NL8104627A - Antimicrobieel middel, werkwijze voor het bereiden daarvan, en methode voor het bestrijden van micro-organismen met voornoemd middel. - Google Patents

Description

- 1- 4 ' *

Antimicrobiëel middel/ werkwijze voor het bereiden daarvan/ en" methode voor het bestrijden van micro-organismen met voornoemd middel.

Het is bekend, dat bepaalde alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur zoals isopropyl-/ isobutyl- en n-butyl-p-hy-droxybenzoaat geschikte antimicrobiële middelen of preserverings-middelen zijn. Ook is bekend, dat chloorhexidinediacetaat, chloor-5 hexidinedihydrochloride en chloorhexidinegluconaat geschikte desinfecteermiddelen of preserveringsmiddelen zijn.

In het Brits octrooischrift 1.514.469 wordt een mondwater beschreven met de volgende samenstelling:

Gew.% 10 Chloorhexidinegluconaat 0,2

Trichloorbutanol 0,1

Methyl-p-hydroxybenzoaat 0,2

Propyl-p-hydroxybenzoaat 0,2

Chloroform 0,5 15 Natriumdioctylsulfosuccinaat 0,1

Pepermuntolie DAB 7 1,5

Menthol 0,15

Ethanol (94 %) 45,00

Glycerol (86 %) 35,00 20 Water (gedestilleerd) 17,05

Volgens voornoemd Brits octrooischrift 1.514.469 is bij proeven met waterige preparaten die 5 gew.% van boven aangegeven samenstelling bevatten, gebleken, dat het 30 min. duurde om Streptococcus haemolyticus bacteriën te doden, en meer dan 30 min.

25 om Candida albicans micro-organismen te doden. Verder wordt vermeld, dat de samenstelling van voorbeeld I die geen chloorhexidineverbin-ding en geen lage alkylester van p-hydroxybenzoëzuur bevat, beter is dan boven aangegeven samenstelling of preparaat.

In het Amerikaans octrooischrift 3.097.131 wordt 30 vermeld, dat eutectische mengsels van alkylesters van p-hydroxy- 8104627 ϊί % - 2 - benzoëzuur geëmulgeerd kunnen worden in een waterige oplossing die colloldale beschermende stoffen zoals gelatine of carboxymethyl-cellulose bevat.

In het Amerikaans octrooischrift 3.960.745 wor-5 den reinigingspreparaten (geschikt voor pre-operatieve reiniging bij chirurgische ingrepen) beschreven die 0,5-10,0 gew./vol.% van een oplosbaar chloorhexidinezout (bijvoorbeeld chloorhexidine-acetaat of chloorhexidinegluconaat), een blokcopolymeer van poly-oxyethyleen en polyoxypropyleen, en een inert verdunningsmiddel of 10 inerte drager bevatten, en verder eventueel een parfum, kleurstof en preserveringsmiddel, bijvoorbeeld ethanol, isopropanol, methyl-p-hydroxybenzoaat of propyl-p-hydroxybenzoaat.

Gevonden is, dat de combinatie van een lage alkylester van p-hydroxybenzoëzuur en een chloorhexidinezout bij 15 zeer lage gewichtsconcentraties een synergistisch effect vertoont bij toepassing als antimicrobieel middel.

De uitvinding heeft geleid tot een antimicrobieel middel bestaande uit een vloeibaar mengsel van ongeveer 0,0032-0,05 gew.% chloorhexidinedihydrochloride, chloorhexidine-20 diacetaat en/of chloorhexidinegluconaat, en ongeveer 0,0063-0,2 gew.% van één of meer lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur.

Het chloorhexidinedihydrochloride, chloorhexidl-nediacetaat en chloorhexidinegluconaat (of chloorhexidinedigluco-naat) zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen afzonderlijk of als 25 mengsel worden toegepast.

Als lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur komen in aanmerking alkylesters met 1-6 koolstofatomen, bijvoorbeeld methyl-, propyl-, n-butyl-, sec.-butyl-, arayl-, en hexyl-p-hydroxybenzoaat. Ook de alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur kunnen 30 afzonderlijk of als mengsel van twee of meer esters zoals mengsels van methyl- en propyl-p-hydroxybenzoaat, worden toegepast.

