MXPA97006501A - Deteccion de biomoleculas - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método para la detección de la presencia de un ribozima catalíticamente activa en un medio. La detección de la ribozima catalíticamente activa puede ser un objetivo por símismo o la ribozima puede servir como una molécula de la información para la presencia de otras biomoléculas en muestras ensayadas. La detección se lleva a cabo en un sistema catalítico, en el que la presencia de la ribozima activa sirve para producir la ribozima activa en una forma amplificadora de la retroalimentación positiva.

Description

DETECCIÓN DE BIO OLECULAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método y equipo para la detección de la presencia de ribozimas catalíticamente activas en un medio. El método y equipo de la invención pueden ser útiles de la estructura de un método y equipo para la detección de la presencia de bio oléculas específicas en una muestra de prueba. La detección de la presencia de biomoléculas específicas, tales como secuencias de ADN o ARN, proteínas, antígenos, anticuerpos, etc., en una muestra se requiere para una diversidad de propósitos experimentales, de diagnóstico y terapéuticos. Una multitud de ensayos están disponibles para la detección de biomoléculas proteinaseas tales como electrofotogramas en gel, CLAP, cromatografía de afinidad, así como también otros ensayos los cuales son realizados por el uso de una sonda marcada aproximadamente. Aunque tales ensayos son satisfactorios, donde la biomolécula proteinasea que va a detectarse está presente en cantidades suficientemente grandes, algunas veces no son lo suficientemente sensibles para permitir la detección de cantidades pequeñas de las biomoléculas. Las secuencias de ADN o ARN puede ser detectadas por el uso de una sonda marcada. Donde las secuencia de ADN o ARN va a ser detectadas se presentan solo en cantidades muy pequeñas, tienen que ser amplificadas por métodos tales como LCR (reacción en cadena de la ligasa) , SSR (replicación de 1-a secuencia autosostenida) o PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . Aunque los métodos de amplificación tales como PCR tienen un impacto extremadamente elevado sobre la búsqueda básica, lentos en transición al ambiente clínico. La razón principal para esto, es que el requisito para la automatización combinado con el ambiente clínico de las muestras, han producido procesos que son complejos, lentos y caros. La necesidad para enzimas proteicas con alta sensibilidad a factores ambientales necesita un medio ambiente muy controlado en el cual van a funcionar. Típicamente, una muestra clínica contiene muchos componentes que pueden interferir con la capacidad de la enzima para realizar su actividad catalítica. Además, los métodos estándar que son utilizados para la preparación de la muestra para liberar los ácidos nucleicos, tales como tiocinato de Guanidina o extracción con Fenol son inadecuados pata la actividad enzimática basada en la proteína y por lo tanto es necesario eliminar el ácido nucleico objetivo de la preparación de la muestra. Las ribozimas típicamente son moléculas de ARN que tienen actividades catalíticas similares a una enzima que usualmente son desdoblamiento, corte o ligazón de secuencias de ácido nucleico. El sustrato conocido para las ribozimas son moléculas de ARN, aunque también han habido algunas indicaciones de que las ribozimas pueden actuar sobre moléculas de ADN y sobre proteínas. Las ribozimas naturales las cuales participan en el trabajo de la reacción intracelular en cis, catalizan solamente una sola vez y usualmente son automodificadas durante la reacción. Sin embargo, las ribozimas pueden ser manipuladas por ingeniería genética para actuar en trans, en una forma verdaderamente catalítica, con un giro mayor que uno y sin ser automodificadas . Dos regiones distintivas pueden ser identificadas en una ribozima: la región de enlace, la cual da a la ribozima su especificidad por medio de hibridación a una secuencia de ácido nucleico específica (y posiblemente, también para proteínas específicas) , y una región catalítica la cual da a la ribozima la actividad de desdoblamiento, ligazón o corte. Cada clase de ribozimas desdobla una secuencia diferente de nucleótidos utilizando un mecanismo distinto de acción. Cada clase además se distingue por el número de bases de nucleótido que son esenciales para su actividad catalítica y por el grado de la especificidad de la ribozima y la secuencia objetivo (Robert H. Simons, Annual Rewiew o f Biochemistry, §1 , pp. 641-671, (1992)). Recientemente se ha propuesto utilizar las ribozimas para tratar enfermedades o desordenes genéticos por desdoblamiento de un ARN específico, tal como ARN viral o ARN mensajero transcrito de los genes que deben ser inactivados. Este método es propuesto como una alternativa para el bloqueo del ARN transcrito por el uso de las secuencias antisentido. Debido a la naturaleza catalítica de la ribozima, una sola molécula de ribozima desdobla muchas moléculas del ARN objetivo, y por lo tanto se logra la actividad terapéutica en concentraciones relativamente menores que aquellas requeridas en un tratamiento antisentido (WO 96/23569) . El uso de las ribozimas para propósitos de diagnóstico solamente mencionado rara vez. La WO 94/13833 describe un método para detectar moléculas de ácido nucleico en una solución por preparación de una molécula de ribozima específica que tiene dos regiones, una complementaria para la secuencia de ácido nucleico que va a ser detectado y la otra complementaria para una molécula co-objetivo que lleva una marca detectable. La ribozima es capaz de unirse específica y reversiblemente a ambas de una secuencia de ácido nucleico objetivo seleccionada y al co-objetivo marcado. Cuando ambos del objetivo y el co-objetivo están unidos, la ribozima soporta un cambio conformacional, el cual la vuelve activa y capaz de desdoblar la marca eliminándola del co-objetivo, y la marca libre entonces puede ser detectada. Por el desdoblamiento del co-objetivo, la ribozima es capaz de reasociarse con un co-objetivo adicional, desdoblando más marca y produciendo señales más detectables. Aunque los inventores de la WO 94/13833 llamaron a su invención "amplificación de señal " actualmente no hay amplificación en el número de ribozima producida, sino por el contrario la reacción es puramente una reacción enzimática, en la que la sustancia catalítica (en este caso la ribozima) desdobla el sustrato (en este caso el co-objetivo) y luego se disocia y desdobla otro sustrato. No hay una amplificación verdadera del número de ribozimas activas implicadas en la reacción que ocurre. Lo siguiente es un glosario de los términos los cuales son utilizados en la siguiente descripción y reivindicaciones. Sin embargo, este glosario no debe ser considerado separadamente y para la comprensión completa de los diversos términos y el significado en los cuales estos términos tienen el contexto de la invención, el glosario debe ser leído junto con el resto de la descripción de la presente. Ribozima - un molécula de ácido nucleico la cual posee actividad catalítica similar a la enzima. El término " ribozima" como se utiliza en la técnica, generalmente se refiere a moléculas de ARN que tiene actividad catalítica aunque en el contexto de la presente invención, ese término es utilizado para significar en general un oligonucleótido catalíticamente activo (similar a una enzima) . La ribozima de la invención -de esta forma puede ser una molécula de ARN, puede ser- un oligonucleótido, puede ser un oligonucleótido que comprende los dNTP o compuesto completamente de los dNTP y también puede comprenden una diversidad de nucleótidos que no se presentan naturalmente, tales como 5'-0-(l-tio-trifosfato) nucleositos de IsoC o IsoG y 5-0-metil nucleótidos. La ribozima, la cual puede utilizarse de acuerdo con la presente invención, puede estar formada exclusivamente de ácido nucleico como se describió en lo anterior o puede requerir un cofactor para su actividad catalítica. - Las ribozimas pueden tener una actividad catalítica de desdoblamiento, ligazón, corte eliminación por corte (eliminación) de la secuencia de oligonucleótido, además de grupos para los oligonucleótidos, el rearreglo de secuencias de ácido nucleico, etc. Biomoléculas ensayadas - una molécula, la presencia de la cual en la muestra de prueba va a ser detectada. Puede ser un oligonucleótido o un miembro de un par de reconocimiento tal como receptor/ligando, anticuerpo/ antígeno, lectina/glicoproteína, etc. Ribozima de iniciación - La ribozima, la cual inicia la reacción donde más ribozimas son producidas, llevando eventualmente a la generación de una marca detectable. Donde el método de la invención se utiliza para detectar biomoléculas, la ribozima de iniciación es parte del sistema de detección (véase lo siguiente) , y sirve como una molécula de información para la presencia de la biomolécula ensayada, ya que solamente en presencia de las biomoléculas ensayadas es ya sea generada o llega a ser catalíticamente activa. La presencia de una riboziraa de iniciación activa, activa al sistema catal ítica (véase lo siguiente) . Sistema de detección - la combinación de moléculas y reactivos que permiten la producción o activación de una ribozima de iniciación, catalíticamente activa la cual sirve como una molécula de información para la presencia de las biomoléculas ensayadas en la muestra de prueba. En otras palabras, en presencia de las biomoléculas ensayadas, siguiendo una reacción o una cascada de reacciones, una ribozima de iniciación catalíticamente activa es eventualmente generada. La presencia de la ribozima de iniciación se verifica en el sistema de catalítico (véase lo siguiente) , donde lleva a la generación de más ribozimas activas en una manera amplificadora (las ribozimas por si mismas o un producto de su actividad catalítica, por ejemplo una marca libre entonces es detectada en la etapa final del ensayo) . Ribozima inactiva - una ribozima catalíticamente activa potencial, la cual no puede ejercer su actividad catalítica, (desdoblamiento, corte, ligazón, etc.) hasta que ha sido modificada, o hasta que las condiciones en el medio no han sido corregidas para tal en el cual llega a ser activa. Activación - vuelve una ribozima inactiva catalíticamente