JP4460615B2 - ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物の生合成のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒグリコシルトランスフェラーゼ - Google Patents

ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物の生合成のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒグリコシルトランスフェラーゼ Download PDF

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（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／１１８，２１３号（１９９９年２月１日出願）の利益を主張し、そして米国特許出願第０９／４９５，４０６（２００年１月３１日出願）の一部継続出願であり、これら両方が、本明細書中で全ての目的に対して参考として援用される。
（本発明の分野）
本発明は、ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物を含むオリゴサッカリドの酵素的合成の分野に関する。
（本発明の背景）
ガングリオシドは、３つのエレメントからなる糖脂質の１クラスであり、しばしば細胞膜中に見出される。１つ以上のシアル酸残基が、オリゴサッカリドまたは炭水化物のコア部分に結合されて、これは、次いで一般的に細胞膜中に存在する疎水性脂質（セラミド）構造体に結合される。このセラミド部分は、長鎖塩基性（ＬＣＢ）部分および脂肪酸（ＦＡ）部分を含む。ガングリオシドならびに他の糖脂質およびそれらの構造体は、一般的に、例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９８１）２８７〜２９５頁およびＤｅｖｌｉｎ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，１９９２）に論じられている。ガングリオシドは、炭水化物部分におけるモノサッカリドの数、ならびにその炭水化物部分中に存在するシアル酸基の数および位置に従って、分類される。モノシアロガングリオシドは、「ＧＭ」の略号が付けられ、ジシアロガングリオシドは「ＧＤ」と称され、トリシアロガングリオシドは「ＧＴ」、そしてテトラシアロガングリオシドは「ＧＱ」と称される。ガングリオシドは、さらにシアル酸残基の位置またはその残基が結合した位置に依存して、分類される。さらなる分類は、オリゴサッカリドのコアに存在するサッカリドの数に基づき、ここで、添え字の「１」が４つのサッカリドを有するガングリオシド（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）を表し、下付き「２」「３」および「４」がそれぞれ、トリサッカリドを有するガングリオシド（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）、ジサッカリドを有するガングリオシド（Ｇａｌ−Ｇｌｃ−セラミド）およびモノサッカリドを有するガングリオシド（Ｇｌｃ−セラミド）を表す。
ガングリオシドは脳で、特に神経末端に最も多量に存在する。これらは、神経伝達物質（アセチルコリンを含む）に対するレセプター部位に存在すると考えられ、そしてまた、他の生物学的な高分子（インターフェロン、ホルモン、ウイルス、細菌毒素などを含む）に対して特異的なレセプターとして作用し得る。ガングリオシドは、神経系障害の処置のために使用されている。Ｍａｈａｄｎｉｋら（１９８８）Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｒｅｓ．１５：３３７−３６０；米国特許第４，７１０，４９０号および同第４，３４７，２４４号；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ（１９８８）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．１７４：５９３−６００；Ｋａｒｐｉａｔｚら（１９８４））Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ａｎｄ Ｂｉｏｌ．１７４：４８９−４９７を参照のこと。特定のガングリオシドは、ヒト血球細胞の表面上に見出され（Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄら（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２６０：２７２−２７８；Ｍａｃｈｅｒら（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１９６８−１９７４；Ｄａｃｒｅｍｏｎｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４２４：３１５−３２２；Ｋｌｏｃｋら（１
９８１）Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ７：２４７）、これらガングリオシドは、これらの細胞の末端顆粒球の分化において役割を有し得る。Ｎｏｊｉｒｉら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：７４４３−７４４６。これらのガングリオシドは、「新生ラクト（ｎｅｏｌａｃｔｏ）」系列といわれ、式［Ｇａｌβ−（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）］ｎＧａｌβ（１，４）Ｇｌｃ（ここで、ｎ＝１〜４）を有する中性のコアオリゴサッカリドを有する。３’−ｎＬＭ１（ＮｅｕＡｃα（２，３）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌβ（１，４）−Ｇｌｃβ（１，１）−セラミド、および６’−ｎＬＭ１（ＮｅｕＡｃα（２，６）Ｇａｌβ（１，４）ＧｌｃＮＡｃβ（１，３）Ｇａｌβ（１，４）−Ｇｌｃβ（１，１）−セラミドは、これらの新生ラクト系列のガングリオシドの中に含まれる。
ガングリオシド「模倣物」は、いくつかの病原性生物と関連する。例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９株の低分子量ＬＰＳのコアオリゴサッカリドは、ガングリオシドの分子的擬態を提示することが示された。１９７０年代後半より、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉは、ヒトにおける急性胃腸炎の重要な原因として認識されている（Ｓｋｉｒｒｏｗ（１９７７）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．２：９−１１）。上皮学的な研究により、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染がＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染よりも発展途上国においてより普通であり、そしてこれらはまた、発展途上国における下痢疾患の重要な原因であることが示された（Ｎａｃｈａｍｋｉｎら（１９９２）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。急性胃腸炎の原因であることに加えて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ感染は、全身性麻痺の最も通常の原因である神経障害の１形態である、Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群の発症に先立つ頻発するものとして関係している（Ｒｏｐｐｅｒ（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６：１１３０−１１３６）。Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群に関連する最も通常のＣ．ｊｅｊｕｎｉの血清型は、Ｏ：１９であり（Ｋｕｒｏｋｉ（１９９３）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．３３；２４３−２４７）、そしてこのことは、この血清型に属する株のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）構造体の詳細な研究を興した（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ａ）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２１２２−２１２５；Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ｂ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２４１−２４９；およびＡｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ｃ）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２５０−２５５）。
ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＭ１およびＧＴ１ａの末端オリゴサッカリド部分に同一な末端オリゴサッカリド部分は、種々のＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９株において見出されている。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４は、血清型Ｏ：１９に属し、そして一時期の下痢の期間の後にＧｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ症候群の発症した患者から単離された（Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４ａ）、前記）。これは、トリシアル化ガングリオシドＧＴ１ａを模倣する外部コアＬＰＳを有することが示された。ＬＰＳのサッカリド部分によって宿主構造体の分子的擬態は、免疫応答をくぐり抜けるこの方法を使用する種々の粘膜性病因の有毒因子であるとみなされる（Ｍｏｒａｎら（１９９６ａ）ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：１０５−１１５；Ｍｏｒａｎら（１９９６ｂ）Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｓ．３．５２１−５３１）。
結論として、ＬＰＳ合成に関係する遺伝子の同定およびそれらの制御の研究は、これらの細菌によって使用される病原性の機構のよりよい理解のために考慮に値して有益である。さらに、治療剤としてのガングリオシドの利用、およびガングリオシド機能の研究は、所望のガングリオシドおよびガングリオシド模倣物の便利で且つ効果的な合成方法によって促進される。３’−ｎＬＭ１および６’−ｎＬＭ１の合成への酵素的アプローチおよび化学的アプローチの組み合わせが、記載されている（ＧａｕｄｉｎｏおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１１４９−１１５０）。しかし、従来で利用可能な酵素的方法は、十分な量で十分に低コストで、実践的な大規模ガングリオシド合成のために、効率的に酵素を生成することの困難を被っている。従って、大規模生産に利用可能なガングリオシド合成に関する新規酵素についての必要性が存在する。また、ガングリオシド合成のためのより効率的な方法についての必要性が存在する。本発明は、これらの必要性および他の必要性を充足する。
（本発明の要旨）
本発明は、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼ酵素およびこの酵素をコードする核酸を提供する。１つの実施形態において、本発明は、単離された核酸分子および／または組換え核酸分子を提供し、この核酸分子は、ポリヌクレオチド配列をコードし、このポリヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択されるポリペプチドを、コードする：
ａ）脂質Ａ生合成アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド３５０〜１２３４（ＯＲＦ２ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１２３４〜２４８７（ＯＲＦ３ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド２７８６〜３９５２（ＯＲＦ４ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約１００アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｄ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７７％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｅ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；
ｆ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性、またはα２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方のいずれかを有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０の１つ以上に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約６６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；
ｇ）シアル酸合成活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド６９２４〜７９６１によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｈ）シアル酸生合成活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド８０２１〜９０７６によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｉ）ＣＭＰ−シアル酸合成酵素活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９０７６〜９７３８によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｊ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９７２９〜１０５５９によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；および
ｋ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１０５５７〜１１３６６の逆相補配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
本発明において好ましい実施形態において、本発明は、単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供し、この核酸は、ポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードする：ａ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、ここでこのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７６％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；ｂ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドであって、ここでこのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；ｃ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、ここでこのガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
また、本発明によって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ核酸が、所望される宿主細胞中でグリコシルトランスフェラーゼの発現を促進するプロモーターおよび他の制御配列と作動可能に連結される、発現カセットおよび発現ベクターが提供される。本発明のグリコシルトランスフェラーゼを発現する組換え宿主細胞もまた、提供される。
本発明はまた、以下からなる群から選択される、単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドを、提供する：
ａ）脂質Ａ生合成アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド３５０〜１２３４（ＯＲＦ２ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１２３４〜２４８７（ＯＲＦ３ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ
生合成遺伝子座のヌクレオチド２７８６〜３９５２（ＯＲＦ４ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約１００アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｄ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７７％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｅ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を包含する、ポリペプチド；
ｆ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性、またはα２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方のいずれかを有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約６６％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；
ｇ）シアル酸合成活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド６９２４〜７９６１によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｈ）シアル酸生合成活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド８０２１〜９０７６によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｉ）ＣＭＰ−シアル酸合成酵素活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９０７６〜９７３８によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；
ｊ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９７２９〜１０５５９によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；および
ｋ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号１に示されるような、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１０５５７〜１１３６６の逆相補配列によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
本発明において好ましい実施形態において、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを提供し、これは、以下を含む：ａ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであり、ここで、このシアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７６％同一であるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド；ｂ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドであって、ここで、このＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドが、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；およびｃ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、ここで、このガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドが、配列
番号２７または配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
本発明はまた、シアリル化オリゴサッカリドの合成のための反応混合物を提供する。この反応混合物は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドを含む。またこの反応混合物中には、ガラクトシル化アクセプター部分、およびシアリル−ヌクレオチド糖も存在する。このシアリルトランスフェラーゼは、シアリル−ヌクレオチド糖からの第１のシアル酸残基（例えば、ＣＭＰ−シアル酸）を、α２，３結合でガラクトシル化アクセプター部分に転移し、そしてさらに、第２のシアル酸残基を、α２，８結合で第１のシアル酸残基に付加する。
別の実施形態において、本発明は、シアリル化オリゴサッカライドの合成のための方法を提供する。これらの方法は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチド、ガラクトシル化アクセプター部分、ならびにシアリル−ヌクレオチド糖を含む反応混合物を、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドが、α２，３結合でシアリル−ヌクレオチド糖からの第１のシアル酸残基を、ガラクトシル化アクセプター部分に転移し、そしてさらに、第２のシアル酸残基を、α２，８結合で第１のシアル酸残基に転移する適切な条件下でインキュベートする工程を、包含する。
・本発明はまた、以下も提供し得る：
・項目１． ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子または組換え核酸分子であって、当該ポリペプチドは、
ａ）脂質Ａ生合成アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド３５０〜１２３４（ＯＲＦ２ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１２３４〜２４８７（ＯＲＦ３ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド２７８６〜３９５２（ＯＲＦ４ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約１００アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｄ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７７％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｅ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド；
ｆ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０のうちの１つ以上に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約６６％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｇ）シアル酸合成酵素活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド６９２４〜７９６１によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｈ）シアル酸生合成活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド８０２１〜９０７６によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｉ）ＣＭＰ−シアル酸合成酵素活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９０７６〜９７３８によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｊ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９７２９〜１０５５９によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
ｋ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１０５５７〜１１３６６の逆相補体によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
からなる群より選択される、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
・項目２． 項目１に記載の単離された核酸分子または組換え核酸分子であって、当該核酸は、
ａ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、当該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｂ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドであって、当該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｃ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、当該ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
からなる群より選択される１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子または組換え核酸分子。
・項目３． 項目１に記載の核酸分子であって、上記配列比較は、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）３、Ｇ＝１１、Ｅ＝１およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスにてＢＬＡＳＴＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０アルゴリズムを使用して実施される、核酸分子。
・項目４． 項目１に記載の核酸分子であって、上記領域は、上記ポリペプチドのアミノ酸配列の全長にわたって延びる、核酸分子。
・項目５． 項目１に記載の核酸分子であって、
ａ）上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、もしくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含み；
ｂ）上記ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み；
ｃ）上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７もしくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む；
核酸分子。
・項目６． 項目５に記載の核酸分子であって、
ａ）上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６に示される核酸配列と、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であり；
ｂ）上記β１，４−ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１６に示される核酸配列と、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であり；
ｃ）上記β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２６もしくは配列番号２８に示される核酸配列と、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一である；
核酸分子。
・項目７． 項目６に記載の核酸分子であって、上記配列比較は、語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）１１、Ｇ＝５、Ｅ＝２、ｑ＝−２、およびｒ＝１にてＢＬＡＳＴＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０アルゴリズムを使用して実施される、核酸分子。
・項目８． 項目６に記載の核酸分子であって、
ａ）上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６に示される核酸配列を有し；
ｂ）上記ＧａｌＮａｃトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１６に示される核酸配列を有し；
ｃ）上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２６もしくは配列番号２８に示される核酸配列を有する；
核酸分子。
