MXPA97009802A - Un proceso para la purificacion de (+) - k-252a - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para la purificación de (+) -K-252a, que comprende:el tratamiento de células de microorganismos que contienen (+) - K-252a representado por la fórmula (I):con una solución alcalina para transformar (+) -K-252a en (+)-K-252b representado por la fórmula (II):o bien sales alcalinas del mismo, que son después liberados de las células, la metilación de (+)-K-252a o bien sales alcalinas del mismo para convertirlos en (+) K-252a otra vez, y el aislamiento y la recolección de K-252 resultante.

Description

UN PROCESO PARA LA PURIFICACIÓN DE (•!-) -K-252a CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para la purificación de (+)-K-252a.

ANTECEDENTES DE LA TÉCNICA (+)-K-252a es una sustancia fisiológicamente activa producida por microorganismos (solicitud de Patente Japonesa Abierta No. 41489/1985) . Tiene una actividad de inhibición para la proteinquinasa C y presenta varios efectos farmacoic-gicos. Un proceso de purificación convencional de ( + -¥-252a comprende los pasos de: a) recoger microorganismos mediante filtración de una solución de cultivo; b) extraer ios microorganismos mediante la adición a ellos de un solvente orgánico hidratado o bien anhidro como por ejemplo metanol o bien acetona; c) remover los microorganismos mediante filtración; d) concentrar la solución extraída resultante; e) extraer adicionalmente dicha solución con un solvente orgánico anhidro en rendimientos altos; f) separarla mediante el uso de una columna llena de adsorbentes como por ejemplo carbón activado o bien Diaion HP-10 y vehículos como por ejemplo gei de sílice, gel de sílice silanizado, oxido de aluminio o bien dextrano; y g) concentrarla para obtener un cristal de (+)-K-252a crudo. Sin embargo, el cristal obtenido de esta forma no tendrá una pureza suficiente. Este proceso requiere por consiguiente adicionalmente de un paso de recristalización con el objeto de lograr una pureza mayor. Además, este proceso nc es adecuado para filtrar una gran cantidad de solución de cultivo porque es considerablemente difícil filtrar la solu-ción de cultivo en este proceso. Alternativamente, es también posible recoger y extraer una solución mediante la extracción directa de una solución de cultivo con un solvente orgánico y después mediante su filtración. Sin embargo, este proceso requiere ademas de un tra-tamiento en columna porque el solvente orgánico empleado para extracción debe agregarse en el mismo volumen que la solución de cultivo o bien más debido a una solubilidad menor de ' + -K-252a en varios solventes (5 a 10 g/1, por ejemplo 5 g/1 en acetona) , un volumen de líquido a tratar es extremadamente incrementado y la solución extraída resultante tiene una pureza menor. PRESENTACIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un proceso de purificación de (+)-K-252a, que comprende: el tratamiento de células de microorganismos que contienen :-?c>?a representado por la fóimula (I) con una solución alcalina para convertir (+)-K-252a eii p I -K-252b representado por la fórmula (II): o bien sales alcalinas del mismo, que se liberan después de las células, la metílación de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo para convertirlos en (+)-K-252a otra vez, y el aislamiento y recuperación de (+)-K-252a resultante. Las células de microorganismos que contienen (p-K-252a empleadas en la presente invención pueden obtenerse mediante- cl cultivo de microorganismos capaces de producir p ) -K-?ÍPri t-n un medio nutriente. Los microorganismos capaces de producir (+)-K-252a incluyen Nocardiopsis sp . K-252 depositado ante la Agricultural Research Service Culture Collection en los Estados Unidos de América bajo el número de acceso NRRL15532 (Solicitud de Patente Japonesa Abierta No. 41489/1985) . Como medio nutriente, se puede emplear cualquier medio convencional generalmente empleado para cultivar microorganismos capaces de producir (+)-K-252a. Ejemplos incluyen un medio nutriente empleado para cultivar antinomicetes normales. Los microorganismos pueden cultivarse adecuadamente en un medio líquido, particularmente en una condición de cultivo sumergido. Pueden cultivarse de preferencia a una temperatura de 25 a 40°C y a un pH neutro de 5 a 9, con mayor preferencia de 6 a 8. Después de la acumulación de (+)-K-252a dentro de las células de microorganismos, el cultivo de las células es detenido para obtener microorganismos empleados para la purificación de (+)-K-252a. (+)-K-252a puede acumularse de pre-ferencia dentro de las células en una concentración de al menos 1.0 g/litro en volumen de células, con mayor preferencia al menos 5.0 g/litro en volumen de células. Las células de microorganismos pueden ser recogidas, mediante centrifugación. De preferencia, un ácido como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico y acido acético, de preferencia acido sulfúrico, puede agregarse a la solución de cultivo para ajustar su pH a 2-4 antes de recoger las células. Cualquier separador centrifugal puede emplearse pa-ra centrifugación. Particularmente, el separador Westfalia el separador alfa-Labal se prefieren porque separar continuamente una gran cantidad de