activa por algún tipo de acción catalítica (desdoblamiento, corte, ligazón, adición de grupos, rearreglos) o por cambio de las condiciones externas (tales como adiciones de iones de magnesio) . Porción inhibidora - una porción, la cual puede aveces estar presente en la segunda molécula compleja (véase lo siguiente) y la cual, cuando está presente hace a la ribozima de iniciación inactiva. El efecto inhibidor de la porción inhibidora puede ser terminado por su modificación o eliminación de la molécula compleja. Molécula compleja - una molécula la cual forma parte del sistema de detección de acuerdo con una modalidad de la invención mencionada en la presente como la "modalidad de activación" . En un modo de llevar a cabo la modalidad de activación, una "primera molécula compleja" está siendo utilizada, la cual comprende un ribozima de iniciación, la cual es a priori , catalíticamente inactiva (por ejemplo, debido a la falta de iones magnesio en el medio) unida a una secuencia capaz de ser desdoblada por una ribozima de iniciación activa y que comprende una biomolécula de reconocimiento (véase lo siguiente) . En otro modo de llevar a cabo la modalidad de activación, una " segunda molécula compleja" está siendo utilizada, la cual comprende una ribozima de iniciación, la cual es a priori , catalíticamente inactiva y está unida a una secuencia capaz de ser desdoblada por una ribozima de iniciación activa y que comprende además una biomolécula de reconocimiento (véase los siguiente) . La segunda molécula compleja además comprende una porción inhibidora. Biomolécula de reconocimiento - una molécula capaz de reconocer específicamente y unirse a la biomolécula ensayada. Donde la biomolécula ensayada es una secuencia de oligonucleótidos, la biomolécula de reconocimiento es la secuencia complementaria. Donde la biomolécula ensayada es un miembro de un par de reconocimiento (tal como antígeno -anticuerpo) , la biomolécula de reconocimiento es el otro miembro del par. Primer oligonucleótido - un oligonucleótido, típicamente una molécula de ADN, la cual comprende un promotor funcional de doble cadena 3'-5': una secuencia de una sola cadena que codifica para una secuencia complementaria para la secuencia de las ribozimas de iniciación, una secuencia de una sola cadena idéntica (con los reemplazos U?T necesarios) con una secuencia de ARN capaz de ser desdoblada por la ribozima de iniciación catalíticamente activa y una secuencia de una sola cadena complementaria para la parte 5 ' de la secuencia de oligomicleótidos que va a ser detectada. Segundo oligonucleótido - un oligonucleótido, típicamente una molécula de ADN, la cual comprende de 3'?5': una sola cadena 3 ' -parte complementaria para la secuencia de oligonucleótidos que va a ser detectada y una plantilla de oligonucleótidoe de activación (véase lo siguiente) . Plantilla de oligonucleótidos de activación - una secuencia de oligonucleótido, la cual es parte del segundo oligonucleótido, el producto de la transcripción del cual es capaz de hibridar con el constructo promotor posterior (véase lo siguiente) . Secuencia de oligonucleótidos de activación - el producto de la transcripción de la plantilla de oligonucleótidos de activación, capaz de hibridar con el copstructo promotor posterior (véase lo siguiente) y después el promotor posterior ha sido terminado, puede llevar a la transcripción de una secuencia de oligonucleótidos a la cual está unida. Hebra de oligonucleótido que no es plantilla - el producto de la transcripción del híbrido de oligonucleótido obtenido por hibridación de la secuencia de ácido nucleico ensayado, el primer oligonucleótido y el segundo oligonucleótido, y el cual comprende de 3 '?5 ' : una secuencia de oligonucleótidos de activación, una secuencia complementaria para la biomolécula ensayada, una secuencia complementaria para una secuencia la cual puede ser desdoblada por la ribozima de iniciación y una secuencia complementaria. Constructo promotor posterior - una secuencia promotora de una sola cadena unida a una secuencia de una sola cadena capaz de hibridar con la secuencia de oligonucleótidos de activación. Después de hibridar con la secuencia de oligonucleótidos de activación, y por la acción de una ADN polimerasa adecuada, un promotor de doble cadena funcional se crea, el cual en presencia de un sistema de transcripción (véase lo siguiente) es capaz de producir el transcri to oligonucleótido final (véase lo siguiente) . Transcrito de oligonucleótido final - el producto de la transcripción de los híbridos del oligonucleótido obtenidos después de la hibridación del constructo promotor posterior, hebra de oligonucleótido que no es plantilla (después de que el promotor ha sido terminado por un ADN polimerasa adecuada a un promotor funcional de doble cadena) y que comprende de 5'?3': una secuencia de ribozima de' iniciación, una secuencia capaz de ser desdoblada por la ribozima de iniciación, una secuencia «que codifica para el complemento de la secuencia detectada sobre la biomolécula ensayada y una secuencia que codifica para el complemento de la plantilla oligonucleótido de activación. La ribozima de iniciación en el transcrito oligonucleótido final puede desdoblar su secuencia adyacente de esta forma liberándose a si mismo y produciendo una ribozima de iniciación totalmente activa, libre. Tercera secuencia de oligonucleótido - una secuencia de ácido nucleico complementaria para 5 ' -parte de la secuencia que va a ser detectada en la biomolécula ensayada. Tercera molécula compuesta - una molécula utilizada en la "modalidad de ensamble" de la invención y la cual comprende la tercera secuencia de oligonucleótidos unida a parte de la ribozima de iniciación. Opcionalmente también comprende una secuencia que se puede desdoblar por una ribozima de iniciación activa. Cuarta secuencia de oligonucleótidos - una secuencia de oligonucleótidos complementaria para 3 ' -parte de la secuencia que va a ser detectada en la biomolécula ensayada . Cuarta molécula compuesta - una molécula utilizada en la "modalidad de ensamble" de la invención, la cual comprende la cuarta secuencia de oligonucleótidos unida a parte de la ribozima de iniciación requerida para completar la parte presente en tercer compuesto para obtener una ribozima catalíticamente activa, completa. Opcionalmente, también comprende una secuencia que se puede desdoblar por una ribozima de iniciación activa. Sißtema catalítico - un ensamble de moléculas y mezclas de reacción, el cual en presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa produce una señal detectable. Este ensamble de moléculas comprende una combinación de moléculas compuestas que comprenden una ribozima, la cual es a priori inactiva. Por una modalidad, el sistema catalítico comprende reactivos y una combinación de una primera molécula compuesta y una segunda molécula compuesta (véase lo siguiente) , que comprende una primera y segunda ribozima (inactiva), respectivamente. La primera y segunda ribozimas son a priori inactivas y cualquiera o ambas pueden ser activadas por una ribozima de iniciación catalíticamente activa. La primera ribozima activa puede activar las segundas moléculas de ribozima inactivas y las segundas ribozimas activas pueden activar la primera ribozima inactiva, para provocar la amplificación del número de ribozimas activas en una forma de retroalimentación positiva. Alternativamente, la primera y segunda ribozimas pueden estar inmovilizada o espacialmente separadas entre sí y desdoblar de una o ambas por la ribozima de iniciación, que provoca su liberación al medio. Las ribozimas libres, liberadas pueden liberar a las segundas ribozimas inmovilizadas (por ejemplo por desdoblamiento) y las segundas ribozimas libres pueden, a su vez soltar y liberar a la primera ribozima, dando en esta forma un aumento para la reacción de autoamplificación en cascada, los cual rápidamente produce una amplificación en el número de ribozimas activas en una forma de retroalimentación positiva. El sistema catalítico también puede consistir de acuerdo con otra modalidad, solamente de una especia de moléculas compuestas, las cuales son inmovilizadas o espacialmente separadas entre sí en el recipiente de reacción o las cuales son a priori inactivas. Una ribozima de iniciación acti *va a la ribozima inactiva o libera a la ribozima de la molécula compuesta y activa o libera a las ribozimas, entonces actúa para activar respectivamente activar otras ribozimas inactivas o liberar otras ribozimas inmovilizadas, entonces dando un aumento para una reacción de autoamplificación en cascada, lo cual rápidamente produce una amplificación en el número de ribozimas activas en una forma de retroalimentación positiva. Como resultado de la activación de la ribozima o liberación, una señal detectable es producida, cuya señal es indicadora para la presencia de la ribozima de iniciación en el medio. Primera molécula compuesta - comprende una primera ribozima (véase los siguiente) , opcionalmente marcada, unida a la segunda secuencia de ácido nuclei co (véase lo siguiente) . Segunda molécula compuesta - comprende una segunda ribozima (véase lo siguiente) , opcionalmente marcada, unida a una primera secuencia de ácido nucleico (véase lo siguiente) . Primera secuencia de ácido nucleico - una secuencia de oligonucleótidos, la cual es parte de la segunda molécula compuesta y la cual es un objetivo para la actividad catalítica de la primera ribozima (véase lo siguiente) . Después de la actividad catalítica de la primera ribozima sobre la primera secuencia de ácido nucleico, la segunda ribozima (véase lo siguiente) es ya sea liberada en el medio o se vuelve catalíticamente activa. Segunda secuencia de ácido nucleico - una secuencia de oligonucleótido la cual es parte de la primera molécula compuesta y la cual es un objetivo para la actividad catalítica de la segunda ribozima (véase lo siguiente) . Después de la actividad catalítica de la segunda ribozima sobre la segunda secuencia de ácido nucleico, la primera ribozima (véase lo siguiente) es ya sea liberada dentro del medio o se vuelve catalíticamente activa. Primera ribozima - parte de la primera molécula compuesta - es capaz de desdoblar la primera secuencia de ácido nucleico y es idéntica en su actividad catalítica para la ribozima de iniciación. Es marcada opcionalmente.