Zeer geschikt zijn eutectische mengsels van drie of meer alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur. Dergelijke mengsels kunnen in de vorm verkeren van oliën. Een voorkeursmengsel is t 35 dat van isopropyl-, isobutyl- en n-buyl-p-hydroxybenzoaat met een 8104627 at__-» - 3 - verhouding tussen ongeveer 1:1:1 en 4:2:2 en in het bijzonder tussen 4:2,5:2,5 en 4:3:3 (bijvoorbeeld 4:2,95:2,96). Voorbeelden van andere eutectische mengsels zijn een mengsel van isopropyl-, sec.butyl- en amyl-p-hydroxybenzoaat, en een mengsel van sec.-5 butyl-, isobutyl- en n-butyl-p-hydroxybenzoaat.

De antimicrobiële middelen volgens de uitvinding zijn geschikt voor het bestrijden van bacteriën, gisten en fungi.

De antimicrobiële middelen volgens de uitvinding 10 kunnen gemakkelijk worden bereid door het chloorhexidinezout op te lossen in bijvoorbeeld water, propyleenglycol, polyethyleenglycol of glycerol. De chloorhexidinezoutoplossing wordt dan gemengd met een oplossing van één of meer alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur in bijvoorbeeld propyleenglycol. De concentratie componenten wordt 15 binnen boven aangegeven grenzen gekozen met het oog op het te bestrijden micro-organisme. Behalve oplossingen kunnen ook emulsies warden toegepast.

Het synergistisch effect van de antimicrobiële middelen volgens de uitvinding blijkt uit de hieronder beschreven 20 proeven. Zo bedraagt bijvoorbeeld de minimale concentratie van een chloorhexidinediacetaatoplossing om de groei van Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, 15442, 13388 en 14502 volkomen te remmen 0,05 gew.%, terwijl een oplossing van 0,1 gew.% methyl-p-hydroxy-benzoaat en 0,025 gew.% propyl-p-hydroxybenzoaat tegen voornoemde 25 micro-organismen onwerkzaam is. Maar wanneer in laatstgenoemde oplossing slechts 0,0063 gew.% chloorhexidinediacetaat wordt opgelost, wordt de groei van voornoemde micro-organismen met uitzondering van Pseudomonas aeruginosa ATCC 14502, volkomen geremd.

Een ander voorbeeld: een oplossing van 0,1 gew.% van een eutectisch 30 mengsel van isopropyl-, isobutyl- en n-butyl-p-hydroxybenzoaat met een gewichtsverhouding van ongeveer 4:2,95:2,96 is onwerkzaam tegen Pseudomonas aeruginosa, maar een oplossing van hetzelfde eutectisch mengsel in een concentratie van 0,05 gew.% waaraan toegevoegd 0,025 gew.% chloorhexidinegluconaat is in staat om de groei van dit zeer 35 resistente micro-organisme volkomen te remmen.

8104627 ¢- - 4 -

Het is duidelijk, dat de lage concentraties componenten in het antimicrobiële middel volgens de uitvinding kosten besparend is. Maar bovendien worden toxicologische risico's erdoor verminderd. En daar komt nog bij, dat het werkingsspectrum 5 tegen micro-organismen erdoor wordt verhoogd, terwijl wordt voorkomen dat een micro-organisme resistentie ontwikkelt tegen een enkele component afzonderlijk. En voor wat de bereiding van waterige oplossingen betreft, daar doen zich geen problemen in verband met de oplosbaarheid van alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur voor 10 zoals met hogere concentraties (bijvoorbeeld 1 gew.%) vein dergelijke esters.

Voorbeeld I

Een 5 gew.%-ige voorraadoplossing van chloor-hexidinediacetaat in propyleenglycol werd bereid door 5 g chloor-15 hexidinediacetaat in een 100 ml kolf te brengen en propyleenglycol toe te voegen tot een volume van 100 ml. De gevormde oplossing werd goed gemengd met een Sybron magnetische roerplaat.

Een voorraadoplossing van 10 gew.% methyl-p-hydroxybenzoaat en 2,5 gew.% propyl-p-hydroxybenzoaat in propyleen-20 glycol werd bereid door 10 g methyl-p-hydroxybenzoaat en 2,5 g propyl-p-hydroxybenzoaat in een 100 ml kolf te brengen en propyleenglycol toe te voegen tot een volume van 100 ml. Ook deze oplossing werd goed gemengd op een magnetische roerplaat.

De minimale groei-remmende concentratie van elke 25 oplossing afzonderlijk en van mengsels daarvan tegen verschillende micro-organismen werd als volgt bepaald: A) Agarplaatbereiding 1) Tryptine soja agar (TSA) werd bereid volgens de aanwijzingen van de fabrikant in hoeveelheden van 100 ml. De 30 media werden 15 min. geautoclaveerd bij 121° C in een Castle Thermatic GO autoclaaf.