・項目９． 項目５に記載の核酸分子であって、上記シアリルトランスフェラーゼは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性とα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性との両方を有する二機能性シアリルトランスフェラーゼであり、当該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４に示される核酸配列と少なくとも約７５％同一である、核酸分子。
・項目１０． 項目１に記載の核酸分子を含む、発現カセット。
・項目１１． 項目１０に記載の発現カセットを含む、発現ベクター。
・項目１２． 項目１１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
・項目１３． 単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、
ａ）脂質Ａ生合成アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド３５０〜１２３４（ＯＲＦ２ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｂ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１２３４〜２４８７（ＯＲＦ３ａ）によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｃ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド２７８６〜３９５２（ＯＲＦ４ａ）によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも約１００アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約５０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｄ）β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７７％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｅ）β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｆ）α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１０に示されるようなアミノ酸配列と、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約６６％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｇ）シアル酸合成酵素活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド６９２４〜７９６１によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｈ）シアル酸生合成活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド８０２１〜９０７６によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｉ）ＣＭＰ−シアル酸合成酵素活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９０７６〜９７３８によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
ｊ）アセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド９７２９〜１０５５９によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
ｋ）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド１０５５７〜１１３６６の逆相補体によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも約６５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
からなる群より選択される、単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチド。
・項目１４． 項目１３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、組換え生産されており、かつ少なくとも部分的に精製されている、ポリペプチド。
・項目１５． 項目１３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、異種宿主細胞により発現された、ポリペプチド。
・項目１６． 項目１５に記載の単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドであって、上記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである、ポリペプチド。
・項目１７． 項目１３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：２ポリペプチドである、ポリペプチド。
・項目１８． 項目１３に記載の単離されたポリペプチドまたは組換え生産されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、ｇに記載のシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであり、当該ポリペプチドは、
α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号３に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４由来のＬＯＳ生合成遺伝子座のＯＲＦ ７ａによりコードされるｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号５に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１０由来のｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号７に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：４１由来のｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、当該ポリペプチドは、配列番号１０に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：２由来のｃｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
からなる群より選択される、ポリペプチド。
・項目１９． 項目１８に記載の単離されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドまたは組換え生産されたシアリルトランスフェラーゼポリペプチドであって、該シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５．配列番号７、および配列番号１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
・項目２０． 項目１３に記載のポリペプチドであって、
ａ）ｆのシアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、もしくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有し；
ｂ）ｄの１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有し；
ｃ）ｅのβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号２７もしくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する；
ポリペプチド。
・項目２１． シアリル化オリゴサッカライドの合成のための反応混合物であって、当該反応混合物は、
α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド；
ガラクトシル化アクセプター部分；ならびに
シアリル−ヌクレオチド糖；
を含み、
該シアリルトランスフェラーゼは、α２，３結合において当該シアリル−ヌクレオチド糖から当該ガラクトシル化アクセプター部分へと第１のシアル酸残基を転移し、そしてさらに、α２，８結合において第２のシアル酸残基を当該第１のシアル酸残基へと転移する、
反応混合物。
・項目２２． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記シアリル−ヌクレオチド糖は、ＣＭＰ−シアル酸である、反応混合物。
・項目２３． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する、反応混合物。
・項目２４． 項目２３に記載の反応混合物であって、上記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、反応混合物。
・項目２５． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシル化アクセプターは、式Ｇａｌβ１，４−ＲまたはＧａｌβ１，３−Ｒを有する化合物を含み、当該式において、Ｒは、Ｈ、サッカライド、オリゴサッカライド、または少なくとも１つの炭水化物原子を有するアグリコン基からなる群より選択される、反応混合物。
・項目２６． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシル化アクセプターは、タンパク質、脂質、またはプロテオグリカンに結合している、反応混合物。
・項目２７． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記シアリル化オリゴサッカライドは、ガングリオシド、ガングリオシド模倣物、またはガングリオシド炭水化物部分である、反応混合物。
・項目２８． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記シアリル化オリゴサッカライドは、リゾガングリオシド、リゾガングリオシド模倣物、またはリゾガングリオシド炭水化物部分である、反応混合物。
・項目２９． 項目２７に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシル化アクセプター部分は、Ｇａｌ４Ｇｌｃ−Ｒ １ およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ ２ からなる群より選択される式を有する化合物を含み、当該式において、Ｒ １ は、セラミドまたは他の糖脂質からなる群より選択され、Ｒ ２ は、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、および（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群より選択される、反応混合物。
・項目３０． 項目２９に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシル化アクセプターは、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、Ｇａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、Ｇａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群より選択される、反応混合物。
・項目３１． 項目２１に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシル化アクセプターは、アクセプターサッカライドと、ＵＤＰ−Ｇａｌおよびガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドとを接触させることによって形成され、当該ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、当該ＵＤＰ−Ｇａｌから当該アクセプターへとＧａｌ残基を転移させる、反応混合物。
・項目３２． 項目３１に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、当該ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２７もしくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する、反応混合物。
・項目３３． 項目３２に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼは、配列番号２７もしくは配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有する、反応混合物。
・項目３４． 項目３１に記載の反応混合物であって、上記アクセプターサッカライドは、末端ＧａｌＮＡｃ残基を含む、反応混合物。
・項目３５． 項目３４に記載の反応混合物であって、上記ガラクトシルトランスフェラーゼのアクセプターサッカライドは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアクセプターと、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドと接触させることによって形成され、当該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、当該ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃから、当該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアクセプターへと、ＧａｌＮＡｃ残基を転移させる、反応混合物。
・項目３６． 項目３５に記載の反応混合物であって、上記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有し、当該ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する、反応混合物。
・項目３７． 項目２９に記載の反応混合物であって、上記ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する、反応混合物。
・項目３８． シアリル化オリゴサッカライドを合成するための方法であって、当該方法は、
反応混合物（α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、シアリルトランスフェラーゼポリペプチド；ガラクトシル化アクセプター部分；ならびにシアリル−ヌクレオチド糖；を含む）を、当該シアリルトランスフェラーゼが、α２，３結合において当該シアリル−ヌクレオチド糖から当該ガラクトシル化アクセプター部分へと第１のシアル酸残基を転移し、そしてさらに、α２，８結合において第２のシアル酸残基を当該第１のシアル酸残基へと転移する条件下でインキュベートする工程；
を包含する、方法。
・項目３９． 項目３８に記載の方法であって、前記シアリル化オリゴサッカライドはガングリオシドである、方法。
・項目４０． 項目３８に記載の方法であって、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を有する、方法。
・項目４１． 項目４０に記載の方法であって、前記シアリルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する、方法。
・項目４２． 項目３８に記載の方法であって、前記シアリル化オリゴサッカライドは、ガングリオシド、リゾガングリオシド、ガングリオシド模倣物、またはリゾガングリオシド模倣物である、方法。
（詳細な説明）
（定義）
本発明のグリコシルトランスフェラーゼ、反応混合物および方法は、モノサッカリドをドナー基質からアクセプター分子に転移させるために有用である。この付加は一般的に、生体分子上のオリゴサッカリドの非還元性末端、または炭水化物部分で起こる。本明細書で定義される生体分子としては、炭水化物、タンパク質（例えば、糖タンパク質）および脂質（例えば、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質およびガングリオシド）のような、生物学的に重要な分子が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の略号を本明細書中で使用する：
Ａｒａ＝アラビノシル；
Ｆｒｕ＝フルクトシル；
Ｆｕｃ＝フコシル；
Ｇａｌ＝ガラクトシル；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミニル；
Ｇｌｃ＝グルコシル；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコトサミニル；
Ｍａｎ＝マンノシル；および
ＮｅｕＡｃ＝シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）。
用語「シアル酸」とは、９つの炭素を含むカルボン酸化された糖のファミリーの任意のメンバーのことをいう。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド（ａｃｅｔａｍｉｎｄｏ）−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（ｇａｌａｃｔｏｎｏｎｕｌｏｐｙｒａｎｏｓ−ｌ−ｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（しばしば、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃまたはＮＡＮＡと略される））である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５ＧｃまたはＮｅｕＧｃ）であり、このＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基は、ヒドロキシル化されている。シアル酸ファミリーの第３のメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Ｎａｄａｎｏら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１１５５０−１１５５７；Ｋａｎａｍｏｒｉら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２１８１１−２１８１９）。９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ様の９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃまたは９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃおよび９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような９−置換シアル酸もまた、含まれる。シアル酸ファミリーの概説としては、例えば、Ｖａｒｋｉ（１９９２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２：２５−４０；Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｒ．Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｅｄ．（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｓｃｈａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０：６４−８９（１９８７）、およびＳｃｈａｕｒ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０：１３１−２３４を参照のこと。シアル酸付加手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、１９９２年１０月１日に公開された国際出願ＷＯ９２／１６６４０に開示されている。
グリコシルトランスフェラーゼに対するドナー基質は、活性化された糖ヌクレオチドである。このような活性化された糖は、概して、ウリジン二リン酸およびグアノシン二リン酸、ならびにヌクレオシド二リン酸またはヌクレオシド一リン酸が脱離基として働く糖のシチジン一リン酸誘導体からなる。細菌系、植物系および真菌系は、時々、他の活性化された糖ヌクレオチドを使用し得る。
オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であるか否か関わらず、還元末端および非還元末端を有すると考えられている。受容された命名法に従って、オリゴ糖は、非還元末端を左にそして還元末端を右にして、本明細書中に記述される。
本明細書中に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖（例えば、Ｇａｌ）についての名前および略称と共に記載され、グリコシド結合（αまたはβ）の配置、環の結合、結合に関与する還元糖の環の位置が続き、次いで還元糖の名前または略称（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）がくる。２つの糖の間の結合は、例えば、２，３、２→３または（２，３）として表現され得る。糖の各々は、ピラノースまたはフラノースである。
用語「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーのことをいい、他に制限がなければ、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で核酸とハイブリダイズする天然のヌクレオチドの既知のアナログを含有する。他に指示がなければ、特定の核酸配列は、その相補的配列を含む。
用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、単一の配列または転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的な連結のことをいい、ここで、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響する。
本明細書中で使用される場合、「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」とは、特定の宿主細胞に対し外来の供給源に由来するポリヌクレオチドまたは核酸、あるいは、同一の供給源由来の場合、その元の形態から改変されるポリヌクレオチドまたは核酸である。従って、宿主細胞中の異種グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、特定の宿主細胞に対し内因性であるが改変されている、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。異種配列の改変が、例えば、プロモーターに作動可能に連結され得るＤＮＡフラグメントを生成するために、ＤＮＡを制限酵素によって処理することにより生じ得る。部位特異的変異
誘発のような技術もまた、異種配列を改変するために有用である。
細胞に関して使用される場合、用語「組換え」は、細胞が異種核酸を複製するか、あるいは異種核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、ネイティブ（非組換え型）形態の細胞の中に見出されない遺伝子を含み得る。組換え細胞はまた、ネイティブ形態の細胞に見出されるが、人工的な手段によって改変されかつ細胞に再導入される遺伝子を含む細胞をいう。この用語はまた、細胞から核酸を除去することなしに改変された、細胞に対して内因性の核酸を含む細胞を含有する；このような改変は、遺伝子の置換、部位特異的突然変異および当業者に公知の関連する技術によって獲得されるものを含む。
「組換え核酸」は、天然の状態から変えられた形態の核酸である。例えば、用語「組換え核酸」は、核酸が天然に生じる形態では連結されない、プロモーターおよび／または他の発現制御領域、プロセシングシグナル、別のコード領域などに、作動可能に連結されるコード領域を含む。「組換え核酸」はまた、例えば、対応する天然に存在する核酸と比較して、その中において、１つ以上のヌクレオチドが、置換され、欠失され、挿入されているコード領域または他の核酸を含む。改変は、インビトロでの操作、インビボでの改変、合成法などによって導入され得る。
「組換え産生されるポリペプチド」は、組換え核酸および／または異種核酸によってコードされるポリペプチドである。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの中に導入されるＣ．ｊｅｊｕｎｉのグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸から発現されるポリペプチドは、「組換え産生されるポリペプチド」である。非ネイティブプロモーターに作動可能に連結される核酸により発現されるタンパク質は、「組換え産生されるポリペプチド」の一例である。本発明の組換え産生されるポリペプチドは、精製されていない形態（例えば、細胞溶解物またはインタクトな細胞として）でか、または完全にかもしくは部分的に精製された後の形態で、ガングリオシドおよび他のオリゴ糖を合成するために使用され得る。
「組換え発現カセット」または単純に「発現カセット」は核酸エレメントを用いて組換え的にまたは合成的に生成される核酸構築物であり、ここで核酸エレメントは、このような配列と適合し得る宿主中の構造遺伝子の発現に影響し得る。発現カセットは、少なくともプロモーターおよび必要に応じて、転写終結シグナルを含む。代表的には、この組換え発現カセットは、転写されるべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコードする核酸）、およびプロモーターを含む。発現への影響において必要なまたは役立つさらなる因子はまた、本明細書中に記載されるように使用され得る。例えば、発現カセットはまた、宿主細胞からの発現タンパク質の分泌を方向付ける、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。遺伝子発現に影響する転写終結シグナル、エンハンサーおよび他の核酸配列はまた、発現カセット中に含まれ得る。
「部分配列」とは、核酸またはアミノ酸のより長い配列（例えば、ポリペプチド）の一部をそれぞれ含む核酸またはアミノ酸の配列のことをいう。
用語「単離された」とは、実質的にかまたは本質的に、通常そのネイティブ状態において見出される材料に付随する構成要素を含まない材料をいうことを意味する。代表的には、単離された本発明のタンパク質または核酸は、少なくとも約８０％純粋、通常少なくとも約９０％そして好ましくは少なくとも約９５％純粋である。純度または同質性は、タンパク質サンプルまたは核酸サンプルのアガロースゲル電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当該分野で周知の多数の手段によって同定され得、染色による可視化が続く。特定の目的のために、高分解能が必要とされ、そして精製のためにＨＰＬＣまたは同様の手段が使用される。「単離された」酵素は、例えば、実質的にまたは本質的に
、酵素の活性を妨げる構成要素を含まない酵素である。「単離された核酸」とは、例えば、核酸が天然に生じる細胞の染色体には存在しない核酸を含む。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一の」または「同一性」％とは、同一であるかまたは特定の割合のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する二つ以上の配列または部分配列のことをいい、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用するか、または視覚による検査によって測定されるように、最大の対応について比較されそして整列される場合、同一である。
２つの核酸またはポリペプチドの文脈において、句「実質的に同一」とは、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用するか、または視覚による検査によって測定されるように、最大の対応について比較されそして整列される場合、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列または部分配列をいう。好ましくは、実質的な同一性は、配列の領域にわたって存在し、これは、少なくとも約５０残基長、より好ましくは少なくとも１００残基長の領域にわたり、そして最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、この配列は、コード領域の全長にわたり実質的に同一である。
配列の比較のために、代表的には、１つの配列が参照配列として働き、これに対して、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列は、コンピューターにインプットされ、部分配列の座標が示され、そして必要な場合、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが、指定される。これらの配列比較アルゴリズムは、次いで、指定されたプログラムのパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列について、配列同一性％を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））によってか、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））によってか、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎの類似性の検索方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８））によってか、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によってか、または視覚検査（一般には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５補遺）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照のこと）によって実施される。