Segunda ribozima - parte de la segunda molécula compuesta - es capaz de desdoblar la segunda secuencia de ácido nucleico y está marcada opcionalmente. Tercera ribozima - una ribozima, la cual forma parte del sistema catalítico de acuerdo con otra modalidad de la misma. Las terceras ribozimas son inicialmente activas. La ribozima de iniciación actúa para activar la tercera ribozima ejerciendo su actividad catalítica sobre ella (en una forma que se explica en lo siguiente) y la ribozima activada entonces puede actuar para activar otras terceras ribozimas en un sistema catalítico. Sistema de transcripción - ensamble del oligonucleótido, nucleótido, ARN polimerasa y reactivos, los cuales, en presencia de una plantilla de oligonucleótido lleva a la transcripción de un transcrito oligonucleótido. Cuarta ribozima - una ribozima la cual es parte del sistema catalítico de acuerdo con una modalidad de la misma y la cual una vez catalíticamente activa puede ligar dos partes de la quinta ribozima (véase lo siguiente) para producir una quinta ribozima catalíticamente activa. La cuarta ribozima está formada de por lo menos dos componentes, los cuales están inicialmente separados y los cuales son ligados juntos por la quinta ribozima (cuando está catalíticamente activa) . Después, tal ligazón, la cuarta ribozima se vuelve catalíticamente activa.

Quinta ribozima - una ribozima la cual es parte del sistema catalítico que comprende la cuarta ribozima y la cual una vez catalíticamente activa puede ligar juntas dos partes de la cuarta ribozima para producir una cuarta ribozima catalíticamente activa. La quinta ribozima está compuesta de por lo menos dos componentes, los cuales están inicialmente separados y los cuales son ligados juntos por la cuarta ribozima. Después de tal ligazón, la quinta ribozima llega a ser catalíticamente activa. Sexta ribozima - un ejemplo específico de la tercera ribozima, donde la ribozima inactiva lleva una secuencia de ácido nucleico extra, y es activada por desdoblamiento o eliminación por corte (es decir, eliminación) de la secuencia. Séptima ribozima - una ribozima en la que la secuencia de ácido nucleico ensayada completa una porción perdida esencial para su actividad catalítica y de esta forma una vez combinada con la secuencia ensayada se vuelve catalíticamente activa. La presente invención proporciona un método de amplificación - señal basada en la ribozima, el cual es relativamente sencillo de realizar, es rápido y barato. A diferencia hasta ahora de los métodos de detección amplificación disponibles, el método de la invención también es adecuado para una prueba de punto de cuidado (POC) .

Una ventaja del método de la invención está en que las ribozimas son activas bajo condiciones encontradas en el ambiente clínico, por ejemplo fluidos biológicos. Además como se mostrará en lo siguiente, el método de señal amplificación de acuerdo con la invención no requiere la observancia de condiciones específicas para asegurar la especificidad (observancia estricta de las condiciones es un deber en los métodos de señal - amplificación de la técnica anterior. Adicionalmente, las ribozimas son funcionales en varias mezclas de preparación de la muestra, por ejemplo tiocianato de Guanidina 1 M así como también en una preparación de fenol saturado, la cual usualmente inhibe la función de otros sistemas de detección - amplificación. Las ribozimas están formadas de secuencias de ácido nucleico y de esta forma las secuencias de ensayo y de sonda pueden estar incluidas en la molécula de ribozima. Además, es posible aumentar la especificidad del proceso de amplificación por ingeniería genética de la ribozima, de tal manera que la parte de secuencia ensayada por si misma sea requerida por la ribozima para ejercer su actividad catalítica. Una técnica muy poderosa, llamada en la técnica como "evolución in vi tro" ha sido aplicada exitosamente a las ribozimas para producir una ribozima con diversas actividades catalíticas y especificidades. Por tales técnicas, una vasta disposición de ribozimas potenciales son tamizadas para la actividad. Esas ribozimas que muestran actividad son purificadas por otras rondas de selección y después rondas repetidas solamente permanecen los candidatos más potentes. En las técnicas de amplificación tradicional, después de una elección de la enzima, el ambiente donde la enzima va a funcionar, es decir la muestra - comprende medio que va a ser modificado para permitir la actividad adecuada de la enzima. En el caso de las ribozimas > utilizando la evolución in vitro, es posible seleccionar una ribozima, la cual es altamente activa en un medio clínico (biológico) deseado por funcionamiento de la evolución in vi tro en un medio de selección, el cual es idéntico en su composición a la muestra clínica. La presente invención proporciona un método sensible para la detección de una ribozima catalíticamente activa (mencionada en la presente como " ribozima de iniciación" ) en un medio. La detección de la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa puede ser un objetivo por si mismo, aunque usualmente la ribozima de iniciación catalíticamente activa sirve como la molécula de información para la presencia de otras biomoléculae en la muestra de prueba. Una vez que un medio que comprende una ribozima de iniciación activa es introducido en un sistema catalizador de acuerdo con la invención, allí resulta una cascada de reacción catalítica, la cual da un aumento para una amplificación exponencial en el número de ribozimas activas. El- sistema catalítico comprende ribozimas las cuales son ya sea inactivas o separadas espacialmente entre sí, de tal manera que no puedan ejercer su actividad' catalítica; la ribozima de iniciación libera o activa las ribozimas del sistema catalítico, el cual a su vez libera o activa respectivamente, otras ribozimas del sistema. Las ribozimas ya sea que lleven una marca detectable o la actividad catalítica provoca la generación de una marca detectable, la cual entonces sirve como una indicación de la cascada catalítica la cual ocurrió en el sistema. De acuerdo con las modalidades de la presente invención, en las cuales las ribozimas están inmovilizadas inicialmente, la presencia de las ribozimas libres en el medio de reacción pueden servir como una señal detectable por si misma. De acuerdo con otra modalidad, cada ribozima activa se prepara para llevar o producir una marca detectable y entonces estas sirven como la señal detectable. De acuerdo con el método de la invención, hay muy poca señal falsa positiva, es decir nivel de ruido bajo; además ei método de la invención permite la detección de varias bio-noléculas en un solo sistep-a de ensaye. La presente invención de esta forma proporciona un método para detectar la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa en un medio, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un sistema catalítico que comprende (aa) ribózi as las cuales son a pri ori catalíticamente inactivas o confinadas espacialmente, de tal manera que no pueden ejercer su actividad catalítica sobre sus objetivos; el objetivo de las ribozimas es otra ribozima del sistema catalítico, su actividad catalítica sobre tales otras ribozimas provocando ya sea: (i) la activación de la ribozimas inactivas, (ii) liberación de las ribozimas confinadas espacialmente para permitir que alcancen sus objetivos; por lo menos algunas de las ribozimas del sistema catalítico que es un objetivo de la actividad catalítica de la ribozima de iniciación, la actividad catalítica de la ribozima de iniciación sobre alguna de las ribozimas que es aquella de (i) o (ii) anterior; y que comprende (ab) una marca detectable que tiene propiedades detectables, de tal manera que la actividad catalítica de la ribozima provoca un cambio en las propiedades detectables; (b) poner en contacto el medio cor- el sistema catalítico; (c) proporcionar las condiciones que permitan que la ribozima de iniciación catalíticamente activa y las ribozimas catalíticamente activas del sistema catalítico ejerzan