MXPA97007970A - Bacterias que tienen actividad nematicida y su uso agricola - Google Patents

Abstract

Se ha encontrado nuevas cepas bacterianas de la especie B. firmus, las cuales una actividad nematicida. La bacteria y sus mutantes activas se usan para controlar infestación de nematodos de varias plantas. Las cepas se han depositado y se les ha dado los números de acceso CNCM I-1562 respectivamente. Además, se describe una composición que contiene las cepas o esporas de las mismas, como un ingrediente activo y vehículo. Además, se describe también un método para controlar nematodos patogénicos para plantas, tales como aquellos nematodos capaces de producir enfermedad nodular.

Description

BACTERIAS QUE TIENEN ACTIVIDAD NEMATICIDA Y SU USO AGRÍCOLA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a cepas bacterianas nematicidas y particularmente a cepas que afectan nemátodos patogénicos para plantas. La invención también se refiere a composiciones nematicidas agrícolas así como a métodos para controlar nemátodos patogénicos para plantas. ANTECEDENTES DE LA I NVENCIÓN La formación de nodulos es una de las enfermedades de plantas más serias en el mundo. En todo el mundo, la enfermedad nodular causa una pérdida de producción anual promedio de aproximadamente el 5% . Sin embargo, las pérdidas mayores se presentan para aquellos que menos pueden afrontarlo , a saber, los granjeros de países en desarrollo. Sus pérdidas pueden ser de tanto como 25-50% sobre una amplia área de tierra de siembra disponible. Además , hay varias pérdidas indirectas asociadas con la enfermedad nodular incluyendo el ataque secundario por otros patógenos (en combinación con otros patógenos, la enfermedad nodular puede ser desastrosa) ; la utilización ineficiente de fertilizantes y agua, y el alto costo de tratamiento qu ímico. Los parásitos más comunes que ocasionan esta enfermedad pertenecen a la Meloidogyne spp. Se ha mostrado que estos nemátodos paralizan más de 3000 especies de plantas incluyendo todas las familias principales de cosechas . Los nemátodos nodulares se encuentran en todas las zonas climáticas y en la mayoría de los tipos de suelo. Son más activos para hallar y atacar plantas en climas calientes que en regiones más frías. Las plantas infectadas por nemátodos nodulares exhiben uno o ambos de los siguientes síntomas: los sistemas de raíces tienen agallas o nudos en las raíces. Las agallas varían en tamaño de una cabeza de alfiler a agallas compuestas de más de 2.5 cm de diámetro. Son irregulares, esféricas o en forma de huso y con más frecuencia se encuentran en raicillas delicadas. Estas estructuras hospedan de uno a varios cientos de nemátodos hembras, los cuales permanecen estacionarios todo su ciclo de vida y se alimentan adentro de la raíz. En vista de su impacto económico global en cosechas comerciales, hay una necesidad urgente de encontrar una manera eficiente de controlar los nemátodos nodulares. Hasta ahora, los químicos tales como bromuro de metilo o dibromuro de etilo se han usado para controlar a los nemátodos. Sin embargo, el desarrollo de resistencia por los patógenos a químicos nematicidas, así como una conciencia del daño ecológico causado a corto y largo plazo por estos y otros químicos, han incrementado el interés en desarrollar un producto bionematicida que actúa específicamente contra su nemátodo blanco sin ocasionar daño ecológico. COMPEN DIO DE LA I NVENCIÓN Es un objetivo de la presente invención proveer cepas que tienen actividad nematicída contra nemátodos que ocasionan la formación de nodulos .

