NL8005336A - E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen. - Google Patents

Description

ν'

Br/Bl/lh/8 E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen.

De uitvinding heeft betrekking op E-5-(2-halogeen-vinyl]i-2 * -deoxycytidinen, bijvoorbeeld E-3r- (2-broomvinyll -2r-deoxycytidine en E-5-(2-joodvinyl!-2’-deoxycytidine. De uitvinding heeft verder betrekking op de chemische synthese 5 van dergelijke verhindingen alsmede op het gebruik daarvan, in farmaceutische preparaten.

E-5-(2-broomvinyll-2'-deoxycytidine en E-5-(2-joodvinyl ).-21-deoxycytidine of systematischer E-5.-(2-broom-vinyl).- en E-5- (2-joodvinyl? -1-(21 -deoxy-^D-erythro-penta-10 furanosylj-4-amino-l,2-dihydropyrimidin-2-on, zijn chemische verbindingen, die voorgesteld kunnen worden door de structuur-formule 1 van het formuleblad, waarin Hal een broom- of jodd-atoom voorstelt. Opgeraerkt wordt, dat in de formule 1 de aan·'de dubbele binding van de vinylrest in de halogeenvinyl-15 zijketen aan weerszijden gebonden groepen de trans- of E-configuratie bezitten en dat de pyrimidinekern zich op de ^-plaats ten opzichte van de pentofuranosylgroep bevindt.

De verbindingen met de formule 1 kunnen op diverse manieren worden bereid, bijvoorbeeld door het invoeren van 20 een E-5- (2-halogeenvinyl).-, bijvoorbeeld een E-5-(2-joodvinyl)-, zijketen in 21-deoxycytidine of door condensatie, van een gemaskeerd reaktief 2-deoxy-D-erythro-pentofuranosyl-derivaat met een trialkylsilyl-derivaat van E-5-(2-broomvinyll- of E-5-(2-joodvinyl1-cytosine.

25 Uit onderzoekingen is gebleken, dat E-5-(2-broom- vinyl). -2’ -deoxycytidine en E-5- (2-joodvinyl)_-2 * -deoxycytidine een antivirele activiteit bezitten, die zeer specifiek is ten opzichte van herpes simplex virus. Bovendien vertonen zij, naar het schijnt, de afwezigheid van toxiciteit in een cellen-30 kweèk, hetgeen een hoge antivirele index tegen dit type virus tot gevolg heeft, waardoor zij bruikbaar zijn voor de hehan-deling van ziekten, die door herpes simplex bij mens en dier worden veroorzaakt.

^ Tot de stand der techniek behoren reeds enkele 80 05 336 Γ ^ -2- verwante deoxycytidine-verbindingen alsmede verscheidene verwante deoxyuridine-verbindingen, die alle antivirele activiteiten bezitten. Een algemeen overzicht hiervan is gegeven door E. De Clercq c.s. in J. Carbohydrates-Nucleosides, 5 Nucleotides, !5 (3)., 137-224 (1978) waarop de aandacht wordt gevestigd voor verdere bijzonderheden. Hierbij moet echter worden opgemerkt, dat de antivirele activiteit van de meeste van deze verbindingen niet bijzonder specifiek, is,omdat zij een even goede activiteit vertonen tegen verschillende DNA-10 virussen, zoals vaccinia, en herpes simplex. Bovendien is de toxiciteit van de meeste van deze verbindingen en in het bijzonder van de gewone toegepaste standaardverbinding 5-jood-2'-deoxyuridine, niet te verwaarlozen. Het is daarom verrassend, dat.de verbindingen E-5-(2-broomvinyll-2'-deoxycytidine 15 en E-5-(2-joodvinyl)-2'-deoxycytidine een dergelijke specifieke antivirele activiteit tegen een type virus (herpes simplex), bezitten en dat de toxiciteit daarvan in een cellen-kweek. nul kan zijn, zoals bovenstaand.vermeld.

Verder moet worden opgemerkt, dat een specifieke 20 antivirele activiteit tegen herpes simplex.virus alsmede een geringe toxiciteit in een cellenkweek zeer onlangs ook vermeld zijn voor E-5-(2-broomvinyll-2'-deoxyuridine en E-5-(2-joodvinyl).-2'-deoxyuridine. Vergelijk E. De Clercq c.s. in Proceedings National Academy of Science USA, 76.' no· 6, 25 2947r29.5J.- (1979)..

In vergelijking met deze overeenkomstige deoxy-uridine-verbindingen schijnen de verbindingen volgens de uitvinding ten minste even specifiek en bovendien minder toxisch. te zijn en dus geschikt te zijn voor het gebruik in farmaceu-30 tische preparaten en bij de behandeling van de ziekten, die bij mens en dier veroorzaakt worden door. herpes simplex.