su actividad catalítica por lo que la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa da un aumento para una cascada de reacción en la cual las ribozimas del sistema catalítico son activadas o liberadas dentro del medio; y (d) detectar las propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de una ribozima de iniciación activa en el medio. La utilidad principal del método de detección de la ribozima de la invención, está dentro de la estructura de un ensayo diseñado para detectar la presencia de una biomolécula, tal como: una secuencia de ácido nucleico específica, un miembro de un par de enlace tal como anticuerpo - antígeno, azúcar - lectina, etc., en una muestra biológica. Tal ensayo puede ser conceptualmente pensado que comprende dos componentes distintos (aunque estos componentes puede ser incluidos físicamente juntos en un solo recipiente de reacción) : un sistema de detección y un sistema catalítico. En tal ensayo, la presencia de la biomolécula ensayada lleva a la producción en una forma que es descrita adicionalmente en lo siguiente, de una ribozima de iniciación catalíticamente activa en el medio. La ribozima de iniciación catalíticamente activa entonces actúa como una moléculas de información en el sistema catalítico, produciendo, después de una cascada de reacción, la cual amplifica el número de ribozimas activas para la aparición de una marca detectable en el medio de reacción como generalmente se describe en lo anterior. La aparición de tal marca detectable en el medio del sistema catalítico de esta forma indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra biológica ensayada original . De acuerdo con la invención, se hace el uso nuevo de las ribozimas. En el sentido más generalizado, un sistema catalítico que comprende las ribozimas se utiliza para la detección de la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa en un medio ensayado. La detección de la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa en un medio ensayado, puede ser un objetivo por si mismo, por ejemplo en el proceso de preparación de las ribozimas por la evolución in vi tro. Además, de acuerdo con una modalidad preferida de la invención, la ribozima de iniciación catalíticamente activa sirve como una molécula de información para la presencia de una biomolécula ensayada (a parte de la ribozima de iniciación) en una muestra biológica ensayada. Las ribozimas utilizadas de acuerdo con la invención pueden ser formadas completamente de ARN. A la vez es posible reemplazar también algunos de los ribonucleótidos ("rNTP") en el ARN con desoxi nucleótidos ("dNTP") o algunos otros nucleótidos que se presentan en forma natural o en forma no natural tales como nucleositos de IsoG o IsoC 5 ' -0-(1-tiotrifosfato) y 5-0-metil nucleótidos. Tal reemplazo es a la vez deseado, por ejemplo para aumentar la estabilidad de la ribozima para la ARNasa las cuales están presentes en casi todas las muestras biológicas. Aunque esto específicamente no será mencionado cada vez, se entiende que el término " ribozima" significa nucleótidos catalíticos compuestos completamente de rNTP u oligonucleótidos catalíticos, en los que algunos de los rNTP han sido reemplazados por los dNTP u otros nucleótidos. La ribozima también puede ser compuesta completamente de ADN (Breaker et al , Chemistry and Biology, 1(4) :223-9, 1994) . Las ribozimas de la invención pueden consistir de secuencias de ácido nucleico como se describió en lo anterior, formando complejo con una molécula que no es ácido nucleico tal como una proteína, polipéptido, un ácido graso, un colorante, un antibiótico o un carbohidrato. La porción que pc es ácido nucleico que forma complejo con la ribozima puede servir como un co-factor para la actividad catalítica de la ribozima. En lo siguiente, se hará uso del término v oligsnucleótido" . Los oligonucleótidos pueden, dependiendo del contexto, ser un oligonucleótido de ADN (que consiste completamente de los dNTP) o un oligonucleótido ARN (que consiste completamente de rNTP) . Sin embargo, especialmente en el ;aso de los oligonucleótidos ARN es aveces deseable reemplazar algunos o todos de los rNTP con dNTP u otros nucleótidos que se presentan en forma natural y en forma no natural . La presente invención proporciona, en su sentido más amplio, un método para la detección de la presencia en un medio probado de una ribozima de iniciación catalíticamente activa.. Por " catalíticamente activa" se entiende que una ribozima es capaz de llevar a cabo una reacción catalítica, tal como desdoblamiento, corte, ligazón, adición de grupos específicos tales como fosfato a moléculas, rearreglo de secuencias de ácido nucleico y similares. El sistema catalítico de acuerdo con una modalidad para llevar a cabo la invención, comprende dos especies de ribozimas, las cuales son a priori inactivas, pero llegan a ser catalíticamente activas como resultado del ejercicio de la actividad catalítica sobre ella. Por ejemplo, cada ribozima puede tener un corte en una sola cadena o rompimiento en una porción esencial para su actividad y antes de la ligazón de este corte en una sola cadena o rompimiento de esta forma es requerido para su activación. El sistema catalítico en este caso comprende doe especies de ribozimas, cada especie a priori dividida en dos componentes y de esta forma inicialmente inactiva. Una ribozima activa de una especie es capaz de ligar los dos • componentes de la segunda especie de ribozima, de esta forma haciéndola activa y una ribozima activa de la segunda especie -de ribozima es capaz de ligar los dos componentes de la primera especie de ribozimas, por lo que la hace activa. Entonces, la activación procede por ligazón cruzada en una forma amplificadora de retroalimentación positiva. La primera ribozima activa de una especie, puede ser producida por la ribozima de iniciación la cual es un producto del sistema de detección, en una de dos rutas. De acuerdo con una ruta algunas de las ribozimas de la primera especie son a priori totalmente ensambladas pero no pueden ligar las partes de la segunda especie de ribozima, ya que están separadas espacialmente de ellas, por ejemplo, como un resultado de ser inmovilizadas por medio de una membrana porosa, etc. La ribozima de iniciación desdobla las moléculas de la primera especie de ribozimas inmovilizadas, totalmente ensambladas y libera la primera especie de ribozima luego liga la segunda especie de ribozima, la cual a su vez liga los miembros de la primera especie de la ribozima, las cuales no son a priori ensambladas, etc. De acuerdo con la segunda ruta, la ribozima de iniciación es por si misma una ribczima de ligazón, la cual liga de sus partes, por lo menos una especie de las dos ribozimas del sistema catalítico, de esta forma iniciando la ligazón cruzada, en cascada. En tal caso, no hay necesidad de separar espacialmente diversos miembros del sistema catalítico, hasta que la ribozima de iniciación sea introducida a la mezcla de reacción para que no pueda comenzar el proceso catalítico. Otro ejemplo son las ribozimas las cuales tienen una secuencia redundante, la cual hace a la ribozima inactiva y de esta forma necesita ser ya sea desdoblada o eliminada por corte para la activación de la ribozima. Otro ejemplo son las ribozimas las cuales requieren el rearreglo de la secuencia o adición de grupos específicos para la activación. Aún otro ejemplo son las ribozimas, las cuales requieren el corte de exón inverso, es decir adición de una secuencia interna a la ribozima. Una especie de ribozimas cuando están en la forma activa, puede activar ribozimas inactivas de la segunda especie y viceversa, ya que posee las propiedades catalíticas (ligazón, desdoblamiento, corte, rearreglo, etc.) requeridas para modificar la otra especie de ribozima de una forma inactiva a una forma activa. Las dos ribozimas pueden poseer potencialmente el mismo tipo de actividad catalítica (por ejemplo ambas son ribozimas de ligazón o ambas ribozimas de desdoblamiento, ezc . ) o pueden poseer diferentes tipos de actividades catalíticas.