Es un objetivo adicional de la presente invención proveer una composición agrícola útil para proteger a las plantas contra nemátodos nodulares. Es otro objetivo adicional de la presente invención proveer un método para controlar nemátodos patogénicos para plantas. De acuerdo con la presente invención, se han encontrado cepas bacterianas nuevas de la especie B. firmus las cuales tienen una actividad nematicida. Estas dos cepas bacterianas se nombran en la presente como "EIP-NI" y "EIP-N2". Ambas cepas se han depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNMC), Institute Pasteur, Francia, en las siguientes fechas y bajo los siguientes Números de Acceso: El uso de las cepas EIP-N 1 y EIP-N2 actualmente es una modalidad preferida de la invención. Otras cepas útiles de acuerdo con la presente invención son varias cepas mutantes derivadas de cepas EIP-N 1 y EI P-N2 que tienen actividad nematicida . Las cepas mutantes a veces se obtienen espontáneamente pero también se pueden obtener por mutagénesis, v.gr. , mediante el uso de irradiación o mutagenos. Como será apreciado por el artesano, es posible inducir varias clases de mutaciones las cuales no causará n ahora un cambio substancial en la actividad nematicida de bacterias y su capacidad para ejercer esta actividad nematicida cuando se administran al suelo en el cual crecen los cultivos que serán protegidos. La presente invención por lo tanto provee mediante uno de sus aspectos, una cepa de bacteria que pertenece a la especie B. furmus y que tiene actividad nematicida, tal como la cepa que es un miembro del grupo que consiste de EIP-N 1 (CNMC 1-1556) , EI P-N2 (CNCM 1 -1652) y mutantes nematicidalmente activas de dichas EI P-N 1 ó EIP-N2. También por la presente invención se proveen cultivos puros de bacterias, seleccioands del gurpo que consiste de EIP-N 1 , EI P-N2 o una mutante nematicidalmente activa de dichas EIP-N 1 ó EIP-N2. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención , se provee una composición nematicida para usarse en protección de plantas comprendiendo una cantidad efectiva de un ingrediente activo de una bacteria nematicida o de esporas de los mismos, las bacterias siendo de una cepa seleccionada del grupo que consiste de EIP-N 1 , EIP-N2 , y una mutante nematicidalmente activa de dichas EIP-N 1 ó EIP-N2, junto con un vehículo compatible con las bacterias nematicidales. De acuerdo con la modalidad preferida de la invención , la composición se suplementa por uno o más suplementos los cuales mejoran o intensifican la capacidad de la bacteria para ejercer su actividad nematicida. Los suplementos, por ejemplo, pueden ser nutrientes tales como gelatina, hidrolisato de gelatina, harina de semilla de algodón e hidrolisato de caseína. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para controlar nemátodos patogénicos para plantas, comprendiendo la aplicación a las raíces de plantas o al ambiente del suelo en el cual crece la planta, una cantidad efectiva de bacteria o esporas de los mismos, las bacterias siendo de una cepa seleccionada del grupo que consiste de EIP-N1, EIP-N2 y una mutante nematicidalmente activa de EIP-N1 o EIP-N2. Las bacterias pueden ser introducidas en el suelo aplicando las bacterias bajo el suelo dentro de un vehículo líquido. Alternativamente, las bacterias también pueden ser una fórmula seca y mezclarse con el suelo, v.gr., antes de plantar o sembrarse. Las bacterias también se pueden aplicar impregnando raíces o semillas de plantas antes de plantar o sembrar las mismas en el suelo, con una formulación líquida que comprende las bacterias. Otro aspecto de la presente invención es una mezcla de maceta comprendiendo las bacterias de la invención. Las cepas bacterianas de la presente invención son útiles para controlar nemátodos que ocasionan la enfermedad nodular y particularmente aquellas que pertenecen a la Meloidogyne spp. Sin embargo, las bacterias de la invención también pueden ser efectivas contra otros nemátodos patogénicos tales como nemátodos de cist. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos: La Figura 1 muestra resultados de experimentos en los cuales la actividad de EIP-N1 (Eß), EIP-N2 (0) para controlar nemátodos, comparado con (0), se determinó bajo condiciones de invernadero. La Figura 2, muestra resultados de un experimento similar al mostrado en la Figura 1, obtenida en microparcelas. La presente invención será entendida mejor a partir de la siguiente descripción detallada de modalidades preferidas, tomadas junto con las siguientes figuras, las cuales resumen los resultados de un número de experimentos en los cuales la cepas de la invención se usaron para controlar la actividad patogénica de nemátodos en el invernadero o en microparcelas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODALIDADES PREFERIDAS MATERIALES Y MÉTODOS I. Identificación Las cepas se enviaron a Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkuturen GmbH (DSM) para identificación, usando hibridización en secuencia de ADNr de 16 S parcial. II. Condiciones de crecimiento Las cepas crecen en medio líquido de MBS (medio para esporulación de bacilos) que contiene: GE 90F (hidrolisato comercial de gelatina) - 10 g/L (EIP-N1), o triptosa - 5 gr/L (EIP-N2); Extracto de levadura - 2 gr/L; KH2HPO4 - 6.8 gr/L; y los siguientes elementos traza: MgSO4«7H2O - 0.3 gr/L; MnSO4 - 0.02 gr/L; FeSO4 - 0.02 gr/L; ZnSO H2O - 0.02 gr/L; CaCI2 - 0.2 gr/L; pH : 7.4 (ajustado con NaOH). EI P-N2 también puede crecer en medio agar de nutrientes (Difco). Las cepas se desarrollaron en matraces Erlenmeyer de 2 litros o en fermentadores de 100-500 litros de esporas y las células vegetativas se disolvieron en una pequeña cantidad de agua destilada . Las muestras se sembraron antes y después de calentarse a 70°C durante 20 minutos para contar el número total de células y el número de esporas, respectivamente. El número total de esporas usualmente es de 75-90% del conteo total de células. Un rendimiento normal es de 5- 108 esporas/ml. IV. Estabilidad Las esporas mostraron 100% viabilidad después de 6 meses en una forma seca a temperatura ambiente. Las esporas también se pueden almacenar bajo las siguientes condiciones 1 ) Como una pasta a -70°C durante por lo menos seis meses; 2) e iante secado por congelación de esporas en solución de leche descremada al 10% y almacenamiento a 4°C; 3) En galerías inclinadas almacenadas a 4°C; 4) Las esporas se pueden secar en un horno en presencia de musgo de pantano o sílice. Bajo las tres últimas condiciones, la disponibilidad de por lo menos un año. V. Actividad proteolítica La actividad proteolítica se determinó midiendo el incremento en densidad óptica como resultado de la liberación de un producto coloreado en solución siguiendo la descomposición de Azocaseina (Sigma) . La mezcla de reacción (1 ml) contuvo 6 mg de Azocaseina en 0.5 ml y 0.5 ml del sobrenadante del medio de crecimiento, solución reguladora de pH a un pH 7.6 de 0.05 M Tris HCl conteniendo 5 mM de CaCI2- La mezcla de reacción se incubó durante 15 minutos a 37°C, y la reacción se terminó por la adición de 0.5 ml de 10% TCA . Siguiendo una incubación adicional de 30 minutos en hielo y centrifugación ( 10,000 RPM, 15 min), el incremento en densidad óptica a se determinó una longitud de onda de 400 nm vs un control (1 ml de mezcla de reacción sin sobrenadante de medio de crecimiento). VI. Actividad Colagenólitica La actividad Colagenolítica se analizó siguiendo la división de un péptido sintético (4-fenilazobenciloxicarbonil-Pro-Leu-GlyD-Arg) por colagenasa y determinando la cantidad de producto coloreado liberado en la solución.

