NL8120136A - - Google Patents

Description

- 1 - 81 2 O 1 3 6 ki^'" | j | la-Hydroxy-28-fluorcholecalciferol.

Onderwerp van de uitvinding,

De hierin beschreven uitvinding kwam tot stand | tijdens werk met een schenking van het Department of Health»

Education and Welfare.

5 De uitvinding heeft betrekking op een verbinding met vitamine D-achtige activiteit.

De uitvinding heeft meer in het bijzonder betrekking op een derivaat van vitamine D^.

Vitamine D^ is een bekend middel om de calcium- 10 en fosfor homeostase te regelen. Zoals bekend stimuleert deze verbinding normaal bij mens en dier het intestinale calciumtransport en de mobilisatie van calcium uit bot» en is hij doeltreffend om \ rachitis te voorkomen.

Ook is algemeen bekend» dat wil vitamine D^ werk-j 15 zaam zijn, het in vivo moet worden omgezet in de gehydroxyleerde vormen daarvan. Het vitamine wordt bijvoorbeeld eerst in de lever j gehydroxyleerd tot 2 5-hydroxyvitamine D^» enidaarna in de nieren gehydroxyleerd tot la,25-dihydroxyvitamine D3 of 24,25-dihydroxy-vitamine D^. De Ια-gehydroxyleerde vorm van het vitamine wordt in 20 het algemeen beschouwd als de fysiologisch actieve of hormonale i | vorm van het vitamine, en verantwoordelijk geacht voor wat de vitamine D-achtige activiteiten worden genoemd zoals verhoogde resorptie van calcium en fosfaat uit de darm en mobilisatie van calcium uit het bot, en retentie van calcium in de nieren.

25 Stand van de techniek.

In de octrooi- en andere literatuur zijn verschillende vitamine D derivaten beschreven. Zie bijvoorbeeld de Amerikaanse octrooischriften 3.565.924 dat betrekking heeft op 25-hydroxy-

cholecalciferol; 3.697.559 dat betrekking heeft of 1,25-dihydroxy- I

30 cholecalciferol; 3.741.996 dat betrekking heeft op la-hydroxy- j cholecalciferol; 3.907.843 dat betrekking heeft op Ια-hydroxyergo- j calciferol; 3.715.374 dat betrekking heeft op 24,25-dihydrochole- i . ! 8120136 \ _ 2 _ calciferol; 3.739.001 dat betrekking heeft op 25,26-dihydroxy-i cholecalciferol; 3.786.062 dat betrekking heeft op 22-dehydro- 25-hydroxycholecalciferol; 3,847.955 dat betrekking heeft op 1,24,25-trihydroxycholecalciferol; 3.906.014 dat betrekking heeft 5 op 3-deoxy-la-hydroxycholecalciferol; 4.069.321 dat betrekking heeft op verschillende zijketen gefluoreerde vitamine derivaten en zijketen gefluoreerde dihydrotachysterol^ analoga.

Een nieuw derivaat van vitamine is bereid dat i uitstekende vitamine D-achtige activiteit vertoont zoals bepaald 10 door het vermogen om het intestinale calciumtransport te stimuleren,; in het vermogen om calcium uit botweefsel te mobiliseren, in het j vermogen om het serum mineraal fosfor te verhogen, en in de anti-rachitische activiteit zoals bepaald door ratteproeven. Een dergelijke verbinding zou daarom in aanmerking kunnen komen als een 15 vervanging voor vitamine D in verschillende bekende toepassingen daarvan, en zou nuttig kunnen zijn voor het behandel-en van verschillende metabole botaandoeningen.

Dit derivaat is geïdentificeerd als la-hydroxy-20-fluorcholecalciferol (la-OH-2$F-cholecalciferol, lo-OH-2BF-20 vitamine D3 of la-OH-2f5F-D3·

Beste manier om de uitvinding te realiseren.

De verbinding volgens de uitvinding werd bereid zoals hierna beschreven aan de hand van het reactieschema.