Una o ambas especies de las ribozimas inactivas a priori es activada por una ribozima de iniciación catalíticamente activa. Antes de la introducción de la ribozima de iniciación al medio, el sistema catalítico es esencialmente silencio, ya que no se lleva a cabo actividad catalítica. En presencia de tal ribozima de iniciación, una cascada de amplificación de ribozima comienza, ya que cada ribozima activa genera a su vez más ribozimas activas en una forma de retroalimentación positiva. Las ribozimas activas producen una señal. La cual puede ser detectada en una forma como se describe en lo siguiente y tal señal es indicadora de la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa original en el medio. El sistema catalítico de acuerdo con otra modalidad para llevar a cabo la invención, comprende dos especies de moléculas compuestas, que comprenden cada una, una ribozima unida a una secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar. La ribozima en una especie de la molécula compuesta, es capaz de desdoblar la secuencia de ácido nucleico en la otra especie de moléculas compuestas, de tal manera que el desdoblamiento cruzado entre las dos especies de moléculas compuestas es, en un principio, posible aunque el autodesdoblamiento es evitado. Sin embargo, antes de la introducción de la ribozima de iniciación al medio, el desdoblamiento cruzado no resulta, ya que las dos especies de moléculas compuestas se construyen para evitar la interacción mutua entre ellas, aunque las ribozimas desdobladas - son capaces de interactuar con otras moléculas compuestas en el recipiente de prueba y además liberar ribozimas al medio en una forma de retroalimentación positiva. La prevención de la infracción mutua entonces puede hacerse, por ejemplo inmovilización de cada especie de moléculas compuestas a lados opuestos de los recipientes de prueba; por el enlace cada especie de la molécula compuesta a diferentes cuentas o diferentes partículas coloidales que tienen propiedades, por ejemplo tamaño u otras propiedades, por ejemplo la misma carga eléctrica (la cual repele las cuentas entre sí) , lo que evitará cualquier clase de interacción entre las moléculas unidas a una con moléculas unidas a otra; por el enlace de las moléculas compuestas a porciones que tienen la misma carga eléctrica, de tal manera que el rechazo eléctrico entre las porciones evitará cualquier interacción entre dos moléculas compuestas; por la colocación de especies de moléculas compuestas en lados opuestos de una membrana porosa, la cual no permite la permeación a través de ella de la molécula compuesta completa, sino permite el paso de la ribozima desdoblada libre. Una ribozima de iniciación catalíticamente activa, ya sea presente en el medio de prueba a priori , o producida como un resultado de la presencia de otra biomolécula en una muestra biológica (tal ribozima que es en este caso) { " una ribozima de información" ) es capaz de desdoblar ácido nucleico específico presente en una o ambas especies de las moléculas compuestas, de esta forma liberando la ribozima del sistema catalítico. Las ribozimas desdobladas son capaces de interactuar libremente en recipiente de reacción con las ribozimas de la otra especie de moléculas compuestas, las cuales a su vez, nuevamente pueden desdoblar las ribozimas de la primera especie de las moléculas compuestas creando así un desdoblamiento cruzado de "ping-pong" de las ribozimas. Tal desdoblamiento cruzado de las ribozimas actúa en una forma de retroalimentación positiva, provocando la amplificación sustancial de la reacción. Cualquiera o ambas especies de ribozimas, típicamente lleva marcas detectables. La detección de las marcas desdobladas, indica la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa en la mezcla de reacción. Donde la ribozima de iniciación es una ribozima de información, la detección de una marca libre indica la presencia de una biomolécula ensayada en la mezcla de reacción. El sistema catalítico puede consistir, de acuerdo con otra modalidad, solamente de una especie de ribozimas inactivas o una especie de moléculas compuestas que comprenden una ribozima y una secuencia de ácido nucleico desdoblado por la ribozima cuando se convierte en una forma libre o activa. En una forma análoga a aquella descrita en lo anterior, para una modalidad, cada molécula individual de la ribozima es inactiva hasta que la ribozima de iniciación catalíticamente activa es introducida al medio: por ejemplo, cada molécula inactiva está en la forma de un circulo cerrado el cual puede ser abierto por desdoblamiento o eliminación por corte de un fragmento de nucleótidos, por una ribozima de iniciación catalíticamente activa. Las ribozimas activadas (abiertas) entonces abren y activan otras de tales moléculas en circulo cerrado del sistema catalítico. En una forma análoga a aquella descrita en lo anterior para otra segunda modalidad, cada especie individual de la molécula compuesta puede comprender una ribozima colocada en una orientación, la cual evita el autodesdoblamiento de la secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar adyacente, por ejemplo, por colocación de la secuencia inmediatamente adyacente a la ribozima. El hecho de que no haya secuencias de intervención entre la ribozima y la secuencia que se puede desdoblar inhibe estéricamente el desdoblamiento cis . (La secuencia que se puede desdoblar también puede tener una orientación inversa y el desdcblamientc cis de esta forma no será posible- - Sin embargo, la ribozima liberada puede alcanzar la secuencia de ácido nucleico en una orientación correcta y desdoblarlo, per lo que libera más ribozima al medio. Para evitar el desdoblamiento trans espontáneo de las ribozimas no liberadas, es posible asegurar la separación espacial similarmente como se indicó en lo anterior. La detección de la presencia de las ribozimas activas en el sistema catalítico puede tomar varias formas dependiendo del tipo de actividad catalítica de la ribozima. Donde, por ejemplo, la actividad es desdoblada o eliminada por corte, una marca puede ser unida a la parte que va a ser desdoblada o eliminada por corte y la detección de tal marca liberada entonces es una indicación de la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa en el medio. En algunos casos la activación de la ribozima lleva a un cambio en la distancia entre dos regiones de la ribozima, tal como donde dos regiones distantes se llevan juntas por ligazón o rearreglo, por eliminación por corte de una región de interferencia, o donde dos regiones inicialmente adyacentes están separadas, por ejemplo por abertura de un circulo cerrado. En tal caso, es posible unir un marcador fluorescente sobre una región de la ribozima y una porción, tal como Rodamina la cual detiene la emisión de luz del marcador fluorescente sobre la otra región de la ribozima. La Rodamina tiene un efecto de detención sobre la emisión de luz de una marca fluorescente, cuando las dos están adyacentes y sin tal efecto cuando las dos están separadas. Para monitorear el cambio en la emisión de luz de la marca fluorescente, es posible determinar si dos regiones que están adyacentes (por ejemplo en el caso de una ribozima inactiva de circulo cerrado) o separadas (cuando la ribozima ha sido abierta y activada) . La marca también puede llevarse sobre un sustrato, el cual no está asociado con la ribozima y sobre el cual la ribozima catalíticamente activa puede ejercer su actividad catalítica. Por ejemplo, la marca puede ser llevada sobre una secuencia de ácido nucleico, el cual es desdoblado o eliminado por corte como un resultado de una actividad de la ribozima, por lo que la marca es liberada al medio. La detección en tal caso se basará en la presencia de una marca libre en el medio. La activación cruzada "ping-pong" , ya sea por desdoblamiento cruzado, ligazón cruzada, corte cruzado, rearreglo transversal o ciclos alternantes de varias acciones catalíticas, amplifica sustancialmente la reacción resultando en una señal que indica en un tiempo corto, si la ribozima catalíticamente activa de iniciación estuvo presente en el medio. Aunque los métodos de amplificación - detección de la técnica anterior tales como PCR o LCR requieren varias horas para completarse, el método de amplificación - detección de la invención se completa en un periodo de tiempo mucho más corto.

