MXPA97009505A - Metodo para transferir al menos dos unidades de sacarido con una poliglicoslitransferasa - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere aun método para transferir al menos dos unidades de sacárido con un poliglicosiltransferasa, una poliglicosiltrasnferasa y un gen que codifica dicha poligrlicosiltransferasa.

Description

MÉTODO PARA TRANSFERIR AL MENOS DOS UNIDADES DE SACARI DO CON UNA POLIGLICOSILTRANSFERASA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para transferir al menas das unidades de sacárido con una pol igl icosi 1 ransferasa , una pal igl icas 1 transferasa y un gen que codifica tal pol igl icasi 1 transferas . PRESENTACIÓN DE LOS ANTECEDENTES: BIOSI TESIS DE O I80SACÁRI OS Los al igasacáridos son polímeros que presentan un número variable de residuos, enlaces, y subunidades. La subu.ni.dad básica es un monosacérida de carbohidrato o azúcar, co o por ejemplo mañosa, glucosa, galactosa, N-acet i Igl icosaaii na , N- acet i Igalactosa i na , y similares. El número de cadenas de • ol igasacáridos estereoisoméricas posibles diferentes es enorme. Los ol igasacáridos y las polisacáridos desempeñan una función importante en el fune ianamiento y la actividad de las proteínas, porque sirven como moduladores de vida media y, en algunos casos, porque proporcionan estructura. Co o se subrayó arriba, los ol igosacáridas son esenciales para la variabilidad antigénica, y por consiguiente para la evasión inmune de Neisseria, especi lmente gonococos. Se han desarrollado varias técnicas clásicas para la síntesis de los carbohidra os, pero estas técnicas adolecen de la dificultad de requerir de una protección y desprotección selectiva. La síntesis orgánica de al igasacáridos se ve afectada adicionalmente por el carácter lábil de muchos enlaces gl icos id ico , dificultades para lograr acoplamiento de azúcar regioselect i vas, y generalmente rendimientos sintéticos bajos. En resumen, a diferencia de la experiencia con la síntesis de los péptidos, la química orgánica sintética tradicional no proporciona una síntesis cuan i a iva, confiable de ol igasacáridos aún sencillos. Se han dado recientes avances en la síntesis de los ol igasacáridos con el aislamiento de gl icosi 1 transferasas a partir de fuentes naturales. Estas enzimas pueden emplearse in vitro para preparar ol igasacáridos y polisacáridos (ver, por ejemplo, Roth- Patente Norteamericana No. 5,180,674). La ventaja de la biosíntesis con gl icosi 1 transferasas es que los enlaces glicosídicos formados por enzimas son altamente estereoespe í fi os y regioespeci fieos. Sin embargo, cada enzima cataliza un enlace de residuos de donador de azúcar específicos a otra molécula aceptar específica, por ejemplo, un ol igosacárido o lípido. Por consiguiente, la síntesis de un ol igasacárido deseado ha requerido del uso de una gl icosil ransferasa diferente para cada unidad de sacárido diferente que se está transfiriendo.

Más específicamente, tales gl icosi 1 ransferasas que han proporcionado solamente la transferencia de tina unidad de sacárido única, específica para la gl i cosí 1 transferas . Por ejemplo, una g 1 ctasi 1 transf rasa transferirá solamente galactosa, una gl ueasj 1 ansf rasa , transferirá solamente glucosa, una N-a et i lglucosamim 1 trans ferasa transferirá solamente N-acet i lg] ueosamma una sial 11 transferasa transferirá solamente ácido siálico. Sin embargo, las faltas de generalidad de las gl icosi 1 transferasas hace necesario el uso de gl i cosí ltransferasas diferentes para cada donador de azúcar diferente que se está transfiriendo. Conforme la utilidad de los compuestos de ol igosar idos se expande, la capacidad de transferir más que un donador de azúcar proporcionaría una ventaja importante, disminuyendo el número de gl ICOSI 1 transferasas necesarias para formar los enlaces glicosí lieos necesarios. Además, una gl icosi 1 tran ferasa q?e transfirió al menos dos donadores diferentes de azúcar sería de provecho p ra sintetizar dos enlaces glicosídicos de al menos un tpsacápdo, empleando la misma gl icosi 1 transferasa . Un locus involucrado en la biosíntesis de 1. pool ígasacá ido gonococal (LOS) ha sido reportado como clonado a partir de la ct»pa gonococal F62 (Gots hl ich J. E;-p. Med. (1994) 180, 2181-2190). Cinco genes IgtA, IgtB, IgtC, IgtD y IgtE son reportados, y en base a experimentos de remoción, se postulan actividades como codificación para gl icosi 1 transferasas. Debido a la j ncert idumbre provocada. por la naturaleza de los experimentos de remoción, la actividad exac de las proteínas codificadas por cada uno de los genes o fue determinada y en el caso de algunos de los genes se sugiere solamente q?e son responsables de una u otra actividad, en la alternativa. Se sugiere que es muy probable que el gen lgtA codifique una GlcNAc transferasa. A la fecha no se ha reportado la ransf rencia de más de una porción de sacando diferente por una pol ígl icosi 1 ransfera s . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se enfoca hacia un método para transferir al menos dos unidades de sacáridos con una pal ígl icosi 1 transferas , una pol i 1 ícasi 1 ransferasa y ácidos nucleicos que codifican una pol igl íeosi 1 ransferasa. Por con iguiente, en un aspecto, la invención se enfoca hacia un método para transferir al menos dos unidades de sac ndo con una pol íg) icosi 1 transferas . Por consiguiente, otro aspecto de la invención se enfoca hacia un método para transferir al menos dos unidades de sacando con una pol ígl icosi 1 transferasa , que transfiere tanto GlcNAc GalNAc, a partir de los nueleótidos de azúcar correspondiente, a un aceptor de azúcar.