la solución de cultivo mientras se lavan las células de microorganismos con agua de lavacto. Las células recogidas pueden ser suspendidas en una solución alcalina en una concentración de 10 a 80% en volumen, de preferencia de 30 a 50% en volumen para tratarlas con la solución alcalina. Un agente alcalino empleado para la solución alcalina incluye hidroxidos, carbonatos y bicarbonatos de metales alcalinos como por ejemplo litio, sodio o potasio, metales alcalmotérreos como por ejemplo magnesio, calcio o bario, metales monovalentes a trivalentes como por ejemplo aluminio y amonio. Ejemplos que incluyen hidróxido como por ejemplo hidroxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de magne-sio, hidróxido de bario, hidróxido de calcio o bien hidroxido de amonio, carbonatos como por ejemplo carbonato de sodio c bien carbonato de potasio, y bicarbonatos como por ejemplo bicarbonato de sodio o bicarbonato de potasio, prefiriéndose hidroxidos de metales alcalinos. La solución alcalina tiene un contenido alcalino de 0.1 a 5 N, de preferencia de 1 a _ N. El tratamiento alcalino de las células de microorganismos puede efectuarse, como por ejemplo, mediante el calentamiento de las células suspendidas en la solución alcali-na a una temperatura de 30 a 90°C, de preferencia de 60 a 80°C, durante 1 a 24 horas, de preferencia de 3 a 5 horas. En este tratamiento alcalino, (+)-K-252a presente en las células puede ser hidrolizado en (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo y extraído de las células. (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo extraídas con la solución alcalina puede aislarse adicionalmente empleando una columna llena de resinas como por ejemplo resina de adsorción o bien una resina de intercambio de iones con o sin remoción de células de microorganismos. Las células de microorganismos pueden ser removidas, por ejemplo, mediante filtración empleando un embudo de Nutsche, Kiriyama, prensa de filtro o bien separador de canasta. La resina de adsorción incluye SP-207, HP-20, HP-30, HP-40, HP-50 (disponible comercialmente en Mitsubishi Kaseí Corporation) y XAD-2, XAD-4, XAD-284, S-30, S-37, ES-33 (disponible comercialmente en Rohm & Haas) . La resina de intercambio de iones incluye resinas de intercambio de iones fuertemente básicas como por ejemplo PA-304, PA- 12 (comercialmente disponible en Mitsubishi Chemical Corpora-tion), IRA-410, IRA-911, A-26, ES-109, A-101D, ES-111 (comercialmente disponible en Rohm & Haas), DOWEX-2, DO E?-4 (comercialmente disponible en Dow Chemical) y MP-500A, M0-5080 (comercialmente disponible en Bayer) . La resina de adsorción o bien la resina de mter-cambio de iones que retiene (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo pueden lavarse con agua o bien solventes orgánicos hidratados y después someterse a elución de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo a partir de la resina empleando solventes orgánicos o bien solventes orgánicos hidratados. Los solventes orgánicos hidratados empleados para lavar incluyen solventes polares que contienen agua que comprenden acetona, metanol, etanol, propanol o butanol. Estos solventes pueden tener un contenido de agua de al menos 20t, de preferencia de al menos 50%. Los solvente orgánicos empleados para la elución incluyen cetonas como por ejemplo acetona, metiletilcetona, o bien metilisobutilcetona, alcoholes como por ejemplo metanol, etanol o butanol, y esteres como por ejemplo acetato de etilo o bien acetato de butilo. Los solventes orgánicos hidratados empleados para elucción incluyen solventes polares que contienen agua que comprenden acetona, metanol o bien etanol. Estos solventes pueden tener un contenido en agua de al máximo 20%, de preferencia como máximo 10%. A los solventes orgánicos hidratados se les puede agregar opcionalmente una sue-tancia alcalina como por ejemplo hidroxido de sodio c bien una sal como por ejemplo cloruro de sodio y cloruro de anc-nio. La sustancia alcalina puede agregarse de preferencia en una concentración de 0.1 a 1.0 N y la sal puede agregarse de preferencia en una concentración de 0.1 a 1.0 M. La solución extraída con la solución alcalina o bien aislada adicionalmente empleando la columna, que contiene (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo, pueden ser concentradas sin ajustar su pH o bien bajo una condición acida mediante la adición de un acido como por ejemplo acido clorhídrico o bien acido sulfúrico hasta que la cantidad de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo en la solución alcance 0.5 a 20 mg/ml, de preferencia de 5 a 20 mg/ml. Alternativamente, la solución concentrada puede tamoien prepararse mediante la adición de un solvente orgánico a (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo obtenidas mediante la evaporación de la solución eluida hasta sequedad. El solvente orgánico puede agregarse en una cantidad de 50 a 2000 mi, de preferencia de 100 a 200 mi para cada gramo de (+ )-K-252b o bien sales alcalinas del mismo. El solvente orgánico a agre-gar incluye los solventes orgánicos antes mencionados empleados para la elución de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo pueden ser convertidas en (+)-K-252a otra vez mediante su metila-cíon.