Donde la ribozima de iniciación catalíticamente activa, sirve como una- ribozima de información para la presencia de otras biomoléculas, un sistema de detección es requerido, en el cual una ribozima de iniciación catalíticamente activa es generada solamente en presencia de la biomolécula ensayada. Esto puede ser realizado en una de las siguientes modalidades, mencionadas en la presente, como la "modalidad de activación" , la "modalidad de transcripción" , la "modalidad de ensamble" y la "modalidad de termino" . De acuerdo con la modalidad de activación, la ribozima de iniciación (de información) es inactiva a priori . esta inactividad puede ser un resultado de la ausencia de iones magnesio, los cuales son requeridos parta la actividad catalítica de la ribozima del medio; puede ser un resultado de la presencia de una porción inhibidora en el medio; puede ser un resultado de la presencia en el medio de un oligonucleótido, el cual híbrida a la secuencia la cual va a ser desdoblada ya sea para activar o liberar la ribozima en el sistema, cuyo desdoblamiento no es posible mientras que la secuencia sea de doble cadena; etc. De acuerdo con está modalidad, la ribozima está unida a una biomolécula de reconocimiento, la cual es capaz de reconocer específicamente y unir a la biomolécula, la cual va a ser ensayada en la muestra. Por ejemplo, donde la biomolécula ensayada es una secuencia de oligonucleótidos, la . biomolécula de reconocimiento es la secuencia complementaria; donde la biomolécula ensayada es una enzima, la biomolécula de reconocimiento puede ser un sustrato; donde la biomolécula ensayada es un antígeno, la biomolécula de reconocimiento puede ser un anticuerpo el cual interactúa específicamente con el antígeno; etc. La ribozima unida a la molécula de reconocimiento entonces se deja interactuar con la biomolécula ensayada y las ribozimas sin unir entonces son separadas y lavadas separándolas. Tal separación puede llevarse a cabo en base de la diferencia de tamaño entre el complejo de ribozimas unido y las biomoléculas ensayadas y aquella de las ribozimas libres; por, a priori , inmovilización las biomoléculas ensayadas y luego separadas por lavado las moléculas libres de las ribozimas; etc. Después de la separación, las condiciones se cambian para activar la ribozima, por ejemplo, por adición de la falta de iones magnesio; por modificación o eliminación de la porción inhibidora para detener su actividad inhibidora; por fusión de la secuencia que no se puede desdoblar de doble cadena a una cadena que se puede desdoblar de una sola cadena; etc. Solamente si la biomolécula ensayada está presente, las ribozimas, las cuales están unida a ella son retenidas y solamente estas ribozimas retenidas son activadas por un cambio apropiado de las condiciones. La modalidad de transcripción de la invención puede ser utilizada donde la biomolécula ensayada es una secuencia de ácido nucleico. La fase de detección de esta modalidad puede ser llevada a cabo generalmente como se describe en la Solicitudes de Patente de Israel Nos. 105894 y 111857 (y sus contrapartes solicitudes PCT Nos. WO 94/29481 y ) con el " oligonucleótido de activación" que es la ribozima de iniciación. El sistema de detección de esta modalidad comprende dos moléculas de oligonucleótidos, la primera comprende una secuencia complementaria a la 5 ' - parte de la secuencia de ácido nucleico ensayada y la segunda comprende una secuencia complementaria a la 3 ' -parte de la secuencia de ácido nucleico ensayada. La primera molécula de oligonucleótido comprende hacia el extremo 5' desde la secuencia complementaria a la biomolécula ensayada, una secuencia que codifica para una secuencia de ribozima de iniciación y una secuencia que es capaz de ser desdoblada por la ribozima de detección (también, esencialmente una secuencia de ADN) . La segunda molécula de oligonucleótido comprende, hacia el extremo 3' de la 3'- parte de la secuencia ensayada complementaria, una plantilla de oligonucleótido de activación, el producto transcripcional del cual es capaz de activar la transcripción de la secuencia de las ribozimas de iniciación como se explicará en detalle en lo siguiente. Si la biomolécula ensayada, no está presente en la muestra de prueba, entonces la secuencia de oligonucleótido de activación no es transcrita, ya que solamente la presencia de 'la biomolécula ensayada lleva juntas las dos moléculas requeridas para producir la plantilla apropiada de la secuencia de oligonucleótido de activación: a saber, la primera molécula de oligonucleótido que lleva el promotor funcional y la segunda molécula de oligonucleótido que lleva la plantilla de oligonucleótido de activación. Si las biomoléculas ensayadas están presentes, y en presencia del sistema de transcripción, la secuencia de activación es producida, y a su vez es capaz de llevar a la producción de transcritos que contienen la ribozima de iniciación unida a una secuencia capaz de ser desdoblada por ella. Después del autodesdoblamiento, estos transcritos se liberan al medio de la ribozima de iniciación catalíticamente activa. De acuerdo con ía modalidad de ensamble de la invención, también apropiado en los casos donde la biomolécula ensayada es una secuencia de ácido nucleico, el sistema de detección comprende un tercer oligonucleótido, que comprende una secuencia complementaria para ia porción 5 ' - de la eecuencia de ácido nucleico ensayado y un cuarto oligonucledtido que comprende una secuencia complementaria para el resto, la porción 3' de la secuencia de ácido nucleico ensayado. Cada uno de estos oligonucleótidos comprende también una porción (por ejemplo la mitad) de una ribozima y ambas partes juntas constituyen una ribozima completa, funcionalmente activa. De acuerdo con esta modalidad, la función de la secuencia de ácido nucleico ensayada es la de llevar estos dos oligonucleótidos juntos, produciendo así una ribozima de iniciación funcionalmente activa. De esta forma, en la presencia de una secuencia de ácido nucleico ensayada en la muestra, la ribozima de iniciación funcional será generada la cual entonces podría ser detectada en el sistema catalítico de la invención. De acuerdo con la modalidad de termino de la invención, el sistema de detección comprende un séptimo oligonucleótido y la secuencia ensayada, complejos con el séptimo oligonucleótido para producir una ribozima de iniciación catalíticamente activa. Por ejemplo, la secuencia ensayada puede formar parte del núcleo catalítico de la ribozima. De esta forma, de acuerdo con esta modalidad, la ribozima es a priori incompleta y solamente en la presencia de la secuencia ensayada se vuelve una ribozima catalíticamente activa, completa la cual entonces puede ser detectada en el eistema catalítico. La secuencia ensayada puede completar la ribozima por hibridación en su extremo 31 a una secuencia en un lado de la porción que pierde la ribozima y por hibridación a su extremo 5 ' a una secuencia sobre el otro lado de la porción que pierde la. ribozima, de esta forma formando un puente la porción que se pierde y creando una ribozima de iniciación funcional . La secuencia ensayada también puede ser capaz de completar la porción que pierde la ribozima por "corte del exón inverso" , en el que la secuencia ensayada es insertada dentro de la ribozima por medio de reacción de ligazón y desdoblamiento adecuadas. El "corte del exón inverso" puede llevarse a cabo por otras ribozimas presentes en el medio. Para disminuir el nivel de " ruido" del método de la invención y disminuir resultados falsos positivos, es posible combinar dos o más modalidades de la invención para asegurar doblemente que ninguna de las ribozimas de iniciación catalíticamente activa son producidas en ausencia de las biomoléculas ensayadas. Por ejemplo, es posible combinar las modalidades de montaje y activación de la invención por el que las ribozimas catalíticamente activas serán generadas solamente como resultado de dos condiciones acumulativas: ensamble de una ribozima completa a partir de sus dos partes en una mezcla sin magnesio y después eliminar por lavad: las ribozimas incompletas, activación de la ribozima completa por la adición de iones magnesio. La ribozima utilizada en la mayoría de las modalidades del sistema de detección de la invención, son en la mayoría de los casos universales, es decir la misma ribozima puede ser utilizada para detectar diferentes biomoléculas ensayadas, ya que la especificidad es adquirida por la biomolécula de reconocimiento unida (en la modalidad de activación) , o por la primera y segunda moléculas de oligonucleótido (en la modalidad de la transcripción) o por tercera y cuarta secuencias de oligonucleótidos (en la modalidad de ensamble) . El quinto oligonucleótido en el caso d'e la modalidad de término de la invención, tiene que hacerse a la medida para cada ácido nucleico específico que va a ser ensayado, ya que la secuencia que reconoce a la secuencia ensayada es parte de la misma ribozima. La presente invención también proporciona reactivos requeridos para llevar a cabo el método anterior así como también un equipo que comprende los reactivos. En lo siguiente, la invención será descrita con referencia a algunos dibujos no limitantes y ejemplos: Línea recta ( ) - cadena de ADN Línea ondulada ( "X^N^- ^"^) - cadena de ARN A, B, C, etc. .. - secuencia en la cadena de codificación de un ADN A', B1, C , etc. .. - secuencia en la cadena de ADN sin codificación, complementaria . a, b, c, etc. .. - - secuencias de ARN a1, b', c1, etc. .. - secuencia de ARN complementaria para a,b,c inmovilización sobre un soporte sólido * marca detectable porción inhibidora BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura muestra una modalidad del sistema catalítico de la invención, que comprende dos especies de moléculas compuestas activadas por desdoblamiento cruzado; la Figura 2 (a) y 2 (b) muestra un sistema catalítico de acuerdo con una modalidad de la invención, que comprende una especie de molécula compuesta activada por desdoblamiento cruzado o corte cruzado: en el que la ribozima está en la forma de un circulo cerrado (Figura 2 (a) ) ; en el que la ribozima requiere del corte para volverse activa (Figura 2(b)) . la Figura 3 muestra varias formas en las cuales la molécula compuesta puede ser separada entre sí: por inmovilización a distintos sitios del recipiente de reacción (3A) ; por enlace a cuentas grandes (3B) ; por enlace a porciones cargadas (3C) ; y por colocación de cada especie de moléculas compuestas en lados opuestos de una membrana porosa; la Figura 4 muestra un ejemplo del sistema de detección de acuerdo con la modalidad de activación de la invención, en la que la ribozima es activada por la adición de iones magnesio; la Figura 5 muestra otro ejemplo del sistema de detección de acuerdo con la modalidad de activación de la invención, en la que la ribozima es activada por modificación de una porción inhibidora; la Figura 6 muestra un sistema de detección de acuerdo con la modalidad de transcripción de la invención; la Figura 7 (a) y 7 (b) muestran un sistema de detección de acuerdo con la modalidad de ensamble o montaje de la invención; en la que la secuencia de reconocimiento de la ribozima híbrida a la secuencia de ácido nucleico ensayada t (Figura 7 (a) ; o donde el tallo-II abierto de la ribozima híbrida con la secuencia ensayada (Figura (b) ) ,- la Figura 8 muestra un ejemplo del sistema catalítico de la invención, que comprende dos especies de ribozimas activada por ligazón cruzada; la Figura 9 muestra aún otro ejemplo del sietema de detección de acuerdo con la modalidad de activación de la invención, en la que la ribozima es activada haciéndola una secuencia de una sola cadena que se puede desdoblar.