Volgens de uitvinding worden nu' E-5-(2-halogeen-vinyll-21 -deoxycytidinen, bijvoorbeeld E-5- (2-hroomvinyl)-21 -deoxycytidine en E-5-(2-joodvinyl).-2'-deoxycytidine, verschaft. 35 Verder wordt volgens de uitvinding een werkwijze verschaft voor het bereiden van een E-5-(2-halogeenvinyl1-2'-deoxycytidine, die gekenmerkt is door het invoeren van een E-5-(2-halogeenvinyl)-zijketen in 2'-deoxycytidine of de condensatie 80 05 33 6 V 1 -3- van een 2-deoxy-D-erythro-pentafuranosyl-derivaat met gemast keerde hydroxylgroepen met een trialkylsilylderivaat van E-5-(2-halogeenvinyl)-cytosine. Volgens de uitvinding wordt eveneens een farmaceutisch preparaat verschaft, dat ten minste 5 ëën E-5-(2-halogeenvinyl)-2’-deoxycytidine, bij voorkeur E- 5-(2-broomvinyl)-2.'-deoxycytidine of E-5-(2-joodvinyl}.-2'-deoxycytidine, als werkzame stof in een drager bevat. Volgens de uitvinding wordt tevens een werkwijze verschaft voor het bereiden van een dergelijk preparaat, waartoe een E-5-¢2-10 halogeenvinyl1-2’-deoxycytidine, bij voorkeur E-5-(2-broom-vinyll-2’-deoxycytidine of E-5-(2-joodv£nyll-2'-deoxycytidine, met een excipients wordt verenigd.

De chemische synthese van de verbindingen volgens de uitvinding wordt nu méér. in bijzonderheden beschreven.

15 Een bij voorkeur toegepaste chemische synthese is weergegeven op het formuleblad door het chema, dat de formules 2,3,4 en 1 omvat. Deze synthese brengt het invoeren van een E-5-(2-halogeenvinyl).-groep in 2'-deoxycytidine onder toepassing van drie opeenvolgende trappen met zich mee.

2(1 Bij de eerste trap van deze bij voorkeur toegepas te synthese wordt 5-chloormercuri-2'-deoxycytidine met de formule 2 met ethylacrylaat tot omzetting gebracht bij aanwezigheid van lithium-palladiumchloride onder vorming van E-5-(2-carbethoxyvinyl)-2’-deoxycytidine met de formule 3.

25 De omzetting verloopt op gladde wijze bij kamertemperatuur of iets hogere temperatuur en in een geschikt oplosmiddel, zoals droogi'methanol. Andere oplosmiddelen, bijvoorbeeld acetonitrile, kunnen in plaats daarvan worden gebruikt. Hèt reaktiemengsel kan worden opgewekt door behandeling met een 3Q reduktiemiddel, bijvoorbeeld of NaBH^ teneinde gereduceerde palladium- en kweekzouten neer te slaan. Het omzettings-produkt kan in goede opbrengst worden verkregen en bezit een trans- of E-configuratie, zoals weergegeven in formule 3.

In plaats van ethylacrylaat kan eveneens de 35 overeenkomstige methylester of een andere alkylester met een kleinere1 koolstofatomen van acrylzuur worden gebruikt.

Deze eerste trap is analoog aan een reaktietrap, die toegepast wordt voor het bereiden van 2’-deoxyuridine- -4- derivaten zoals beschreven door Bergstrom en ' Ogawa in J.A.C.S. 1QQ, 8106 (1978). Het uitgangsmateriaal met de formule 2 is als zodanig bekend en beschreven door Bergstrom en Ruth in J. Carbohydrates-Nucleosides, Nucleotides, £ (5), 257-269 5 (19771.

Bij de tweede trap van de bij voorkeur toegepaste synthese wordt het E-5- (2-carbethoxyvinyl)-derivaat met de formule 3 gehydrolyseerd tot het overeenkomstige E-5-(2-car-boxyviny11-derivaat met de formule 4. Deze hydrolyse kan on-10 der alkalische of zure omstandigheden worden uitgevoerd, hoewel zure omstandigheden het beste kunnen worden vermeden in verband met de kans op nevenreakties.(bijvoorbeeld de afsplitsing van de substituent op de plaats 5 of de afsplitsing van de suikerrest). De hydrolyse onder alkalische omstandigheden 15 kan worden uitgevoerd onder toepassing van diverse basische stoffen, bijvoorbeeld KOH, NaOH, Na^O^, enz., hoewel de toepassing van KOH de voorkeur verdient.

Bij de derde trap van de bij voorkeur toegepaste synthese wordt het E-5-(2-carboxyvinyll-derivaat met de for-2Q mule 4 omgezet in het overeenkomstige E-5-(2-halogeenvinyll-derivaat met de formule 1. Dit kan plaatsvinden door haloge-nering onder zodanige omstandigheden, dat de carboxylgroep wordt verwijderd. Diverse halogeneringsmiddelen kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld elementair halogeen, waterstofhalogeen, 25 waterstofoxyhalogeniden en organische halogenéringsmiddelen (bijvoorbeeld N-halogeensuccinimidenl. Hiervan verdienen waterstofhalogeniden en N-halogeensuccinimiden de voorkeur, omdat zij de -beste resultaten leveren. Verder kan een geschikt oplosmiddel, bijvoorbeeld water, dimethylformamide, dimethyl-3Q sulfoxide, enz. als reaktiemilieu worden gebruikt.