配列同一性％および配列類似性％を決定するのに適切なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｅｌら（１９７７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に、それぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。例えば、比較は、語長（Ｗ）１１、Ｇ＝５、Ｅ＝２、ｑ＝−２およびｒ＝１を有する
ＢＬＡＳＴＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０アルゴリズム、ならびに両方の鎖の比較を使用して、実施され得る。アミノ酸配列については、語長（Ｗ）３、Ｇ＝１１、Ｅ＝１のデフォルト値およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを有するＢＬＡＳＴＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０アルゴリズムが、使用され得る（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）。
配列同一性％の計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的な分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定値は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、可能性の指標を提供し、これによって２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間の一致が、偶然に生じる。例えば、参照核酸と試験核酸を比較して、最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸が、参照配列に対して類似であると見なされる。
句「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、配列が、複合体混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件の下における、特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、２重化またはハイブリダイズをいう。この用語「ストリンジェントな条件」とは、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、そして異なる環境においても異なる。より長い配列は、より高い温度にて特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにて特定の配列についての熱的融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度として選択される。このＴｍは、標的配列に対し相補的なプローブの５０％が、標的配列に対し平衡状態にてハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下）である。（標的配列が、一般に、Ｔｍにて過度に存在する場合、プローブの５０％は、平衡状態である）。代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａイオン未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３にて約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（約１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、そして、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃の条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。
２つの核酸配列またはポリペプチドが、実質的に同一であるというさらなる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によってコードされるポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である、というものである。従って、ポリペプチドは、代表的に、第２のポリペプチド（例えば、２つのポリペプチドが、単に保存的置換によってのみ異なる）に対し実質的に同一である。２つの核酸配列が、実質的に同一である別の指標は、以下に記載されるように、２つの分子がストリンジェントな条件の下で互いにハイブリダイズする、というものである。
抗体に対して言及される場合、句「タンパク質に特異的に結合する」または「〜と特異的に免疫反応性である」は、タンパク質または他の生物製剤の外来性の集団の存在下において、タンパク質の存在について決定力のある結合反応のことをいう。従って、指定された免疫学的アッセイ条件の下では、特定の抗体は、特定のタンパク質に優先的に結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に、有意な量では結合しない。このような条件の下でのタンパク質への特異的な結合は、抗体を必要とし、この抗体は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される。種々の免疫アッセイ形式が、特定のタンパ
ク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用される。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。特定の免疫反応性を決定するために使用され得る免疫アッセイ形式および条件の記述については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。
特定のポリヌクレオチド配列の「保存的に変更された改変体」とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをいうか、あるいはポリヌクレオチドが、アミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列をいう。遺伝的コードの縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が、任意の所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ，ＡＧＡおよびＡＧＧの全ては、アミノ酸アルギニンをコードする。従って、アルギニンがコドンによって特定される全ての位置において、これらのコドンは、コードされるポリペプチドを変えることなく、所望の対応する任意のコドンに変えられ得る。このような核酸の改変は、「保存的に変更された改変体」の一種である「サイレント改変体」である。ポリペプチドをコードする本明細書中に記載される全てのポリヌクレオチド配列はまた、他に記載がなければ、全ての可能性のあるサイレント改変体を示す。当業者は、核酸中の各コドン（ＡＵＧを除く：これは通常、メチオニンに対する唯一のコドンである）が、標準的な技術によって機能的に同一の分子を得るために変更され得ることを、認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の「サイレント改変体」の各々は、記載された配列の各々を暗に示す。
さらに、当業者は、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかな割合（代表的には、５％未満、より代表的には１％未満）のアミノ酸を変化するか、加えるか、または欠失する個々の置換物、欠失物または付加物は、その変更が、化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる「保存的に変更された改変体」であることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換テーブルが、当該分野で周知である。当業者は、融合タンパク質および融合タンパク質をコードする核酸の多数の保存的改変が、本質的に同一の産物を与えることを理解している。例えば、遺伝的コードの縮重に起因する「サイレント置換」（すなわち、コードされたポリペプチドにおいて変更を生じない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードする全ての核酸配列についての暗示される特徴である。本明細書中に記載される場合、配列は、好ましくは、酵素を生成するために使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、ヒトなど）中での発現のために最適化される。同様に、アミノ酸配列中の１つまたは少しのアミノ酸についての「保存的アミノ酸置換」は、特に類似する性質（上記の、定義の項を参照のこと）を有する、異なるアミノ酸で置換されるか、特定のアミノ酸配列もしくはアミノ酸をコードする特定の核酸配列に対して特に類似するものとしてもまた、容易に同定される。このような保存的に置換された任意の特定の配列の改変体は、本発明の特徴である。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙもまた参照のこと。さらに、コードされた配列中の単一のアミノ酸または低い割合のアミノ酸を変化するか、加えるかまたは欠失する個々の置換物、欠失物または付加物もまた、「保存的に変更された改変体」である。
（好ましい実施形態の記載）
本発明は、新規のグリコシルトランスフェラーゼ酵素、および酵素触媒されるオリゴ糖の合成に関与する他の酵素を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼを含み、このシアリルトランスフェラーゼは、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、二官能性のシアリルトランスフェラーゼを含む。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ、シアル酸シンターゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、および他の酵素もまた、提供される。本発明の酵素は、原核生物の酵素であり、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉの種々の株のリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）の生合成に関与する酵素を含む。本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼの発現における使用のための、これらの酵素をコードする核酸、ならびに発現カセットおよび発現ベクターを提供する。さらなる実施形態において、本発明は、オリゴ糖を合成するために１つ以上の酵素が使用される、反応混合物および方法を提供する。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、いくつかの目的のために有用である。例えば、グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖（ガングリオシドおよび生物学的活性を有する他のオリゴ糖を含む）の化学酵素学的合成のためのツールとして有用である。本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸はまた、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのようなガングリオシド模倣物を合成する生物体の病因メカニズムの研究のために有用である。この核酸は、例えば、ガングリオシド模倣物の合成に関与する遺伝子の発現の研究のための、プローブとして使用され得る。グリコシルトランスフェラーゼに対して惹起される抗体はまた、病因に関与するこれらの遺伝子の発現パターンを分析するために有用である。この核酸はまた、ガングリオシド模倣物（これは、病原体を宿主の免疫系から遮断し得る）の生合成に関与するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ酵素の発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計のために有用である。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、以前から利用可能なグリコシルトランスフェラーゼを越えるいくつかの利点を提供する。本発明のような細菌のグリコシルトランスフェラーゼは、対応する哺乳動物の構造と同一である、オリゴ糖の形成を触媒し得る。さらに、細菌の酵素は、哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼと比較して、多量に生成するのが容易で、そして高価ではない。従って、本発明のような細菌のグリコシルトランスフェラーゼは、多量に得ることが難しくあり得る哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼに対する魅力的な代替品である。細菌由来の本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、比較的高価ではない原核生物の発現系を使用して、多量の酵素の発現を容易にする。代表的には、ポリペプチド産物の発現のための原核生物系は、哺乳動物細胞培養系でのポリペプチドの発現よりコストが低い。
さらに、本発明の新規の二官能性のシアリルトランスフェラーゼは、ガングリオシド（これは、シアル酸を有し、これは、第二のシアル酸にα２，８結合によって結合され、次いで、第二のシアル酸は、ガラクトシル化されたアクセプターにα２，３結合される）のような生物学的に重要な分子の酵素的合成を単純化する。これらの構造体を合成するための以前の方法は、２つの別個のシアリルトランスフェラーゼを必要としたが、本発明の二官能性のシアリルトランスフェラーゼが使用される場合、ただ１つのシアリルトランスフェラーゼのみが必要とされる。このことは、第２の酵素を得ることに関連するコストをなくし、そしてまた、これらの化合物の合成に関与する工程の数を減らし得る。
（Ａ．グリコシルトランスフェラーゼおよび関連する酵素）
本発明は、原核生物のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、ならびにグリコシルトランスフェラーゼに触媒されるオリゴ糖（ガングリオシドおよびガングリオシド模倣物を含む）の合成に関与する他の酵素を提供する。現在の好ましい実施形態において、これらのポリペプチドは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（図１）のリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）遺伝子座内のオープンリーディングフレームによってコードされるポリペプチドを含む。シアリルトランスフェラーゼ（二官能性シアリルトランスフェラーゼを含む）のようなグリコシルトランスフェラーゼ、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼおよびβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ、本明細書中に記載の他の酵素が、本発明の酵素に含まれる。例えば、ＣＭＰ−シアル酸シンテターゼ、シアル酸シンターゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ（これは、リピドＡの生合成に関与する）のような補助酵素（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｅｎｚｙｍｅ）ならびにシアル酸生合成に関与する酵素もまた提供される。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助ポリペプチドは、天然の供給源（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種のような原核生物）から精製され得る。現在好ましい実施形態において、このグリコシルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉから、特にＣ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１９（ＯＨ４３８４株およびＯＨ４３８２株を含む）から獲得される。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１０、Ｏ：４１およびＯ：２から得られるグリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素もまた、提供される。グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが精製され得る方法としては、標準的なタンパク質精製法が挙げられ、この方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと）。
現在好ましい実施形態において、本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび補助酵素ポリペプチドは、本明細書中に記載されるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸、および補助酵素をコードする核酸を使用する組換え発現によって得られる。グリコシルトランスフェラーゼを生成するための発現ベクターおよび方法が、以下に記載される。
いくつかの実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、組換え的に生産されようと、または天然の細胞から精製されようと、それらの天然の環境から単離される。少なくとも９０〜９５％の同質性の実質的に純粋な組成物は、いくつかの用途に好ましく、そして９８〜９９％またはそれ以上の同質性が、最も好ましい。記載されるように、部分的にかまたは同質性にまで一旦精製されると、次いで、ポリペプチドは、使用され得る（例えば、抗体生産のための免疫原として、またはオリゴサッカリドの合成のために、あるいは本明細書中に記載されるか、または当業者に明白な他の用途）。しかし、グリコシルトランスフェラーゼは、所望のサッカリド構造を合成するための使用のためになお部分的に精製されなくてもよい。例えば、本発明は、異種の宿主細胞中で発現し、そして／または組換え核酸から発現する組換え生産された酵素を提供する。細胞溶解物またはインタクトな細胞、ならびに精製された形態で存在する場合、本発明のこのような酵素が、使用され得る。
（１．シアリルトランスフェラーゼ）
いくつかの実施形態において、本発明は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。シアリルトランスフェラーゼは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有し、そしてまた、いくつかの場合において、α２，８シアリルトランスフェラーゼ活性も有する。適切なサッカリドアクセプター（例えば、末端ガラクトースを有するサッカリド）およびシアル酸ドナー（例えば、ＣＭＰシアル酸）との反応混合物中に配置した場合、これらの二機能性のシアリルトランスフェラーゼは、α２，３結合においてドナーからアクセプターへの第１のシアル酸の転移を触媒し得る。次いで、シアリルトランスフェラーゼは、α２，８結合においてシアル酸ドナーから第１のシアル酸残基への第２のシアル酸の転移を触媒する。Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３Ｇａｌ構造のこの型は、しばしば図４に示されるようなＧＤ３およびＧＴ１ａを含むガングリオシド中で見出される。
本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼの例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）中で見出される二機能性シアリルトランスフェラーゼである。本発明の好ましい二機能性シアリルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清型Ｏ：１９の二機能性シアリルトランスフェラーゼである。二機能性シアリルトランスフェラーゼの１つの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４株の二機能性シアリルトランスフェラーゼである；このシアリルトランスフェラーゼは、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する。本発明の他の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、一般的に、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４二機能性シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に少なくとも約７６％同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明のシアリルトランスフェラーゼは、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、ＯＨ ４３８４シアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一、なおより好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性パーセントの領域は、６０アミノ酸よりも長い領域にわたる。例えば、より好ましい実施形態において、類似性の領域は、少なくとも約１００アミノ酸長の領域、より好ましくは、少なくとも約１５０アミノ酸長の領域、そして最も好ましくはシアリルトランスフェラーゼの全長の領域にわたる。従って、本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性のいずれかまたは両方を有し、そしてＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ ＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号３）に対して、それぞれのシアリルトランスフェラーゼ活性を保持するために必要とされるポリペプチドの領域にわたって、少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは約９０％同一であるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の二機能性シアリルトランスフェラーゼは、シアリルトランスフェラーゼの全長にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ ＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼに同一である。
本発明はまた、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有するが、α２，８シアリルトランスフェラーゼ活性をわずかに有するかまたは全く有さないシアリルトランスフェラーゼを提供する。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ）のＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼ（配列番号９）は、８つのアミノ酸だけＯＨ
４３８４株のシアリルトランスフェラーゼと異なるが、それにもかかわらず、α２，８シアリルトランスフェラーゼ活性を実質的に欠損する（図３）。Ｏ：２血清型株ＮＣＴＣ １１１６８由来の対応するシアリルトランスフェラーゼ（配列番号１０）は、ＯＨ ４３８３のシアリルトランスフェラーゼと５２％同一であり、そしてまたα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性をわずかに有するかまたは全く有さない。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株 Ｏ：１０（配列番号５）およびＯ：４１（配列番号７）のＣｓｔＩＩシアリルトランスフェラーゼと実質的に同一であるシアリルトランスフェラーゼもまた提供する。本発明のシアリルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１０（配列番号５）、Ｏ：１４（配列番号７）、Ｏ：１９血清株（配列番号９）またはＯ：２血清型株ＮＣＴＣ １１１６８（配列番号１０）のアミノ酸内列と、少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは約９０％同一であるシアリルトランスフェラーゼを含む。いくつかの実施形態において、本発明のシアリルトランスフェラーゼは、Ｏ：１０、Ｏ：４１、Ｏ：１９血清株またはＮＣＴＣ １１１６８ Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株のシアリルトランスフェラーゼに同一であるアミノ酸配列を有する。
同一性パーセントは、検査によって決定され得るか、または、例えば、ＢＬＡＳＴＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０アルゴリズムのようなアライメントアルゴリズムを使用して、デフォルトパラメーター（例えば、３の語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）、Ｇ＝１１、Ｅ＝１およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックス）を使用して決定され得る。
本発明のシアリルトランスフェラーゼは、配列比較だけでなく、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４二機能性シアリルトランスフェラーゼまたは本明細書中に提供される他のシアリルトランスフェラーゼに対する抗体を調製し、そしてこれらの抗体が目的のシアリルトランスフェラーゼと特異的に免疫反応性であるか否かを決定することによっても、同定され得る。特に二機能性シアリルトランスフェラーゼを得るために、生物体がその細胞表面上にα２，３−シアル酸結合およびα２，８−シアル酸結合の両方を提示するか否かを測定することによって、二機能性シアリルトランスフェラーゼを生産する可能性のある生物体を同定し得る。あるいは、またはさらに、単離されたシアリルトランスフェラーゼの酵素活性を簡単に行って、両方のシアリルトランスフェラーゼ活性が存在するか否かを決定し得る。
（２．β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明はまた、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチド（例えば、ＣｇｔＡ）を提供する。本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、反応混合物中に配置した場合、ドナー（例えば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）から適切なアクセプターサッカリド（代表的に、末端ガラクトース残基を有するサッカリド）へのＧａｌＮＡｃ残基の転移を触媒する。得られた構造（ＧａｌＮＡｃβ１，４−Ｇａｌ−）は、しばしば、多くの他のサッカリド化合物の中で、ガングリオシドおよび他のスフィンゴイド中で見出される。例えば、ＣｇｔＡトランスフェラーゼは、ガングリオシドＧＭ３のＧＭ２への転換を触媒し得る（図４）。
本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）によって生産されるβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼである。β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドの１つの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４株のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼであり、これは配列番号１７で示されるようなアミノ酸配列を有する。本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、一般的に、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、このアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一、なおより好ましくは、配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性パーセントの領域は、５０アミノ酸よりも長い領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域、最も好ましくはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの全長にわたる。従って、本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有し、そしてＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１７）に対して、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を保持するために必要とされるポリペプチドの領域にわたって、少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは約９０％同一であるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼの全長にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼに同一である。
また一方、同一性パーセントは、検査によって決定され得るか、または、例えば、ＢＬＡＳＴＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０アルゴリズムのようなアライメントアルゴリズムを使用して、３の語長（Ｗ）、Ｇ＝１１、Ｅ＝１およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックス）を用いて測定され得る。