La metilación (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo puede llevarse a cabo mediante la adición de un agente de metilación como por ejemplo sulfato de dimetilo a la solución concentrada anterior en la cantidad de 1 a 20 equivalen- tes, de preferencia de 2 a 3 equivalentes para cada equivalente de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo, y su reacción bajo calefacción a una temperatura de 50 a 100°C, de preferencia de 60 a 80°C, durante 2 a 36 horas, de preferencia 6 a 12 horas. Alternativamente, es también posible llevar a cabo la metilación de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo de la siguiente manera. A cada litro de la solución concentrada anterior se agregan 100 a 2000 mi, de preferencia 500 a 800 mi de metanol y un ácido inorgánico como por ejemplo áci- do clorhídrico o bien ácido sulfúrico, un ácido orgánico como por ejemplo ácido metansulfónico o bien ácido toluensulfó- nico, o bien una resina de intercambio de cationes como por ejemplo SK-1A, SK-1B, SK-116 (comercialmente disponible en Mitsubishi Chemical Corporation) , IR-120B, IR-200 (comercial- mente disponible en Rohm & Haas) o bien DOWEX-50W (comercialmente disponible en Dow Chemical). Después, reaccionan entre ellas bajo calefacción a una temperatura de 50 a 100°C, de preferencia de 60 a 80°C durante 2 a 36 horas, de preferencia 6 a 12 horas. El ácido inorgánico, el ácido orgánico o bien - la resina de intercambio de cationes puede emplearse respec-tivamente en una cantidad de 1 a 20 equivalentes, de preferencia 2 a 3 equivalentes para cada equivalente de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo. La solución de reacción metilada de esta forma pue-de ser concentrada bajo vacío y enfriada para precipitar ( -M -K-252a. La concentración bajo vacío puede llevarse a cabo a una presión de 700 a 760 mmHg, de preferencia de 720 a 760 mmHg y a una temperatura de 30 a 80CC, de preferencia de 4U a 50°C, hasta que la concentración de (+)-K-252a alcance una concentración saturada o menos . (+)-K-252a puede ser precipitado de preferencia a una temperatura comprendida entre 10 y 60°C. Alternativamente, es también posible precipitar (+)-K-252a a partir de la solución de reacción mediante la evaporación de la solución metilada hasta sequedad y agregan-do agua y un solvente orgánico. El agua puede agregarse de preferencia en una cantidad de 0.01 a 1 vez, con mayor preferencia de 0.1 a 0.5 veces el volumen del solvente orgánico empleado en la metilación. El solvente orgánico empleado para la precipitación de (+)-K-252a incluye cualquier solvente or-gánico miscible en agua mencionado arriba y puede agregarse de preferencia en una cantidad de 0.5 a 1.5 veces el volumen de agua agregada . El (+)-K-252a precipitado puede ser aislado y recogido en forma general, como por ejemplo mediante filtración y secado.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes ejemplos de prueba. Ejemplos de prueba Ejemplo de prueba 1 Se empleó K-252 de Nocardiopsis sp. (NRRL15532) como células de siembra. Un medio de cultivo que comprende los siguientes ingredientes se empleó como primer medio de cultivo (ph 7.2 a 7.4 antes de esterilización): Glucosa 0.5 g/dl Almidón soluble 3 g/dl Harina de maíz 3 g/dl Licor de maíz 0.5 g/dl Extracto de levadura 0.5 g/dl Carbonato de calcio 0.3 g/dl Un bucle de platino de las células sembradas fue inoculado en un tubo de prueba grueso (volumen de 50 mi) que contiene 14 mi del primer medio de cultivo y fue incubado a 30°C durante 3 días bajo una condición se cultivo agitado. Un frasco de Erlenmeyer (con un volumen de 300 mi) que contenía 40 mi de un segundo medio de cultivo fue inoculado con 4 mi de esta primera solución de cultivo e incubado a 30CC durante 3 días bajo condición de cultivo con agitación . El segundo medio de cultivo comprende los mismos ingredientes que el primer medio de cultivo. Un frasco de Er-lenmeyer desviado (volumen de 2 litros) que contenía 30C mi de un tercer medio de cultivo fue inoculado con 40 mi de esta segunda solución de cultivo e incubado a 30°C durante 4 días bajo una condición de cultivo con agitación. El tercer medio de cultivo comprende los mismos ingredientes que el segundo medio de cultivo. Un termentador de acero inoxidable (volumen de 30 litros) que contenía 16 litros de un medio de cultivo principal para fermentación fue inoculado con 900 mi de esta tercera solución de cultivo e incubado a una temperatura de 30°C durante 7 días bajo una condición de cultivo con agitación y ventilación con una velocidad de agitación de 300 rpm y una velocidad de ventilación de 16 litros/minuto. El medio de cultivo principal para fermentación comprende los mismos ingredientes que el primer medio de cultivo. Un litro de esta solución de cultivo principal fue ajustado a un pH de 3 con ácido sulfúrico concentrado, y las células de microorganismo (300 mi) fueron recogidas empleando un separador de centrifugación de enfriamiento de alta velocidad (CR-20, Hitachi) . 300 mi de las células contenían en total 2 gramos de (+)-K-252a. Estas células fueron lavadas mediante adición de 600 mi de agua y después mediante su centrifugación otra vez. Las células de microorganismos obtenidas de esta forma fueron ajustadas a un pH de 12 mediante adición de hi-dróxido de sodio, y después calentadas a 80°C durante 3 horas para extraer (+) -K-252a . La suspensión de células resultantes fue ajustada a un pH de 7 con ácido sulfúrico concentrado, y después filtrada por Nutsche para remover las células. El (+)-K-252a presente en la solución extraída ob-tenido de esta forma fue casi totalmente convertido en ( + ) -¥-252b o bien sales alcalinas del mismo. Al contrario, cuando se empleó acetona para la extracción, fue necesario emplear 10 litros de acetona para extraer (+)-K-252a a partir de 3GG mi de la célula con un rendimiento del 80%. En la presente invención, (+)-K-252a puede extraerse casi totalmente a partir de las células de microorganismos sin usar solventes orgánicos mediante la conversión de (+)-K-252a en (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo. MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN. Ejemplo 1 El procedimiento del ejemplo de prueba 1 fue repetido para preparar una solución de cultivo. Un litro de la solución de cultivo resultante fue ajustado a un pH de 3 con ácido sulfúrico concentrado, y las células de microorganismos (300 mi) fueron recogidas mediante el uso de un separador de centrifugación de enfriamiento de alta velocidad (CR-20, Hitachi). Dos gramos de (+)-K-252a se encontraron en 300 mi de estas células. Estas células fueron lavadas otra vez mediante centrifugación. A estas células lavadas se agregaron 600 mi de agua para obtener una suspensión de células.