De keuze van het halogenéringsmiddel eh het reaktiemilieu zullen afhankelijk zijn van diverse faktoren, zoals de oplosbaarheid en de stabiliteit van het halogenerings-middel en de oplosbaarheid van het uitgangsmateriaal in het 35 oplosmiddel. Zo kan N-broomsuccinimide met goed resultaat worden gebruikten waterige milieué maar worden N-joodsucci-nimide alsmede elementair broom en jood bij voorkeur onder watervrije omstandigheden, bijvoorbeeld in drooguidimethyl- 80 05 33 6 % * -5- formamide, toegepast. Verder bezit het als uitgangsmateriaal gebruikte carboxyvinylderivaat een geringe oplosbaarheid in water, maar dit probleem kan worden overwonnen door behandeling met waterig kaliumacetaat onder vorming van het gemakke-5 lijk oplosbare kaliumzout of door direkt uitgaan van een waterige· ;op los sing, die bij de voorafgaande hydrolysetrap is verkregen. De oplosbaarheid van het uitgangsmateriaal dln dimethylformamide is iets beter dan in water, maar toch verdient een combinatie van kaliumacetaat en halogeneringsmiddel 10 ook in dit geval de voorkeur.

Volgens de bovenbeschreven drietraps synthese kan het gewenste E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidine in een goede opbrengst worden verkregen. Dit eindprodukt is een ^-anomeer, omdat de gewenste ^-plaats van de py.rimidinekern 15 ten opzichte van de suikerrest reeds in het uitgangsmateriaal aanwezig was. Verder vertoont het een E-configuratie van het halogeenatoom en de pyridinekern ten opzichte van de dubbele binding van de vinylrest dankzij de gekozen methode. Beide feiten zijn van voordeel en leiden ertoe dat de bovenbeschre- 20 ven drietrapsmethode de voorkeur verdient. Een tweede synthe^i se, die minder de voorkeur verdient, is op het formuleblad aangegeven door het schema dat de .formules 5,6 en 1 omvat.

Deze synthese omvat een condensatiereaktie tussen een tri- alkylsilylderivaat van E-5-(2-halogeenvinyll-cytosine (for- 25 mule 51 en een reaktief 2-deqjcy-D-erythxo-pentafuranosyl- derivaat met gemaskeerde hydroxyIgroepen (formule 61 onder vorming van het gewenste eindprodukt. In deze formules stelt R een alkylgroep, bijvoorkeur een methylgroep voor, terwijl R1 een gemakkelijk verdringbare groep, bij voorkeur hetzij 2 3 30 een methojkygroep hetzij een chlooratoom voorstelt, R en R maskerende groepen voor een hydroxylgroep, bij voorkeur de p-toluoylgroep en Hal bijvoorbeeld een broom- of joodatoom Voorstellen en a/ een o(r en/of jSi-configuratie aangeeft.

De condensatiereaktie zal op gladde wijze ver-35 lopen onder invloed van een Lewis-zuurkatalysator, zoals een moleculaire zeef, stannie- of mercurichloride of -bromide of trimethylsilylperfluoralkylsulfonaat. Verder kan een oplosmiddel aanwezig zijn, dat inert is ten opzichte van de -6- reaktiecomponenten en ten opzichte van het produkt en waarin bij voorkeur de reaktiecomponenten en de katalysator in een voldoende mate oplosbaar zijn. Geschikte oplosmiddelen zijn bijvoorbeeld acetonitrile, benzeen, tolueen, dichloormethaan, 5 1,2-dichloorethaan en tetrachloorkoolstof. De omzetting dient in een droge atmosfeer te worden uitgevoerd om de hydrolyse van het trialkylsilylderivaat met de formule 5 te voorkomen.

De reaktietemperatuur is niet kritish. maar zal meestal kamertemperatuur of een lagere temperatuur zijn.

10 Na afloop van de omzetting en het opwerken van het reaktiemengsel kunnen de maskerende groepen uit het verkregen produkt worden afgesplitst volgens gebruikelijke methoden, bijvoorbeeld hydrolyse of alcoholyse.

Deze tweede chemische synthese leidt gewoonlijk 15 tot een mengsel van eenof-t en β-anomeren, welk. mengsel gescheiden moet worden, omdat alleen het ^-anomeer gewenst is. Deze scheiding wordt meestal uitgevoerd voor de verwijdering van de maskerende groepen van de hydroxylgroepen en kan worden uitgevoerd door gefraktioneerde kristallisatie en/of 2Q chromatograféren aan kiezelgel. De schéidingstrap als zódanig is echter nogal lastig zodat de tweede synthese daarom minder de voorkeur verdient.

De uitgangsmaterialen met de formule 6 zijn reeds beschreven en kunnen worden bereid uit 2-deoxy-B-erythrq-25 pentofuranose door methylering van de 1-hydroxylgroep, invoering van maskerende groepen aan de hydroxylgroepen op de plaatsen 3 en 5 en, indien vereist, vervanging van de 1-metho-xygroep'door een chlooratoora (vergelijk bijvoorbeeld C.C.