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se obtiene una pal igl icasi 1 ransferasa a partir de una bacteria del género Neisseria, Eseheriehia o bien Pseudomonas. De conformidad con otro aspecto de la invención, dicha invención se enfoca hacia un método para preparar al menos das compuestos de al igosacárido a partir del mismo aceptor, con una po1 ig 1 ieos i 11ra nsf ras . Por consiguiente, otro aspecto de la presente invención se enfoca hacia un método para preparar al menos dos compuestos de ol igosaeár ido, a partir del mismo aceptor, con una pal igl icosi 1 transferasa que transfiere tanto GlcNAc y Gal Ac, a partir de los nucí ó idos de azúcar correspondientes, hacia el aceptor de a zúca r . De conformidad con otra modalidad de la invención, dich invención se refiere a un método para transferir una N-acet i lgalactasa ina empleando una gl icosi 1 transferasa de SEQ ID N0:3. En modalidades específicas, la invención se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de pol i.péptidos ilustrada en SEQ ID NO: 3. La pol igl icosi 1 trapsferasa funcionalmente activa de la presente invención se caracteriza porque cataliza tanto la adición de Gal Ac beta 1-3 a G l como la adición de GleNAe beta 1-3 a Ga 1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos de una pol igl ?eos? 1 transf rasa de SEO ID 0:3. La figura 2 proporciona la secuencia de pal m?cleót idos de un gen que codifica LOS aisl do a par i de N. gonorrhoeae (SEO ID N0:1), cuyos nucleótidos 445-1488 codifican una pol igl i cosí 1 transf ras . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENriON Como antes presentado, la presente invención ofrece un método para transferir al menos dos unidades de sacando con una pol igl icosi 1 transferas , un gen que codifica una pol igl icosi l rans erasa , y una pol igl i cosí 1 trans rasa . Las pol igl íeosi ] transfer. sas de la presente invención pueden emplearse para la biosíntesis in vH ro de varios al igosacápdos, como por ejemplo el ol igo ac p do de núcleo de los antígenas de grupo sanguíneo humano es decir, lacto--N-neotet raosa . La clonación y e presión de una pol ígl icosi 1 transf rasa de la invención puede lograrse empleando técnicas estándares de conformidad con lo presentado aquí. Tal pol igl icosi 1 ransferasa es útil para la biosíntesis de ol igosacár idos ín vitro, o bien a erna ivamente genes que codifican tal pal igl icusí 1 ransferasa pueden ser transf ctados en células, por ejemplo, células de levadura o bien células eur.a rió t icas, para proporcionar una gl icosi lac lón alternativa de proteínas y lípidos. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento que una pol igl icosi 1 transferasa aislada de Neissepa gonorrhoeae es capaz de transferir tanto Glc Ac beta 1-3 a Gal y G3lNAe beta 1-3 a Gal, a partir de los nucleótidos de azúcar correspondientes. Una prtjteína, con actividad gl icosi 1 transferasa , es reportada por Gotschlich et al., Documento Norteamericano No. de Serie 08/332,387 presentado el día 26 de Septiembre de 1994, mediante la clonación de un locus involucrado en la biosíntesis de LOS gonococal, cepas F62. Se ha descubierto ahora que la secuencia de proteína identificada como SEQ JD N0:3, una proteína de 348 aminoácidos, tiene una actividad pol igl cos 11 ransferas . Más espe íficamente, se ha descubierto que la secuencia de protelna identificada como SEQ ID N0:3 transfería tanto GlcNAc betal-3 a Gal como Sa 3 Ac betal-3 a Ga , a parti de los nucleótidos de azúcar correspond lentes . Además de la secuencia de proteina SEQ ID NO:3 y de las secuencias de ácidos nucleicos para codificarla reportada en el Documento Nort americano No. de Sene 08/312,387, se han descubierto nuevas pol ígl ICOSI 1 ransferasas q?e transfieren dos unidades diferentes de azúcar. Esta proteína es similar a la proteína de SEQ ID NO:3 con la remoción de una o dos de las cinco unidades de glicinas, que ocurren entre los aminoácidos nos 86-90 de gtA. Además, una secuencia de aminoácidos adicional -Ty r-Ser-Arg-Asp-Ser-Ser (SEQ ID N0:7), puede agregarse al extremo carboxi de lie (aminoácido no. 348) de SEQ ID N0:3, mientras se conserva la actividad pal igl ícosi 1 transf rasa . Una secuencia de pol i núcleo t idos que codifica una pol igl íeusí 1 transferasa es similar a la secuencia de los ácidos nucleicos no. 445 a 1488 de un IOS aislado de N. gonorrhoeae (ver figura 2 (SEQ ID N0:1) en donde tres o seis de las unidades de guanina que ocurren entre los ácidos nucleicos 700 a 715 han sido removidas. Otra secuencia de pol inucleó idos es similar a l a secuencia de los ácidos nucleicos no. 445 a 1488 de un LOS aislado de N. gonorrhoeae ¡ver figura 2), en donde ácidos nucleicos suficientes para codificar la secuencia de aminoácidos -Tyr— Ser-Arg-Asp--Ser-Ser (SEQ ID N0:7), pueden agregarse al ácido nucleico 1488. Las abreviaturas empleadas en esta especificación incluyen: l ipopol i sac n do, LPS; 1 ipoal igosa ápdo, LOS; manafasfata de citidma de ácido N-acet i lneurami meo, CMP-NANA; tipo salvaje, «»it; Gal, galactosa, Glc, glucosa; NAc, N-acetilo (por ejemplo, GalNAc o b en GlcNAc). AISLAMIENTO DE GENES PARA POL IG ICOSSLTPANSFERASAS Cualquier célula bacteriana de Ne ssepa puede servir poten í Imente como fuente de ácido nu leico para la clonación molecular de un gen de pol ?gl i cosí 1 transferasa . En una