2) Na autoclaveren werden de media gekoeld tot 45° C in een waterbad.

3) De voornoemde voorraadoplossingen werden nu 35 onder roeren aan de media toegevoegd in verschillende hoeveelheden 8104627 -5 - om de gewenste proefconcentraties te bereiken. Elk mengsel van agarmedium en oplossing werd vervolgens in Petri-schalen van 100 x 15 mm gebracht.

B) Inoculum 5 1} Het bacterie-inoculum bestond uit 0,1 ml van een 1 op 100 verdunde zoutoplossing van een TSB cultuur van elke 6 7

Pseudomonas aeruginosa stam (ongeveer 10-10 KVE/ml waarbij KVE een afkorting is van kolonie vormende eenheden) die een nacht had overgestaan.

10 2> Het inoculum werd met een steriele Dacron prop over het gehele agaroppervlak uitgespreid.

C) Incubatie.

De bacterieplaten werden 48 uren geincubeerd bij 35° C.

15 D) De resultaten werden uitgedrukt in cijfers met de volgende betekenis: 0 : geen groei 1+: 10 KVE per Petri schaal 1+: schaarse groei 20 2+i middelmatige groei 3+: zware groei 4+: vervloeiing (zoals bij de blanco) blanco: 1,125 ml propyleenglycol 25 8104627 - 6 -

O

C

3 H + + +" + « Ί ^ -ï <

Q

α

dP +- dP dP

cn m .-t in >-* m O >< cn Sn . .

o -Λ -η α +| +| +| 0 0 4-10 0 *-< O *-* «h

» 01 * M

O O O +· E o ft O ü + + Ö + + + +- c + + 3^^^^3 NP 3·

i-4 fH + +- H

« « , >< 5$ η α Q >f o

O Λ U

4J 0) CN dP 3 + cn E dP o O o *-4

o CN

dP o + + + + n # in

»*<ί<ί<ίήΐ +i-| O CN

O - >4 O «1 O

4-1 rl Cl *--*·

ITT >1 o O O O

Rf Λ >4 4J -P ft οι cn ai h ü VO E dP +- >* (CO +- + 4- +· rti •h o -t- + + +· <#> in ^ nt np np < 4J pp Ό » m rp m m cn α 3 0 o m ri u Ê « . .

ö o o cn + t -H

-f-4 *- Cl dP Η H OO »h »4 Ό O O CO O >1 •Hm om - ft X CN O O O 0 01 *-* * «> ö ΛΟ +++ O O +- ft

M - O ^ CN CN

<0O

O + H

< >i ++1^1 Η Λ H ft ^ «urn >t o <Hft < CN . js h o >i o

Ei o f- 4- + u ft+ + + + ufl i; ». o ro «-( -· ai « 4-> ft O E dP dP 0)

E dP

dP tn <n +| cn vOdPin 00 0 «h m «-* o O cn o «►. ·» o «h o

* O O O G O O

0 o o o

CN 00 CN CN 00 CN

P·» NP CO O Np 0D O CN 00 CN

cn np rn m p* 3· o m r- np co o o κι n cn m cd n* cn ·ί n in O »-4 «-* «-* O »-( *4 *-* o UI Cl ^ 01 Cl -—* -H -—* O O U U ü u υ .

uuuu uuuu ouuu

94&4EH&4 UEH&4t< UUUU

<<<< ^ < < < tj H Eh Ej < < < < < (0 CO 3 <0 0 CQ 01 β O 0 H = = = β = = = β = = =

On -H -H

3 &> O

>4 3 3 01 0) >4 14 E 3 3 dl 01 Rl (0 •H 01

Cd οι oi β C 3 3

on 0 fi S

14 E O o 0 0=:= E = = = E = = =

1 Ό 0 O

0 3 Ό Ό 14 3 3 3 üffl 3 3 •H ft 3 01 S ft ft 8104627 «·' ·* - 7 -

Uit de resultaten blijkt, dat de combinatie van chloorhexidinediacetaat met methyl- en propyl-p-hydroxybenzoaat in zeer lage concentraties een synergistisch effect vertoont.

Voorbeeld II

5 Voorbeeld I werd herhaald met chloorhexidine- dihydrochloride en een mengsel van methyl- en propyl-p-hydroxybenzoaat, en van chloorhexidinedihydrochloride en een eitectische olie die een mengsel bevatte van isopropyl-, isobutyl- en n-butyl-p-hydroxybenzoaat met een gewichtsverhouding van ongeveer 4:2,25: 10 2,26. De resultaten zijn in onderstaande tabel B vermeld.