La mezcla de reacción incluyó 0.5 ml de sobrenadante del medio de crecimiento, 2 ml del péptido sintético (la solución madre contuvo 10 mg de péptido en 0.1 ml de metanol y 10 ml de solución reguladora de pH veronal a pH 7.6) y 0.25 ml de 50 mM N-etilmaleimida. La mezcla se incubó a 37°C durante 20 minutos y la reacción se terminó mediante la adición de 1 ml de 0.5% de ácido cítrico y 5 ml de mezcla de acetato de etilo a 0.5 ml de la mezcla de reacción. Después de la agitación durante 20 segundos, la solución se separó en dos fases de las cuales la fase superior se separó y su absorbancia se determinó a una longitud de onda de 320 nm. 1 O.D./6-107 células es igual a una enzima unitaria. Vil. Técnicas de aplicación 1. Mezclar las esporas con suelo en presencia o ausencia de suplementos (5-107 esporas/gr suelo): en experimentos de maceta, se usaron 500 gr de suelo, mientras que se usaron pruebas en microparcelas, se usaron cubetas conteniendo de 15-30 kg de suelo. El agente químico usado como control en las pruebas de microparcelas es Nemacur® (Bayer). 2. Adición de esporas formuladas en musgo de pantano o sílice para suelo de maceta o sembrando en cámaras de crecimiento, las esporas se mezclaron con musgo de pantano o sílice y se secaron en un horno (40°C durante la noche) antes de la aplicación. VIII. Análisis de actividad nematicida En todos los experimentos, se usaron plántulas de tomate (cepa Na'ama). El suelo se infestó artificialmente con 0.7 nemátodos/gr de suelo y las plántulas se plantaron en el suelo infestado. Las larvas se prepararon de masas de huevo desarrolladas en raíces de tomate. Cada análisis continuó durante 30 días. La cuantificación se basa en el cambio porcentual en una escala de "í ndice de Formación de Agallas" variando entre 0-5, mientras que "0" representa que no hay agallas en las raíces y "5" representa infestación máxima de raíces. RESULTADOS 1. EIP-N1 La Cepa EI P-N 1 se aisló del suelo obtenido del área descubierta central de Israel , siguiendo los experimentos de maceta de invernadero durante los cuales se enriqueció el suelo con 0.3% de harina de semilla de algodón (HSA) antes de plantarse con plántulas de tomate. Después de 30 d ías, el suelo se homogeneizó en agua y se sembró una muestra en placas de agar lo cual sirvió como una fuente para el aislamiento de la cepa EI P-N 1 . EI P-N 1 mostró similaridad de secuencia superior (98.7%) a Bacillus furmus. Previamente se identificó B. firmus como un agente de control biológico potencial contra Botrytis cinérea (Yildiz, F. , J . De Fitopatolog ía Turca ( 1991 ) 30, 1 1 -22) y también se identificó como un nuevo patógeno de insectos para una peste de lepidoptera de Ailanthus triphysa (Varma , R.V. , y otros, J . Of I nvertebrate pathology (1986), 47, 379-380). Sin embargo, no ha habido ningún reporte con respecto a ala actividad nematicida por esta bacteria.