modalidad específica, ipfra, los genes están aislados de Neissepa gonorrhoeae. El ADN puede ser obtenido mediante procedimientos estándares conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (por ejemplo, una "bibl loteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante clonación de cADN, a bien mediante la clonación de un ADN genómico, o bien fragmentos del mismo, purificados a partir de la célula deseada por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practica! Approach, MPL Press, Ltd., Oxford, Peino Unido Vol. 1, II). Por ejemplo, un ADN genómico de N. gonorrhoeae puede ser digerido con una endonucleasa de restricción o bien can endapucleasas de restricción, por ejemplo Sau3A, en un ve or fago digerido con una endonucleasa de restricción o bien con .arias endonucleasas de restricción, por ejemplo BamHI/EcoRI, para la creación de una biblioteca gen?mica de fago. Cualesquiera q?e sea la fuente, el gen debe estar molécula rmente clonado en un vector adecuado para propagación del gen. En la clonación molecular del gen a partir del ADN gen?mica, se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codifican el gen deseado. El ADN puede ser disociado en sitias específicos empleando vanas enzimas de restricción. Al erna ivamente, se puede emplear ADNsa en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o bien el ADN pu d ser cortado físicamente, co o por ejemplo mediante somcación. Los fragmentos de ADN lineales pueden entonces ser separados de conformidad con tamaño por técnicas estándares, incluyendo, sin limitarse a ellas, electrofóresis en gel de agarosa y pol lacp 1 amida y rom to r fía en columna. Una vez generados los fragmentos de ADN, la i entificaci n del fragmento de ADN específico que contiene el gen de pol igl icosi 1 tran-?ferasa deseado puede lograrse de vanas maneras. Por ejemplo, los fragmentos de ADN generados pueden ser tamizados por hibridación de ácidos nucleicos a la sonda marcada sintetizada con una secuencia de conformidad con lo presentado aquí (Benton y Davis, 39'77, Science 196:380; Grun eins y Hogness, 1975, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Los fragmentos de ADN con una homología sustancial con la sonda se hi bridarán. Sondas adecuadas pueden ser generadas mediante reacción en cadena de poli erasa empleando cebadores aleatorios. Particularmente, una sonda que se híbrida con la secuencia de pol i nuc leo idos que codifica un residuo de cuatro o inco gl cina (es decir, un residuo de doce o quince guanina) sería una sonda adecuada para una pol ígl icosi 1 ransf rasa . De conformidad mn lo arriba descrito, la presencia del gen puede ser detectada por ensayos basados en las propiedades físicas, químicas, o bien inmuno! icas de su producto exprejsado. Por ejemplo, clones de ADN que producen ?na proteina que, por ejemplo, tiene migración elec roforé ica, comportamiento de enfoque isoeléctrico, mapas de digestión proteol í icos , actividad proteolítica o bien propiedades funcionales, p ticularmente acti idad pol ígl icosi 1 transferasa , la capacidad de una proteína de pol igl i cosí 1 transferasa de mediar la transf rencia de dos unidades diferentes de sacárido a una molécula de aceptor similares o idénticos. Alternativos para aisl r un ADN genómico de pol ígl icosi 1 transferasa incluyen, sin limitarse a ellos, la síntesis química de la secuencia del gen misma a partir de una secuencia conocida. que codifica una pal igl ícasi ltransferasa . En otra modalidad, el ADN para un gen de pol ígl icosi 1 ransferasa puede aislarse mediante reacción en cadena de poli me asa empleando cebadores de al igonucleó idos diseñados a partir de las secuencias de nucleótidos presentadas aquí. Otros métodos son posibles y se encuentran dentro del alcance de la invención. El gen identificado y aislado puede insertarse en un vector de clonación apropiado. Un gran numera de sistemas vector-huésped conocidos en la técnica pueden emplearse. Vectores posibles incluyen, sin limitarse a ellos, plésmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula huésped empl ada. En un aspecto espe ifico de la invención, la secuencia de codificación de pol ígl icosi 1 transferasa se inserta en un ve tor de clonación de E. coli. Otros ejemplos de vectores incluyen, sin limitarse a ellos, bacteriófagos como por ejemplo derivados de lambda, o bien plásmidos como por ejemplo derivados de pBR322 o bien derivados plásmidos de pUC, por ejemplo, vectores pGE , pmal-c, pFLAG, etc. La inserción en ?n vector de clonación puede, por ejemplo, lograrse mediante la ligación del fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos totalmente cohesivos. Sin embargo, si los sitios de restricción complementarios empleados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los entremos de las moléculas de ADN pueden ser enzimá icamente modificados. Alternativamente, cualquier sitio deseado puede ser producido mediante ligación de las secuencias de nucleótidos íenlazadores) en los extremos de ADN; estos enlazadares 1 ígados pueden comprender ol igonuc leó idos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. En modalidad específica, se pueden emplear cebadores de Reacción en Cadena de Polimerasa que contienen tales sitios de enlazador para amplificar el ADN para clonación. Moléculas recomb i nantes pueden ser introducidas en las células huésped a través de transformación, transf cc ón, infección, electroporac i ón, etc., de tal manera que se generen muchas copias de la secuencia de gen.