De uitgangsverbinding la (l,2a-epoxycholest-5-en- i 25 3^-yl tetrahydropyranylether) werd behandeld met pyridinium p-tolu- j eensulfonaat (0,1 mol.equiv.) in een 1:1 mengsel van CH-Cl- en MeOH ' O i i \ bij 55 C gedurende 5 uren onder vorming van de epoxyalcohol lb (75 % opbrengst, smeltpunt 105-107° C, 6 0,72 (3H, s, 18-Me), 1,15 (3H, s, 19-Me), 3,08 en 3,20 (2H, een paar doubletten, J = 4 Hz, 1- j 30 en 2-H), 3,90 (1H, m, 3-H), 5,5 (1H, m, 6-H), m/e 400 (M+), 382, 342, 287, 269). (De uitgangsverbinding la is gemakkelijk te verkrijgen met de methode volgens M. Morisaki, Ά. Saika, K. Bannai, M. Sawamura, J.R. Lightbourn en N. Xkekawa, Chem. Pharm. Buil. 23, 3272 (1975)).

35 Pogingen om fluor aan C-2 van de verbinding lb 8120136 - 3 - in te voeren met Et4NF of KF/dicyclohexyl-18-kroon-6 hadden geen succes. Maar bij verhitten van de verbinding lb met kaliumwater-stofdifluoride (Merck KF bevattend KHF2) in ethyleenglycol bij 170° C gedurende 1,5 uren ontstond het fluorhydrin 2 (48 % opbrengst, 5 smeltpunt 167-170° C, S 0,68 (3H, s, 18-Me), 1,13 (3H, s, 19-Me), 3,7 (1H, m, 3-H), 3,96 (1H, m, 1-H), 4,78 (1H, td, JHp = 50 Hz, J„_ - 3 Hz, 2-H), 5,6 (1H, m, 6-H), m/e 420 (M+), 405, 402, 400, tin 382, 307, 289, 265, 247). (Zie P.A. Grieco, T. Sugahara, Y. |

Yokoyama en E. Williams, J. Org. Chem., Φ4, 2189 (1979)).

10 De β-oriëntatie van het fluor aan C-2 werd voor speld uit diaxiale opening van het epoxyde en bevestigd door de koppelingsconstante (3 Hz) van het triplet van doubletten in de verbinding 2 hetgeen verenigbaar is met dihedrische hoeken Θ (H^-Η1)=Θ(Η2-Η3)=60°. De omzetting van de verbinding 2 in 20-fluor-la-15 hydroxy vitamine D3 (verbinding 3) werd uitgevoerd volgens standaard vitamine D techniek. Daarbij werd de verbinding 2 geacetyleerd met azijnzuuranhydride-pyridine bij 90° C gedurende 4 uren onder vorming van het diacetaat, dat bij bromering (N-broomsuccinimide in reflux-end CC14 gedurende 1,3 uren) gevolgd door dehydrobromering (s-20 collidine in refluxende xyleen gedurende 15 min.) werd omgezet in een mengsel van het 5,7-dieen en 4,6-dieen.Door behandelen van het ! ruwe produkt met zuur (p-tolueensulfonzuur in aceton, *s nachts), werd het 4,6-dieen omgezet in een veel minder polair produkt om het ï gewenste 5,7-dieen doeltreffend te kunnen isoleren door chromato- 25 grafie (30 % opbrengst berekend op de verbinding 2, X ^ 262, 271, j 281,5 en 293 nm). Dit werd bestraald met een kwiklamp van middel- j matige druk (Hanovia 654A 36; 200 W) in een mengsel van benzeen- j EtOH (2:1) bij 0° C gedurende 2,5 min. en daarna 1 uur gerefluxd, waarbij na zuiveren over silicagel TLC en twee keer ontwikkelen i 30 met benzeen-AcOEt (14:1) het vitamine D diacetaat in een opbrengst ; van 36 % werd verkregen. Bij daaropvolgende verzeping met 2,5 %-ig KOH in een mengsel van MeOH-THF (1:1) bij 15° C gedurende de nacht, | i gevolgd door zuiveren door hoge druk vloeistofchromatografie (Zorbax 2 ί