8104627 cr - 8 - φ O -Η

ü O HO

rj 4. 4. 4. 4. O + + + + OU + + + + _1 <o φ fl

CQ Η r3 H

0) O « 03 ·

H Ö + Η H -H

>, « + >i -P 3 Λ h ft o dfi a 4J dp H U >t O Φ CM + + + "ία tn >i δ Λ k , I Ή ro + <ίΡ ω

gfsj 4.j.j.XiJ+3ü4Jft +1 3 O in H

15 5 555 P fl -0) O O O H (1) O U Ο H

dPOS (I « # E dP « Q * O

ίη % £ gocN tn +ouo 000 n η # m ^ + C O WA dl Φ o + a <üooo Ό op h q) η ^ ·Η m r*4 Ό >1 OOO k vo + <#> O _ _ _ _ 4-H H x 0 0 m · 0000 >1 k O H O U O ij HA 0 k + + Η ,Π » P - 3 >L o h >0 >·' üouow

. ,3 k ^ ö τ* Θ* P

ί G, o λ 2 >t o p οι ++ + + oio,ck >au

g # 9 k ft PA ?? O

in ό 1 dP a> ί ü i)

rip λι b^H W Ë c)P OOOO -«4 ‘H

5o £ >1 Γ0 in τί * H

*·> h a o <#> cm φιηιηο Λ _ „ _ ΟΟ Ό ο Ο Η ο S NO ο ο ο ο φ ^ * ·*» «* -Η «-<*►* 4- β Α Ο Ο Ο 'Ö Ο Ο Ρ Η -Η Η * 3 Η >, ό , + η * ο + w Β ο χ η a f +) k φ U >t 0 k φ & .ÖQ-Ck OU.

g ++ k U Ρ Α 0 2 Φ

tfPO’-d’^OO ® HUH

dfi in OdPSdP .β op h ro o H m in 0000 U #ino a -- λ φ <*> n wo Λ ^ _

00 u own CM··· OOOO

J v 0 0 0 ο ο p M » » » - 3 '

S OOO O + H

«: I φ 61 S3 8 + H-H . * 1-4 Vj O 4- 4- 4- 4- bi 0 I 4¾

ΌΟ 0 -¾1 u h a SH 5 S i« «L S

._ι _j ·» Q bi 0 j3 4 Μ C O

X Λ ~ O U Λ k O ') is# (1] M dP -P 0. M CJ C I C ..

n ·—> # φ 4IJ»®CMIin + + + + k k n HgdPOOOO 4J>H i^om ^mfn η rn 10 10 in l)>iHHik-

0 >1 Ο + + + + O OP CM Φ Φ A >< > X O

ηλ ο η mt rn ·μ< ο-ho ' ij S ii ti Ρ rj ~j «, » > » 3 H k 3 3 k UOO OOO W O Α Λ Λ T3

NON CM 00 CM NON

r» 41 a o r^’S'coo r- ^ 00 o (ni n m n ^ n in n w w 0 ui ci fl OinrnO* O w n ^ ^ rH HH 0Ί«-Ι«-ί*-4 0Ί *"Ί u u ou uuuu uu u u ü u y u uuuu uuuu i* Eh frj 13¾¾ Eh §3 È! §3 3 3 << < << < < < < <

(ö rö S

01 M 03

o 0 O

β s = = C = = - 2

Η Η H

Cr CP g1 3 g 2 φ k p y g φ φ Φ μ Φ Φ 10 fi M (fl ÏÏ φ Φ fl 2

o» β β S

k 0 o 2 . . .

0B = =: gs== § - - - 1 o o o 0 Ό 'S ^ u d P 3 ü ö) 0) 0) -

Ij £ s 6104627 3T- - 9 -

Opmerking: de eutectische olie op zich vertoont dus in een concentratie van 0,05 % geen groeiremmende werking tegen Pseudomonas aeruginosa.

Voorbeeld ΙΙΙ-Λ 5 Voorbeeld I werd herhaald met chloorhexidine- gluconaat en een mengsel van methyl- en propyl-p-hydroxybenzoaten.

De resultaten zijn in onderstaande tabel C-l vermeld.

Voorbeeld III-B

Voorbeeld I werd herhaald met chloorhexidinegluco-10 naat en een eutectische olie van een mengsel van isopropyl-, iso-butyl- en n-butyl-p-hydroxybenzoaten in een gewichtsverhouding van ongeveer 4:2,25:2,26. De resultaten zijn vermeld in onderstaande tabel C2.