Bath in Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, door 30 R.S. Tipson en W.W. Zorbach, eds, Interscience, vol. 1, 521-522. (196811 ·

Het andere uitgangsmateriaal kan worden bereid door silylering van E-5-(2-halogeenvinyll-cytosine (formule 51 met een silyleringsmiddel, zoals hexamethyldisilazan of 35 trimethylchloorsilaan of mengsels daarvan (vergelijk A.S. Jones c.s., Tetrahedron Letters, 28, 2459-2460. (19-771 voor een - i —— soortgelijke omzetting. Het E-5-(2-halogeenvinyll-cytosine kan op eenvoudige wijze worden verkregen door bromering of 80 05 33 6 Μ » -7- jodering van 5-vinylcytosine gevolgd door afsplitsing van HBr of Hij onder invloed van warmte {vergelijk R.C. Bleakley c.s., Tetrahedron, 32./ 2795-2797 (1976) voor een analoge omzetting aan 5-vinyluracil). Verder kan E-5-(2-halogeenvinyl)-5 cytosine worden verkregen uit 5-formylcytosine door omzetting met malonzuur onder vorming van E-5-(2-carboxyvinyl)-cytosine gevolgd door een geschikte halogenering op eenzelfde wijze als bovenstaand beschreven voor de eerste synthese.

De eerste chemische synthese alsmede de fysische 10 constanten van de eindprodukten worden nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, die evenwel niet als een beperking van de uitvinding kunnen worden opgevat.

Voorbeeld I

a) E-5- (2-carbethoxyvinyl) -21 -deoxy.cy.tidine. (formule 3).

15 ‘ Ί

In een rondbodemkolf met een capaciteit van 250 . ml worden 4,62 g (10 mmol) 5-chloormercuri-2'-deoxycytidine

(formule 2)., 6 g (60 mmol) ethylacrylaat en 100 ml van 0,1M

Li2PdCI4.,in droog methanol met elkaar verenigd en gedurende

24 uren onder stikstof geroerd, waarbij een zwarte suspensie 2Q

wordt verkregen. Deze suspensie wordt afgefiltreerd, waarbij het zwarte neerslag wordt verzameld. Het neerslag wordt in 100. ml methanol verwarmd en afgefiltreerd. De verenigde filtratén worden met NaBH^ behandeld, todat de precipitatie van zwart materiaal is voltooid en de oplossing kleurloos 25 is. Na nogmaals affiltreren wordt de oplossing onder verminderde druk geconcentreerd (tot 30 ml) waaruit 1,4 g (43%) van de in de titel genoemde verbinding uitkristalliseerd.

U.V. spectrum (ethanol): ^min237 nm(£8,230)>max268 nm(£17,430)^^297 nm (£8,250) 30 *Amav327 nm(£13,920). bij pH van 2;1 ,221 mn(£21,670).

nnq.x ^ max ^„245 nm(£8,56Q)/lmax275 nm(£l3,730)^^97 nm(£8,050) "\ 326 nm(£.14,260) bij pH van 7.

NMR spectrium: 5'(dgDMSO) ? 8,50 (s, 1H, H-6) , 7,57(d, 1H, vinyl H, J=l6 Hz) 35 7,42 (s, 2H, NH2) 6,21 (d, 1H, vinyl E, J = 16 Hz) 6,10 (t, 1H): H-l') 5,16(d, 1H, CH-3') 5,14(t, 1H, CE-5’) 4,20 (m, 1H, H-3*) 4,13(g, 2H, CH2-CH3) 3,79(m, 1H, H-4') 4,62 (m, 2H, H-5'). 2,13 (m, 2H, E-2’) 1,24 (t, 3H, CH2-CH3). ö Λ Λ C 7 7 Λ -8-

Het uitgangsmateriaal, het 5-chloormercuri-21-deoxycytidine, is verkregen volgens de methode van Bergstrom and Ruth, J. Carbohydrates-Nucleosides, Nucleotides, 4^ (5), 257-269 (1977).

b) E-5-(2-carboxyvinyl)-2*-deoxycytidine (formule 4).

5 In 40 ml van een 0,5 M NaOH-oplossing worden 325 mg (1 mmol) carbethoxyvinyldeoxycytidine gesuspendeerd en gedurende 2 uren bij kamertemperatuur geroerd. De heldere oplossing wordt geneutraliseerd tot een pH van 7 door toevoeging van Dowex-50H+-vorm en afgefiltreerd. Deze oplossing 10 wordt onmiddellijk. gebruikt voor de bereiding van E-5-(2— broomvinyl)-21-deoxycytidine.

c) E-5- (2-broomvinyl) -21 -deoxycytidine (formule 1, Hal.=Br)

Een oplossing verkregen door hydrolyse van 325 mg (1 mmol). carbethoxyvinyldeoxycytidine, zoals bovenstaand be-15 schreven, wordt met 178 mg (1 mmol) N-broomsuccinimide behandeld en gedurende 15 uren bij kamertemperatuur geroerd. Na verwijdering van het oplosmiddel wordt het residu aan 50 g SiC^ gezuiverd met CHCl^-CH^OH (80:20) als elueermiddel, waarbij 150 mg (48%) van de in de titel genoemde verbinding 20 (R^ = 0,32) wordt verkregen.