II. EIP-N2 La cepa EIP-N2 se asiló de una mezcla de suelo estéril filtrado y 0.05% de harina de semilla de algodón (HSA) siguiendo un experimento entubo en el cual se plantaron las plántulas de tomate.

Diez d ías después , se homogeneizó el suelo en agua y se sembró una mezcla en placas de agar las cuales sirvieron como una fuente para aislamiento de la cepa EIP-N2. La cepa EI P-N2 mostró la similaridad de secuencia superior para las siguientes especies de Bacilos: B. medusa (99.3%) . B. cereus (99.3%); B. thuringiensis (99.3%); y B. mycoides (99.3%) .

Pruebas adicionales indicaron que EI P- N2 pertenece a la especie de B. cereus. III. Actividad enzimática Se determinaron actividades proteolíticas y colagenolíticas de EI P-N 1 y EI P-N2 (células vegetativas) comparado con otros microorganismos y los resultados se muestran en las Tablas I y I I , respectivamente. Se puede observar que las cepas de la invención tienen actividad significativamente superior que los otros microorganismos. Sin restringir la invención en ninguna manera , se piensa que las actividades proteolíticas y colagenolíticas juegan un papel importante en el control de nemátodos, ya sea por efecto directo en la cutícula del nemátodo, o i ndirectamente incrementando la liberación de amonio el cual se conoce que es tóxico para nemátodos debido a la descomposición de la proteína. Tabla I Actividad Proteolítica Tabla II Actividad Colagenolítica IV. Actividad Nematicida Las esporas EIP-N1 y EIP-N2 muestran una actividad bionematicida consistente y significativa contra nemátodos nodulares bajo condiciones de invernadero así como de microparcela. Los resultados de un gran número de experimentos en los cuales la actividad nematicida de EIP-N1 y EIP-N2 contra nemátodos Meloidogyne spp. determinados bajo condiciones de invernadero se resumen en la Fig. 1 y los resultados en microparcelas se resumen en la Figura 2. Los números en paréntesis en la Fig. 1 indican el número de ensayos promediados en los resultados, mientras que los resultados en la Fig. 2 son promedios de 5 experimentos. Las plantas enfermas se trataron con esporas no bacterianas (£2), EIP-N1 (ES)o EIP-N2 (H). Los siguientes suplementos se usaron en los experimentos: a)ninguno; b) gelatina, c) hidrolisato de gelatina: (d) gelatina + harina de semilla de algodón; e) hidrolisato de caseína; y f) Nemacur®. Cuando las esporas bacterianas solas (sin suplemento adicionado) se aplicaron a las plantas, hubo una reducción del 40- 50% en infestación de nemátodos nodulares comparado con el control en el cual no se adicionó ninguna bacteria, tanto en ensayos de invernadero como de microparcelas. Cuando se aplicaron a las plantas sin bacterias, los suplementos tales como gelatina (0.2% p/p) o una mezcla de gelatina y harina de semilla de algodón (HSA) a concentraciones de 0.05% y 0.25% , respectivamente, hubo una reducción de 30-40% en el índice de formación de agallas. Sin embargo, cuando se adicionaron tanto bacterias como suplementos, hubo un efecto intensificado de aditivo dando como resultado una disminución del 90- 100% y 70% en el índice de formación de agallas en los ensayos de invernadero y microparcelas, respectivamente. Los resultados similares se obtuvieron con hidrolisatos de gelatina y caseína. Otros suplementos, ya sea solos o en combinación , se pueden usar para incrementar la actividad nematicida de la bacteria . Estos incluyen granos vegetativos tales como ch ícharos, frijol y harinas de humus y extractos de fuentes animales tales como polvo de pumas, carne en polvo y otros hidrolisatos de proteína no costosos. Ejemplos de combinaciones de suplementos preferidos son material gelatinoso y HSA , o proteína de trigo y HSA, a concentraciones de 0.1 % a 0.25% , respectivamente. Las esporas formuladas en musgo de pantano o sílice antes de mezclarse con suelo de maceta en presencia o ausencia de suplemento mostró la misma actividad nematicida comparado con la técnica de aplicación regular descrita antes.