La transformación de células huésped con moléculas de ADN recombinantes que incorporan el gen aislado de pol ígl ícasi 1 ransf rasa o bien secuencia de ADN sintetizada permite la generación de copias múltiples del yen. Por consiguiente, el gen puede ser obtenido en grandes cantidades por cultivo de transformantes, aislamiento de moléculas de ADN rerom mant s a partir de los transformantes y, cuando es necesario, recuperación del gen insertado a partir del ADN recomb i ríante aislado. La presente invención se refiere también a vectores que contienen genes que codifican las formas truncadas de> la enzima (fragmento) y deri ados de las pol igl íeosi 1 ransferasas que tienen la misma actividad funcional de una pol igl ICOSÍ 1 t ransferas . La producción y uso de fragmentos y derivados rela ionados a las pol igl ícasi 1 transferasas se encuentran dentro del alcance de la presente invención. En ?na modalidad específica, el fragmento o derivado es funcianalmente activo, es decir, capaz de mediar la transf rencia de dos donadores de azúcar a una porción de aceptor. Los fragmentos truncados de las pal ?g] icosi 1 transferasas pueden ser preparados mediante la eliminación del extremo N, extremo C, o bien regiones externas de la proteína que no se requieren para la actividad funcional. Habí tu lmente, tales porciones que son eliminadas incluyen solamente algunos residuos de aminoácido, entre 1 y 5 por ejemplo, pero se pueden remover segmentos más grandes. Moléculas quiméricas, por ejemplo, proteínas de fusión, que contienen toda la pol íg 1 icosi 1 rapsferasa a bien una porción funcionalmente activa de una pol i l i cosí 1 ransferasa de la presente invención unida a otra prateína se plantean también. Lina proteína de fusión de pol igl icos i 1 transferasa comprende al menos una porción fune i on lmente activa de una proteína de no gl i cosí 1 ransferasa unida a través de un enlace de péptido con al menos una porción fupcionalmente activa de un polipép ido de pal igl icasi 1 transferas . Las secuencias no gl icosi 1 ransferasa pueden ser extremo amina o bien carbo?? para las secuencias de pal igl ICOSI 1 transferas . La expresión de ?n=? proteína de fusión puede resul r' en una prateína de fusión de pol igl icosi 1 ransferasa enzimá icamente inac iva. Una molécula de ADN reco b in nte que codifica t l proteina de fusión comprende una secuencia que codifica al menos una porción f?nc íon l mente ai iva de una proteína de no gl i cosí 1 ransf rasa unida en estructura a la se uencia de codificación de pol igl ícosi 1 transferasa , y codifica de preferencia un sitio de disociación pa a una proteasa espe ífica, por ejemplo, trombina o bien factor Xa, de preferencia en la unión de pol i l icasi 1 transferasa con no-gl icosi 1 tran^ferasa . En una modalidad específica, la proteína de fusión puede ser expresada en Eschepchia col i .