Ü.V. spectrum (water):

9^244 nm(£l6,090^min280 nm(£5,26(^^302 nm£7,610 bij pH

van 2;Amax250 ma(£l5,830)λ^^286 nm(£6,390)^^^292 nm (£.6,590) bij dH van 7? λ 249 nm(£l7,360U,, 283 nm(£7,300) max mn 292 nm(£.7,660) bij pH van 11.

IQaX

NMR spectrum:

SfdgDMSO); 8,10(S, 1H, H-6) 7,21(br, 2H, NH2) 7,05(d, 1H, vinyl-R, J=13 Hz) 6,70(d, 1H, vinyl-H, J=13 Hz) 6,10(t, 1H, H-l') 5,05(br, 2H, OH-3' en OH-5’) 4,10 (m, 1H, H-3') 3,75 J (m, 1H, H-4') 3,60(m, 2H, H-5') 2,10(m, 2H, H-2‘).

Voorbeeld II

a) . E-5-(2-carbethoxyvinyl)-2'-deoxycytidine wordt op dezelfde wijze bereid als beschreven in voorbeeld 1(a).

35 b) E-5-(2-carboxyvinyl)-21-deoxycytidine wordt bereid door hydrolyse volgens het voorschrift van voorbeeld 1(b) afgezien van het feit, dat het oplosmiddel na het neutraliseren en 80 05 33 6 4 » -9- affiltreren in vacuo uit-de oplossing wordt verwijderd en het residu boven ?2°5 gedroogd.

c) E-5-(2-joodvinyl)-2'-deoxycytidine. . (formule 1, Hal=J)

Het bij trap 11(b) verkregen residu wordt in 20 ml 5 droog DMF gesuspendeerd, waarna 225 mg (1 mmol) N-joodsucci-nimide wordt toegevoegd. Het mengsel wordt gedurende 4 uren bij kamertemperatuur geroerd en op de gebruikelijke wijze opgewekt, waarbij 105 mg (28%) van de in de titel genoemde verbinding wordt verkregen.

10 Ü.V. spectrum (ethanol) : 258 nm(£l7,282}^ . 200 nm(£7,504) bij pH van 7;J_ 256 nm

ΙΩαλ SXX luuX

(Cl5,l60)X . 293 nm(£4,700)^ 315 nm(££,216) bij pH van 2.

Iulli IucLX

NMR spectrum; $(dgDMSO); 8,06 (s, 1H, H-6) 7,26(d, 1H, vinyl H, J=14 Hz) 15 7,2Q(br, 2H, NH2) 6,64(d, 1H, vinyl H, J=14 Hz) 6,08 (t, 1H, H-1'J 5,11(d, 1H, OH-3') 5,03(t, 1H, OH-5’) 4,20 (m, 1H, H-3') 3,76 (m, 1H, H-4'1 3,58 (m, 2H, H-51) 2,08(m, 2H, H-2').

Biologische proeven 20. Onderstaand wordt een reeks biologische proeven beschreven, waaruit de specifieke antivirele activiteit, de geringe toxiciteit en. de hoge antivirele index van de verbindingen volgens de uitvinding blijkt.

Bij deze proeven werd het effekt van E-5-(2-halo~ 25 geenvinyl1-2'-deoxycytidine en verwante verbindingen op de groei van én de opbrengst van virussen in kweekkweken gemeten.

De onderzochte verbindingen, waren: E-5-(2-broom-vinyl).-2/-deoxycytidine en E-5- (2-joodvinyll-2 '-deoxycytidine 30 (bereid volgens de voorafgaande voorbeeldenI,' E-5-(2-broom-vinyl).-2'-deoxyuridine en E-5-(2-joodvinyl)-2'-deoxyuridine, en J5-jood-2'-deoxyuridine,(geleverd door Ludeco, Brussel).

Al deze verbindingen waren yS-anomeren.

De verbindingen werden onderzocht op -tëaccinia-35 virus en drie stammen van herpes simplex-1 virus (stam KOS, sta, Mcïntyre en stam F). Deze virussen werden gekweekt in cellenkweken van primaire konijnennier (PRK). en huidfibro-blast van de mens (HSF).

O Λ Λ E T 7 a -10-

De techniek voor het meten van de virus groei in cellenkweken is beschreven door De Clercq c.s., Biochem. Pharmacol. 24, 523-527, (1975).

Proef 1 5 Bij deze proef werd de remmende activiteit van E-5-(2-halogeenvinyl)-2*-deoxycytidinen en verwante verbindingen op vaccinia- en herpes simplex-1 virussen in PRK- en HSF-cellenkweken gemeten. De cellen werden tot samenvloeiing gekweekt op microplaten (PRK, HSF) van kunststofmateriaal.