15 8104627 - 10 - o o o o + + + + o C + + + + C 'f 'i

o ++)« *3· «r <3< (B

C+ + +^«H H

β «ï ^ ιί n ffl

H O

© N

s + >, si n U A *H 3 >. U V #> H « X fl> in 0<ü M o dP -B CS . dP f4 η p cs t-ι h +| 0) tn H + O + + + + 'P PJ#0 >, OO -H ΛΟΟ Ol _ _

o ’i'il'N'i >1 OW »Oi o O *· o O O

«. A O O O O · M o - o I » » P -fj- ft O O + ft 4-> : | ^ W .0 + Ή + H ® >, + >1 -PO·

η £ H ft 3 U -P

vo 0 O >i 0 0)30 0+ + + +PU.CP dP«2j

o m n m ft .P ft + H

- Λ «. #0) «-I N # 0

de o c N Ë # O O O O 4J C*1 O O O O

u i*i ui Λ O ui

O dP CS ld O O

•P H O *H o c _- *· (B >1·-*·*· OU® <B A o o o u C -P 3 u cs £ + h S’·*· 5. 0+ + f+ ΟΛ 3 0*

JT * H <J N N P U P dP PUP

«-i m O (d 0)in N Ό 3 51 I C iB dP E CS I -Η# ® Ή .

n^i cm «Η H u X m H

trt 0 kO # O > OOOO ®' (fl # 0 OOOO

u o m * ft J Λοιη

W X 3 OOOO W P O O

(aaito - h - - : p 0 S

< ί N +- + -PftOO+'A sCOOO

^poos'-h·-*® f d

0 - 3 +· H A

O O -H + >t U

1-4 *0 P ft + si fi o ;* o » u X o Λ P 0¾ « -P ft U 3

,C dP « OOOO © OOOO

p Cl g dP dP ®

o VD ui Lil dP P

1/1 o O dP (N tM in H

O + r-l O -< O o o o » o o η o·, ί * * * *· *> 0 u o o o o o

CS CO CS CS CO CS CS CD CS

« co o r« *? ® o r- s1 co o cs^rmi/i cs s* m ι/i n s1 co ιλ ouiflfl o UI Cl ^ O ίο ΙΟ ί

g> ,_l ,H <J\ —-4 »—i «—· Cl Η H

uuuu uuuu uuuu uuuu uuuu uuuu 0¾¾¾ 0¾¾¾ 3 «3 g οι ra 52 O 0 O _ . .

c: : : 3 = = = GS z s •f4 'f4 'f4

Cn ft ft 3 3 3 « P P fcj

S © ® S

01 Λ <B 3 "c ra 52 + 52 m cö <o ,κ 2 ft 3 3 p c p o o u o .

8104627

0 0 .,¾ O

O Ό Ό 1/1¾ P 3 3 CS 3 O © 0) O ® •η oi ra *· ra

SA A O A

% - 11 -

Voorbeeld IV

Een eutecti sche olie (100 g) die een mengsel bevatte van isopropyl-, isobutyl- en n-butyl-p-hydroxybenzoaten in een gewichtsverhouding van ongeveer 4:2,25:2,26, werd gemengd 5 met 80 g van een 20 gew.%-ige chloorhexidinegluconaatoplossing in water, 9 g van een 70 gew.%-ige sorbitoloplossing, 3 g dinatrium-waterstoffosfaat (NajHPO^) en 8 g gelatine ("Croteine SPC”) bij 60-70° C, waarna het mengsel werd geroerd op een magnetisbhe roer-plaat totdat het was afgekoeld en gehomogeniseerd.

10 De antimicrobiële activiteit van de emulsies tegen bacteriën, gisten en fungi werd op dezelfde wijze als in voorbeeld I bepaald. De resultaten zijn in onderstaande tabel D vermeld.