Particularmente, los derivados de pol ígl icosi 1 transferasa pueden ser elaborados alterando las secuencias de ácido nucleico de codificación por sustituciones, adiciones o bien remociones que proporcionan moléculas funciona lmente equivalentes. Debido a la degenera ión de las secuencias de codificación de nuc leo t idos, otras se>.uen las de ADU que codifican substanc íalaiente la misma secuencia de aminoácidos que un gen de pol ígl i cosí 1 ransferasa pueden emplearse en la práctica de» la presente invención. Estas incluyen, sin limitarse a ellas, secuencias de nu 1 eó idos que comprenden todos los genes de pol i l icosi 1 ransf rasa o bien partes de los mismos que son alterados por la sustitución de cadones diferentes que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. De la misma manera, los derivados de pol igl icosi 1 t ransferasa de la presente invención incluyen, sin limitarse a ellos, los «que contienen, como secuencia primaria de aminoácidos, toda la ecu nci de aminoácidos o bien parte de dicha secuencia de una pol iyl icosi 1 transferasa incluyendo secuencias alteradas en donde residuos de aminoácidos fuñe lonal enbe equivalentes están sustituidos por residuos dentro e la secuencia que resultan en una sustitución conservadora de aminoácidos. Por ejemplo, uno o vanos residuos de aminoácidos dentro de l a secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido de una polaridad similar que actúa como equivalente funcional, lo que resulta en una alteración silenciosa. Sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse a partir de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no piolares (hictrofóbi eos ) incluyen alanina, leucina, isolencina, val ma, prolina, feni la lanina , triptófano y me ionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, ser ina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los a inoác idos cargados posi ivamente (básicos) incluyen argimna, lisina e histidina. Los aminoácidos argados negativamente (ácidos) incluyen ácido asp r- ico y ácido glutámico. Los genes que codifican derivados y análogos de pol ígl icosi 1 t ransferasa de la presente invención pueden ser producidos por varias métodos coñac idos en la técnica (por ejemplo, Sambrooi- et al., 1989, supra). La secuencia puede ser disociada en sitios apropiados con endanucleas (s) , de restricción, seguido por una modificación enzimática adicional si se lísea, aislada, y ligada in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de pol ígl icosi 1 trans ferasa , se debe to ar precauciones para asegurar que el gen modificado permanece dentro de la misma estructura de lectura translacional que el gen de pol igl icosi 1 transferasa , sin interrupción por se iles de detención de translación, en la región de gen donde se codifica la actividad deseada. Adicion lmente, la secuencia de ácidos nucleicos de pal ígl icosi 1 transferasa puede aer mutada in vitro o bien in vivo, para crear y/o destruir secuencias de translación, iniciación y/o terminación, o bien para ?_rear variaciones-» en regiones de codificación y/o formar nuevos sitios de endonucleasa de restricción o bien destruir sitios de endonucleasa de restricción pree istentes, para facilitar adíe lona lmente una modifica ión in vi tro. Cualquier técnica para mutagénesis cono ida en la técnica puede emplearse, incluyendo, sin limitarse a ellos, la m?tagénesis dirigida por sitio ín vi tro (Hutchinson, C. , et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y S ith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gene 44.177; Hulchinson et al., 1986, Froc. Nati. Acad. S: i . U.S. A. 83:710), el uso de enlazadores TABO (Pharmacia), etc. Se prefieren técnicas de reacción en cadena de polimerasa para m?tagénesis dirigida por sitio (ver Higuchi, 1989, "Using PCR to Engmeer DNA", (El uso de la reacción en cadena de poli erasa para manipular el ADN), en PCR Technology: Principies and Applications for DNA Ampl i f ica ion, H.: Erlich, ed . , Stoe1 ton Press, capítulo 6, páginas 61-70). Mientras se ha aislado una pol igl icos i 1 transf rasa a partir de una bacteria de Neissepe gonorrhoeae, se pueden aislar también pal igl icosi 1 ransf rasa a partir de otras especies bacterianas de Neissepa. Ejemplo de fuentes bacterianas de Neissepa incluyen N. animal is (ATCC 19573), N. canis (ATCC 14687), N. cinérea (ATCC 14685), N. cuniculi (ATCC 14688), N. demtpficans (ATCC 14686), N. elongata (ATCC 25295), N. elongata subsp. glycolytica (ATCC 29315), N. elongata s?bsp. nitroreducens (ATCC 49377), N. flavescens (ATCC 13115), N. gonarrhoeae (ATCC 33084), N. lacta ica (ATCC 23970), N. macaca (ATCC 33926), N. meningí t idi s, N. muco-sa (ATCC 19695), N. mucosa subsp. heidelbergensis (ATCC 25c?98) , N. polysaecharea (ATCC 43768), N. sicca (ATCC 29256) y N. subflava (ATCC 49275). Además se pueden aislar pol igl icosi 1 transferasas a partir de Branha ella catarrhalis, Haemophilu influenzas, Eschepchia col i , Fseudomonas aeruginosa y Pseudomonas cepacia. EXPRESIÓN DE UNA FOLIGL ICOSS LTRANSFER?SA El gen que codifica una pol ígl icosi 1 transferas , o bien un fragmento func lona 3 mente activo o bien otro derivado del