本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを、免疫反応性によってもまた同定し得る。例えば、配列番号１７のＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼに対する抗体を調製し、そしてこれらの抗体が目的のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと特異的に免疫反応性であるか否かを決定し得る。
（３．β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ）
β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣｇｔＢ）もまた、本発明によって提供する。適切な反応媒体中に配置する場合、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ドナー（例えば、ＵＤＰ−Ｇａｌ）から適切なサッカリドアクセプター（例えば、末端ＧａｌＮＡｃ残基を有するサッカリド）へのガラクトース残基の転移を触媒する。β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼによって触媒された反応物の中でも、ＧＭ２のオリゴサッカリド部分へのガラクトース残基の転移は、ＧＭ１ａオリゴサッカリド部分を形成する。
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの例は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）によって生産されるβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼである。例えば、本発明の１つのβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株 ＯＨ ４３８４のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、これは配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有する。
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの別の例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉＯ：２血清型株ＮＣＴＣ １１１６８のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼである。このガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２９に示される。このガラクトシルトランスフェラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で十分に発現し、そして例えば、多量の可溶性活性を示す。さらに、反応混合物が過剰のドナーを含みそして十分に長期間インキュベーションされる場合、１つより多くのガラクトースを付加し得るＯＨ ４３８４ ＣｇｔＢとは異なり、ＮＣＴＣ １１１６８ β１，３−ガラクトースは、十分な量のポリガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有さない。いくつかの適用のために、ＯＨ ４３８４酵素のポリガラクトシルトランスフェラーゼ活性が、所望されるが、他の適用（例えば、ＧＭ１模倣物の合成）においては、１つの末端ガラクトースのみの付加が所望される。
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、一般的に、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、それぞれ、配列番号２７および配列番号２９に示されるようなＯＨ ４３８４またはＮＣＴＣ １１１６８ ＣｇｔＢのアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、これらのいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一であり、なおより好ましくは、配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性パーセントの領域は、５０アミノ酸よりも長い領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域、最も好ましくはガラクトシルトランスフェラーゼの全長にわたる。従って、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有し、そしてＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（配列番号２７）またはＮＣＴＣ １１１６８ガラクトシルトランスフェラーゼ（配列番号２９）のアミノ酸配列に対して、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を保持するために必要とされるポリペプチドの領域にわたって、少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは約９０％同一であるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼの全長にわたって、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼまたはＮＣＴＣ １１１６８ β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼに同一である。
同一性パーセントは、検査によって決定され得るか、または、例えば、ＢＬＡＳＴＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０アルゴリズムのようなアライメントアルゴリズムを使用して、３の語長（Ｗ）、Ｇ＝１１、Ｅ＝１およびＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックス）を用いて測定され得る。
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、それぞれのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種から得られ得るか、または組換え的に生産され得る。酵素活性のアッセイによって、あるいは、例えば、配列番号２７に示されるようなアミノ酸配列を有するＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４ β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼまたは配列番号２９に示されるようなアミノ酸配列を有するＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８ β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼに対して惹起された抗体との特異的免疫反応性を検出することによって、ガラクトシルトランスフェラーゼを、同定し得る。
（４．ＬＯＳ生合成経路に関与するさらなる酵素）
本発明はまた、細菌性のリポオリゴサッカリド上で見出されるようなオリゴサッカリドの生合成に関与するさらなる酵素を提供する。例えば、ＣＭＰシアル酸（シアリルトランスフェラーゼのドナー）の合成に関与する酵素を提供する。シアル酸シンターゼは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４株のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）８ａ（配列番号３５）およびＮＣＴＣ １１１６８株のオープンリーディングフレーム８ｂによってコードされる（表３を参照のこと）。シアル酸合成に関与する別の酵素は、ＯＨ ４３８４のＯＲＦ ９ａ（配列番号３６）およびＮＣＴＣ １１１６８の９ｂによってコードされる。ＣＭＰシアル酸シンターゼは、それぞれ、ＯＨ ４３８４およびＮＣＴＣ １１１６８のＯＲＦ １０ａ（配列番号３７）および１０ｂによってコードされる。
本発明はまた、リピドＡの生合成に関与するアシルトランスフェラーゼを提供する。この酵素は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４株のオープンリーディングフレーム２ａ（配列番号３２）およびＮＣＴＣ １１１６８株のオープンリーディングフレーム２Ｂによってコードされる。以下のアセチルトランスフェラーゼもまた、提供される；この酵素は、ＯＨ ４３８４のＯＲＦ １１ａ（配列番号３８）によってコードされる；ホモログは、ＮＣＴＣ １１１６８株のＬＯＳ生合成遺伝子座においては見出されない。
３つのさらなるグリコシルトランスフェラーゼもまた提供する。これらの酵素は、ＯＨ ４３８４株のＯＲＦ ３ａ（配列番号３３）、ＯＲＦ ４ａ（配列番号３４）およびＯＲＦ １２ａ（配列番号３９）、ならびにＮＣＴＣ １１１６８株のＯＲＦ ３ｂ、ＯＲＦ ４ｂおよびＯＲＦ １２ｂによってコードされる。
本発明は、これらの酵素の各々について、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、本明細書中に示されるようなアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明の酵素は、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、それぞれのアミノ酸配列に少なくとも約８５％同一、なおより好ましくは、このアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性パーセントの領域は、５０アミノ酸よりも長い領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域、最も好ましくはこの酵素の全長にわたる。従って、本発明の酵素は、それぞれの活性を有し、そして本明細書中に示されるような酵素に対応するアミノ酸配列に対して、それぞれの酵素活性を保持するために必要とされるポリペプチドの領域にわたって、少なくとも約６５％同一、より好ましくは少なくとも約７０％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一、そして最も好ましくは約９
０％同一であるポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明の酵素は、酵素の全長にわたって、対応するＣ．ｊｅｊｕｎｉＯＨ ４３８４酵素に同一である。
（Ｂ．グリコシルトランスフェラーゼおよび関連する酵素をコードする核酸）
本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼおよび本発明の他の酵素をコードする単離された核酸および／または組換え核酸を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼコード核酸は、対応するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの組換え発現を含むいくつかの目的に有用であり、そして他のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を同定し、そして酵素の調節および発現の研究のためのプローブとして有用である。
本発明の核酸は、上記のような全長グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸、ならびにグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの部分配列をコードする核酸を含む。例えば、本発明は、全長のグリコシルトランスフェラーゼ酵素ではないが、それにもかかわらず、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ ４３８４株のＬＯＳ遺伝子座のヌクレオチド配列は、配列番号１として本明細書中で提供され、そしてそれぞれのリーディングフレームが、同定される。さらなるヌクレオチド配列もまた、以下に議論されるように提供される。本発明は、本明細書中に示されるようなヌクレオチド配列を含む核酸だけでなく、例示された実施形態と実質的に同一か、または実質的に相補的である核酸もまた含む。例えば、本発明は、本明細書中に示されるヌクレオチド配列に少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも７５％、なおより好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％同一であり、そして例証されたヌクレオチド配列になおより好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を含む。同一性の領域は、少なくとも約５０ヌクレオチドにわたり、より好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドにわたり、なおより好ましくは約５００ヌクレオチドにわたる。いくつかの実施形態において、特定された同一性パーセントの領域は、それぞれの酵素活性を保持するために十分なコードされた酵素の部分のコード領域を包含する。好ましい実施形態において、特定された同一性パーセントは、酵素のコード領域の全長にわたる。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、当業者に公知の方法を使用して得られ得る。適切な核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムまたは部分配列（プローブ））は、クローン化され得るか、またはインビトロでの方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＴＡＳ）、自己持続配列複製系（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＳＳＲ）によって増幅され得る。広範なクローニングおよびインビボでの増幅方法論は、当業者に周知である。多くのクローニングの実行を通じて当業者を指示するのに十分なこれらの技術および指示書の例は、以下に見出される：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ （Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，との間の共同事業（１９９４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）；Ｃａｓｈｉｏｎら、米国特許第５，０１７，４７８号；およびＣａｒｒ，欧州特許番号第０，２４６，８６４号。インビトロでの増幅方法を通じて当業者を指示するのに十分な技術の例は、以下において見出される：Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，ならびにＭｕｌｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ ＆ ＥＮ ３６−４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３：８１−９４；（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｅ ４：５６０；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７。インビトロで増幅された核酸の改善されたクローニング方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする核酸またはこれらの核酸の部分配列は、上記のような任意の適切な方法（例えば、クローニングおよび適切な配列の制限を含む）によって調製され得る。実施例のように、通常のクローニング方法によって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸が得られ得る。本明細書中に記載されるような目的のグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の公知のヌクレオチド配列を使用して、ゲノムＤＮＡサンプル中の適切な酵素をコードする遺伝子または全ＲＮＡサンプル中のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを提供し得る（例えば、サザンブロットまたはノーザンブロットにおいて）。好ましくは、これらのサンプルは、原核生物（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種）から得られる。特に目的のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種の例としては、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉが挙げられる。多くのＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９株は、ガングリオシド模倣物を合成し、そして本発明のグリコシルトランスフェラーゼの供給原として有用である。
一旦、標的グリコシルトランスフェラーゼの核酸が同定されると、これは、当業者に公知の標準的な方法に従って単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ
Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸はまた、物理的特性、化学的特性および免疫学的特性に基づくアッセイによって、その発現した産物を検出することによってクローン化され得る。例えば、ガラクトシル化アクセプターとα２，３結合におけるシアル酸とのカップリング、次いでα２，８結合における第１のシアル酸と第２のシアル酸残基のカップリングを触媒する、この核酸によってコードされるポリペプチドの能力によって、クローン化された二機能性シアリルトランスフェラーゼコード核酸を同定し得る。同様に、それぞれ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ由来のＧａｌＮＡｃ残基またはＵＤＰ−Ｇａｌ由来のガラクトース残基の、適切なアクセプターへの転移を触媒する、コードされたポリペプチドの能力によって、β１，４ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼまたはβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼをコードするクローン化した核酸を同定し得る。適切なアッセイ条件は、当該分野で公知であり、そして実施例に記載される条件を含む。特定の核酸から発現したポリペプチドの他の物理的特性は、本発明の公知のガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドの特性（例えば、本明細書中に記載される特性）と比較され、本発明のガラクトシルトランスフェラーゼをコードする核酸を同定する別の方法を提供し得る。あるいは、推定のガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、変異され得、そしてグリコシルトランスフェラーゼとしてのその役割は、それぞれの複合糖質を生産する能力における変化を検出することによって確立され得る。
他の実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼコード核酸は、ＤＮＡ増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して、クローン化され得る。従って、例えば、核酸配列または核酸部分配列は、好ましくは、１つの制限部位（例えば、ＸｂａＩ）を含むセンスプライマーおよび別の制限部位（例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ）を含むアンチセンスプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅される。これは、所望のグリコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列またはアミノ酸部分配列をコードし、そして末端制限部位を有する核酸を生産する。次いで、この核酸は、第２の分子をコードし、そして適切な対応する制限部位を有する核酸を含むベクターへと容易に連結され得る。適切なＰＣＲプライマーは、本明細書中に提供される配列情報を使用して、当業者によって決定され得る。適切な制限部位はまた、部位特異的変異誘発によって、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸またはアミノ酸部分配列に付加され得る。グリコシルトランスフェラーゼコードヌクレオチド配列またはヌクレオチド部分配列をふくむプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断され、次いで、標準的な方法に従って増幅および／または発現のために、適切なベクターに連結される。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼコード核酸の増幅のために適切なプライマーの例は、表２に示される；いくつかのプライマー対は、増幅フラグメント上に５’ＮｄｅＩ制限部位および３’ＳａｌＩ部位を提供するように設計される。酵素コード配列または酵素コード部分配列を含むこのプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼで切断され、次いで標準的な方法に従って増幅および／または発現のために適切なベクターに連結される。
グリコシルトランスフェラーゼコード核酸のクローニングに代わるものとして、適切な核酸が、本発明のグリコシルトランスフェラーゼをコードする公知の配列から化学的に合成され得る。直接的な化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１のリン酸ジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２のジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法が挙げられる。化学合成は、単鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補配列とハイブリダイズすることによって、またはテンプレートとして単鎖を使用してＤＮＡポリメラーゼで重合化することによって、２重鎖ＤＮＡに転換され得る。当業者は、ＤＮＡの化学合成は、しばしば約１００塩基の配列に限定されるが、より長い配列は、より短い配列の連結によって得られ得ることを認識する。あるいは、部分配列は、クローニング化され得、そして適切な部分配列が、適切な制限酵素を使用して切断され得る。次いで、このフラグメントは、連結され、所望のＤＮＡ配列を生成する。
いくつかの実施形態において、酵素をコードする核酸を改変することが所望され得る。当業者は、所定の核酸構築物中に変化を生じさせる多くの方法を認識する。このような周知の方法としては、部位特異的突然変異誘発、変性オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ
増幅、核酸を含む細胞の突然変異誘発因子または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きい核酸を作製するための連結および／またはクローニングと組み合わせて）、および他の周知の技術が挙げられる。例えば、ＧｉｌｉｍａｎおよびＳｍｉｔｈ（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：８１−９７，Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１を参照のこと。
現在の好ましい実施形態において、本発明の細胞中に存在する組換え核酸は、改変され、好ましいコドンを提供する。このコドンは、選択された生物体中の核酸の翻訳を増強する（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの好ましいコドンは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのコード核酸に置換されている）。
本発明は、単離された（すなわちネイティブの染色体位置に存在しない）核酸および／または組換え体（すなわち、元の形態から改変され、ネイティブではない生物体中に存在するなど）を含む。
（１．シアリルトランスフェラーゼ）
本発明は、上記のようなシアリルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を有する、二官能性シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする。これらのシラリルトランスフェラーゼ核酸は、シアリルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、少なくとも約６０アミノ酸長の領域にわたって、配列番号３に示されるアミノ酸配列と、少なくとも７６％が同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明の核酸によってコードされるシアリルトランスフェラーゼは、少なくとも６０アミノ酸長の領域にわたって、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性％の領域は、６０アミノ酸よりも長い領域にわたり、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸の領域にわたり、そして最も好ましくはシアリルトランスフェラーゼの全長にわたる。本発明の好ましい実施形態において、本発明のシアリルトランスフェラーゼコード核酸は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
本発明の核酸の例は、単離されたおよび／または組換え形態である、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４の二官能性シアリルトランスフェラーゼコード核酸である。この核酸のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。本発明のシアリルトランスフェラーゼコードポリヌクレオチド配列は、典型的には、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、配列番号２の核酸配列に対して、少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、本発明のシアリルトランスフェラーゼコード核酸は、このヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、配列番号２のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、特定化された同一性％閾値の領域は、５０ヌクレオチドよりも長い領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチドの領域にわたり、そして最も好ましくはシアリルトランスフェラーゼコード領域の全長にわたる。したがって、本発明は、二官能性シアリルトランスフェラーゼコード核酸を提供し、この核酸は、配列番号２に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４ ｃｓｔＩＩまたはＯ：１０株（配列番号４）と実質的に同一である。
本発明の他のシアリルトランスフェラーゼコード核酸は、α２，３シアリルトランスフェラーゼ活性を有しているが、実質的なα２，８シアリルトランスフェラーゼ活性を欠く、シアリルトランスフェラーゼをコードする。例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ血清株Ｏ：１９
（配列番号８）およびＮＣＴＣ１１１６８由来のＣｓｔＩＩα２，３シアリルトランスフェラーゼをコードする核酸が、本発明によって提供される；これらの酵素は、α２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性をごくわずか有するかまたは全く有さない（表６）。
本発明の核酸を同定するために、視覚検査が使用され得るかまたは適切な整列アルゴリズムが使用され得る。本発明の二官能性シアリルトランスフェラーゼコード核酸を同定し得る代替の方法は、ストリンジェントな条件下で目的の核酸を、本明細書中に示されるようなシアリルトランスフェラーゼのポリヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズさせることによる方法である。
（２．β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）
本発明によって、β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸がまた提供される。このポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４β１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼと少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有するＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドをコードし、このポリペプチドは、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列を有する。より好ましくは、本発明の核酸によってコードされるＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、このアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたり、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性％の領域は、５０アミノ酸より長い領域にわたって伸長し、より好ましくは少なくとも約１００アミノ酸の領域にわたり、そして最も好ましくはＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドの全長にわたる。本発明の好ましい実施形態において、本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドコード核酸は、配列番号１７に示されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。本発明の核酸を同定するために、視覚検査が使用され得るかまたは適切な整列アルゴリズムが使用され得る。