TABEL D

15 Micro-organisme Proefemulsie Blanco 0,05 %

Bacillus subtills ATCC 6633 0 4+

Staphylococcus aureus ATCC 6538 0 4+

Staphylococcus epidermidis ATCC 1228 0 4+ 20

Streptococcus faecalis 0 4+

Escherichia coli ATCC 8739 0 4+

Klebsiella pneumoniae ATCC 8308 0 4+

Salmonella typhosa ATCC 6539 0 4+

Proteus vulgaris ATCC 13315 0 4+ 25

Serratia marcescens ATCC 8100 0 4+

Enterobacter cloacae ATCC 23355 0 4+

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 0 4+

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 0 4+

Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 0 4+ 30

Pseudomonas aeruginosa ATCC 14502 0 4+

Pseudomonas stutzeri 0 4+

Candida albicans ATCC 10231 0 4+

Saccharomyces cerevisiae 0 4 +

Aspergillus niger ATCC 9642 0 4+

PeniciIlium chrysogenum ATCC 9480 0 4+

Trichophyton mentagrophytes 0 4+ 35 8104627 i'; 'v - 12 -

Voorbeeld V

Voorbeeld I werd herhaald met mengsels van chloorhexidinediacetaat (CDA) en methyl-p-hydroxybenzoaat# chloorhexidinegluconaat (CG) en methyl-p-hydroxybenzoaat# chloor-5 hexidinedihydrochloride (CDC) en methyl-p-hydroxybenzoaat# en chloorhexidinediacetaat (CDA) en propyl-p-hydroxybenzoaat. De resultaten zijn in onderstaande tabel E vermeld.

10 8104627 - 13 - *

TABEL

Chloorhexidinedlacetaat en

Micro-organisme 0,0125% CDA + 0,0063% CDA + 0,2% methyl 0,2% methyl_

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 0 0 " " ATCC 15442 0 0 " ” ATCC 13388 0 0 " " ATCC 14502 0 0

Chloorhexidinegluconaat en 0,0125% CG + 0,0063% CG + 0,2% methyl 0,2% methyl__

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 0 0 " " ATCC 15442 0 0 " " ATCC 13388 0 0 " " ATCC 14502 0 0

Chloorhexidinedihydrochlori 0,0125% CDC + 0,0063% CDC + 0,2% methyl 0,2% methyl_

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 0 0 " " ATCC 15442 0 0 " ATCC 13388 0 0 " " ATCC 14502 0 0 _Chloorhexidinediacetaat en 0,0125% CDA + 0,0063% CDA + 0,04% propyl 0,04% propyl

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 0 0 ” " ATCC 15442 0 0 " " ATCC 13388 0 0 " " ATCC 14502 8104627

E

methyl-p-hydroxybenzoaat 0,0032% CDA + 0,0125% CDA + 0,0063% CDA + 0,0032% CDA + Blanco 0,2% methyl_0,1% methyl_0,1% methyl_0,1% methyl_ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ methyl-p-hydroxybenzoaat 0,0032% CG + 0,0125% CG + 0,0063% CG + 0,0032% CG + Blanco 0,2% methyl_0,1 % methyl 0,1% methyl_0,1% methyl_ 0.0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ de en methyl-p-hydroxybenzoaat 0,0032% CDC + 0,0125% CDC + 0,0063% CDC + 0,0032% CDC + Blanco 0,2% methyl 0,1% methyl_0,1% methyl_0,1% methyl 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ propyl-p-hydroxybenzoaat 0,0032% CDA + 0,0125% CDA + 0,0063% CDA + 0,0032% CDA + Blanco 0,04% propyl 0,02% propyl 0,02% propyl 0,02% propyl_ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ 0 0 0 0 4+ . 8 1 0 4 6 2 7

r. y- «V

- 14 -

De resultaten met chloorhexidinediacetaat, chloor-hexidinegluconaat en chloorhexidinedihydrochloride afzonderlijk zijn reeds in het voorgaande vermeld. De resultaten met methyl-p-hydroxy-benzoaat en propylrp-hydroxybenzoaat afzonderlijk zijn in onder-5 staande tabel P aangegeven.

TABEL F

Micro-organisme Methyl-p-hydroxybenzoaat 0,2% 0,1%_Blanco

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 1+ 4+ 4+ 10 " " ATCC 15442 2+ 4+ 4+ " " ATCC 13388 3+ 4+ 4+ " " ATCC 14502 2+ 4+ 4+

Propyl-p-hydroxybenzoaat 0,05%_0,025% Blanco 15 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 3+ 4+ 4+ " " ATCC 15442 3+ 4+ 4+ " " ATCC 13388 2+ 4+ 4+ " '* ATCC 14502 3+ 4+ 4+

20 Voorbeeld VI

De bepaling werd uitgevoerd aan Pseudomonas aeruginosa ATCC 13388 omdat dit micro-organisme zoals bekend resistent is tegen gebruikelijke antimicrobiële middelen.