En general, las bacterias y los suplementos tuvieron un efecto positivo en el peso fresco superior de la planta de tomate. Cuando se usaron por separado, incrementaron el peso fresco superior por 50-100% comparado con el control. Sin embargo, cuando se usaron en combinación, las bacterias y suplemento dieron un incremento de 200-300%. V. Estabilidad Las cepas de EIP-N1 y EIP-N2 mostraron estabilidad a largo plazo superior con respecto a actividad nematicida sobre otras numerosas cepas, algunas de las cuales aparecen en las tablas I y II. Por ejemplo, la cepa 555TT al cual mostró alta actividad colagenolítica tuvo estabilidad pobre a RT o 4°C. En resumen, las cepas EIP-N1 y EIP-N2 se eligieron debido a su rendimiento superior en las tres categorías de actividad nematicida, actividad de enzima y estabilidad. VI. Composiciones nematicidas Una composición nematicida normal incluirá el ingrediente activo (esporas EIP-N1 o EIP-N2), un suplemento apropiado, un vehículo que es compatible con la actividad de las esporas así como a la planta que está siendo tratada y, preferiblemente, un agente tensoactivo. Ejemplos de suplementos que se pueden adicionar son 0.1% de Scanpro™ 210/F (material gelatinoso crudo) + 0.25% de HSA, o 0.1% de AMP™ 800 (proteína de trigo) 0.25% HSA. La composición se puede modificar de acuerdo con la técnica de aplicación mediante la cual será usada: 1) solicitud a través del sistema de irrigación ; 2) mezclar en el suelo de las plantas; 3) revestimiento de semillas. Se apreciará por personas expertas en la materia que la presente invención no se limita a lo que ha sido descrito, pero en su lugar el alcance de la presente invención se limita solo por las siguientes reividicaciones:

Claims (9)

1. REIVI N DICACIONES 1 . Una cepa de bacterias que tienen actividad nematicida, dicha cepa siendo un miembro seleccionado del grupo que consiste de EI P-N 1 (CNCM 1-1556) , EI P-N2 (CNCM 1-1562) y mutantes nematicidalmente activos de dichas EI P-N 1 y EI P-N2.
2. 2. Un cultivo puro de una cepa bacteriana, dicha cepa siendo un miembro seleccionado del grupo que consiste de EI P-N 1 (CNCM 1-1556), EI P-N2 (CNCM 1-1562) y una mutante nematicidalmente activa de dichas EI P-N 1 y EI P-N2.
3. 3. Una composición nematicida para usarse en protección de plantas comprendiendo como un ingrediente activo, una cantidad efectiva de bacterias o esporas de una cepa, dicha cepa siendo un miembro seleccionado del grupo que consiste de EIP-N 1 (CNCM I-1556), EI P-N2 (CNCM 1-1562) y mutante nematicidalmente activa de dichas EI P-N 1 y EI P-N2 y comprendiendo además un vehículo compatible con las bacterias o esporas.
4. 4. U na composición de acuerdo con la reivindicación 3, comprendiendo además un suplemento el cual mejora la actividad nematicida de las bacterias.
5. 5. U na composición de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho suplemento se selecciona del grupo que consiste de gelatina, hidrolisato de gelatina, material gelatinoso crudo, proteína de trigo, hidrolisato de caseína y harina de semilla de algodón .
6. 6. Un método para controlar nemátodos patogénicos de plantas, comprendiendo aplicar a dicha planta una cantidad nematicidalmente efectiva de bacterias o esporas de una cepa, dicha cepa siendo un miembro seleccionado del grupo que consiste de EI P-N 1 (CNCM 1-1556), EI P-N2 (CNCM 1-1562) y una mutante nematicidalmente activa de dicha EI P-N 1 y EI P-N2.
7. 7. Un método para controlar nemátodos patogénicos para plantas comprendiendo aplicar a dicha planta una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
8. 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, para controlar nemátodos que ocasionan la enfermedad nodular.
9. 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, para controlar nemátodos que pertenecen a la especie Meloidogyne.