Sit, 15 cm x 4,1 mm, CHgC^-hexaan (4:1), 90 kg/cm ) ontstond 20- i35 fluor-la-hydroxyvitamine D_ (verbinding 3) (X . 226, X_^„ 265 nm, j nm nax 81201 3 6 - 4 - m/e 418 (M+), 403, 400, 398, 380, 365, 305, 287, 150, 135, 6 0,49 (3H, s, 18-Me), 0,82 (6H, d, J - 7 Hz, 26,27-Me), 0,87 (3H, d, J 6 Hz, 21-Me), 4,3 en 4,5 (3h, een paar multipletten,1-, 2- en 3-H), 5,14 en 5,54 (2H, een paar multipletten, 19-H), 5,99 (1H, d, J = 12 5 Hz, 7-H), 6,36 (1H, d, J = 12 Hz, 6-H). Het massaspectrum van de verbinding 3 vertoonde slechts een zwak ion ten gevolge van splitsing van de 07,8 binding (m/e 170) terwijl in plaats daarvan m/e 380 afkomstig van M-HgO-HF- overheerste. Ook dient te worden opgemerkt, dat de polariteit door het fluoratoom aanmerkelijk wordt verlaagd} 10 de retentietijd van de verbinding 3 bij hoge druk vloeistofchroma-tografie (zie boven) bedroeg 4,1 min.tegen 11,0 en 1,5 min. voor respectievelijk Ια-hydroxyvitamine D3 en vitamine d3·

Desgewenst kan voor bepaalde doeleinden het geace-tyleerde 5,7-dieen zoals gevormd bij hoger beschreven acetylering 15 van de verbinding 2, op bekende wijze worden verzeept (5 %-ige KOH in MeOH, 20° c, 15 uren) om de acetoxygroep op de 3-plaats om te zetten in de hydroxylgroep.

Ook kan de previtamineverbinding desgewenst vóór of na verzeping van de aanwezige acetyl-groep of groepen worden 20 gewonnen, door verdamping van het oplosmiddel gevolgd door chroma-tograferen over silicagel zoals algemeen bekend, en aansluitend daarop omzetting tot de vitamineverbinding. De previtamineverbinding kan worden weergegeven met de formule 4.

Het vitamine D derivaat volgens de uitvinding, 25 la-hydroxy-28-fluorcholecalciferol,kan in kristallijne vorm worden verkregen door herkristallisatie in een geschikt oplosmiddel of ! oplosmiddelsysteem, bijvoorbeeld ethanol. j

Biologische activiteit.

|

De biologische sterkte van 1<*-0H-28F-D3 werd in 30 vivo bepaald aan ratten.

Pas gespeende mannetjes ratten (afkomstig van Holtzman Co., Madison, Wisconsin) werden ad libitum gevoed met water en hetzij een laag-calcium-adequaat fosfo^vitamine D deficiënt dieet ; zoals beschreven door Suda et al (J. Nutrition 100, 1049, 1970), het-35 zij een hoog calcium-laag-fosfo^vitamine D deficiënt dieet (rachito- ; 8120136 - 5 - geen dieet) zoals beschreven door Tanaka en DeLuca PNAS 71, 1040, 1974, gedurende 3 weken.

Bepaling van serum mineraal fosfor.

De ratten die drie weken op het rachitogeen dieet 6 waren gezet, werden in zes groepen van 5-6 dieren verdeeld, en kregen respectievelijk 325 pmol lct-OH-26F-D3 of Ια-OHD^ opgelost in 0,05 ml 95 %-ige ethanol intrajugulair 24 uren of 96 uren alvorens | te worden gedood, toegediend, Aan de controlegroepen werd alleen het ethanolverhiculum op dezelfde wijze toegediend. De dieren wer- ^ 10 den gedood door decapitatie op de aangegeven tijden na de toediening waarna het bloed werd verzameld. j

Het bloed werd onmiddellijk gecentrifugeerd om serum te verkrijgen. Aan het serum werd 10 %-ig trichloorazijnzuur toegevoegd, en de na centrifugeren afgescheiden bovenstaande vloei-15 stof werd geanalyseerd volgens de methode van P.S. Chen et al (Anal.

i

Chem. 28, 1756, 1956). De resultaten zijn vermeld in onderstaande tabel 1.