2 g

Ongeveer 10 - 10 KVE/ml van voornoemd micro- 25 organisme werd toegevoegd aan 100 ml van een 0,85 gew.%-ige zoutoplossing met verschillende concentraties chloorhexidinegluconaat, eutectisch mengsel van isopropyl-, isobutyl- en n-butyl-p-hydroxy-benzoaten met een gewichtsverhouding van ongeveer 4:2,95:2,96,en combinaties daarvan. Als blanco werd alleen een 0,85 gew.%-ige 30 zoutoplossing gebruikt. Van elke proef oplossing werd 1 ml met een pipet in gesteriliseerde Petri-schalen van kunststof (100 x 15 mm) gebracht na respectievelijk 1, 2, 3 en 20 uren. Verder werd aan elke Petri-schaal 20 ml Tripticase soja agar toegevoegd die 0,07 gew.% lecithine en 0,5 gew.% Polysorbaat 80 als preserveringsinac-35 tivatoren bevatte. De schalen werden zachtjes rondgedraaid om de 8104627 - 15 - inhoud te mengen waarna men ze liet staan om af te koelen. Vervolgens werden de platen omgekeerd en 48 uren gelncubeerd bij 37° C. De resultaten zijn uitgedrukt met cijfers die de volgende betekenis hebben: 5 0 geen groei 1+: schaarse groei 2+: middelmatige groei 3+: zware groei 4: vervloeiing (zoals bij de blanco) 10 Bactericide activiteit trad op bij proeven waar bij geen provocerende micro-organismen konden worden aangetoond, en bleef tijdens de gehele duur van de proef behouden. De resultaten zijn in onderstaande tabel G vermeld, waarbij het eutectisch mengsel is aangeduid als Parabens.

15 TABEL G

Chloorhexidinegluconaat - Parabens synerglsme Bacteriële activiteit tegen Pseudomonas aeruginosa na 1 uur_2 uren 3 uren_20 uren 20 0,05% CG 0 0 0 0 0,025% CG 2+0*0 0 0,0125% CG 3+ 3+ 2+ 2+ 0,10% Parabens 2+ 2+ 2+ 4+ 0,05% Parabens 4+ 4+ 4+ 4+ 25 0,025% CG - 0,05% Parabens 00 00 0,0125% CG - 0,025% Parabens 1+0 02+ 0,0063% CG + 0,0125% Parabens 2+ 2+ 1+ 2+

Blanco 4+ 4+ 4+ 4+

30 Voorbeeld VII

De bepaling werd uitgevoerd aan de fungi Aspergillus niger ATCC 9642 en Candida albicans ATCC 10231. Ongeveer 104 - 105 KVE/ml Aspergillus sporen of Candida cellen werden toegevoegd aan 100 ml van een 0,85 gew.%-ige zoutoplossing met verschil- 35 lende concentraties chloorhexidinegluconaat, een eutectisch mengsel 8(04527 - 16 - van isopropyl-, isobutyl- en n-butyl-p-hydroxybenzoaten met een gewichtsverhouding van ongeveer 4:2,95:2,96, en met combinaties daarvan. Als blanco werd een 0,85 gew,%-ige zoutoplossing zonder meer gebruikt. Van elke proefoplossing werd na respectievelijk 1, 5 2, 3 en 20 uren 1 ml met een pipet in gesteriliseerde Petri-schalen (100 x 15 mm) van kunststof gebracht. Aan elke Petri-schaal werd 20 ml Trypticase soja agar toegevoegd die 0,07 gew.% lecithine en 0,5 gew.% Polysorbaat 80 bevatte als preserveringsinactivatoren.

De schalen werden zachtjes gedraaid om de inhoud te mengen. Na 10 afkoelen werden de platen gekeerd en 72 uren geincubeerd bij 30° C. De groeiresultaten werden gewaardeerd met cijfers die de volgende betekenis hebben: 0 : geen groei 1+: schaarse groei 15 2+: middelmatige groei 3+: zware groei 4+: vervloeiing (zoals bij de blanco).

Fungicide activiteit trad op bij proeven waarbij provocerende micro-organismen niet konden worden aangetoond, en 20 bleef gedurende de proef gehandhaafd.

De resultaten zijn in onderstaande tabellen H en I vermeld waarbij het eutectisch mengsel is aangeduid als Parabens.