10 Bij samenvloeiing werden de cellen geent met 10Q CCID^q van hetzij vaccinia- hetzij herpes simplex-1 virus. Eén CCIDj-q of "cell culture infecting dose-50" is de dosis van het virus, die vereist is om 50% van de cellenkwekën te infecteren.. Eën uur na het enten van het virus werden de verbindingen 15 toegevoegd in verschillende concentraties (lopende van 0,001 jig/ml tot 100 /ig/ml). Voor elk virus-cellen-systeem werd de 10,-q bepaald. De ID,-q of "inhibitory dose-50" is de concentratie van de verbinding, die vereist is om het cytopatische effect op het virus met 50% te verlagen. Dit cytopatische 2Q effekt (CPE). werd geregistreerd zodra het bij de niet-behan-delde, met virus besmette cellenkweken volkomen was (in het algemeen 3 dagen nadat de cellen met het virus zijn geent).

De resultaten zijn onderstaand in tabel A vermeld, waarin de gegevens gemiddelde waarden zijn voor de drie afzonderlijke 25 proeven.

Uit tabel A blijkt, dat de E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen, hoewel iets minder actief dan de overeenkomstige deoxyuridine-verbindingen, even actief of iets actiever tegen herpes simplejd-1 zijn dan de standaardverbinding 3Q 5-jood-2*-deoxyuridine. Verder blijkt het, dat het tegenstelling met de standaardverbinding de E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deojxycytidinen een antivirele activiteit bezitten, die zeer specifiek is tegen herpes simplex-1 virus. Deze specificiteit is ongeveer gelijk aan de specificiteit van de over-35 eenkomstige deoxyuridine-verbindingen.

c —n 80 05 33 6 ril- ιΗ k H (¾

CL

C %

££ 03 1¾ W «h «H

13 -P g rH O CN O CN| !5 cflWft · * · · · H m £>00000 I j--- m Tj ω β S &

0) rH «P

g I a CU w ^ +J m S’ r* h η- ιλ gj m ö « ooooih 5 Qj CQ. · · · · · ffBCiooooo S, S «

£ H

Η | Ή ë co 1 η ï ® ~

<D ε-R (¾ ,_h Γ'- f\J

> 'v.w m o o o o cn tn CS · · · · ·

Oj $ - o o o o o I gs I i__

> H

§ fj m i—i Q Γ-

£ ft. S- . Γ" O rH

m ff ^ooiHOr-i S -H _ Li «,.«· . *ri tOSK 0 0 0-0 0 'O (O Q.

* u i w

Ei g & · I I J__- 1 £ ~ Γ** ™

cn o ω cMor^iHO

1 S H

6 -J---; % $ G °. .

Φ n S o r- o o o

(D O P4 «Η iH fH

I § “___ rö - Φ f -5 § S s a a 5 a .3 A t d t 3 ώι 11 & i t aili,.

*. 7 y ? ? s

<D ? 7 7 (M CM

43 ö — -!> I I -ft

•Η *H Η H <·^» H

5 1 & & $ £ I

o t t -S -5 8 § Λ £ I 5 3 Φ ft 0 0¾¾¾ <d φ σ ο ο o r <H > MU O 0 -

0) o 3 -rn -o fM

ft I I 1 I 1

•ft (N 04 ΓΊ CNJ 'Q

80 05 33 6 1 1 ϊ I, 1 j A

-12-

Proef 2

Verder werd het remmende effekt van E-5-(2-halo-geenvinyl)-2'-deoxycytidinen en een verwante verbinding op de vermenigvuldiging van herpes simplex-1 (stam KOS) virus ^ 5 in PRK-cellenkweken gemeten.

Samenvloeiende enkelvoudige lagen.van PRK-cellen in Petri-schalen van kunststofmateriaal (diameter van 55 mm) werden met herpes simplex-1 (4,5 log^g PFE/0,5 ml/Petri-schaal) geent en gedurende één uur bij een temperatuur van 37°C be-1Q broed en onmiddellijk daarna blootgesteld aan 0,1 /ag/ml van elk. van de te -onderzoeken verbindingen. De cellenkweken werden daarna gedurende verschillende perioden (1, 2 of 3 dagen), bij een temperatuur van 37°C bebroed. Na afloop van de be-broedingsperiode werden de cellen bevroren bij een tempera-15 tuur van -70°C en werden de celhomogenaten onderzocht op het virusgehalte door plakvorming in VERO-cellenkweken (VERO = een continue cellenkweek van groene apencellen). De resultaten zijn in tabel B samengevat als de verschillen in virus-opbrengst tussen de behandelde met virus besmette cellen-20 kweken en de niet-behandelde, met virus besmette cellenkweken. PFE betekent plakvormingseenheden.

80 05 33 6 -13-

TABEL· B

Remmend effekt van E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen op de vermenigvuldiging van herpes simplex-1 (stam KOS) virus in PRK-cellenkweken.