La suspensión de células resultante fue ajustada a un pH de 12 mediante la adición de hidróxido de sodio concentrado, y después fue calentada a 80CC durante 3 horas para extraer (+)-K-252a. La suspensión de células tratadas bajo calentamiento fue ajustada a un pH de 7 con ácido sulfúrico concentrado, y después filtrada por Nutsche para remover las células. La solución extraída obtenida de esta forma fue aplicada a una resina de adsorción (volumen 200 mi, SP-207, Mitsubishi Chemical Corporation) a una velocidad de flujo de SV2. La resina de adsorción fue lavada con 200 mi de agua y 400 mi de metanol al 50%, y después sometida a elución empleando 2000 mi de metanol al 100%. Una fracción que contenía (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo fue concentrada a 1000 mi. A esta solución aluida se agregó 1 mi de ácido sulfúrico concentrado y después se calentó a 60°C durante 3 horas para convertir (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo en (+) -K-252a. La solución resultante fue enfriada y filtrada para obtener un cristal de (+)-K-252a crudo con una pureza del 75% en un rendimiento del 70% (1.4 g en forma de un cristal puro). El cristal de (+)-K-252a crudo resultante puede purificarse adicionalmente fácilmente por recristalización convencional para obtener (+ )-K-252a con una pureza del 95% en un rendimiento del 80% (1.1 g en forma de un cristal puro).