本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼコード核酸の１つの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼコード核酸の、単離されたおよび／または組換えられた形態である。この核酸は、配列番号１６に示されるようなヌクレオチド配列を有する。本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼコードポリヌクレオチド配列は、典型的には、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、配列番号１６の核酸配列と、少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼコード核酸は、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、このヌクレオチド配列に対して少なくとも約８５％同一であり、なおより好ましくは、配列番号１６のヌクレオチド配列に対して約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性％の領域は、５０ヌクレオチドより長い領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチドの領域にわたり、および最も好ましくは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼコード領域の全長にわたる。
本発明の核酸を同定するために、視覚検査が使用され得るかまたは適切な整列アルゴリズムが使用され得る。本発明のＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼコード核酸を同定し得る代替の方法は、ストリンジェントな条件下で配列番号１６のポリヌクレオチド配列を含む核酸に対して目的の核酸をハイブリダイズさせることによる方法である。
（３．β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ）
本発明はまた、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性（ＣｇｔＢ）を有するポリペプチドプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明のこれらの核酸によってコードされるβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、少なくとも約５０アミノ酸長の領域にわたって、好ましくは配列番号２７に示されるようなＣ．ｊｅｊｕｎｉ株ＯＨ４３８４ β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に対して、または配列番号２９に示されるようなＮＣＴＣ１１１６８株β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも約７５％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、本発明のこれらの核酸によってコードされるガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、このアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、配列番号２７または配列番号２９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性％の領域は、５０アミノ酸よりも長い領域にわたり、より好ましくは、少なくとも約１００アミノ酸の領域にわたり、そして最も好ましくはガラクトシルオトランスフェラーゼポリペプチドコード領域の全長にわたる。
本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼコード核酸の１つの例は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼコード核酸の、単離されたおよび／または組換えられた形態である。この核酸は、配列番号２６に示されるようなヌクレオチド配列を含む。別の適切なβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼコード核酸は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８株のヌクレオチド配列を含み、そのヌクレオチド配列は、配列番号２８に示される。本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼコードポリヌクレオチド配列は、典型的には、少なくとも約５０ヌクレオチド長の領域にわたって、配列番号２６の核酸配列または配列番号２８の核酸配列に対して少なくとも約７５％同一である。より好ましくは、本発明のβ１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼコード核酸は、これらのヌクレオチド配列番号の少なくとも１つに対して、少なくとも約８５％同一であり、そしてなおより好ましくは、少なくとも５０アミノ酸長の領域にわたって、配列番号２６および／または配列番号２８のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％同一である。本発明の好ましい実施形態において、同一性％の領域は、５０ヌクレオチドよりも長い領域にわたって伸長し、より好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチドの領域、そして最も好ましくは、β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼコード領域の全長にわたる。
本発明の核酸を同定するために、視覚検査が使用され得るかまたは適切な整列アルゴリズムが使用され得る。本発明のガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドコード核酸を同定し得る代替の方法は、ストリンジェントな条件下で、配列番号２６または配列番号２８のポリヌクレオチド配列を含む核酸に対する目的の核酸をハイブリダイズさせることによる方法である。
（４．ＬＯＳ生合成経路に関与するさらなる酵素）
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒのような原核生物のＬＯＳ生合成経路に関与する他の酵素をコードする核酸がまた、提供される。これらの核酸は、例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４株のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）８ａおよびＮＣＴＣ１１１６８株のオープンリーディングフレーム８ｂによりコードされるシアル酸シンターゼＯＨ４３８４のＯＲＦ９ａおよびＮＣＴＣ１１１６８の９ｂによってコードされり誌ある酸合成に関与する別の酵素、ならびにＯＨ４３８４のＯＲＦ１０ａおよびＮＣＴＣ１１１６８のＯＲＦ１０ｂによりコードされるＣＭＰ−シアル酸侵ターゼのような酵素をコードする。
本発明はまた、リピドＡの生合成に関与するアシルトランスフェラーゼをコードする核酸を提供する。この酵素は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４株のオープンレーディングフレーム２ａおよびＮＣＴＣ１１１６８株のオープンレーディングフレーム２Ｂによってコードされる。アシルトランスフェラーゼをコードする核酸もまた、提供される；この酵素は、ＯＨ４３８４株のＯＲＦ１１ａによってコードされる；ＮＣＴＣ１１１６８株のＬ
ＯＳ生合成座においては見出されるホモログはない。
３つのさらなるグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸もまた、提供される。これらの酵素は、ＯＨ４３８４株のＯＲＦ３ａ、４ａ、および１２ａならびにＮＨ１１１６８株のＯＲＦ３ｂ、４ｂ、および１２ｂによってコードされる（図１）。
（Ｃ．グリコシルトランスフェラーゼの発現カセットおよび発現）
本発明はまた、本発明のグリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素を産生するために使用され得る発現カセット、発現ベクター、および組換え宿主細胞を提供する。典型的な発現カセットは、グリコシルトランスフェラーゼまたは目的の他の酵素をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。この発現カセットは、典型的には、適切な宿主細胞中、好ましくは、原核生物宿主細胞中に導入される発現ベクター上に含まれる。１つより多いグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、単一の発現ベクター中に複数の転写カセットを配置することによってか、１つより多いグリコシルトランスフェラーゼからなる融合タンパク質をコードする遺伝子を構築することによってか、または各グリコシルトランスフェラーゼについての異なる発現ベクターを利用することによって、単一の宿主細胞中で発現され得る。
好ましい実施形態において、発現カセットは、原核生物宿主細胞中のグリコシルトランスフェラーゼの発現について有用である。一般的に使用される原核生物制御配列は、転写開始のためのプロモーターを含むように本明細書中で定義され、必要に応じて、リボソーム結合部位配列に沿ってオペレーターを有し、以下のような一般的に使用されるプロモーターを含む：β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクト−ス（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ，Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７）、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８３）８０：２１−２５）；ならびにλ−由来ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）。この特定のプロモーター系は、本発明に対して重要ではなく、原核生物中で機能する任意の利用可能なプロモーターが使用され得る。
構成性プロモーターまたは調節プロモーターのいずれかが、本発明において使用され得る。調節プロモーターは、宿主細胞が、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの発現が誘導される前に、高密度まで増殖され得るために、都合がよい。異種タンパク質の高レベルでの発現は、いくつかの状況において細胞増殖を遅らせる。調節プロモーターは、バクテリオファージλＰＬプロモーター、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター（Ａｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：２１、およびバクテリオファージＴ７プロモーター（Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）；Ｔａｂｏｒら，（１９８５）を含むＥ．ｃｏｌｉ中で使用するのに特に適切である。これらのプロモーターおよびそれらの使用は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）中で議論される。本発明の好ましい調節プロモーターは、二重ｔａｃ−ｇａｌプロモーターであり、これは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２０５２８（国際公開番号ＷＯ ９８２０１１１）に記載される。
Ｅ．ｃｏｌｉ以外の原核生物細胞中のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの発現について、特定の原核生物種中で機能するプロモーターが必要とされる。このようなプロモーターは、上記の種からクローニングされた遺伝子から得られえるか、または異種プロモーターが使用され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で機能する。真核生物宿主細胞中での使用に適切なプロモーターは、当業者に周知である。
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、原核生物宿主細胞中での使用を意図される、本発明の発現カセット中に都合よく含まれる。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＲＢＳは、例えば、開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流側に配置される３〜９ヌクレオチド長のヌクレオチド配列からなる（ＳｈｉｎｅおよびＤａｌｇａｒｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４；Ｓｔｅｉｔｚ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編），第１巻，３４９頁，１９７９，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ）。
翻訳カップリングが、発現を促進させるために使用され得る。このストラテジーは、翻訳系に対してネイティブな、高度に発現された遺伝子に由来する短い上流のオープンリーディングフレームを使用する。この短上流オープンリーディングフレームは、プロモーターの下流に配置され、そしてリボソーム結合部位は、いくつかのアミノ酸コドンの後の終止コドンに続く。終止コドンの直前は、第二のリボソーム結合部位であり、そして続く終止コドンは、翻訳を開始するための開始コドンである。この系は、ＲＮＡ中の二次構造を解き、効率の良い翻訳の開始を可能にする。Ｓｑｕｉｒｅｓら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２９７−１６３０２を参照のこと。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞内で発現され得るかまたは細胞から分泌され得る。細胞内発現は、しばしば、高い収率を生じる。必要な場合、溶質である活性グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの量は、再折りたたみ手順を実施することによって増加され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ｍａｒｓｔｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）２：８００；Ｓｃｈｏｎｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：１５１を参照のこと）。実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞からペリプラズム中へかまたは細胞外媒体中へのいずれかに分泌され、グリコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、切断可能なシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列に連結される。このシグナル配列は、細胞膜を通して、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの転移を配向する。プロモーター−シグナル配列単位を含むＥ．ｃｏｌｉ中での使用に適切なベクターの例は、ｐＴＡ１５２９であり、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｈｏＡプロモーターおよびシグナル配列を有する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：７２１２；Ｔａｌｍａｄｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：３９８８；Ｔａｋａｈａｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．（１９８５）２６０：２６７０を参照のこと）。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドはまた、融合タンパク質として産生され得る。このアプローチは、しばしば、高収率を生じる。なぜならば、通常の原核生物制御配列は、転写および転移を指向するからである。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ｌａｃＺ融合は、しばしば異種タンパク質を発現するために使用される。適切なベクター（例えば、ｐＵＲシリーズ、ｐＥＸシリーズ、およびｐＭＲ１００シリーズ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）は、容易に入手可能である。特定の用途のために、精製後の融合タンパク質から非グリコシルトランスフェラーゼアミノ酸を切断することが、所望され得る。これは、当該分野で公知の任意のいくつかの方法（シアノゲンブロミド、プロテアーゼ、またはＸａ因子による切断を含む）によって達成され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；Ｉｔａｋｕｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９８：１０５６；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１０６；Ｎａｇａｉら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：８１０；Ｓｕｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：５６１を参照のこと）。切断部位は、所望の切断点における融合タンパク質のために、遺伝子中に操作され得る。
Ｎ−末端の完全性を維持するＥ．ｃｏｌｉから組換えタンパク質を得るための適切な系は、Ｍｉｌｌｅｒら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：６９８−７０４（１９８９）に記載されている。この系において、目的の遺伝子は、ペプチダーゼ切断部位を含む酵母ユビキチン遺伝子の最初の７６残基に対するＣ−末端融合物として産生される。二つの部分の接合部における切断は、インタクトな標準のＮ−末端残基を有するタンパク質の産生を生じる。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、種々の宿主細胞において発現され得、その宿主細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、および種々のより高度な真核生物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ）およびＨｅＬａ細胞株および骨髄腫細胞株が挙げられる。有用な細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ、およびＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。この組換えグリコシルトランスフェラーゼコード核酸は、各宿主についての適切な発現制御配列に作動可能に連結される。Ｅ．ｃｏｌｉについては、Ｔ７、ｔｒｐ、またはλプロモーター、リボソーム結合部位および好ましくは転写末端シグナルのようなプロモーターを含む。真核生物細胞については、制御配列は、プロモーターを含み、好ましくは、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するエンハンサー、およびポリアデニル化配列を含み、そしてスプライスドナーおよびアクセプター配列を含み得る。
本発明の発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉについては塩化カルシウム形質転換および哺乳動物細胞についてはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションのような周知の方法によって、選択された宿主細胞内に移入され得る。プラスミドによって形質転換された細胞は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝子のような、プラスミド上に含まれる遺伝子によって与えられる抗生物質に対する耐性によって選択され得る。
一旦発現されると、組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、当該分野の標準的な手順に従って精製され得、その手順としては、硫酸アンモニウム沈降、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などが挙げられる（一般的には、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照のこと）。少なくとも９０〜９５％均質である実質的に純粋な組成物が好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の均質性が最も好ましい。一旦、部分的に、または所望される場合均質になるまで精製されると、そのポリペプチドが使用され得る（例えば、抗体産生のための免疫源として）。このグリコシルトランスフェラーゼはまた、未精製または半精製状態でも使用され得る。例えば、グリコシルトランスフェラーゼを発現する宿主細胞は、浸透または他の細胞破壊のような工程を伴ってかまたは伴わずに、グリコシルトランスフェラーゼ反応において、直接的に使用され得る。
当業者は、修飾が、グリコシルトランスフェラーゼタンパク質の活性を減少することなくこのタンパク質でなされ得ることを認識する。いくつかの修飾は、クローニング、発現または融合タンパク質への標的細胞の取りこみを容易にし得る。このような修飾は、当業者に周知であり、例えば、以下が挙げられる：アミノ末端へのメチオニン付加によって開始部位を提供する、またはいずれかの末端にさらなるアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）を配置して、都合よく配置された制限部位または終止コドンまたは精製配列を作製する。
（Ｄ．オリゴ糖の合成のための方法および反応混合物）
本発明は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼが、所望のオリゴ糖（これは、２つ以上の糖からなる）を調製するために使用される、反応混合物および方法を提供する。本発明のグリコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼ、ドナー基質、アクセプター糖および典型的には可溶性の二価の金属カチオンを含む反応培地中で行われる。この方法は、グリコシルトランスフェラーゼを使用して、基質（「アクセプター」ともよばれる）糖への糖の付加を触媒する。所望のオリゴ糖構造を合成するためにグリコシルトランスフェラーゼを使用する多くの方法が知られている。例示的な方法は、ＷＯ９６／３２４９１、Ｉｔｏら（１９９３）Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６５：７５３、ならびに米国特許第５，３５２，６７０号、同第５，３７４，５４１号、および同第５，５４５，５５３号に記載される。
例えば、本発明は、活性化シアル酸（例えば、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、ＣＭＰ−ＮｅｕＧｃなど）を含む反応混合物を、本発明の二官能性シアリルトランスフェラーゼの存在下で末端ガラクトース残基を含むアクセプター部分に接触させることによって、α２，３結合中のシアル酸をガラクトース残基に付加する方法を提供する。本発明の好ましい実施形態において、この方法はまた、α２，８結合によって第一のシアル酸に連結される第二のシアル酸残基の付加を生じる。この方法の生成物は、Ｓｉａα２，８−Ｓｉａα２，３−Ｇａｌ−である。適切なアクセプターの例は、β１，４結合によってＧｌｃＮＡｃまたはＧｌｃに連結される末端Ｇａｌ、およびＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃのいずれかにβ１，３結合される末端Ｇａｌである。シアル酸自身に結合されるシアル酸に対する末端残基は、例えば、Ｈ、糖、オリゴ糖、または少なくとも１つの炭水化物原子を有するアグリコン基に結合され得る。いくつかの実施形態において、アクセプター残基は、例えば、タンパク質、脂質、またはプロテオグリカンに結合されるオリゴ糖の一部である。
いくつかの実施形態において、本発明は、ガングリオシド、リゾガングリオシド、ガングリオシド模倣物、リゾガングリオシド模倣物、またはこれらの分子の炭水化物部分を合成するための反応混合物および方法を提供する。これらの方法および反応混合物は、代表的に、Ｇａｌ４Ｇｌｃ−Ｒ１およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ−Ｒ２からなる群から選択される式を有する化合物をガラクトシル化受容体部分として含み；ここでＲ１は、セラミドまたは他の糖脂質からなる群から選択され、Ｒ２は、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、および（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群から選択される。例えば、ガングリオシド合成について、ガラクトシル化受容体は、Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、Ｇａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒ、およびＧａｌ３ＧａｌＮＡｃ４（Ｎｅｕ５Ａｃ８Ｎｅｕ５ｃ３）Ｇａｌ４ＧｌｃＣｅｒからなる群から選択され得る。
本発明の方法および反応混合物は、任意の多数のガングリオシド、リゾガングリオシド、および関連の構造を生成するために有用である。目的の多くのガングリオシドは、Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｈ．Ｆ．（編），Ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，ＶＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９８９，ｐｐ．１０〜１５、およびこれらで引用される参考文献に記載される。特定の目的のガングリオシドとしては、例えば、表１に列挙される脳および他の供給源で見出されるものが挙げられる。
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 本発明の二機能性のシアリルトランスフェラーゼは、例えば、ガングリオシドＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ｃ、およびＧＱ１ｂ、またはこれらのガングリオシドの炭水化物部分を合成するために特に有用である。表１に示されるこれらのガングリオシドについての構造は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性およびα２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性の両方を必要とする。本発明の方法および反応混合物によって提供される利点は、両方の活性が単一のポリペプチド中に存在することである。
本発明のグリコシルトランスフェラーゼは、さらなるグリコシルトランスフェラーゼと他の酵素との組み合わせで使用され得る。例えば、シアリルトランスフェラーゼとガラクトシルトランスフェラーゼとの組み合わせが使用され得る。本発明のいくつかの実施形態において、二機能性のシアリルトランスフェラーゼによって利用されるガラクトシル化受容体は、適切な受容体をＵＤＰ−Ｇａｌおよびガラクトシルトランスフェラーゼと接触させることによって形成される。本明細書中に記載されるものの１つであり得るガラクトシルトランスフェラーゼポリペプチドは、Ｇａｌ残基をＵＤＰ−Ｇａｌから受容体に転移させる。
同様に、ガラクトシルトランスフェラーゼについての受容体を合成するために本発明のβ１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼが使用され得る。例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼのための受容体サッカリドは、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼについての受容体をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドと接触させることによって形成され得、ここでこのＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼポリペプチドは、ＧａｌＮＡｃ残基をＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃからＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのための受容体に転移させる。
この群の実施形態において、酵素および基質は、最初の反応混合物と組み合わされ得るか、または第２のグリコシルトランスフェラーゼ周期のための酵素および試薬が、一旦第１のグリコシルトランスフェラーゼ周期が終結に近づくと反応媒体に添加され得る。単独容器中で２つのグリコシルトランスフェラーゼ周期を連続して処理することによって、全収率は、中間種が単離される手順よりも改善される。さらに、余分の溶媒および副産物の除去および処分が低減される。
上記のプロセスによって生成された生成物は、精製せずに使用され得る。しかし、生成物を回収することが通常好ましい。グリコシル化サッカリドを回収するための標準的な周知の技術としては、薄層クロマトグラフィーもしくは厚層クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーのようなものがある。膜ろ過を使用することが好ましく、逆浸透膜を利用することがより好ましく、回収のために１つ以上のカラムクロマトグラフィー技術を使用することが好ましい。
（Ｅ．グリコシルトランスフェラーゼおよび本発明の方法を用いて生成された糖結合体の使用）
グリコシルトランスフェラーゼおよび本発明の方法を用いて作製されるオリゴサッカリド化合物は、種々の適用（例えば、抗原、診断試薬、または治療剤）において使用され得る。従って、本発明はまた、種々の状態の処置において使用され得る薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、上記の方法に従って生成されるオリゴサッカリドから構成される。