mismo, puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contienen los elementos necesarios para la transcripción y translación de la secuencia de codificación de proteína insertada. Un vß.tor de expresión incluye también de preferencia un origen de repl icación. Las señales de transcripción y translación necesarias pueden también ser suministradas pior el gen nativo de pol ígl icosi 1 transferasa y/o sus regiones de flanco. Varios sistemas huésped-ve tor pueden emplearse para expresar la secuencia de codificación de proteina. De preferencia, sin embargo, se emplea un sistema de expresión bacteriana para ofrecer un alto nivel de expresión de la prateína con una probabilidad más alta de conformación nativa. Sistemas potenciales huésped-vector incluyen, sin limitarse a ellos, sistemas de células de mamífero infectados con virus (por ejemplo virus de la vaccima, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectados con virus (por eje plo bac?lovirus); microorganismos co o por ejemplo levadura que contiene vectores de levadura, o bien bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN de plásmido, o bien ADN de cósmido. Las elementos de expresión de vectores varían en sus fuerzas y espe ificidades. Según el sistema huésped-vector empleado, cualquiera de vanos elementos adecuados de transcripción y translación puede emplearse. De preferencia, la forma pepplásmica de la pol ígl icosi ltransferasa (que contiene una secuencia de señal) se produce para la exportación de la proteína al per ipl asma de Eschepchia coli o bien en un sistema de expresión basado en Bacillus subtillis. Cualesquiera de los métodos previamente descritos para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede e pilearse para construir vectores, de expresión que contienen un gen quimérico que consiste en señales apropiadas de control de transcripción/translación y las secuencias de codificación de proteína. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y de ADN recombinante in vi tro así como reco b mant s ín vivo ( recomb nac i ón genética). La expresión de secuencia de ácidos nucleicos que codifica una pol igl icasi 1 transferasa o bien fragmento de péptido puede ser rey?lada por una segunda. secuencia de ácidos nucleicos de tal manera que la pol igl icosi 1 transferasa o bien péptido e expiresa en un huésped transformado por la molécula de ADN recomb inante. Por ejemplo, la expresión de una pol ígl i cosí 1 ransf rasa puede ser controlada por cualquier elemento promotor / i ncre entador conocido en la técnica, pero estos elementos de regulación deben ser funcionales en el huésped seleccionado para expresión. Para la expiresi?n en bacterias, se requieren promotores bacterianos. Promotores virales eucapót icos a bien promotores eucar íó i eo , incluyendo promotores y específicos para tejido, se prefieren cuando se inyecta un vector que contiene un gen de pol igl icosi 1 ransferassa directamente en un sujeto para expresión transiente, lo que resulta en una protección heteróloga contra una infección bacteriana, de conformidad con lo descrito con detalles a con inuación. Promotores que pueden emplearse para controlar la expresión de gen de pío3 iyl ico i 1 transferasa in: luyen, sin limitarse a ellos, la región de promotor temprano de SV40 ( eopist y Chambón, 1981, Nature 290:304-330), el promotor contenido en la repetición terminal de longitud 31 de Rous sarcoma virus (Yama ots, et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de i idinquinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. S i . U.S. A. 78:1441-1445), las secuencias de regulación del gen de meta lot ione ina (Bpnster et al., 1982, Nature 296:39-42); los v c tares de expires ón procarió icos como por ejemplo promotor de 0~lacta asa (Vi 1 la-r'amarof f , et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Se i . U.S. . 75:3727-3733), o bien el promotor tac (DeBo r, et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80:21-25); ver también "Proteínas útiles a partir de bacterias recomb mantés" en Scientific American, 1980, 242:74-94; y similares. Vectores de expresión que contienen insertos de gen da pol ígl icosi 1 transf rasa pueden ser identificados mediante cuatro enfoques generales: (a) amplificación por reacción en cadena de pol ímerasa del ADN de plásmido deseado o bien mARN espec ífico, (b) hibridación de ácidos nucleicos, (c) presencia o ausencia de fun iones genéticasa de "marcador", y (d) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, los ácidos nucleicos pueden -ser amplificadas por reacción en cadena de polimerasa con incorporación de radionucleót idos o bien marcados con bromuro de etilio para permitir la detección del producto amplificado. En el segundo enfoque, la presencia de un gen foráneo insertado en un vector de expresión puede ser detectada por hibridación de ácidos nucleicos empleando sondas que comprenden secuencias homologas a un gen de piol igl icosi 1 transferasa insertado. En el tercer enfoque, el sistema vector/huésped recombinante puede ser identificado y selec ionado en base a la presencia o ausencia de ciertas funciones de gen "marcador" (por ejemplo, actividad beta-gal c osí dasa , actividad