I —-----j I - Dosis Vermindering van de virusopbrengst 1 I Verbindincr (μΐ/ml) toio / in vergelijking met con- s' ” ‘ trole- (niet-behandelde ,met virus besmette) I celkwéken___

Ifagen na besmetting 1 2 3 E-5- (2-bra atvinyl) - 2 * -deoxycyt id ine 10 3.8 2.9 2.2 E-5- (2-joodvdnyl) - 2'-deeKycytidine 10 4.3 2.8 2.0 5- jood-2 '-deaxy- uridine 10 4.0 2.6 1.9

|l---_J

Uit tabel B blijkt, dat de door E-5- (2-halogeenvi.nyll-2,-deoxyeytidinen teweeggebracht vermindering van de virusopbrengst vergelijkbaar is met de vermindering bereikt met de standaardverbinding: 5-jood-2'-deoxyuridine.

80 0 5 3 3 6 -14-

Proef 3

De antimetabolische activiteit van E-5-(2-halo-geenvinyl)-2'-deoxycytidinen en verwante verbindingen in PRK-cellenkweken werd gemeten.

Daartoe werd de opname van bepaalde radio-actief 5 gemerkte DNA-voorprodukten in DNA van de cellen en het effekt van 5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen en verwante verbindingen hierop onderzocht. De techniek is beschreven door De Clercq c.s. in Biochemical Pharmacology, 26, 794-797 (1977) en door De Clercq c.s. in Molecular Pharmacology, 1£, 422-430 10 (1978).

3

De toegepaste DNA-voorprodufcten waren (methyl- H) (2'-deoxythymidine) (TdR), en (2-i4C)(2'-deoxyuridine)(UdR).

De cellen werden gedurende 16 uren blootgesteld 3 5 aan 0,12 μ0±:0,01 nmol (methyl- HjTdR (per 10 cellen) of 15 14 μΟί:0,01 nmol (2-140 UdR (per 10^ cellen) bij aanwezigheid van de verbindingen in verschillende concentraties (lopende van 1-200 /ig/ml). De opname van het radio-actief gemerkte voorprodukt werd daarna op de beschreven wijze gemeten, waarna de ID5Q werd bepaald. De ID^g komt overeen met de remmende 20 dosis-50, dat wil zeggen de concentratie van de verbinding, 3 die vereist is om de opname van hetzij (methyl- E)TdR of 14 (2- C)UdR met 50% te remmen. De resultaten zijn onderstaand in tabel C vermeld.

ï·—1 80 05 336 -15-

TABEL C

Antimetabolische activiteit van E-5- (2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen en verwante verbindingen in PRK-cellenkweken.

IDcn ^ig/ml)

Verbinding ------------

Opname. van7‘ . Opname van

(nethyl-%) TdR ’ (2-l4C)UdR

in ENA van da in DNA van da cellen cellen j ' . E-5- (2-brooirvinyl) -21 -deoxy- cytidine 200 >> 200 E-5- (2-brccttvinyl) -2 ‘-deoxy- uridine 100 (70) 100 (70) E-5- (2-.jood/inyl) -2' -deoxy- cytidine ?> 200 >> 200 : E-5- (2-jc»dvmyl)-2 '-deoxy- : uridine 80 (70) 150 (70) 5- jooch2' -deoxyuridine (2.5) (1.2)

Opmerking: De tussen haken opgenomen gegevens zijn verkregen bij afzonderlijke proeven zoals vermeld door D.e Clercq c.s. in Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 76, 2947-2951 (1979).

Uit tabel C blijkt dat geen van de E-5-(2-halogeenvinyl)-2’- 3 deoxycytidinen enige remming van de opname van (methyl- H)

TdR of (2-^C)UdR in DNA van de cellen veroorzaakt zelfs niet' bij 200 pg/ml, de hoogste onderzochte concentratie.

80 05 336 -16-

Proef 4

Tenslotte werd de antivirele index van E-5-(2- halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen en verwante verbindingen in PRK-cellenkweken bepaald als een resultaat van de bij de 5 voorafgaande proeven uitgevoerde metingen.

De antivirele index werd bepaald als de verhou- 14 ding van IDj-q voor de opname van (2- C)UdR in DNA van de cellen tot de ID^q voor de reproduktie van herpes simplex-1 (stam KOS) virus (vergelijk tabellen A en C). De resultaten 10 zijn onderstaand in tabel D vermeld.

TABEL D

Ahtivirele index van E-5-(2-halogeenvinyl)-21-deoxycytidinen en verwante verbindingen in PRK-cellenkweken.

! ___________

Verbinding Antivirele index _ ;E-5—(2-brcmvinyl)-2'-deoxycytidine »3000 ; E-5-(2-broomvinyl)-21 -deoxyuridine 14300 (10000) |E-5-(2-jood vinyl)-2'-deoxycytidine » 2000 E-5- (2-jöbd'vinyl)-2 '-deoxyuridine 15000 (7000) 5-jood-2'-deoxyuridine (12) i ___

Opmerking: Vergelijk de voetnoot bij tabel C met betrekking 15 tot de getallen tussen haken.