本発明の薬学的組成は、種々の薬物送達系における使用に適切である。本発明における使用に適切した処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）に見出される。薬物送達のための方法の手短な論評について、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７〜１５３３（１９９０）を参照のこと。
薬学的組成物は、予防処置および／または治療処置のために、エアロゾルまたは経皮によって、非経口投与、鼻腔内投与、局所投与、経口投与または局部投与されることが意図される。一般に、薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内）に投与される。従って、本発明は、非経口投与のための組成物を提供し、これらの組成物は、受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリア（例えば、水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳなど）に溶解または懸濁した化合物を含む。この組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤、界面活性剤など）を含み得る。
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、またはろ過滅菌され得る。得られた水溶液は、そのままで使用のためにパックされるか、または凍結乾燥され、この凍結乾燥調製物は、投与の前に滅菌水性キャリアと一緒にされる。この調製物のｐＨは、代表的に３と１１との間であり、より好ましくは５〜９であり、そして最も好ましくは７〜８である。
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴサッカリドは、標準的な小胞形成脂質から形成されるリポソームに組み込まれ得る。種々の方法が、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０），米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、および同第４，８３７，０２８号に記載されるように、リポソームの調製について利用可能である。種々の標的化因子（例えば、
本発明のシアリルガラクトシド）を用いたリポソームの標的化が、当該分野において周知である（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号、および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
オリゴサッカリドを含む組成物が、予防処置および／または治療処置のために投与され得る。治療の適用において、組成物は、疾患およびその合併症の症状を回復させるか、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、上記のような疾患にすでに罹患している患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療的に有効な量」として規定される。この使用のために有効な量は、疾患の重篤度、ならびに患者の体重および全体的な状態に依存するが、一般に７０ｋｇの患者について１日あたり約０．５ｍｇ〜約４０ｇのオリゴサッカリドの範囲であり、１日あたり約５ｍｇ〜約２０ｇの化合物の用量がより一般的に使用される。
組成物の単回投与または複数回投与は、処置する医師によって選択される投薬レベルおよびパターンで実行され得る。少なくとも、薬学的処方物は、効果的に患者を処置するために十分な本発明のオリゴサッカリドの量を提供するべきである。
このオリゴサッカリドはまた、診断試薬としての用途を提供し得る。例えば、標識した化合物が、炎症を有すると予測される患者における炎症または腫瘍転移の範囲を位置づけるために使用され得る。この使用のために、化合物は、適切な放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１４Ｃ、またはトリチウム）で標識され得る。
本発明のオリゴサッカリドは、本発明の化合物と特異的に反応するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の生成のための免疫原として使用され得る。種々の免疫グロブリン分子の生成および操作について当業者に利用可能な多数の技術が、本発明において使用され得る。抗体は、当業者に周知の種々の手段によって生成され得る。
非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、ウマなど）の生成は周知であり、例えば、本発明のオリゴサッカリドを含む調製物を用いて動物を免疫化させることによって、達成され得る。この免疫化動物から得られる抗体産生細胞は、不死化され、そしてスクリーニングされるか、または所望の抗体の産生についてまずスクリーニングされてから不死化される。モノクローナル抗体産生の一般的手順の考察について、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく例示するために提供される。
この実施例は、細菌性病原Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のＬＯＳにおけるＧＴ１ａガングリオシド模倣物の生合成の原因である４つの遺伝子のクローニングのための２つのストラテジーの使用を記載し、この細菌は、ギヤン−バレー症候群に関連する（Ａｓｐｉｎａｌｌら、（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２１２２〜２１２５）。Ａｓｐｉｎａｌら（（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：２４１〜２４９）は、この株がトリシアリル化ガングリオシドＧＴ１ａを模倣する外部コアＬＰＳを有することを示した。本発明者らは、まず活性スクリーニングストラテジーを用いて、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−Ｉ）をコードする遺伝子をクローン化した。次いで、本発明者らは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８の近年完全に決定された配列からの生のヌクレオチド配列情報を使用して、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４からのＬＯＳ生合成に関する領域を増幅した。ヘプトシルトランスフェ
ラーゼＩおよびＩＩに位置するプライマーを用いて、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来の１１．４７ｋｂのＬＯＳ生合成遺伝子座を増幅した。配列決定は、この遺伝子座が、１３個の部分的なオープンリーディングフレーム、または完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、その一方でＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８における対応する遺伝子座が１３．４９ｋｂに及び、そして１５個のＯＲＦを含むことを明らかにし、これらの２つの株の間の異なる組成を示した。
潜在的なグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子を、それぞれクローン化し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで発現させ、そして受容体として合成蛍光オリゴサッカリドを用いてアッセイした。本発明者らは、β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニル−トランスフェラーゼ（ｃｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｃｇｔＢ）、ならびにシアル酸をガラクトースのＯ−３およびガラクトースにα−２，３−結合しているシアル酸のＯ−８に転移させる二機能性シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−ＩＩ）をコードする遺伝子を同定した。それぞれの同定されたグリコシルトランスフェラーゼの結合特異性を、インビトロで合成されたモデル化合物のナノモル量にて６００ＭＨｚでＮＭＲ分析することによって確認した。グラジエントインバース広帯ナノ−ＮＭＲ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎｖｅｒｓｅ ｂｒｏａｄｂａｎｄ ｎａｎｏ−ＮＭＲ）プローブを用いて、配列情報を、グリコシド結合を横切る３Ｊ（Ｃ，Ｈ）相関の検出によって入手し得た。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４におけるＧＴ１ａ模倣物の合成におけるｃｇｔＡおよびｃｓｔ−ＩＩの役割を、そのＬＯＳにおいてより短いガングリオシド模倣物を発現する２つの関連するＣ．ｊｅｊｕｎｉ株における対応するホモログとその配列および活性とを比較することによって、確認した。従って、これらの３つの酵素は、ラクトースから開始されるＧＴ１ａ模倣物合成のために使用され得る。
使用される略語は以下である：ＣＥ、キャピラリー電気泳動；ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、シチジンモノホスフェート−Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＣＯＳＹ、相関分光法；ＦＣＨＡＳＥ、６−（５−フルオレセイン−カルボキサミド）−ヘキサン酸スクシミジルエステル；ＧＢＳ、ギヤン−バレー症候群；ＨＭＢＣ、異種核多重結合コヒーレンス；ＨＳＱＣ、異種核１量子コヒーレンス；ＬＩＦ、レーザー誘導蛍光；ＬＯＳ、リポオリゴサッカリド；ＬＰＳ、リポポリサッカリド；ＮＯＥ、核オーバーハウザー効果；ＮＯＥＳＹ、ＮＯＥ分光法；ＴＯＣＳＹ、全相関分光法（ｔｏｔａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）。
（実験手順）
（細菌株）
以下のＣ．ｊｅｊｕｎｉ株を、本研究で使用した：血清株（ｓｅｒｏｓｔａｉｎ）Ｏ：１９（ＡＴＣＣ＃４３４４６）；血清型Ｏ：１９（株ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４を疾患制御のための研究センター（Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｎａｄａ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｍａｎｉｔｏｂａ）から入手した）；および血清型Ｏ：２（ＮＣＴＣ＃１１１６８）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、ＨｉｎｄＩＩＩライブラリーについて使用した一方で、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＤ２０２（ＣＧＳＧ＃７２９７）を異なるクローン化グリコシルトランスフェラーゼを発現するために使用した。
（基本的な組換えＤＮＡ方法）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株からのゲノムＤＮＡ単離を、以前に記載された（Ｇｉｌｂｅｒｔら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１〜２８２７６）ようにＱｉａｇｅｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ ５００／Ｇ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて実行した。プラスミドＤＮＡ単離、制限酵素消化、クローニングのためのＤＮＡフラグメントの精製、ライゲーションおよび形質転換を、酵素供給者、または特定の手順のために使用されるキットの製造者によって推奨されるとおりに実行した
。長ＰＣＲ反応（＞３ｋｂ）を、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）によって記載されるとおりにＥｘｐａｎｄＴＭ ｌｏｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステムを用いて実行した。特定のＯＲＦを増幅するためのＰＣＲ反応を、製造者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）によって記載されるとおりＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行した。制限酵素およびＤＮＡ改変酵素を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｌｔｄ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）から購入した。ＤＮＡ配列決定を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）モデル３７０Ａ自動化ＤＮＡシーケンサーおよび製造者のサイクルシーケンシングキットを用いて実行した。
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のシアリルトランスフェラーゼについての活性スクリーニング）
ゲノムライブラリーを、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４の染色体ＤＮＡの部分的ＨｉｎｄＩＩＩ消化を用いて調製した。部分消化物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．）で精製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−を用いてライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを、ライゲーション混合物を用いてエレクトロポレーションし、そして細胞を、１５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．０５ｍＭ ＩＰＴＧおよび１００μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を有するＬＢ培地上に蒔いた。白色コロニーを、１００のプールに釣菌し、そして１５％グリセロールを有する１ｍＬの培地に再懸濁した。２０μＬの各プールを、１５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを補充した１．５ｍＬのＬＢ培地に接種するために使用した。３７℃で２時間の増殖後、ＩＰＴＧを１ｍＭまで添加し、そして培養物をさらに４．５時間増殖させた。細胞を、遠心分離によって回収し、０．５ｍＬの５０ｍＭ Ｍｏｐ（ｐＨ７、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に再懸濁し、そして１分間超音波処理した。インキュベーション時間および温度が、それぞれ１８時間および３２℃であることを除いて、以下に記載されるとおりに、この抽出物をシアリルトランスフェラーゼ活性についてアッセイした。陽性プールを単一コロニーのために蒔き、そして２００個のコロニーを釣菌し、そして１０のプールで活性について試験した。最終的に、陽性プールのコロニーを個々に試験し、これらは２つの陽性クローン、ｐＣＪＨ９（５．３ｋｂ挿入物）およびｐＣＪＨ１０１（３．９ｋｂ挿入物）の単離を導いた。いくつかのサブクローン化フラグメントおよび注文設計した（ｃｕｓｔｏｍ−ｍａｄｅ）プライマーを用いて、２つのクローンの挿入物を、両方の鎖について完全に配列決定した。個々のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを有するクローンをまた、シアリルトランスフェラーゼ活性について試験し、そして陽性の１つのみの挿入物（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−中にクローン化された１．１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント）を、ｐｌａｃプロモーターに対して反対方向の挿入物を得るためにＫｐｎＩ部位およびＰｓｔＩ部位を用いてｐＵＣ１１８に転移させた。
（ＬＰＳ生合成遺伝子座のクローニングおよび配列決定）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のＬＰＳ生合成遺伝子座を増幅するために使用されるプライマーは、株ＮＣＴＣ１１１６８の完全なゲノム配列を決定したＣ．ｊｅｊｕｎｉ配列決定群（Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ，ＵＫ）のウェブサイト（ＵＲＬ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／）から入手可能な予備配列に基づいていた。プライマーＣＪ−４２およびＣＪ−４３（全てのプライマー配列は、表２に記載される）を、ＥｘｐａｎｄＴＭｌｏｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＰＣＲシステムを用いて１１．４７ｋｂの遺伝子座を増幅するために使用した。このＰＣＲ産物を、Ｓ−３００スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で精製し、そしてプライマーウォーキングおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのサブクローニングの組み合わせを用いて両方の鎖について完全に配列決定した。特定のＯＲＦを、表２に記載されるプライマーおよびＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。このＰＣＲ産
物を、適切な制限酵素（表２を参照のこと）を用いて消化し、そしてｐＣＷｏｒｉ＋にクローン化した。
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 （Ｅ．ｃｏｌｉでの発現およびグリコシルトランスフェラーゼアッセイ）
種々の構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＤ２０２に移入させ、そして１ｍＭ ＩＰＴＧでの４時間の誘導後、グリコシルトランスフェラーゼ活性の発現について試験した。抽出を、超音波処理によって行い、そして酵素反応を、３２℃で一晩実行した。ＦＣＨＡＳＥ標識化オリゴサッカリドを、以前に記載された（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９１６６〜１９１７３）とおりに調製した。タンパク質濃度
を、ビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。全ての酵素アッセイについて、活性の１単位を、１分あたり１μｍｏｌの産物を生成する酵素の量と規定した。
クローンのプールにおけるα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性についてのスクリーニングアッセイは、最終容量１０μＬで１ｍＭ Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥ、０．２ｍＭ ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ Ｍｏｐｓ（ｐＨ７）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んでいた。種々のサブクローン化ＯＲＦを、１ｍＭ ＩＰＴＧでの培養の４時間誘導後にグリコシルトランスフェラーゼ活性の発現について試験した。抽出を超音波処理によって行い、そして酵素反応を３２℃で一晩実行した。
β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼを、０．２ｍＭ ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥ、１ｍＭ ＵＤＰ−Ｇａｌ、５０ｍＭ Ｍｅｓ（ｐＨ６）、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２および１ｍＭ ＤＴＴを用いてアッセイした。β−１，４−ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼを、０．５ｍＭ ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥ、１ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）および１０ｍＭ ＭｎＣｌ２を用いてアッセイした。α−２，３−シアリルトランスフェラーゼを、０．５ｍＭ Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥ，０．２ｍＭ ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いてアッセイした。α−２，８−シアリルトランスフェラーゼを、０．５ｍＭ ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥ、０．２ｍＭ ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７）および１０ｍＭ ＭｎＣｌ２を用いてアッセイした。
反応混合物を、１０ｍＭ ＮａＯＨで適切に希釈し、そして以前に記載された（Ｇｉｌｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、２８２７１〜２８２７６）の分離条件および検出条件を用いて実行したキャピラリー電気泳動によって分析した。電気泳動図のピークを、Ｐ／ＡＣＥステーションソフトウェアを用いる手動のピークインテグレーションを用いて分析した。酵素活性の迅速な検出のために、トランスフェラーゼ反応混合物由来のサンプルを、以前に記載された（同上）ようにシリカ−６０ ＴＬＣプレート（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）上で薄層クロマトグラフィーによって試験した。
（ＮＭＲ分光法）
ＮＭＲ実験を、Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ６００ ＮＭＲ分光計で実行した。５ｍｍ
Ｚグラジエント三重共鳴プローブを用いて、ほとんどの実験を実行した。ＮＭＲサンプルを、０．３〜０．５ｍｇ（２００〜５００ナノモル）のＦＣＨＡＳＥ−グリコシドから調製した。化合物を、Ｈ２Ｏに溶解し、そしてｐＨを希ＮａＯＨを用いて７．０に調整した。凍結乾燥後、サンプルを６００μＬのＤ２Ｏに溶解した。全てのＮＭＲ実験を、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ，ＮＯＥＳＹ，１Ｄ−ＮＯＥＳＹ，１Ｄ−ＴＯＣＳＹおよびＨＳＱＣのような標準技術を用いて以前に記載された（Ｐａｖｌｉａｋら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４１４６〜１４１５２；Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：３２７８〜３２９２）とおり実行した。プロトン化学シフト基準について、内部アセトンのメチル共鳴を、２．２２５ｐｐｍ（１Ｈ）にセットした。１３Ｃ化学シフト基準については、内部アセトンのメチル共鳴を、６７．４０ｐｐｍでの外部ジオキサンと比較して３１．０７ｐｐｍにセットした。同種核実験は、それぞれ５〜８時間のオーダーであった。８０００スキャンおよび８００ｍｓの混合時間を用いるＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥ［０．３ｍＭ］についての１Ｄ ＮＯＥＳＹ実験を、それぞれ８．５時間の持続時間で実行し、そして２〜５Ｈｚのラインブロードニングファクター（ｌｉｎｅ ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）で処理した。４．１６ｐｐｍでの共鳴の１Ｄ ＮＯＥＳＹについて、３０００スキャンを実行した。以下のパラメーターを、ＨＳＱＣスペクトルを得るために使用した：１．０秒の緩和遅延（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｅｌａｙ）、各々６０００Ｈｚおよび２４１４７ＨｚのＦ２およびＦ１でのスペクトル幅、１７１
ｍｓのｔ２における取り込み時間。ｔ１次元について、１２８焦点ポイント（ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｏｉｎｔ）を、１増分あたり２５６スキャンを用いて得た。Ｆ１における符合識別（ｓｉｇｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）を、Ｓｔａｔｅｓ法によって達成した。合計の取り込み時間は、２０時間であった。ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについて、幅広の線に起因して、ＨＳＱＣが６４時間実行されるように１増分あたりのスキャンの数を増加した。位相感受性スペクトルを、２０４８×２０４８ポイントにゼロフィリングした後に得た。非シフトガウスウインドウ関数を、両方の次元に適用した。ＨＳＱＣスペクトルを、１３Ｃ次元で２３Ｈｚ／ポイント、およびプロトン次元で８Ｈｚ／ポイントの分解能でプロットした。多重線分裂の観察のために、１Ｈ次元を、前進線形予測（ｆｏｒｗａｒｄ ｌｉｎｅａｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）およびπ／４−シフト化平方サインベル（ｓｉｎｅｂｅｌｌ）関数を用いて２Ｈｚ／ポイントの分解能で再処理した。全てのＮＭＲデータを、ＶＮＭＲ５．１またはＶＮＭＲ６．１ソフトウェアを備えたＶａｒｉａｎ標準シーケンス（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いて得た。同じプログラムを、処理のために使用した。
勾配逆性広帯域ナノ（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎｖｅｒｓｅ ｂｒｏａｄｂａｎｄ ｎａｎｏ）−ＮＭＲプローブ（Ｖａｒｉａｎ）を使用して、ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥサンプルについて、勾配ＨＭＢＣ（ＢａｘおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８，２０９３−２０９４；Ｐａｒｅｌｌａら（１９９５）Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．Ａ １１２，２４１−２４５）実験を実施した。高分解能マジック角回転プローブ（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍａｇｉｃ ａｎｇｌｅ ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｐｒｏｂｅ）であるナノ−ＮＭＲプローブは、たった４０μＬ中にしか溶解していない液体サンプルの高分解能スペクトルを産生する（Ｍａｎｚｉら、（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，９１５４−９１６３）。ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥサンプル（質量＝１４８６．３３Ｄａ）を、オリジナルの０．６ｍＬのサンプル（２００ナノモル）を凍結乾燥して、そして最終濃度が５ｍＭとなるように、４０μＬのＤ２Ｏ中に溶解することによって、調製した。このサンプルの最終ｐＨを、測定し得なかった。
勾配ＨＭＢＣ実験を、２９９０Ｈｚの回転速度、１０２４の複合ポイントの４００増分、１増分あたり１２８スキャン、０．２１秒の収集時間、１８．５ｈの間、１Ｊ（Ｃ，Ｈ）＝１４０ＨｚおよびｎＪ（Ｃ，Ｈ）＝８Ｈｚにて、行った。
（質量分析）
全ての質量測定物を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｇｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）Ｅｌｉｔｅ−ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ器を使用して、得た。約２μｇの各オリゴ糖を、ジヒドロキシ安息香酸の飽和溶液を含むマトリクスと混合した。正の質量スペクトルおよび負の質量スペクトルを、リフレクター様式を使用して得た。
（結果）
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性の検出）
グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングの前に、本発明者らは、いくつかの酵素活性について、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４細胞およびＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８細胞を試験した。酵素活性を検出したときに、このアッセイ条件を最適化して（実験手順中に記載される）、最大活性を保証した。本発明者らが使用したキャピラリー電気泳動アッセイは、非常に高感度であり、μＵ／ｍｌ範囲での酵素活性の検出を可能にした（Ｇｉｌｂｅｒｔら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２８２７１−２８２７６）。本発明者らは、ＧＴ１ａガングリオシド模倣合成に必要とされる酵素について、配列決定された株ＮＣＴＣ １１１６８およびＧＢＳ関連株ＯＨ４３８４の両方を試験した。予想されたように、株ＯＨ４３８４は、以下の構造の合成のために必要とされる酵素活性を有した：β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェ
ラーゼ，β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ，α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ。株ＮＣＴＣ １１１６８のゲノムは、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性およびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性を欠いていた。
（活性スクリーニングストラテジーを使用するα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−Ｉ）のクローニング）