TABEL 1

Toename in serum mineraal fosforconcentratie in respons op een 20 enkele dosis 325 pmol la-OH~26F-D3 of la-OH-D.^.

Toegediende stof Concentratie serum mineraal fosfor 24 uren na toediening 96 uren na toediening

Ethanol 1,6 + 0,4* a) 1,4 + 0,4 d) la-OH-23F-D, 3,3 + 0,4 b) 2,4 + 0,3 β) J c) f) ! 25 la-OH-D, 2,6+0,4 ' 1,9 + 0,2 ' j I J ' j | — standaard deviatie van het gemiddelde | Significantie van het verschil | b) met a) p < 0,001 j !30 c) met a) p < 0,005 | j ; b) met c) p < 0,025 j ; e) met d) p < 0,001 f) met d) p < 0,05 | e) met f) p < 0,025 i ! 35 8120136 ..................................................

- 6 -

Intestinaal calciumtransport.

De ratten die drie weken op het laag-calcium vitamine Ö deficiënt dieet waren gezet werden verdeeld in groepen van 5-6 d:?ren, en kregen elk respectievelijk 32,5 pmol, 68 pmol i 5 of 325 pmol la-OH-20F-D_ opgelost in 0,05 ml 95 %-ige ethanol in- ; j trajugulair 24 uren alvorens te worden gedood, toegediend. De controlegroep kreeg alleen het ethanol vehiculum op dezelfde wijze toegediend. De ratten werden gedood door decapitatie waarna het duodenum onmiddellijk werd verwijderd om de intestinale calcium-10 transport-activiteit te bepalen volgens de methode van Martin en DeLuca (Am. J. Physiol. 216, 1351, 1969). De resultaten 2ijn vermeld in de tweede kolom van onderstaande tabel 2.

TABEL 2

Toename in serum calcium concentratie en intestinaal calcium 15 transport activiteit in respons op een enkele dosis van la-OH-2$F- D^ of la-OH-D3 toegediend 24 uren vóór decapitatie.

Toegediende stof Hoeveelheid Serum calcium Intestinaal calcium (pmol) concentratie transpoA- ^Ca sero-(mg/100 ml) sal/^^Ca mucosal 20 Ethanol 4,8 + 0,l*a) 5,0 + 1,3 a) 32,5 5,6 + 0,3 b) 7,2 + 1,0 b) la-OH-26F-D3 68,0 6,5 + 0,3 b) 9,2 + 2,2 b) 325 6,2 + 0,3 b) 8,8 + 1,8 b) 25 32,5 5,5+ 0,1 b) la-0H-D3 68,0 6,0 + 0,4 b> 325 6,2 + 0,1 b) i - Significantie van het verschil 30 b) met a) p < 0,001 b) met a) p < 0,001

Een andere bepaling van de activering van het intestinale calciumtransport door la-OH-2BF-D3 werd uitgevoerd aan ratten die drie weken op het rachitogene dieet waren gezet. Deze werden verdeeld in vijf groepen van elk 5-6 dieren en kregen respec- |35 tievelijk 6,5 of 65 pmol/dag la-0H-2pF-D_ of la-OH-D- opgelost in Γ ! 8120136 - 7 - I 0,05 ml van een mengsel van 5 % ethanol en 95 % propyleenglycol dagelijks subcutaan toegediend gedurende 7 dagen. 20 Uren na de i laatste toediening werden de ratten gedecapiteerd waarna het bloed werd verzameld om de concentratie serum mineraal fosfor te meten.

5 Het duodenum werd gebruikt om de intestinale calcium transport- j activiteit te meten zoals hoger beschreven. De resultaten zijn vermeld in de eerste kolom van onderstaande tabel 3. De toename in de serum fosfor concentratie in respons op een dagelijkse dosis van de verbinding is vermeld in de tweede kolom van tabel 3.