Ejemplo 2 El procedimiento del ejemplo 1 fue repetido para tratar las células de microorganismos con hidróxido de sodio, para aplicar la solución extraída resultante a la resina de adsorción y para lavar la resina de adsorción. (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo adsorbidos en la resina fueron eluidos con 9:1 metanol -hidróxido de sodio. La solución resultante eluida a partir de la resina fue evaporada hasta sequedad, y después disuelta en 1000 mi de acetona. Se agrégaron dos equivalentes de sulfato de dimetilo a esta solución y se calentó a 60°C durante 3 horas para convertir (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo en (+) -K-252a . La solución resultante fue enfriada y filtrada para obtener un cristal crudo de (+)-K-252a con una pureza del 75% en un rendimiento del 70% (1.4 g en forma de un cristal puro) . El cristal crudo de (+)-K-252a resultante puede purificarse fácilmente adicionalmente por recristalización convencional para obtener (+)-K-252a con una pureza del 95% en un rendimiento del 80% (1.1 g en forma de un cristal puro) . Ejemplo 3 El procedimiento del ejemplo 1 fue repetido para tratar las células de microorganismos con hidróxido de sodio.

Las células tratadas fueron aplicadas después directamente sobre una resina de adsorción sin aislamiento de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo a partir de las células. Des-pues, se repitió al procedimiento del ejemplo 2 para obtener un cristal de ( + )-K-252a crudo con una pureza del 75'- en un rendimiento del 70% (1.4 g en forma de un cristal puro). El cristal crudo de (+)-K-252a resultante puede ser fácilmente purificado adicionalmente por recristalización convencional para obtener (+)-K-252a con una pureza del 95% en un rendimiento del 80% (1.1 g en forma de un cristal puro). Ejemplo 4 El procedimiento del ejemplo 2 fue repetido para obtener un cristal crudo de (+)-K-252a con una pureza del 75% en un rendimiento del 70% (1.4 g en forma de un cristal puro) , excepto que se empleó una resina de intercambio de iones fuertemente básica (PA-412, Mitsubishi Chemical Corporation) en vez de la resina de adsorción y 9:1 metanol - cloru-ro de amonio 0.1 N se empleó como eluyente. El cristal crudo resultante de (+)-K-252a puede ser fácilmente purificado adicionalmente mediante recristalización convencional para obtener (+)-K-252a con una pureza del 95% en un rendimiento del 80% (1.1 g en forma de un cristal puro). Ejemplo 5 Se repitió el procedimiento del ejemplo 4 para obtener un cristal crudo de (+)-K-252a con una pureza del 5* en un rendimiento del 70% (1.4 g en forma de un cristal puro) , excepto que las células de microorganismos fueron apli-cadas directamente a la resina de intercambio de iones sin aislamiento de (+)-K-252b ni de sales alcalinas del mismo a partir de las células. El cristal (+)-K-252a crudo resultante pude ser fácilmente purificado adicionalmente mediante recristalización convencional para obtener (+)-K-252a con una pureza del 95% en un rendimiento del 80% (1.1 g en forma de un cristal puro) . APLICACIÓN INDUSTRIAL De conformidad con la presente invención, la purificación industrial de (+)-K-252a puede lograrse fácil y eco-nómicamente sin emplear grandes cantidades de solventes orgánicos. El (+)-K-252a obtenido de conformidad con la presente invención tiene una pureza más alta.

Claims (2)

1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Un proceso de purificación de (+)-K-252a qut comprende : el tratamiento de células de microorganismos que conu-iiH. (+)-K-252a representado por la fórmula (I): con una solución alcalina para convertir (+)-K-252a en K-252b representado por la fórmula (II) : o bien sales alcalinas del mismo, que son después liberados de las células, la metilación de ( + )-K-252b o bien sales alcalinas del mi sm. -para convertirlos en (+)-K-252a otra vez, y eJ aislamiento y recolección de (+)-K-252a resultante.
2. 2.- Un proceso de purificación de (+)-K-252a que comprenda: el tratamiento de células de microorganismos que luii ent-n (+)-K-252a representado por la fórmula (I) : con una solución alcalina para convertir (+)-K-252a en í + i -K-252b representado por la fórmula (II) : C02H o bien sales alcalinas del mismo, que son después liberaaos de las células, el asilamiento de (+)-K-252b o bien sales alcalinas del mismo, la metiJación de (+)-K-252b o bien sales alcalinas deJ mismo para convertirlos en ( + )-K-252a otra vez, y el asila-miento y recolección de p)-K-252a resultante.