Ｃ．ｊｅｉｕｎｉ ＯＨ４３８４由来の染色体ＤＮＡの非画分性の部分的ＨｉｎｄＩＩＩ消化から作製されたプラスミドライブラリーは、２，６００の白色コロニー（１００のプールを形成するために選択された）を生じた。本発明者らは、「分断攻略（ｄｉｖｉｄｅ ａｎｄ ｃｏｎｑｕｅｒ）」スクリーニングプロトコルを使用して、これにより、２つのポジティブクローンを得て、そして、ｐＣＪＨ９（５．３ｋｂインサート、３つのＨｉｎｄＩＩＩ部位）およびｐＣＪＨ１０１（３．９ｋｂインサート、４つのＨｉｎｄＩＩＩ部位）と命名した。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４の染色体ＤＮＡを用いたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）分析およびＰＣＲ反応は、ｐＣＪＨ９が染色体ＤＮＡ中で隣接していないインサートを含むことを示した。ｐＣＪＨ９中の１４４０番目のヌクレオチドの下流の配列をさらに研究しなかったが、最初の１４３９のヌクレオチドは、ｐＣＪＨ１０１の配列内に完全に含まれることが見出された。染色体ＤＮＡを用いたこのＯＲＦ分析およびＰＣＲ反応は、ｐＣＪＨ１０１のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの全てが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４の染色体ＤＮＡ中で連続していることを示した。
４つのＯＦＲ（２つは部分的で、そして、２つは完全である）は、ｐＣＪＨ１０１の配列中に見出された（図２）。最初の８１２ヌクレオチドは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のペプチド鎖放出因子ＲＦ−２（ｐｒｆＢ遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＥ０００５３７）の最後の２６５アミノ酸残基と６９％同一であるポリペプチドをコードする。この鎖放出因子のＴＡＡ終止コドンの最後の塩基はまた、ｐＣＪＨ１０１中の８１２番目〜２１０４番目のヌクレオチドにわたるオープンリーディングフレームのＡＴＧ開始コドンの最初の塩基である。このＯＲＦを、ｃｓｔ−Ｉ（ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒシアリルトランスフェラーゼＩ）と命名して、そして、このＯＲＦは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｕ３２７２０）由来の推定ＯＲＦと相同である４３０アミノ酸のポリペプチドをコードする。この推定Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＯＲＦは、ＣｓｔＩポリペプチドの中間領域（８０番目〜３３０番目のアミノ酸残基）と３９％同一である２３１アミノ酸のポリペプチドをコードする。ｃｓｔ−Ｉの下流の配列は、Ｅ．ｃｏｌｉの硫酸アデニルトランスフェラーゼの２つのサブユニット（ＣｙｓＤおよびＣｙｓＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＥ０００３５８）と相同（＞６０％の同一性）であるポリペプチドをコードするＯＲＦおよび部分的ＯＲＦを含む。
ｃｓｔ−Ｉ ＯＲＦがシアリルトランスフェラーゼ活性をコードすることを確認するために、本発明者らは、このＯＲＦをサブクローニングして、そして、Ｅ．ｃｏｌｉ内でこのＯＲＦを過剰発現させた。この発現した酵素を使用して、シアル酸をＧａｌ−β−１，４−Ｇｌｃ−β−ＦＣＨＡＳＥ（Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥ）に添加した。この生成物（ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥ）を、ＮＭＲによって分析して、Ｃｓｔ−ＩのＮｅｕ５Ａｃ−α−２，３−Ｇａｌ結合特異性を確認した。
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座の配列決定）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８の配列決定グループのウェブサイト（Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ，ＵＫ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／）にて利用可能な先行する配列データの分析は、ＬＰＳの内部コアの合成に関連する２つのへプトシルトランスフェラーゼが、他の細菌ヘプトシルトランスフェラーゼとの配列相同性によって容易に同定可能であることを示した。２
つのヘプトシルトランスフェラーゼの間の領域は、ＮＣＴＣ １１１６８において１３．４９ｋｂにわたり、そして、ＧｅｎＢａｎｋにおけるＢＬＡＳＴ検索に基づいて、少なくとも７つの可能性のあるグリコシルトランスフェラーゼを含む。ＮＣＴＣ １１１６８のＬＯＳ外部コアに関して利用可能な構造はないので、この株において、推定グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に関する機能を示唆することは不可能であった。
ヘプトシルトランスフェラーゼ配列中の保存領域に基づいて、本発明者らは、プライマー（ＣＪ−４２およびＣＪ−４３）を設計して、それらの間の領域を増幅した。本発明者らは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８からの染色体ＤＮＡを使用して、１３．４９ｋｂのＰＣＲ産物およびＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４からの染色体ＤＮＡを使用して、１１．４７ｋｂのＰＣＲ産物を得た。ＮＣＴＣ １１１６８株からのＰＣＲ産物の大きさは、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅのデータと一致した。ＯＨ４３８４株からのＰＣＲ産物のより小さい大きさは、２つのヘプトシルトランスフェラーゼ遺伝子の間の領域において、これらの株間で異質性を示して、そして、ＯＨ４３８４株に特異的なグリコシルトランスフェラーゼのうちのいくつかについての遺伝子が、その位置に存在し得ることを示唆した。本発明者らは、プライマーウォーキングとＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＦ１３０９８４）とのサブクローニングの組合せを使用して、１１．４７ｋｂのＰＣＲ産物を配列決定した。このＤＮＡのＧ／Ｃ含量は、２７％であった（これは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ由来のＤＮＡに典型的である）。配列の分析は、２つのヘプトシルトランスフェラーゼをコードする２つの部分的ＯＲＦに加えて、１１の完全なＯＲＦを示した（図２、表３）。推定アミノ酸配列を比較した場合、本発明者らは、２つの株が、８０％の同一性を上回る６つの遺伝子、および５２〜６８％の間が同一である４つの遺伝子を共有することを見出した（表３）。４つの遺伝子は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８に特徴的であるが、１つの遺伝子は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４に特徴的である（図２）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４において別個のＯＲＦ（ＯＲＦ＃５ａおよびＯＲＦ＃１０ａ）として存在する２つの遺伝子が、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８において、インフレームの融合ＯＲＦ（＃５ｂ／１０ｂ）で見出される。
（表３）
（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来のＬＯＳ生合成遺伝子座のＯＲＦの位置および記述）
Figure 0004460615
Figure 0004460615
Figure 0004460615
 ａＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８のＯＲＦの配列は、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／）から得ることができる。
ｂ実験的に決定された機能は、太字である。他の機能は、ＧｅｎＢａｎｋからのより高いスコア相同性に基づく。
（外部コアグリコシルトランスフェラーゼの同定）
いくつかの構築物を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来の２つのヘプトシルトランスフェラーゼ間に局在化する潜在的なグリコシルトランスフェラーゼの各々を発現させるために作製した。プラスミドｐＣＪＬ−０９はＯＲＦ＃５ａを含み、そして、この構築物の培養は、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥをアクセプターとして使用してアッセイした場合に、ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ活性を示した。ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼは、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥが貧困な基質である（ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥで観察された活性の２％未満）ので、シアリル化アクセプターに特異的であった。ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥから得られた反応産物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって決定した際、正確な質量を、そして、ＣＥアッセイにおいて、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥ標準と同一の溶出時間を有した。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４の外部コアＬＰＳの構造を考慮すると、このＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ（Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ グリコシルトランスフェラーゼＡについてｃｇｔＡ）はＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥの末端Ｇａｌ残基に対して、β−１、４−特異性を有する。ＣｇｔＡの結合特異性を、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥのＮＭＲ分析によって確認した（以下のテキストを参照のこと、表４）。ＧＭ２模倣物の合成におけるｃｇｔＡのインビボでの役割は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８２により提供される天然のノックアウト変異体により確認される（図１）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８２からのｃｇｔＡホモログの配列決定の際に、本発明者らは、短縮化ｃｇｔＡバージョン（３４７アミノ酸の代わりの２９アミノ酸）の発現を生じるフレームシフト変異体（７１番目の塩基の後の、８つのＡの代わりの７つのＡの伸長）を見出した。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８２のＬＯＳ外部コア構造は、内部ガラクトース残基がシアル酸だけで置換されるときのβ−１，４−ＧｌａＮＡｃトランスフェラーゼの非存在と一致する（Ａｓｐｉｎａｌｌら、（１９９４
）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，２４１−２４９）。
プラスミドｐＣＪＬ−０４はＯＲＦ＃６ａを含み、そして、この構築物のＩＰＴＧ誘導化した培養は、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥをアクセプターとして使用してガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示し、これによって、ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥを生成した。この産物は、β−１，３−ガラクトシダーゼに感受性であり、そして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって適当な質量を有することが見出された。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のＬＯＳ外部コアの構造を考慮すると、本発明者らは、このガラクトシルトランスフェラーゼ活性（ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒグリコシルトランスフェラーゼＢについてｃｇｔＢ）は、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥの末端ＧａｌＮＡｃ残基に対して、β−１，３−特異性を有することを示唆する。ＣｇｔＡの連結特異性を、Ｃｓｔ−Ｉ、ＣｇｔＡおよびＣｇｔＢを連続的に使用することで合成したＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥのＮＭＲ分析によって確認した（以下のテキストを参照のこと、表４）。
プラスミドｐＣＪＬ−０３はＯＦＲ＃７ａを含み、そして、ＩＰＴＧ−誘導した培養物は、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥおよびＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥの両方をアクセプターとして使用して、シアリルトランスフェラーゼ活性を示した。ＯＨ４３８４由来のこの第２のシアリルトランスフェラーゼを、ｃｓｔ−ＩＩと命名した。Ｃｓｔ−ＩＩは、シアル酸α−２，３をＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥの末端Ｇａｌに移して、そしてまた、α−２，８−をＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥの末端シアル酸に移すので、二機能性であることが示されている。Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥを用いて形成させた反応産物のＮＭＲ分析は、Ｇａｌ上の第１のシアル酸のα−２，３−結合および第２のシアル酸のα−２，８−結合を確認した（以下のテキストを参照のこと、表４）。
（表４）
（クローニングされたグリコシルトランスフェラーゼを使用して合成したガングリオシド模倣物の蛍光誘導体についての、プロトンＮＭＲ化学シフト）
Figure 0004460615
Figure 0004460615
 ａ６００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ（ｐＨ７）、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥについて２８℃、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥについて２５℃、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについて１６℃、ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥについて２４℃およびＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥについて２４℃にて得られたＨＳＱＣスペクトルからのｐｐｍにおいて。内部アセトンのメチル共鳴は、２．２２５ｐｐｍ（１Ｈ）である。誤差は、１Ｈ化学シフトについて±０．０２ｐｐｍ、おおび、サンプル温度について±５℃である。誤差は、重複に起因して、ａ、ｂ、ｄおよびｅの残基のＨ−６共鳴について、±０．１ｐｐｍである。
（シアリルトランスフェラーゼの比較）
トリシアル化ＧＴ１ａガングリオシド模倣物の合成におけるＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来のｃｓｔ−ＩＩのインビボでの役割を、ジシアル化ＧＤ１ａガングリオシド模倣物を発現するＣ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９（血清型株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ））由来のｃｓｔ−ＩＩホモログと比較することで支持する。これらの２つのｃｓｔ−ＩＩホモログの間で８アミノ酸の差異に翻訳する２４ヌクレオチドの差異が存在する（図３）。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現される場合、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９（血清型株）由来のｃｓｔ−ＩＩホモログは、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を有するが、α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ活性は低く（表５）、このことは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９（血清型株）ＬＯＳ外部コア中の末端α−２，８−結合シアル酸の非存在と一致する（Ａｓｐｉｎａｌｌら、（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，２４１−２４
９）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８由来のｃｓｔ−ＩＩホモログは、Ｏ：１９（血清型株）またはＯＨ４３４８由来のホモログよりも、極度に低いα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性を発現して、検出可能なα−２，８−シアルトランスフェラーゼ活性は発現しなかった。本発明者らは、ＮＣＴＣ １１１６８由来のｃｓｔ−ＩＩをＥ．ｃｏｌｉ中で発現した場合に、ＩＰＴＧ誘導性のバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出し得た（データは示さず）。ＮＣＴＣ １１１６８由来のＣｓｔ−ＩＩタンパク質は、Ｏ：１９（血清型株）またはＯＨ４３８４由来のホモログと、たった５２％の同一性しか共有しない。本発明者らは、これらの配列の差異がＥ．ｃｏｌｉ中で発現されたより低い活性の原因であり得るか否かを決定できなかった。
ｃｓｔ−Ｉは、ＬＯＳ生合成遺伝子座の外に位置したが、これは、ｃｓｔ−ＩＩに対して明らかに相同である。なぜならば、その最初の３００残基が、Ｃ．ｊｅｎｕｎｉ ＯＨ４３８４またはＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ １１１６８のいずれかに由来するＣｓｔ−ＩＩと４４％の同一性を共有するからである（図３）。これらの２つのＣｔｓ−ＩＩホモログは、それらの間で５２％同一な残基を共有しており、そして、Ｃｓｔ−ＩのＣ末端側の１３０アミノ酸を欠いている。Ｃ末端にて１０２アミノ酸を欠いているＣｓｔ−Ｉの短縮バージョンは、活性であることが見出されて（データは示さず）、これは、Ｃｓｔ−ＩのＣ末端ドメインがシアリルトランスフェラーゼ活性に必要でないことを示す。Ｃ末端の１０２残基はインビトロでの酵素活性に不可欠であるが、これらは、調節的な目的か、または、適切な細胞局在化のいずれかのために、インビボで他の細胞構成成分と相互作用し得る。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉシアリルトランスフェラーゼの間での低レベルの保存は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼについて以前に観察されたものとは非常に異なり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅで、ｌｓｔトランスフェラーゼは、これらの２つの種の間、およびこれらの同じ種の異なる単離物の間のタンパク質レベルにて、９０％より高く同一である（Ｇｉｌｌｂｅｒｔら、前述）。
（表５）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来シアリルトランスフェラーゼの活性の比較。種々のシアリルトランスフェラーゼを、ベクターｐＣＷｏｒｉ＋中のマルトース結合タンパク質で融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた（Ｗａｋａｒｃｈｕｋら、（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉ．３，４６７〜４７５）。超音波処理した抽出物を、５００μＭのＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥまたはＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥのいずれかを用いてアッセイした。
Figure 0004460615
 ａ活性は、抽出物中の総タンパク質１ｍｇあたりのμＵ（１分間あたりの産物のｐｍｏｌ）で表現される。
ｂＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥに対する活性で割ったＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥに対する活性の比率（％）。
（合成モデル化合物のナノモル量のＮＭＲ分析）
同定されたグリコシルトランスフェラーゼの連結特異性を適切に評価するために、その産物を、ＮＭＲ分光法によって分析した。酵素産物の精製のために必要とされる時間を減少させるために、ＮＭＲ分析を、ナノモル量で実施した。全ての化合物は、可溶性であり、そして数Ｈｚの線幅を有する鋭い共鳴を与える。なぜなら、Ｈ−１アノマー二重線（Ｊ１，２＝８Ｈｚ）は、十分に分離されるからである。唯一の例外は、おそらく凝集に起因するブロードな線（約１０Ｈｚ）を有するＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについてである。ナノ−ＮＭＲプローブにおける５ｍＭ ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥ溶液のプロトンスペクトルについて、アノマーシグナルの線幅は、増加した濃度に起因して、４Ｈｚのオーダーであった。また、おそらく経時的なサンプルの分解に起因して、さらなるピークが観測された。０．３ｍＭから５ｍＭへとサンプルを濃縮する際のｐＨ変化におそらく起因して、いくつかのわずかな化学シフトの変化もまた存在した。プロトンスペクトルを、アノマー共鳴とのＨＤＯ共鳴の重複を避けるために、種々の温度で取得した。プロトンスペクトルから評価され得るように、全ての化合物は純粋であり、そして存在した不純物または分解産物は、既に記載されるように実施されたＮＭＲ分析を妨げなかった（Ｐａｖｌｉａｋら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４１４６〜１４１５２；Ｂｒｉｓｓｏｎら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，３２７８〜３２９２）。
全てのＦＣＨＡＳＥグリコシドについて、同様なグリコシドの１３Ｃの帰属（ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９８６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８，２０６８〜２０８０；Ｍｉｃｈｏｎら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６，８３９９〜８４０５；Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４〜１０４５）が、利用可能であった。ＦＣＨＡＳＥグリコシドについて、１３Ｃの帰属は、標準的な同種核２Ｄ実験、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹから、まずプロトンスペクトルを帰属し、次いでＣ−Ｈ相関を検出するＨＳＱＣ実験から１３Ｃの帰属を確認することによって検証した。このＨＳＱＣ実験は、シアル酸のＣ−１およびＣ−２のような四級炭素を検出しないが、ＨＭＢＣ実験は検出する。主にＧｌｃの共鳴について、ＨＳＱＣスペクトルから得られたプロトン化学シフトは、１３Ｃデカップリングの間のサンプルの加熱に起因して、同種核実験で得られたプロトン化学シフトと異なった。異なる温度で取得された一連のプロトンスペクトルから、Ｇｌｃ残基の化学シフトは、温度に最も感受性であることが見出された。全ての化合物において、ＧｌｃのＨ−１共鳴およびＨ−２共鳴は、０．００４ｐｐｍ／℃だけ、Ｇａｌ（１−４）Ｈ−１は、０．００２ｐｐｍ／℃だけ、そしてＮｅｕ５Ａｃ Ｈ−３および他のアノマー共鳴について０．００１ｐｐｍ／℃未満変化した。ＬＡＣ−ＦＣＨＡＳＥについて、Ｇｌｃ Ｈ−６共鳴は、０．００８ｐｐｍ／℃だけ変化した。
Ｇｌｃ共鳴についての大きな温度係数は、ＦＣＨＡＳＥのアミノフェニル基への連結によって誘起される環電流シフトに起因される。ＨＳＱＣ実験の間のサンプルの温度は、ＧｌｃのＨ−１共鳴およびＨ−２共鳴の化学シフトから測定された。ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥについて、温度は、溶液中のＮａ＋濃度の存在に起因して、１２℃から２４℃まで変化し、そしてＮａＯＨを用いてｐＨを調整した。他のサンプルは、ほとんど厳しい加熱を有さなかった（＜５℃）。全ての場合において、温度に伴うプロトン化学シフトの変化は、ＨＳＱＣスペクトルにおける共鳴の帰属においていずれの問題も生じなかった。表４および表６において、全ての化学シフトは、ＨＳＱＣスペクトルから取得される。
アグリコンに対する連結部位は、主に、１０のシアリルオリゴサッカリドについて既に
なされたように（Ｓａｌｌｏｗａｙら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，２９４５〜２９４９）、グリコシル化のシフトを決定するために、この酵素産物の１３Ｃ化学シフトの、前駆体のものとの比較から決定した。ここで、１３Ｃスペクトルを比較する代わりに、ＨＳＱＣスペクトルが比較される。なぜなら、１００倍以上の物質が、１３Ｃスペクトルを得るために必要とされるからである。前駆体化合物のＨＳＱＣスペクトルからの１３Ｃ化学シフトが、酵素産物のものと比較される場合、主な低磁場シフトが、連結部位にて常に生じるが、前駆体の他の化学シフトは、実質的に変化しなかった。プロトン化学シフトの差は、長距離コンフォーメーションの効果、サンプル調製、および温度に大きく影響されやすい。付加された新たな糖の同定は、その１３Ｃを化学シフトと、モノサッカリドまたは任意の末端残基の化学シフトとの比較から迅速に同定され得る。なぜなら、グリコン（ｇｌｙｃｏｎ）のアノマー化学シフトのみが、グリコシド化の際に実質的に変化するからである（ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）。
１Ｄ ＴＯＣＳＹ実験または１Ｄ ＮＯＥＳＹ実験から得られる近位プロトンスピン−スピンカップリング（ＪＨＨ）はまた、糖の同定を決定するために使用される。ＮＯＥ実験は、アノマーグリコンプロトンの共鳴（シアル酸についてＨ−３）とアグリコンプロトンの共鳴との間のＮＯＥの観測によって、糖を配列決定するためになされる。最大のＮＯＥは、通常、連結プロトンに対してであるが、連結部位に隣接するアグリコンプロトン共鳴に対して、他のＮＯＥもまた生じ得る。６００ＭＨｚにて、多くのテトラサッカリドおよびペンタサッカリドのＮＯＥは、ポジティブまたは非常に小さいが、全てのこれらの化合物は、おそらく大きなＦＣＨＡＳＥ部位の存在に起因して、８００ｍｓの混合時間で良好なネガティブなＮＯＥを与えた。
合成Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥについて、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥのラクトース部分についての１３Ｃの帰属を、上記で概説した２Ｄ法によって確認した。全てのＧｌｃ単位のプロトン共鳴を、１８０ｍｓの混合時間でＧｌｃのＨ−１共鳴に対する１Ｄ−ＴＯＣＳＹ実験から帰属した。Ｇａｌ Ｈ−１についての１Ｄ−ＴＯＣＳＹ実験を、Ｇａｌ単位のＨ−１〜Ｈ−４の共鳴を帰属するために使用した。次いで、Ｇａｌ単位の残りのＨ−５およびＨ−６を、ＨＳＱＣ実験から帰属した。糖単位についての近位スピン−スピンカップリング値（ＪＨＨ）は、これまでのデータと一致した（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）。ＦＣＨＡＳＥ部分についての化学シフトは、既に与えられている（Ｇｉｌｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２８２７１〜２８２７６）。
Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥからのＣｓｔ−Ｉの酵素産物の正確な質量決定は、Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥアクセプターへのシアル酸の付加と一致した（図４）。この産物を、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥとして同定した。なぜなら、この産物の糖部分のプロトンスペクトルおよび１３Ｃの化学シフト（表６）が、ＧＭ３オリゴサッカリドまたはシアリルラクトースについてのもの（αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃ；ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）と非常に類似したからである。ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥのプロトン共鳴を、ＣＯＳＹスペクトル、ＨＳＱＣスペクトル、ならびにαＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ−ＦＣＨＡＳＥのもの（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）とのプロトンおよび１３Ｃの化学シフトの比較から帰属した。これらの２つの化合物について、Ｎｅｕ５Ａｃ残基およびＧａｌ残基に対するプロトンおよび１３Ｃの化学シフトは、お互いを結び付ける誤差内であった（Ｉｄ．）。Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥとＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥとのＨＳＱＣスペクトルの比較から、連結部位は、（２−３）シアリルオリゴサッカリドについて代表的なシアリル化の際に、Ｇａｌ Ｈ−３およびＧａｌ Ｃ−３についての大きな低磁場シフトに起因して（ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）、Ｇａｌ Ｃ−３であることが明らかである。また、αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ（１−４）βＧｌｃＮＡｃ−ＦＣＨＡＳＥについて既に見られるように（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）、シアル酸のＨ−３ａｘからＧａｌのＨ−３へのＮＯＥを、代表的なαＮｅｕ５