10 Antirachitische activiteit.

j

De ratten die op het rachitogene dieet waren I gezet werden in vijf groepen van elk 5-6 dieren verdeeld en kregen j 6,5 of 65 pmol/dag 1cj-OH-2$F-D^ of la-OH-D^ opgelost in 0,05 ml van een mengsel van 5 % ethanol en 95 % propyleenglycol gedurende 15 7 dagen toegediend zoals hoger beschreven. Aan de controlegroep werd alleen het vehiculum op dezelfde wijze toegediend. Een week later werden de ratten gedood. Het duodenum werd gebruikt om de intestinale calcium transport activiteit te bepalen,en het bloed om het serum mineraal fosfor te bepalen zoals eerder beschreven, 20 met de in respectievelijk de eerste en tweede kolom van tabel 3 vermelde resultaten. De radii en ulnae werden verwijderd en onderzocht volgens de ratteproef (ü.S. Pharmacopoeia, 15e druk, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1955, biz. 889). De resultaten zijn in de derde kolom van tabel 3 vermeld.

25 i ! ] | i ! i ; j i i t 8120136 » - 8 - •o

•H

0) <U

Ό A

01 G

C A 41 01 O 41 oi — dl Η in

0 PP O *4 10 .4 I

H H * 01 A 0) Λ.

G OP

0 Rf Ή ft k >

01 Η H

<ü k c o δ io G « •h ro k

DO

φ t 4η Λ ^ Λ Λ •H SB 03 4-1 O' A O' Η •PO 0 in O r«* «β* p* ιβ I 4-1--. * » : » ·« HO .-4 0.10 00 g ^ g f +1+1 .+1 +1 +1 01 4-4 (0 o OO MO Φ^^ιΟιΛ d 01 *4 . « . . « 0 m c\ <n n in m rr 0 D HO1

t I S E

k ft v o on ε 4-1 CM 3 οι I k OSS C) mo w

HO

(β ·ι "s.

ιβ H

k C ιβ <u ο οι <e c ε o - H 3k X Λ Ο Ό 01 E »1 H 41

n H OOI *sf CM O' O» CO

ε 01 Η . . : . . .

AGO ιβ ιβ Ο η η ΟΟ W k Ό ου . , .

« «1 ιη Η +| +| +| 4*| 4-1 < 01 01 ΗΊ1 ιβ

JH 01 Ιβ 0) Τ'- —π :0» 00CM

C X Λ 41 Ο * *· »· Η -η C k Ο CN ι£> Η CT» Η Η Ο 3 ι οι η ρ ft ε ε 41 01 0) 01 (0 θ' 01 C <8 Ό G <8 Ρ <8 U Η α> ό c Μη οι Ο Η 4>0> Ό PC Ό

_ 01 Η I

C 4) Β Η 4) Ό 41-1 C Η θ' Λ ρ ιβ αι θ' ο .1 k > Α ιβ Ρ 01 ο

Ο Η Ό 01 k Ο I

; ft ρ οι \ in in £ ti * i ‘OiHOiH -m-m >ö m !

C 41 >0 10101010 C O

ιβ P 01 B I8PV O

k H O ft > 01 - P > ta ^ a in ft m o !

_ η 41 O CM

g P H G O O V i

3 ü P 18 *· <8 *· I

•kiem ιβ > o o ft U 0 -H P··· IHQ) P >0)Voi01V01—.01 «sav> οι -Η ε · * m *

O O „ Ό P ft C ft C C

W 0) H G -~· P

Η -Η Ό D 8 φΛ

«P G I kOieOOimSH

18 H 41 ft 18 H * CA h ca m (omp-»ppp->p HO Φ H CM Q ΌΗ0)Ο4)β)0)Η01 ρ ιβ ei o i i c c s ε ε ε ε : oik O' C Η SB «O' * ·, οι η αι δ Ο O ph^ — —

+2 +J P A T T WWOAAOO>AA

c c h Pa o j H (8 W -* -I Hi 8120136 i.......................... ............ _ ; . : » - 9 -