PhaA, actividad í i ipqu i nasa , resistencia a los antibióticos, fenotipo de transforma ión, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.) provocadas por la inserción de genes foráneos en el vector. Si el gen de pol igl íeosi 1 t ransf rasa es insertado dentro de la secuencia de gen marcador del vector, los recomb i nantes que contienen el inserto de pol igl icosi 3 trans fera a pueden ser identificados por la ausencia de la función de gen marcador. En el cuarto enfoque, vectores de expresión recombinantes pueden ser identificados mediante el ensayo de la a tividad del producto de gen de pol ígl icasi 1 t ransferasa expresados por el recomb ?n3pte. Tales ensayos pueden basarse, por ejemplo en las propiedades físicas o funcionales del producto de gen de pal igl icosi 1 transf rasa en sistema de ensayo ín vi tro, por ejemplo, actividad pal ígl icosi 1 tran ferasa . Una vez establecidos un sistema de huésped adecuado y condiciones adecuadas de crecimiento, se pueden propagar y preparar cantidades grandes de vectores de expresión recomb mant s. BIOSINTESIS DE OL IGOS CÁRIDOS La pol ígl icosi 1 transferasa de la presente invención puede emplearse en la biosíntesis de ol igosacár idos. Las pol ígl icosi 1 ransferasas de la invención tienen capacidad de conjugación estereoespecl f i C? de dos unidades de sac ndo activadas específica sobre moléculas de aceptor específicas. Tales sacáridos activados consisten generalmente de derivados de di fosfato de guanosina o un dina y monofosfato de citidina de los sacápdos, en donde el monofosfato y difosfato de n?cle?sido sirve >_omo grupo lábil. Por consiguiente, el sacárido activado puede ser un sac ndo-UDP , un sacápdo-GDP, o bien un sacápdo-CMP. En modalidades especificas, el sacando a ivado es UDP-GlcNAC, UDP-GalNAc, o bien UDP-Gal . Dentro del contexto de la invención recl mada, dos unidades diferentes de sacando significan ¿acáridos que difieren en cuanto a estructura y/o estereoquímica en una posición otra que Cl y por consiguiente la pirasana y furanosa de la misma estructura de carbono se consideran como 3a misma unidad de sacárido, mientras que la glucosa y galactosa (es decir, isómeros C4) se consideran diferentes. Para que se considere que una g 1 icosi 1 ransf rasa tiene una actividad gl icosi 1 ransfer sa específica, se requiere típicamente que una gl i eos 11 transfera sa tenga una actividad catalítica de aproxi adamente 3 a 250 rotac i ones/sec . Por consiguiente cada actividad gl i cosí 1 ransf rasa individual de la pol ígl icosi 1 rapsferasa de la presente invención se encuentra dentro del rango de 1 a 250 ratae lunes/sec , de preferencia de 5 a 100 rotac: iones/ser. , con mayor preferencia de 10 a 30 rotac ione / ec . Además de la actividad gl icosi 1 transf rasa absoluta, las velocidades relativas de cada uno de las actividades gl icosi 3 transf rasa identificadas, en la pol ígl icosi 1 transí rasa , tiene actividades relativas de 0.1 a 10 veces, de preferencia de .2 a 5 veces, con mayor preferenci de 0.5 a 2 veces, y can preferencia especial de 0.8 a 1.5, la velocidad de cual squiera de las otras actividades de gl icosi 1 transferas . El término "por ión de aceptor" comu se emplea aquí se refiere a las moléculas a las cual s la pol igl icosi Itransferasa transfiere los azúcares activados. Para la síntesis de un ol igosacá ido, una pol igl i eos 111 ransf ra sa es puesta en contacto con un sacárido activado apropiado y una porción de aceptor apropiado bajo condiciones efectivas para transferir y enlazar- covalentemente el sac ndo sobre la molécula aceptor. Condiciones de tiempo, temperatura y pH apropiado y óptimo para una transferencia de unidad de sacarina particular pueden ser determinadas a través de pruebas de rutina. En general, las condiciones fisiológic s son aceptables. Algunos o re i. ti vos pueden también ser deseables; por ejemplo, puede ser más efectivo poner en contacto la pol ig 1 icos i 1 transferasa con el sac ndo activado y Ll a porción aceptor en presencia de un catión divalente.

De conformidad con la presente invención, l s en; imas de pol i l icosi 3 transíera a pueden ser covalentemente o bien no covalentemente inmovili adas en un soporte de fase sólida co o po ejemp3o SELPHADE , SEPHAROSE, o bien resina de poli (ac p 1 ami da-co-N-aep lox ísueci imida ) (PAN). Una reacción específica puede ser realizada en una solución de reacción aislada con separa ión fá il de la enzima de fase sólida a partir de los productos de la reacción. La inmovilización de la en: i a permite también un flujo biosintético continuo, con las pol ígl icosi 1 tr psf r as espe íficas fijadas sobre un soporte sólido, con los soportes arreglados aleato iamente o bien en zonas distintas en el orden especificado en una columna, >-on pasaje de la solución de reacción a través de la columna y elución del ol igosacá ido deseado al final. Un método eficiente par-a fi a la pol ígl icosi 1 transferasa sobre un soporte sólido y usar tales pal igl icosi 1 ransf rasas inmovilizadas se describe en la Patente Norteamericana No. 5,180,674, expedida el día 19 de Enero de 3993, a Roth, que se incorpora específicamente aquí por referencia en s? totalidad.