Uit tabel D blijkt het, dat de antivirele index voor de E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidinen volgens de. uitvinding (veel) meer dan 2000-3000 bedraagt. Daar deze 20 verbindingen bij de hoogste onderzochte concentratie (200 pg/ml) geen toxiciteit vertoonden, kon de exacte antivirele index niet nauwkeurig worden bepaald.

Uit het voorafgaande zal het duidelijk zijn, dat E-5-(2-broomvinyl)-2'-deoxycytidinen en E-5-(2-joodvinyl)-2'-25 deoxycytidine een uitmuntende en zeer specifieke antivirele activiteit tegerrherpes simplex virus bezitten en dat de toxiciteit daarvan in een cellenkweek naar het schijnt nul is. In vergelijking met de overeenkomstige E-5-(2-halogeen- 80 05 336 -17- vinyl) -2'-deoxyuridinen kunnen zij een grotere specificiteit ten opzichte van herpes simplex virus en een kleinere toxiciteit ten opzichte van levende cellen in cellenkweken bezitten. Hoewel de absolute waarde van de antivirele activiteit daar-5 van iets lager kan zijn dan de waarde voor de analoge 2'-deo-xyuridine-verbindingen doet het schijnbaar ontbreken van toxiciteit bij de nieuwe verbindingen in cellenkweken vermoeden, dat de verbindingen tenslotte therapeutische indices kunnen bereiken die evenhoog zijn of zelfs hoger zijn dan de 10 therapeutische indices, die door de analoge 21-deoxyuridine-verbindingen worden bereikt. De verbindingen kunnen dus met voordeel worden gebruikt voor het bereiden van farmaceutische preparaten en voor de behandeling van ziekten, die bij mens en dier veroorzaakt worden door herpes simplex virus.

15 Farmaceutische preparaten, die E-5-(2-broombinyl)- 21-deoxycytidine of E-5-(2-joodvinyl)-2'-deoxycytidine als werkzame stof bevatten, kunnen de vorm bezitten van poeders, suspensies, oplossingen, emulsies alsmede zalven en pasta^s en kunnen voor parenterale (intradermale, intramusculaire, 20 intrathecale, ___) injecties, orale rectale, intravaginale - en intranasale toedieningen of topicale toediening (bijvoorbeeld op beschadigingen van de huid, slijmvliezen en het oog) worden gebruikt. Deze preparaten kunnen worden bereid door het werkzame bestanddeel (de werkzame bestanddelen) te 25 verenigen met farmaceutisch toelaatbare excipientia, die gewoonlijk voor dit doel worden gebruikt. Deze excipientia kunnen bestaan uit waterige of niet-waterige oplosmiddelen, stabiliseermiddelen, suspendeermiddelen, dispergeermiddelen, bevochtigingsmiddelen en dergelijke en zullen voor het 30 deskundige op*;het farmaceutische gebied bekend zijn. Verder kan het preparaat elk geschikt toevoegsel, zoals polyethyleen-glycolen en desgewenst kleurstoffen, parfums en dergelijke bevatten.

De farmaceutische preparaten zullen het werkzame 35 bestanddeel gewoonlijk in een concentratie van ten minste 0,1% (gew.deel/volj bevatten. De eigenlijke concentratie zal afhankelijk zijn van de te behandelen ziekte en de gekozen - wijze van toediening. In het algemeen zal deze concentratie

O Λ Λ C

Claims (8)

1. Een E-5- (2-halogeenvinyl)-21-deoxycytidine.

2. E-5-(2-broomvinyl)-2’-deoxycytidine.

3. E-5-(2-joodviny1)-2'-deoxycytidine.

4. Werkwijze voor het bereiden van een E-5-(2-5 halogeenvinyl)-21-deoxycytidine, met het kenmerk, dat men een E-5-(2-halogeenvinyl)-groep invoert in 2'-deoxycytidine.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men 5-chloormercuri-2'-deoxycytidine tot omzetting brengt met een alkylacrylaat en een lithiumpalladiumchloride- 10 katalysator, het verkregen E-5-(2-carbalkoxyvinyl)-2’-deoxycytidine hydrolyseert en het verkregen E-5-(2-carboxyvinyl)-2'-deoxycytidine halogeneert tot het overeenkomstige E-5-(2-halogeenvinyl)-2'-deoxycytidine.

6. Werkwijze voor het bereiden van een E-5-(2- 15 halogeenvinyl)-2'-deoxycytidine, met het kenmerk, dat men een reactief derivaat van 2-deoxy-D-erythro-pentofuranose met gemaskeerde hydroxylgroepen tot omzetting brengt met een trialkylsil^l-derivaat van E-5-(2-halogeenvinyl)-cytosine en daarna alle maskerende groepen verwijderd.

7. Farmaceutisch preparaat gekenmerkt door ten minste één verbinding volgens conclusie 1,2 of 3 als werkzaam bestanddeel.

8. Werkwijze voor het bereiden.van een farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat men een. verbinding vol- 25 gens conclusie'- 1,2 of * 3 in een voor therapeutische toepassing geschikte toedieningsvorm brengt. 80 05 33 6