Mobilisatie van calcium uit het bot. ^

De ratten die drie weken op het laag-calcium vitamine D deficiënt dieet van Suda waren gezet werden verdeeld in zeven groepen van elk 5-6 dieren en kregen respectievelijk 32,5 5 pmol, 68,0 pmol of 325 pmol la-OH-26F-D^ of la-OH-D^ opgelost in 0,05 ml 95 %-ige ethanol 24 uren voor decapitatie intrajugulair toegediend. De controlegroep kreeg alleen het ethanol vehiculum op ; dezelfde wijze toegediend. Na decapitatie werd het bloed verzameld ; en gecentrifugeerd om serum te verkrijgen. Van het serum werd 0,1 j 10 ml gemengd met 1,9 ml 0,1 %-ige lanthaniumchloride-oplossing. De j calciumconcentratie werd gemeten met een atoomabsorptiespectrofoto- meter (Perkin-Elmer Model 214). Omdat de opname van calcium uit hetj dieet verwaarloosbaar laag is, wordt de toename in serum calciumconcentratie in respons op la-OH-2(^-0^ geacht het mobilisatiever-15 mogen van calcium uit het bot weer te geven. De resultaten zijn vermeld in de eerste kolom van tabel 2.

Uit de boven vermelde resultaten is het duidelijke dat la-OH^BF-D^ uitgesproken vitamine D-achtige activiteit vertoont en in dit opzicht even werkzaam blijkt te zijn als la-OH-D^ (zie 20 het Amerikaans octrooischrift 3.741.996).

1,25-Dihydroxy-2(3-fluorvitamine D^ kan gemakkelijk worden toegediend als steriele parenterale oplossingen, door injectie of intraveneus, langs orale weg, of als suppositoria.

Doseringen van ongeveer 0,1 yg tot ongeveer 2,5 yg per dag blijken 25 werkzaam te zijn om de fysiologische calciumbalans-responsies die kenmerkend zijn voor vitamine D-achtige activiteit, te bereiken, waarbij onderhoudsdoseringen van ongeveer 0,1 yg tot ongeveer 0,5 yg geschikt zijn.

Doseringsvormen van de verbinding kunnen worden 30 bereid door deze te combineren met een niet-toxische farmaceutisch : aanvaardbare drager zoals algemeen gebruikelijk. Dergelijke dragers 1 kunnen vast of vloeibaar zijn zoals bijvoorbeeld maïszetmeel, lactose, sucrose, arachisolie, olijfolie, sesamolie en water. Wanneer een i : I vaste drager wordt gebruikt, kunnen de doseringsvormen van de ver- i | 35 bindingen volgens de uitvinding tabletten, capsules, poeders, j 812 0 13 0 .............................................................................................

-ΙΟΙ trocheën of lozenges zijn. Wanneer een vloeibare drager wordt ge bruikt, kunnen de doseringsvormen zachte gelatine-capsules, siropen of vloeibare suspensies, of emulsies of oplossingen zijn. De dose- | ringsvormen kunnen ook toevoegingen bevatten zoals preserverings-5 middelen, stabilisatoren, bevochtigingsmiddelen of emulgatoren, middelen om de oplosbaarheid te verhogen, etc.. Ook kunnen zij andere therapeutisch waardevolle stoffen bevatten.

Hoewel doseringstrajecten zijn aangegeven, is | het duidelijk, dat de preciese dosis die wordt toegediend, afhanke- : 10 lijk is van de aard van de te behandelen aandoening, de beoogde eindresultaten in een bepaald geval, alsook van andere factoren zoals bekend aan deskundigen op het gebied van de therapeutische toepassing van dergelijke geneesmiddelen.

15 i i | | 1

j I

812 0 1 3 6

Claims (9)

1. Verbindingen met de formule 5 waarin R en R| elk waterstof of acetyl voorstellen. !

2. Verbinding volgens conclusie 1 waarin R en Rj 5 waterstof zijn.

3. Verbinding volgens conclusie 2 in kristallijne vorm.

4. Verbindingen met de formule 6 waarin R en Rj waterstof of acetyl voorstellen.

5. Verbinding volgens conclusie 4 waarin R en R^ waterstof zijn.

6. Verbindingen met de formule 7 waarin R en R^ waterstof of acetyl voorstellen.

7. Verbinding volgens conclusie 6 waarin R en R^ 15 waterstof zijn.

8. Verbindingen met de formule 8 waarin R en Rj waterstof of acetyl voorstellen.

9. Verbinding volgens conclusie 8 waarin R en R^ waterstof zijn. j 20 | i i i i I i j 8120136