La Figura 10 muestra los resultados del desdoblamiento de un sistema de detección, que comprende el tallo-II abierto de la ribozima de la Figura 7 (b) ; la Figura 11 muestra los resultados del desdoblamiento de un sistema catalítico que comprende la molécula compuesta de un circulo cerrado de la Figura 2 (b) ; y la Figura 12 muestra los resultados del desdoblamiento de la ribozima en la presencia de sangre sin tratar y agentes desnaturalizantes. Sistema Catalítico Primero se hace referencia a la Figura 1 que muestra una forma de construir el sistema catalítico de la invención. El sistema catalítico comprende dos especies de moléculas compuestas 10 y 11. La molécula compuesta 10 comprende un tipo de ribozima marcada, la cual será llamada ribozima A (12) unida a una secuencia de ARN llamado b (13) . La molécula compuesta 11 comprende otro tipo de ribozimas marcadas, las cuales serán llamadas ribozima B (14) y una secuencia de ARN a (15) . La ribozima B en la molécula 11 es capaz de desdoblar la secuencia b en la molécula 10 y la ribozima A en la molécula 10 es capaz de desdoblar la secuencia a en la molécula 11. Las moléculas 10 y 11 inicialmente no son capaces de interactuar, ya que cada una esta inmovilizada a un sitio distinto del recipiente de reacción. La ribozima de iniciación 16 también es capaz de desdoblar la secuencia b en la molécula 10. Si la ribozima de iniciación está presente en la mezcla de reacción, entonces la secuencia b es desdoblada liberando a la ribozima A libre (12) para la mezcla de reacción. La ribozima A (12) libre es capaz de difundirse dentro del recipiente de reacción para desdoblar la molécula 11, liberando de esta forma para la mezcla de reacción la ribozima libre B (14) . La ribozima libre B (14) nuevamente es capaz de migrar a través del recipiente de reacción para desdoblar la molécula 10 para liberar nuevamente la ribozima A (12) libre y el ciclo se repetitivo una y otra vez en una forma de retroalimentación positiva. Ya que ambas de las ribozimas A y B están marcadas, la detección de cualquiera o ambas en el sobrenadante indica la presencia de la ribozima de iniciación 16 en la mezcla de reacción. Los siguiente es un ejemplo de la molécula 10 que comprende una ribozima Í2 del tipo de cabeza de martillo unida a la secuencia 13, la cual entonces es marcada en el extremo 3' por biotina: (letras Mayúsculas: 2 ' -0-metilada; letráe minúeculae: ARN) 'CCA cugauga gGCC GAAA GGCc gaa acGUguc CGU AAA- Los siguiente es un ejemplo de la molécula 11 que comprende otras ribozima 14 del tipo de cabeza de martillo, la cual es capaz de desdoblar la secuencia 13 presente en la molécula 10. La ribozima 14 está unida a la secuencia 15 capaz de ser desdoblada por la ribozima 12 de la molécula, la cual entonces es marcada en su extremo 3' por biotina: (letras Mayúsculas: 2 ' -0-metilada; letras minúsculas: ARN) '~GAG ACG cugauga gGCC G AA GGCc gaa acAC guc UGG AAA Aunque las ribozimas A y B son mencionadas como ribozimas diferentes y las secuencias A y b son mencionadas como secuencias diferentes, ambas de las ribozimas y las secuencias pueden ser realmente idénticas. En tal caso el autodesdoblamiento en cada molécula 10 u 11 es evitado por el enlace de la ribozima a su secuencia anexa en tal proximidad, la cual no permite el desdoblamiento en cis, aunque las ribozimas libres sean capaces de doblar moléculas compuestas en tras. Esto puede haceree por el enlace de la ribozima inmediatamente adyacente a la secuencia potencialmente desdoblable. Esto es debido a que la ribozima debe estar separada de su secuencia potencialmente desdoblable por varios nucleótidos para que se lleve a cabo el desdoblamiento eficiente. Por lo tanto, cuando la ribozima en la molécula compuesta está unida directamente sin separación a la secuencia desdoblable, no hay posibilidad del desdoblamiento cis y la secuencia puede ser desdoblada solamente en trans, aunque permite solamente el desdoblamiento en trans . Ahora se hace referencia a la Figura 2 (a) la cual muestra otra alternativa, donde solamente una especie de moléculas compuestas está presente en el recipiente de reacción. El sistema catalítico comprende una sola especie de moléculas 17' que comprenden cada una ribozima C (18') y una secuencia que se puede desdoblar C (19') la molécula 17' está en la forma de un circulo cerrado y de esta forma la ribozima 18' es inicialmente inactiva. Si la ribozima de iniciación catalíticamente activa 16" está presente en los medios, es capaz de desdoblar la secuencia c' y abrir la ribozima para que llegue hacer activa. La ribozima abierta 18' a su vez puede abrir, por desdoblamiento, moléculas compuestas 17' adicionales volviéndolas activas. La detección puede llevarse a cabo utilizando una marca fluorescente (F) y Rodamina (Rd) cuando las dos están adyacentes como en las moléculas cerradas, la emisión de luz de la marca fluorescente es detenida y cuando están separadas, como en la secuencia de molécula abierta, la emisión de luz de la marca fluorescente llega a ser más fuerte . Ahora se hace referencia a la Figura 2 (b) la cual muestra aún otra alternativa para el sistema catalítico que comprende solamente una sola especie de molécula compuesta. La ribozima 17" tiene en su región de núcleo una secuencia de nucleótido extra 18", la cual hace a la ribozima inactiva. En la terminal de la secuencia extra hay un grupo de bloqueo 19, el cual no permite la ligazón espontánea del extremo abierto. La ribozima de iniciación 16, la cual tiene la actividad catalítica de corte es capaz de ambos desdoblar eliminando la secuencia extra 18 y bloqueando el grupo 19 y después ligando los extremos libres para dar una ribozima funcional. La ribozima funcional entonces es capaz de cortar otras ribozimas en el medio de reacción, provocando una amplificación de la reacción. La detección de acuerdo con una opción (Opción 1) se lleva a cabo esencialmente como se describió en la Figura 2 (a) , pero en este caso inicialmente la Rodaminas (Rd) en el grupo fluorescente (F) están separadas y solamente por la activación de la ribozima llegan a estar adyacentes, de tal manera que la ribozima activa es detectada por detención de la emisión de luz. De acuerdo con el segundo modo de detección (Opción 2) el grupo eliminado por corte comprende la secuencia extra libre 18 y el grupo de bloqueo 19 lleva una marca detectable. Las ventajas dei modo de la Figura 2 (b) reside en un nivel de " ruido" muy bajo, ya que para una ribozima inactiva que de vuelve espontáneamente activa (no en presencia de una ribozima de iniciación) dos presentaciones espontáneas deben suceder y desdoblamiento espontáneo (o una probabilidad de 10"6/min en MgCl 10 mM a pH fisiológico y a una temperatura de 37°C) y la ligazón espontánea (a una probabilidad de 107/min) dando una probabilidad muy baja para la activación espontánea (1913/min) . La marca unida a cualquiera o ambas ribozima A, B, o C (Figura 1) puede ser cualquier marca detectable conocida en la técnica tal como un radioisótopo, una marca fluorescente, una enzima la cual en presencia de un sustrato es capaz de producir una reacción de color, etc. La Figura 3 muestra varias formas en las cuales las dos moléculas compuestas 10 y 11 de la primera modalidad son colocadas para evitar la interacción mutua, pero permiten la interacción entre las ribozimas libres 12 y 14 y las moléculas compuestas. Debe entenderse que los mismos principios también se aplican a la forma para construir el sistema catalítico de la invención, es decir donde solamente una especie de molécula compuesta está presente, representada en la Figura 2. En la Figura 3 (A) las moléculas 10 y 11 están inmovilizadas sobre sitios distintos y separados del recipiente de reacción 18, mientras que las ribozimas 12 y 14 ee difunden libremente en la mezcla de reacción. La Figura 3 (B) muestra moléculas 10 y 11 las cuales hetmán inmovilizadas sobre las cuentas 19, el tamaño de las cuales evita la interacción entre las moléculas. Sin embargo, la ribo-zi a libre 12 y 14 son capaces de difundirse libremente en la mezcla de reacción e interactuar con las moléculas inmovilizadas, compuestas. La Figura 3 (C) muestra otro ejemplo de separación de las moléculas compuestas, en el que las moléculas compuestas 10 y 11 están unidas a porciones cargadas que llevan la misma carga 37. El rechazo eléctrico entre sus porciones unidas elimina la posibilidad de interacción entre las moléculas 10 y 11. Sin embargo, la ribozima libre 12 y 14 las cuales están esencialmente sin carga son capaces de interactuar con la molécula compuesta. La Figura 3 (D) muestra aún otro ejemplo de separar las moléculas compuestas 10 y 11 colocándolas en extremos opuestos de una membrana porosa 34, la cual sirve como un tamiz, bloqueando el paso de moléculas grandes 10 y 11 mientras que permite el paso de las ribozimas 12 y 14 libres, más pequeñas .