Un ol igosacá ido, por ejemplo, un isa rido, preparado empleando la pol i l icosi 1 transferasa de la presente invención puede servir como porción de aceptor para síntesis adicional, empileando ya sea otras pol igl icctsi 1 transferasas de la invención o bien gl icosi 1 transfera sa;> conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Roth, Patente Norteamericana No. 5, 180, 67-q). Al erna ivamente, las pol ígl icosi 1 ransferasas de la presente invención pueden emplearse para preparar GalNAcbetal-3--Galbeta3-4-GlcNAebetal-3~-6albetal-4-61e o bien G lNAcbetal~3-G 3bet 3-4-GleNAcbet l-3-Gal et 3 -4-61 NAc a partir de lactosa o bien lactosami na , respectivamente, en donde se emplea un pol igl icosi 1 transferasa piara sintetizar tanto el enlace GlcNAC beta3-3-Gal y GalNAc betal-3 Gal. Por cansí g? i ente, un método para 3 a preparación de ?n oligosacápdo q?e tiene la estructura G lNACbetal-3-Galbetal-4~GlcNAcbetal-3-G lb t l-4-8lc omprende secuenc lalmente la realización de los siguientes pasos: (a) poner en contacto la mezcla de la reacción que comprende un GlcNAc activado (como por ejemplo UDP-GlcNAc) con lactosa con una pol ígl íeosi 1 transferasa que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID N0:3, o bien un fragmento funcionalmente activo de la misma; (b) poner en contacto una mezcla de la reacción que comprende un Gal activado (es decir UDP-G31 ) con la porción ?7 aceptor que comprende un residuo Gc 3 NAcbeta 1-3-Ga Ibeta 1-4- Glc en presencia de una betal -4-g l ctos 11 transf r a ; (c) poner en contacto una mezcla de la reacción que comprende un GalNAc activado (es dec. i r , UDP-GalNAc) con la porción de aceptor que comprende un residuo Galbetal-4- GlcNAcbetal -3-G=? lbetal --4-Glc en presencia de la pol igl i cosí 11 ransf rasa de paso a). Una betal-4 g 1 acto s i 1 fc r ansferasa puede ser aislada a partir de le he bovina. La síntesis de ol igosacá idos, empleando una pal igl ícasi 1 transferasa , se lleva a cabo generalmente a una temperatura comprendida entre 15 y 38ßC, de preferencia entre 20 y 25°C. Mientras la actividad enzimática es comparable a 25°C y 37°C, la estabilidad de pol ígl icosi 1 transferasa es mayor- a 25"C. En una modalidad preferida, se observa una actividad pol ígl icosi 1 transferasa en ausencia de al fa~lactalbum?n . En una modalidad preferida, se observa una actividad pol igl icosi 1 transf r-asa en el mismo pH, con mayor preferencia a un pH comprendido entre 6.5 y 7.5. En una modalidad preferida, se observa una actividad pol ígl icosi l ransferasa a la misma temperatura. Otras características de la presente invención serán aparentes en el curso de a * siyuí^ntes descripciones de modalidades ejemplares que se proporcionan piara la ilustración de la invención y no tienen el propósito de limitar dicha invención. EJEMPLO 1 Sínte is de G lNAcbetal-3~Galbeta -4-81cNAebet l-3-Galbeta3 -4-Glc: Se puso en contacto lactosa con UDP-N-acet i Ígl ucosamina y una beta-galactosida betal-3 N-aceti lglucosamini 1 transferasa de SEQ ID N0:3, en una solución acuosa regulada con HEPES 0.5 M a una temperatura de 25°C. El trisecando producto fue después puesto en contacto con UDP~6al, y una beta-N~ acet i lglucasami nosido betal-4 galactosi 1 transferasa aislada a partir de leche bovina, en una solución acuosa regulado con HEPES 0.05 M a una tempier tura de 37°C. El tetrasacár ido producto fue después puesto en contacto con UDP-N-acet i Ig lactosamina y beta-galaetósido betal-3 N-acet 11 galactosami ni 1 transferasa de SEQ ID N0:3, en una solu ión acuosa regulada con HEPES 0.05 M 3 una temperatura de 25°C. El pentasacár ido del título fue aislado por métodos conven ion les. * •* * * # * * •* Evidentemente numerosas o i fieac iones y variaciones a la piresente invención son posibles en base a las enseñanzas anteriores. Por consiguiente se entiende que dentro del alcance de las r i indi ciones anexas, la invención puede ser practicada de otra forma que lo espe íficamente descri o aquí .

Claims (10)

1. 50
2. REIVINDICACIONES 1. Un método para transferir al menos dos unidades ds sacando con una enzima única que comprende la puesta en contacto de una porción aceptor y dos donadores de a z ?ca r diferentes con una pol igl ICOS? 1 transf rasa . 2. El método de la reivindicación 1, donde dichas dos unidades de sacárido son N-acet i Iglueo amina y N- aceti lga lac os mina .
3. 3. El método de la reivindicación 1, donde dicha porción de aceptor tiene? una galactosa en un extremo no reductor.
4. 4. El método de la reivindicación 3, donde dicha pol igl i cosí 1 transfer asa es aislada de Neissepa.
5. 5. El método de la reivindicación 1, donde dicha pol ?g3 icosi 11 ransferasa es aislada a partir de Neissepe gonorrhoeae.
6. 6. Un método piara transferir N-aeet i Igalac tosamina a una porción aceptor, que comprende la puesta en contacto de un donador de N-acet i lgalactosami na y una porción acepitor con una N-acet i lglucosa ini 1 transferasa .
7. 7. El método de la reivindicación 6, donde dicha N-acet i lglucosammi 1 transferasa es aislada a partir de N issepa .
8. 8. El método de la reivindicación 6, donde dicha N-aceti lglucasamini 1 ransferasa es aislada a partir de Neissena gonorrhoeae.
9. 9. El método de la reivindicación 6, donde dicha porción de aceptor tiene una galactosa en un extremo no reductor.
10. 10. El método de la reivindicación 8, donde dicha Neisseria gonorrhoeae es ATCC 33084.