbeeld la) toegevoegd. De concentratie anorganisch fosfaat werd ingesteld op 20 micromol per liter. De pH van het reactiemengsel werd met verdund zoutzuur Ingesteld op 7. Het reactiemengsel werd onder roeren (12 rpm) gedurende 24 uur op een temperatuur van 40°C gehouden. Vervolgens werd het reactiemengsel gedurende 24 uur bij 4°C bewaard. De verkregen vaste amyloserijke fase werd door centrifugeren (als in voorbeeld lb) van de vloeibare fase afgescheiden, gewassen en gedroogd. De opbrengst amyloseprodukt bedroeg 26 g. De karakterisering van beide fracties vond plaats als in voorbeeld lb is beschreven. De amyloserijke fractie had een zuiverheid van 47%. De vertakkingsgraad van de amyloserijke fractie bedroeg 1,20 mol-%. Het molecuulgewicht van de amylosemoleculen bedroeg 280.000 Dalton (gewichtsgemiddelde). De verrijkte amylopectinefractie had een zuiverheid van 96%.

De vertakkingsgraad van de amylopectinefractie bedroeg.

3,7 mol-%. Uit dit voorbeeld blijkt dat roeren van het reactiemengsel een ongunstige invloed heeft op de zuiverheid van de amyloserijke fractie.

Voorbeeld 3 a) Bereiding van het gezuiverde aardanoelfosforvlase.

Als uitgangsmateriaal voor de zuivering dient het preparaat S2 genoemd onder la.

Het ruwe enzympreparaat is gezuiverd door middel van (F)ast (P)rotein (L)iquid (C)hromatografie over een high-load mono Q kolom (ionenwisselaar).

Voor de chromatografie wordt de oplossing eerst gedialyseerd tegen 20 mM Tris/HCl, pH = 7,6, teneinde laag-molculaire componenten te verwijderen en zouten uit te wisselen tegen de startbuffer voor de ionenwisselings-chromatografie.

Tijdens de chromatografie wordt een stapgsgewijze zoutgradiënt aangelegd (0-1M NaCl). Het grootste deel van het eiwit elueert bij een zoutconcentratie van 0 tot 0,5 M NaCl. Bij een zoutconcentratie tussen 0,5 en 0,6 M NaCl elueert het fosforylase van de kolom. Van het opgebrachte fosforylase wordt 90-100% teruggewonnen in één piek. De totale hoeveelheid eiwit in deze piek representeert 4% van het totaal opgebrachte eiwit. Het fosforylase bevindt zich in 20 mM Tris/HCl pH = 7,6 + 0,53 M NaCl.

De zuiverheid van het fosforylase kon worden aangetoond door middel van elektroforese. Bij elektroforese op gradiënt-gelen kon na eiwitkleuring met Coomassie Blue één band worden aangetoond met een molecuulgewicht van 200.000 Dalton.

De activiteit van het gezuiverde fosforylase bedraagt 1,5 units/ml.

b) Fractionerinq in aanwezigheid van anorganisch fosfaat zonder roeren.

250 g aardappelzetmeel (20% vocht) werd opgeroerd met water tot een suspensie van 2 liter. De zetmeelsuspensie werd verstijfseld door middel van een jet-cooker bij 150°C. Van de verkregen zetmeeloplossing werd 864 ml gekoeld tot 37°C. De pH van de oplossing werd met verdund zuur ingesteld op 7,0. Onder roeren werden toegevoegd 136 ml gezuiverde fosforylase en 20 micromol/liter in water oplosbaar anorganisch fosfaat. Het reactiemengsel werd zonder roeren 24 uur op een temperatuur van 37°C gehouden. De ontstane vaste amyloserijke fractie werd afgecentrifugeerd, gewassen en gedroogd. De opbrengst amyloseprodukt bedroeg 12,9 g. De amylosefractie had een zuiverheid van 80%.

Voorbeeld 4 (vergelijkingsvoorbeeld)

Indien men voorbeeld 3b herhaalt, waarbij men echter geen fosforylase toevoegt, vindt geen fractionering plaats als in voorbeeld 3b is beschreven. Hieruit blijkt, dat de inwerking van fosforylase noodzakelijk is voor het verkrijgen van een goed afscheidbare vaste amyloserijke fase.