Ａｃ（２−３）Ｇａｌ連結で観測した。
（表６）
ラクトースｂ（ＳａｂｅｓａｎおよびＰａｕｌｓｏｎ、前出）、ガングリオシドオリゴサッカリドｂ（Ｉｄ．Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４〜１０４５）および（−８ＮｅｕＡｃ２−）３（Ｍｉｃｈｏｎら（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６，８３９９〜８４０５）について観測された１３Ｃ化学シフトとのＦＣＨＡＳＥグリコシドａについての１３Ｃ化学シフトの比較。グリコシド化部位の化学シフトに下線を付す。
Figure 0004460615
Figure 0004460615
 ａＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥについて２８℃で、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥについて２５℃で、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについて１６℃で、ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥについて２４℃で、そしてＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥについて２４℃で、６００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ、ｐＨ７で得られたＨＳＱＣスペクトルに由来する（ｐｐｍ）。外部のジオキサン（６７．４０ｐｐｍ）に対する内部のアセトンのメチルの共鳴は、３１．０７ｐｐｍである。誤差は、１３Ｃ化学シフトについて±０．２ｐｐｍであり、そしてサンプル温度について±５℃である。誤差は、重複に起因して、６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｅについて±０．８ｐｐｍである。ｂ＋０．５２ｐｐｍの補正を、参照化合物（２５、２７）の化学シフトに加えて、ジオキサンに対する化学シフトを６７．４０ｐｐｍに設定した。ＦＣＨＡＳＥ化合物の化学シフトと対応する参照化合物の化学シフトとの間の１ｐｐｍを越える差を太字で示す。ｃＣ−３およびＣ−４の帰属が、逆転されている。ｄＣ−４およびＣ−６の帰属が、逆転されている。
Ｌａｃ−ＦＣＨＡＳＥからのＣｓｔ−ＩＩの酵素産物の正確な質量決定は、２つのシアル酸がＬａｃ−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに付加されたことを示した（図４）。プロトンの共鳴を、ＣＯＳＹ、１Ｄ ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ ＮＯＥＳＹならびに公知の構造と化学シフトの比較から帰属した。Ｇｌｃ Ｈ１〜Ｈ−６およびＧｌｃ Ｈ−１〜Ｈ−４の共鳴を、Ｈ−１共鳴に対する１Ｄ ＴＯＣＳＹから帰属した。Ｎｅｕ５Ａｃの共鳴を、ＣＯＳＹから帰属し、そして１Ｄ ＮＯＥＳＹによって確認した。４．１６ｐｐｍでのＨ−８、Ｈ−９ Ｎｅｕ５Ａｃの共鳴の１Ｄ ＮＯＥＳＹを、Ｈ−９およびＨ−７の共鳴を位置付けるために使用した（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）。わずかに近位のカップリング定数に起因するＮｅｕ５Ａｃ（２−３）のＨ−７共鳴の一重線の出現は、２〜８の連結を象徴する（Ｉｄ．）。他の共鳴を、ＨＳＱＣスペクトルおよび末端シアル酸についての１３Ｃの帰属から帰属した（Ｉｄ．）。Ｇａｌ単位のプロトンおよび１３Ｃ炭素の化学シフトは、ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥにおけるものと同様であり、このことは、αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）Ｇａｌ連結の存在を示した。２つのシアル酸のＪＨＨ値、プロトンおよび１３Ｃの化学シフトは、α（２−８）に連結したＮｅｕ５ＡトリサッカリドにおけるαＮｅｕ５Ａｃ（２−８）Ｎｅｕ５Ａｃのもの（Ｓａｌｌｏｗａｙら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，２９４５〜２９４９）と同様であり、このことは、この連結の存在を示した。従って、産物をＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥとして同定した。Ｎｅｕ５ＡｃのＣ−８でのシアリル化は、そのＣ−８の共鳴を７２．６ｐｐｍから７９．１ｐｐｍへと−６．５ｐｐｍの低磁場シフトを引き起こした。
ＧＤ３−ＦＣＨＡＳＥについての内部残基ＮＯＥもまた、αＮｅｕ５Ａｃ（２−８）αＮｅｕ５Ａｃ（２−３）βＧａｌ配列のものを象徴した。Ｎｅｕ５Ａｃ（２−３）およびＮｅｕ５Ａｃ（２−８）の１．７〜１．８ｐｐｍでの２つのＨ−３ａｘ共鳴に由来する最大の内部残基ＮＯＥは、Ｇａｌ Ｈ−３および−８）Ｎｅｕ５Ａｃ Ｈ−８の共鳴に対する。Ｇａｌ Ｈ−４および−８）Ｎｅｕ５Ａｃ Ｈ−７に対するより小さい内部残基ＮＯＥもまた観測される。ＦＣＨＡＳＥの共鳴に対するＮＯＥもまた、Ｈ−３ａｘの共鳴とのＦＣＨＡＳＥの共鳴の重複に起因して、観測される（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）。Ｎｅｕ５Ａｃ（２−３）のＨ−３ｅｑからＧａｌ Ｈ−３への内部残基ＮＯＥもまた観測される。また、残基内は、プロトンの帰属を確認した。２〜８の連結についてのＮＯＥは、−８Ｎｅｕ５Ａｃα２−ポリサッカリドについて観測されるものと同様である（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）。
シアル酸グリコシドの連結はまた、グリコシド結合を横切る３Ｊ（Ｃ，Ｈ）相関を検出するＨＭＢＣ実験の使用によって確認され得た。α−２，３連結およびα−２，８連結の両方についての結果は、２つのＮｅｕ５ＡｃアノマーＣ−２の共鳴とＧａｌ Ｈ−３および−８）Ｎｅｕ５Ａｃ Ｈ−８の共鳴との間の３Ｊ（Ｃ，Ｈ）相関を示す。２つのＮｅｕ５Ａｃ残基のＨ−３ａｘとＨ−３ｅｑとの共鳴に対する残基内相関もまた観測された。このＧｌｃ（Ｃ−１，Ｈ−２）相関もまた観測される。なぜなら、ＨＭＢＣスペクトルにおいて、１０１ｐｐｍでの交差ピークと１００．６ｐｐｍでの交差ピークとの部分的な重複が存在したからである。
ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥからのＣｇｔＡの酵素産物の正確な質量決定は、Ｎ−アセチル化ヘキソース単位がＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに付加されたことを示した（図４）。この産物は、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥとして同定された。なぜなら、このグリコシドのプロトンおよび１３Ｃの化学シフトが、ＧＭ２オリゴサッカリド（ＧＭ２ＯＳ）についてのもの（Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４〜１０４５）と同様であったからである。ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについてのＨＳＱＣスペクトルおよびそのプロトンスペクトルの積分から、今度は、新たなアノマーの「ｄ１」に沿って４．１７ｐｐｍおよび４．１８ｐｐｍでの２つの共鳴ならびに２．０４ｐｐｍでの２つのＮＡｃ基が存在する。ＴＯＣＳＹ実験およびＮＯＥＳＹ実験から、４．１８ｐｐｍでの共鳴は、Ｈ−１とＨ−３との間の強力なＮＯＥのために、明らかにＧａｌ Ｈ−３に帰属された。βガラクトピラノースについて、Ｈ−１とＨ−３との間およびＨ−１とＨ−５との間の強力な残基内ＮＯＥが、アキシアル位のプロトンおよびこれらの短いプロトン間距離に起因して観測される（Ｐａｖｌｉａｋら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，１４１４６〜１４１５２；Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６，３２７８〜３２９２；Ｓａｂｅｓａｎら（１９８４）Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．６２，１０３４〜１０４５）。ＴＯＣＳＹスペクトルおよびＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥおよびＧＭ２ＯＳのＨ１化学シフトの比較（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）から、４．１７ｐｐｍでの共鳴は、Ｇａｌ Ｈ４として帰属される。同様に、ＴＯＣＳＹスペクトルおよびＮＯＥＳＹスペクトルから、ＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃのＨ−１〜Ｈ−５、ならびにＮｅｕ５ＡｃのＨ−３〜Ｈ−６を帰属した。ブロードな線に起因して、共鳴の多重線のパターンは、観測され得なかった。他の共鳴を、前駆体のＨＳＱＣスペクトルとの比較およびＧＭ２ＯＳについての１３Ｃの帰属から帰属した（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）。ＧＭ３−ＦＣＨＡＳＥグリコシドとＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥグリコシドとのＨＳＱＣスペクトルの比較によって、前駆体と産物との間に−９．９ｐｐｍの低磁場シフトが、Ｇａｌ Ｃ−４の共鳴に対して生じた。βＧａｌＮＡｃのＨ−３およびＨ−５への残基内ＮＯＥとともに、４．１７ｐｐｍでのＧａｌＮＡｃ Ｈ−１からＧａｌ Ｈ−４への残基内ＮＯＥもまた観測され、βＧａｌＮＡｃ（１−４）Ｇａｌ配列を確認した。観測されたＮＯＥは、ＧＭ２ガングリオシドのコンフォメーションの特性から予想されるものであった（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）。
ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥからのＣｇｔＢの酵素産物の正確な質量決定は、ヘキソース単位がＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥアクセプターに付加されていることを示した（図４）。この産物を、ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥとして同定された。なぜなら、このグリコシドの１３Ｃ化学シフトが、ＧＭ１ａオリゴサッカリドについてのものと同様であったからである（Ｉｄ．）。プロトンの共鳴を、ＣＯＳＹ、１Ｄ ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ ＮＯＥＳＹから帰属した。この産物のさらなる「ｅ１」共鳴に対する１Ｄ ＴＯＣＳＹから、β−ガラクトピラノースに代表的な多重線パターンを有する４つの共鳴を観測した。βＧａｌＮＡｃのＨ−１共鳴に対する１Ｄ ＴＯＣＳＹおよび１Ｄ ＮＯＥＳＹから、Ｈ−１〜Ｈ−５の共鳴を帰属した。βＧａｌＮＡｃ Ｈ−１〜Ｈ−４の多重線パターンは、β−ガラクトピラノシル構造に代表的であり、ＧＭ２−ＦＣＨＡＳＥについての糖の同定を確実にした。グリコシド化の際に、大きな摂動が、βＧａｌＮＡｃの共鳴に対して生じることが明らかであり、そしてＧａｌＮＡｃ Ｃ−３の共鳴に対するアクセプターと産物との間に−９．１ｐｐｍの低磁場シフトが存在した。また、ＧａｌのＨ−３、Ｈ−５に対する残基内ＮＯＥとともに、Ｇａｌ Ｈ−１からＧａｌＮＡｃ Ｈ−３への残基間ＮＯＥおよびＧａｌＮＡｃ Ｈ−４へのより小さいＮＯＥが観測され、βＧａｌ（１−３）ＧａｌＮＡｃ配列を確実にした。観測されたＮＯＥは、ＧＭ１ａガングリオシドのコンホメーション特性から予想されるものであった（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）。
ＧＭ２ＯＳとＧＭ１ＯＳとにおいて、Ｃ−３およびＣ−４のβＧａｌ（１−４）の共鳴の帰属でいくつかの矛盾が存在し、これは、公開されているデータと反対である（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）。これまでに、この帰属は、公知の化合物との１３Ｃの化学シフトの比較に基づいていた。ＧＭ１ａ−ＦＣＨＡＳＥについて、Ｇａｌ（１−４）のＨ−３に対する帰属を、プロトンの次元で２Ｈｚ／点で処理されたＨＳＱＣスペクトルで直接的に、その大きな近位カップリングＪ２，３＝１０Ｈｚを観測することによって確認した。Ｈ−４多重線は、ガラクトースのＨ−４のエクアトリアル位に起因して、はるかにより小さい（５Ｈｚ未満）（Ｓａｂｅｓａｎら、前出）。表６において、（−８Ｎｅｕ５Ａｃ２−）３中の１つのシアル酸のＣ−４およびＣ−６の帰属もまた、Ｈ−４およびＨ−６の帰属から確認されるように逆転されている（Ｍｉｃｈｏｎら、前出）。
ＨＳＱＣスペクトルから得られたＦＣＨＡＳＥグリコシドの１３Ｃの化学シフトは、表６に示される参照オリゴサッカリドのものと非常に一致した。１ｐｐｍを越える差異が、いくつかの共鳴について観測され、そしてこれらは、還元末端での異なるアグリコンに起因する。これらの共鳴を排除すると、ＦＣＨＡＳＥグリコシドとこれらの参照化合物との間の化学シフトにおける差の平均は、±０．２ｐｐｍ未満であった。従って、公知の構造を用いるプロトンの化学シフト、ＪＨＨ値および１３Ｃの化学シフトの比較、ならびにＮＯＥまたはＨＭＢＣの使用は、種々のグリコシルトランスフェラーゼについての連結特異性を決定するために全て使用された。ＨＳＱＣスペクトルを使用する利点は、プロトンの帰属が独立して確認されて、連結部位での原子の１３Ｃ共鳴の帰属を確認し得ることである。感度の面から、プロトンＮＯＥが、最も感受性で、続いてＨＳＱＣ、次いでＨＭＢＣである。同量の物質に対して、５ｍｍＮＭＲプローブの代わりにナノ−ＮＭＲプローブを使用すると、総取得時間がかなり減少され、一晩でのＨＭＢＣ実験の取得を可能した。
（考察）
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＬＯＳグリコシルトランスフェラーゼをクローン化するために、本発明者らは、本発明者らが以前に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のα−２，３−シアリルトランスフェラーゼのクローン化に使用したもの（Ｇｉｌｂｅｒｔら、前出）と同様に活性スクリーニングストラテジーを利用した。この活性スクリーニングストラテジーは、同じα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子（ｃｓｔ−ｌ）の２つのバージョンをコードする２つのクローンを与えた。ＯＲＦ分析は、４３０残基ポリペプチドがα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性の原因であることを示唆した。ＬＯＳ生合成に関わる他の遺伝子を同定するために、本発明者らは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＮＣＴＣ１１１６８の完全なゲノム配列におけるＬＯＳ生合成遺伝子座を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４由来の対応する遺伝子座と比較した。完全なオープンリーディングフレームが同定され、そして分析された。β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ｃｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ｃｇｔＢ）および二官能性シアリルトランスフェラーゼ（ｃｓｔ−ＩＩ）を含むいくつかのオープンリーディングフレームを、Ｅ．ｃｏｌｉ中で個々に発現させた。
ナノモル量のガングリオシド模倣物の蛍光誘導体のインビトロでの合成およびそれらのＮＭＲ分析は、４つのクローン化したグリコシルトランスフェラーゼの連結特異性を明らかに確実にする。これらのデータに基づき、本発明者らは、図４に記載される経路が、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４によってＧＴ１ａ模倣物を合成するために使用されることを示唆する。ｃｇｔＡについてのこの役割は、この遺伝子の不活性なバージョンを保有するＣ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３４２が、そのＬＯＳ外部コアにおいてβ−１，４−ＧａｌＮＡｃを有さないという事実によってさらに支持される（図１）。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４からのｃｓｔ−ＩＩ遺伝子は、インビトロアッセイにおいて、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびα−２，８−シアリルトランスフェラーゼの両方を示したが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９（血清系統（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ））からのｃｓｔ−ＩＩは、α−２，３−シアリルトランスフェラーゼ活性のみを示した（表５）。このことは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４（これらの両方は、同一のｃｓｔ−ＩＩ遺伝子を有するが、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９（血清系統、図１を参照のこと）では有さない）において、末端α−２，８−連結シアル酸の付加におけるｃｓｔ−ＩＩについての役割と一致する。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９（血清系統）からのＣｓｔ−ＩＩ相同体とＯＨ４３８２／８４からのＣｓｔ−ＩＩ相同体との間で８アミノ酸の違いが存在する。
ｃｓｔ−ＩＩの二官能性は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ感染の結果に対して影響を有し得る。なぜなら、末端ジシアリル化エピトープの発見は、神経障害性合併症（例えば、ギヤン−バ
レー症候群）の発生に関与し得ることが示されているからである（Ｓａｌｌｏｗａｙら（１９９６）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４，２９４５〜２９４９）。その二官能性活性が、これまでに記載されたシアリルトランスフェラーゼの中で新規であることもまた注目すべきである。しかし、二官能性グリコシルトランスフェラーゼ活性は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクツロソン酸トランスフェラーゼについて記載されている（Ｂｅｌｕｎｉｓ，Ｃ．Ｊ．およびＲａｅｔｚ，Ｃ．Ｒ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，９９８８〜９９９７）。
ｃｓｔ−ＩＩの一／二官能性活性およびｃｇｔＡの活性化／不活性化は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉに、宿主に提示される異なる表面糖質を作らせる相変異機構の２つの形態であると考えられる。３つのＯ：１９系統（血清系統、ＯＨ４３８２およびＯＨ４３８４）の中で見出されるこれらの小さな遺伝子改変に加えて、この遺伝子座が、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４とＮＣＴＣ １１１６８（Ｏ：２系統）との間で比較される場合、大きな遺伝的再配列が存在する。ｐｒｆＢ遺伝子を除いて、ｃｓｔ−Ｉ遺伝子座（ｃｙｓＮおよびｃｙｓＤを含む）は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４においてのみ見出される。ＯＨ４３８４系統とＮＣＴＣ １１１６８系統との間のＬＯＳ生合成遺伝子座の組織化において有意な差が存在する。いくつかの遺伝子は、十分に保存され、いくつかの遺伝子は、不十分に保存されているが、他の遺伝子は、系統のどれか一方に固有である。ＯＨ４３８４において別個のＯＲＦ（＃５ａ：ｃｇｔＡおよび＃１０ａ：ＮｅｕＡ）として存在する２つの遺伝子は、ＮＣＴＣ １１１６８ではインフレーム融合ＯＲＦ（ＯＲＦ＃５ｂ／＃１０ｂ）として見出される。β−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性は、この系統で検出され、これは、融合物の少なくともｃｇｔＡ部分が活性であり得ることを示唆する。
要約すると、この実施例は、カンピロバクター属におけるリポオリゴサッカリドの合成に関わる酵素をコードするいくつかのオープンリーディングフレームの同定を記載する。
本明細書中で記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみであること、ならびにそれらを考慮して、種々の改変または変更が、当業者に示唆され、そしてこの適用および添付された特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、本明細書によって全ての目的について参考として援用される。
図１Ａ〜１Ｃは、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９株由来のリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）外側コア構造を示す。これらの構造は、Ａｓｐｉｎａｌｌら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３，２４１−２４９に記載され、そしてガングリオシドのオリゴサッカリド部分と類似性を示す部分を、枠で囲まれたを定める。図１Ａ：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９血清型（ＡＴＣＣ＃４３４４６）のＬＯＳは、ガングリオシドＧＤ１ａのオリゴサッカリド部分と構造的類似性を有する。図１Ｂ：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｏ：１９株ＯＨ４３８４のＬＯＳは、ガングリオシドＧＴ１ａのオリゴサッカリド部分と構造的類似性を有する。図１Ｃ：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８２のＬＯＳは、ガングリオシドＧＤ３のオリゴサッカリド部分と構造的類似性を有する。 図２Ａ〜２Ｂは、ＯＨ４３８４由来のｃｓｔ−Ｉ遺伝子座の遺伝子編成およびＯＨ４３８４およびＮＣＴＣ１１１６８のＬＯＳ生合成遺伝子座の比較を示す。目盛記号の間の距離は１ｋｂである。図２Ａは、ＧｅｎＢａｎｋ（＃ＡＦ１３０４６６）から利用可能であるヌクレオチド配列を基にした、ＯＨ４３８４のｃｓｔ−Ｉ遺伝子座の模式図を示す。部分的なｐｒｆＢ遺伝子は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のペプチド鎖放出因子（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＥ０００５３７）にある程度類似であり、一方、ｃｙｓＤ遺伝子および部分的ｃｙｓＮ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子がコードする硫酸アデニリルトランスフェラーゼのサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＥ０００３５８）に類似である。図２Ｂは、ＯＨ４３８４のＬＯＳ生合成遺伝子座の模式図を示し、この遺伝子座はＧｅｎＢａｎｋ（＃ＡＦ１３０９８４）に由来するヌクレオチド配列に基づく。ＯＨ４３８２のＬＯＳ生合成遺伝子座のヌクレオチド配列は、ｃｇｔＡ遺伝子を除いてＯＨ４３８４の遺伝子座と同一であり、このｃｇｔＡ遺伝子は、「Ａ」を欠失している（本文およびＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ１６７３４５を参照のこと）。ＮＣＴＣ１１１６８のＬＯＳ生合成遺伝子座の配列は、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｃ＿ｊｅｊｕｎｉ／）より利用可能である。対応する相同な遺伝子は同じ数を有し、ＯＨ４３８４遺伝子についての後続の「ａ」、およびＮＣＴＣ１１１６８遺伝子についての後続の「ｂ」を有する。ＯＨ４３８４株に特有の遺伝子を黒色で示し、そしてＮＣＴＣ１１１６８に特有の遺伝子をグレーで示す。ＯＨ４３８４のＯＲＦの＃５ａおよび＃１０ａは、ＮＣＴＣ１１１６８におけるインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合ＯＲＦ（＃５ｂ／１０ｂ）として見出され、そしてアスタリスク（＊）で表示される。各々のＯＲＦについての提案される機能は、表４に見出される。 図３は、シアリルトランスフェラーゼの縮退したアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＯＨ４３８４ｃｓｔ−Ｉ遺伝子（最初の３００残基）、ＯＨ４３８４ ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子（ＯＨ４３８２ ｃｓｔ−ＩＩと同一）、Ｏ：１９（血清株（ｓｅｒｏｓｔｒａｉｎ））ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ１６７３４４）、ＮＣＴＣ１１１６８ ｃｓｔ−ＩＩ遺伝子およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ推定ＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｕ３２７２０）を、ＣｌｕｓｔａｌＸアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，４８７６−８２）を使用して並置させた。プログラムＧｅｎＤｏｃ（Ｎｉｃｈｏｌａｓ，Ｋ．Ｂ．およびＮｉｃｈｏｌａｓ、Ｈ．Ｂ．（１９９７）ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｒｉｓ．ｃｏｍ／〜ｋｅｔｃｈｕｐ／ｇｅｎｅｄｏｃ．ｓｈｔｍｌ）によって作成した。 図４は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ ＯＨ４３８４のグリコシルトランスフェラーゼを使用する、ガングリオシド模倣物の酵素的な合成についての模式図を示す。合成のアクセプター分子から出発して、示される配列を使用して、組換えのα−２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃｓｔ−Ｉ）、β−１，４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＣｇｔＡ）、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＣｇｔＢ）、および二機能性のα−２，３／α−２，８−シアリルトランスフェラーゼ（Ｃｓｔ−ＩＩ）を用いて、一系列のガングリオシド模倣物を合成した。全ての生成物を質量分析によって分析し、そして単一同位体（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）の観測された質量（括弧で示す）は、全て理論上の質量の０．０２％以内であった。ＧＭ３模倣物、ＧＤ３模倣物、ＧＭ２模倣物およびＧＭ１ａ模倣物もまた、ＮＭＲ分光法によって分析した（表４を参照のこと）。
（配列表）
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Claims (8)

  1. 単離された核酸分子または組換え核酸分子であって、該核酸分子は、
    β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
    を含み、
    該ポリヌクレオチド配列は、配列番号３０のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するか、または配列番号３１のアミノ酸配列をコードする、
    核酸分子。
  2. 請求項１に記載の核酸によりコードされる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、β−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する、ポリペプチド。
  3. 請求項２に記載の単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  4. オリゴサッカリドを合成するための、請求項２〜３のうちのいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
  5. 請求項４に記載の使用であって、前記オリゴサッカリドはガングリオシドである、使用。
  6. 請求項１に記載の核酸分子を含む、発現ベクターまたは発現カセット。
  7. 請求項６に記載の発現ベクターまたは発現カセットを含む、宿主細胞。
  8. グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを合成するための、請求項１に記載の核酸分子あるいは請求項６に記載の発現ベクターまたは発現カセットあるいは請求項７に記載の宿主細胞の、使用。
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