25 8104627 - 17 - TABEL Η

Chloorhexidinegluconaat - Parabens synergisme Fungicide activiteit tegen Candida albicans na 1 uur 2 uren 3 uren 20 uren 5 0,0125% CG 1+00 0 0,0063% CG 2+ 1+ 1+ 0 0,0032% CG 3+ 2+ 2+ 1+ 0,0016% CG 4+ 3+ 3+ 1+ 0,05% Parabens 000 0 10 0,025% Parabens 1+ 1+ 1+ 0 0,0125% Parabens 4+ 4+ 4+ 4+ 0,0063% Parabens 4+ 4+ 4+ 4+ 0,0063% CG - 0,0063% Parabens 000 0 0,0032% CG - 0,0125% Parabens 0000 15 0,0016% CG - 0,0125% Parabens 2+ 1+ 1+ 0 0,0016% CG - 0,0063% Parabens 3+ 2+ 2+ 1+

Blanco 4+ 4+ 4+ 4+

TABEL I

20 Chloorhexidinegluconaat - Parabens synergisme

Fungicide activiteit tegen Aspergillus niger na 1 uur 2 uren 3 uren 20 uren 0,0125% CG 4+ 4+ 4+ 3+ 0,0063% CG 4+ 4+ 4+ 3+ 25 0,05% Parabens 2+ 1+ 1+ 0 0,025% Parabens 4+ 4+ 4+ 4+ 0,0125% CG - 0,05% Parabens 1+0 0 0 0,0063% CG - 0,05% Parabens 1+00 0 0,0032% CG - 0,05% Parabens 1+1+0 0 30 0,0016% CG - 0,05% Parabens 2+ 2+ 1+ 0 0,0125% CG - 0,025% Parabens 2+ 2+ 2+ 1+ 0,0125% CG - 0,0125% Parabens 4+ 4+ 4+ 3+

Blanco 4+ 4+ 4+ 4+ 35 8104627

Claims (16)

1. Antimicrobieel middel- bestaande uit een vloeibaar mengsel van één of meer chloorhexidineverbindingen en één of meer lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur, met het kenmerk» 5 dat het antimicrobieel middel ongeveer 0,0032-0,05 gew.% chloor- hexidinedihydrochloride, chloorhexidinediacetaat en/of chloorhexi-dinegluconaat, en ongeveer 0,0063-0,2 gew.% van één of meer lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur bevat.

2. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, 10 met het kenmerk, dat het middel chloorhexidinediacetaat bevat.

3. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het middel chloorhexidinedihydrochloride bevat.

4. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het middel chloorhexidinegluconaat bevat.

5. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het middel methyl-p-hydroxybenzoaat en propyl-p-hydroxybenzoaat bevat.

6. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het middel methyl-p-hydroxybenzoaat bevat.

7. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het middel propyl-p-hydroxybenzoaat bevat.

8. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het middel een eutectisch mengsel van drie of meer lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur bevat.

9. Antimicrobieel middel volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het eutectisch mengsel bestaat uit een mengsel van isopropyl-p-hydroxybenzoaat, isobutyl-p-hydroxybenzoaat en n-butyl-p-hydroxybenzoaat.

10. Antimicrobieel middel volgens conclusie 9, 30 met het kenmerk, dat de verhouding isopropyl-p-hydroxybenzoaat, isobutyl-p-hydroxybenzoaat en n-butyl-p-hydroxybenzoaat in het eutectisch mengsel ongeveer 4:2,95:2,96 bedraagt.

11. Antimicrobieel middel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de concentratie chloorhexidineverbinding onge- 35 veer 0,0032 gew.% bedraagt. 8104627 s - 19 -

12. Antimicrobieel middel volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de concentratie methyl-p-hydroxybenzoaat ongeveer 0/05 gew.% bedraagt en de concentratie propyl-p-hydroxy-benzoaat ongeveer 0/0125 gew.%.

13. Antimicrobieel middel volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de concentratie van het eutectisch mengsel ongeveer 0,0063 gew.% bedraagt.

14. Werkwijze voor het bereiden van een antimicrobieel middel bestaande uit een vloeibaar mengsel van één of meer 10 chloorhexidineverbindingen en één of meer lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur door vereniging van de samenstellende bestanddelen, met het kenmerk, dat een antimicrobieel middel wordt bereid volgens één der conclusies 1-13.

15. Werkwijze voor het bestrijden van bacteriën, 15 gisten en fungi met een antimicrobieel middel bestaande uit een vloeibaar mengsel van één of meer chloorhexidineverbindingen en één of meer lage alkylesters van p-hydroxybenzoëzuur, met het kenmerk, dat als antimicrobieel middel wordt gebruikt een antimicrobieel middel volgens één der conclusies 1-13 c.q. bereid met de 20 methode volgens conclusie 14.

16. Antimicrobiële middelen en werkwijzen alsmede daarbij verkrijgbare en verkregen antimicrobiële middelen zoals beschreven in de beschrijving en voorbeelden. 25 8104627