Voorbeeld 5

Volgens dit voorbeeld wordt gefractioneerd in aanwezigheid van glucose-1-fosfaat zonder roeren. Het toegepaste aardappelfosforylasepreparaat werd verkregen volgens de methode die in voorbeeld 3a is beschreven.

250 g aardappelzetmeel (20% vocht) werd opgeroerd met water tot een suspensie van 2 liter. De zetmeelsuspensie werd verstijfseld door middel van een jet-cooker bij 150°C. Van de verkregen zetmeeloplossing werd 864 ml gekoeld tot 37°C. De pH van deze oplossing werd met verdund zuur ingesteld op 7,0.

Onder roeren werden toegevoegd 136 ml gezuiverde aardappel-fosforylase en 10 irtM/1 dinatrium-a-D-glucose-l-fosfaat toegevoegd. Het reactiemengsel werd zonder roeren 24 uur op een temperatuur van 37°C gehouden. De ontstane vaste amylosefractie werd afgecentrifugeerd, gewassen en gedroogd.

De opbrengst aan amyloseprodukt bedroeg 28,5 g. Deze amylose-fractie had een zuiverheid van 97%. De vertakkingsgraad bedroeg 0,53%. Het molecuulgewicht van de amylosemoleculen bedroeg 590.000 Dalton (gewichtsgemiddelde).

Voorbeeld 6 (vergelijkingsvoorbeeld)

In dit voorbeeld wordt aangetoond dat aardappel-fosforylase in actieve vorm noodzakelijk is voor het verkrijgen van een goed af scheidbare vaste amylosefractie.

Aardappelsap Sl (van voorbeeld la) werd op een kokend waterbad verhit gedurende 5 minuten. Door dit kookproces wordt het in het aardappelsap aanwezige aardappelfosforylase grotendeels geïnactiveerd. Na het kookproces werd het neerslag door centrifugeren uit de oplossing verwijderd. Het heldere supernatant werd volgens onderstaande werkwijze toegepast, in plaats van het aardappelfosforylasepreparaat, dat toegepast werd in voorbeeld 1b.

De werkwijze volgens voorbeeld lb werd herhaald, waarbij echter in plaats van 304 ml S2 (verkregen volgens voorbeeld la) 304 ml van bovengenoemd heldere supernatant (met geïnactiveerde fosforylase) werd toegepast. Na 20 uur incubatie bij 30°C en 24 uur bewaren bij 4°C werd een troebele oplossing verkregen. Het bleek niet mogelijk om een vast amyloserijk produkt af te scheiden.

Claims (13)

1. Werkwijze voor het fractioneren van zetmeel, met het kenmerk, dat men aardappelfosforylase laat inwerken op een waterige zetmeeloplossing, die tevens opgelost fosfaat hervat, en de verkregen vaste amyloserijke fractie afscheidt van de resterende vloeibare fase van het reactiemengsel.

2. Werkwijze volgens conclusie l, met het kenmerk, dat men aardappelfosforylase toepast in de vorm van onteiwit aardappelsap.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men aardappelfosforylase toepast in de vorm van een door zuivering uit aardappelsap verkregen preparaat.

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men als opgelost fosfaat een anorganische fosfaatverbinding toepast.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men als opgelost fosfaat glucose-1-fosfaat toepast.

6. Werkwijze volgens conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de zetmeelconcentratie in het reactiemengsel ligt tussen 3 en 40 gew.%.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de zetmeelconcentratie in het reactiemengsel ligt tussen 5 en 30 gew.%.

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de pH van het reactiemengsel ligt tussen 5 en 9.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de pH van het reactiemengsel ligt tussen 6 en 8.

10. Werkwijze volgens conclusies 1-9, met het kenmerk, dat de reactietemperatuur ligt tussen 0 en 60°C.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de reactietemperatuur ligt tussen 20 en 45°C.

12. Werkwijze volgens conclusies l-ll, met het kenmerk, dat het reactiemengsel tijdens het uitvoeren van de fractionering niet wordt geroerd.

13. Werkwijze volgens conclusies 1-12, met het kenmerk, dat men als zetmeel aardappelzetmeel toepast.