Otra forma para asegurar que las dos moléculas compuestas 10 y 11 no interactúan es por el uso de moléculas bloqueadoras, las cuales son complementarias para una secuencia específica haciéndola de doble cadena. De acuerdo con esta forma, las moléculas compuestas 10 comprenden una molécula bloqueadora, la cual hace a la secuencia b que se pueda desdoblar y parte de la región catalítica de la ribozima A de doble cadena. En la molécula compuesta 10 parcialmente de doble cadena, la ribozima no es activa debido al hecho de su región catalítica es de doble cadena. La molécula compuesta 11 es bloqueada en una forma similar. Si la ribozima de iniciación está presente en la mezcla de reacción, desplaza una parte de la molécula bloqueadora presente sobre la molécula presente 10 y entonces la molécula de iniciación es capaz de desdoblar la secuencia b. Una vez que la secuencia b es la ribozima A desdoblada también se hace activa, ya que la molécula bloqueadora desplaza parcialmente cae completamente fuera de la molécula compuesta 10 girando su región catalítica para que llegue a ser de una sola cadena y activa, la ribozima activa A entonces desplaza a la molécula bloqueadora de la molécula compuesta 11 en una forma similar como se describió en lo anterior, desdoblando la secuencia a que se puede desdoblar, girando la ribozima B de una sola cadena y activa. La ribozima B entonces activa a la molécula compuesta 10 en una forma similar para la activación de la ribozima de iniciación descrita en lo anterior, una activación cruzada de las dos moléculas compuestas entonces puede proceder. Ahora se hace referencia a la Figura 8, la cual muestra otra alternativa para construir el sistema catalítico de la invencidn. El sistema catalítico comprende dos especiee de ribozimas 80 y 81, las cuales son activas cuando se ensamblan completamente pero son inactivas cuando se separan en sus partes 80a, 80b y. 81a, 81b, .respectivamente. La ribozima 80 completa es capaz de ligar las partes 81a y 81b de la ribozima para producir una ribozima 81 completa y activa. La ribozima 81 completa es capaz de ligar las partes 80a y 80b de la ribozima para producir una ribozima 80 completa y activa, de tal manera que procede la activación cruzada por la ligazón cruzada. La ribozima de iniciación 86 y 86 ' es capaz de crear una ribozima 80 completa y activa por desdoblamiento de una ribozima inmovilizada pero completa de una ubicación, en la que está separada especialmente de las partes 81a y 81b de la ribozima, por ejemplo, en una de las formas especificadas en la Figura 3 (Figura 8 izquierda superior) o siendo capaz de ligar las partes 80a y 80b para formar la ribozima 80 completa y activa (Figura 8 derecha superior) . SISTEMA DE DETECCIÓN Donde el método de la invención va a ser utilizado para ayudar en la detección de biomoléculas a parte de las ribozimas, la invención incluye también un sistema de detección capaz de producir la ribozima de iniciación catalíticamente activa solamente en presencia de la molécula ensayada .

La Figura 4 muestra un ejemplo de la modalidad de activación de la invención. En este ejemplo, la biomolécula ensayada es una secuencia de ácido nucleico A inmovilizada (41) por ejemplo una secuencia de ADN. La inmovilización puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, con la ayuda de agentes de enlace cruzado o por atrapamiento de las moléculas de ácido nucleico ensayadas entre dos membranas porosas las cuales permiten el paso de moléculas más pequeñas. Donde la biomolécula ensayada es una proteína, puede ser inmovilizada sobre cuentas que llevan los agentes de atrapamiento apropiados, tales como anticuerpos inmovilizados adecuadamente, dirigidos contra regiones las cuales no son requeridas para la detección, etc. Alternativamente, la biomolécula ensayada puede ser inmovilizada sobre una hoja de nitrocelulosa y otra proteína tal como albúmina, entonces debe aplicarse sobre la hoja de nitrocelulosa para saturar todas las indicaciones vacías de las hojas y evitar, en la siguiente etapa, la absorción no específica. El sistema de detección también comprende la primera molécula compleja 42 que comprende la ribozima 43, unida a la secuencia c' desdoblable (44) capaz de ser desdoblada por la ribozima activa y además comprende la secuencia a (45) complementaria para la secuencia A ensayada (41) . La ribozima 43 no se autodesdobla, ya que la molécula 42 es mantenida en una mezcla de reacción sin magnesio, lo cual elimina la actividad catalítica de las ribozimas. Esto puede hacerse, por ejemplo manteniendo la molécula compleja 42 en una mezcla de reacción que contiene EDTA sin magnesio. Un ejemplo de la ribozima 43 unida a la secuencia de desdoblamiento c' (44) del tipo de cabeza de martillo (letras Mayúsculas: 2 ' -0-metilado; letras minúsculas: ARN; sobre- y subrayado: ADN) '-GCAACAGTGGAGGAAAGCC UACguc UGG UACGU CCA cugauga gGCC GAAA GGCc gaa acGUAGU AAA Las moléculas 41 y 42 se dejan hibridar para dar el híbrido inmovilizado 46. Las moléculas libres 42 son lavadas separándolas y para el híbrido inmovilizado 46 se agregan iones magnesio en una concentración suficiente para activar a las ribozimas. En la presencia de tal concentración de ribozimas 43- de magnesio se ha capaz de desdoblar la secuencia c1, de esta forma liberando por sí misma a la mezcla de reacción, mientras que deja el híbrido desdoblado inmovilizado 47. La ribozima 34 libre y catalíticamente activa puede servir como la ribozima de iniciación en el sistema catalítico. La Figura 5 muestra otro ejemplo de la modalidad de activación de la invención. La biomolécula 51 ensayada, la cual comprende la secuencia de ácido nucleico A, por ejemplo una secuencia de ADN es inmovilizada como se describió en lo anterior. El sistema de detección comprende una segunda molécula compleja 52 que comprende la ribozima 53 unida a la secuencia c' (54), la cual puede ser desdoblada por la ribozima catalíticamente activa y la secuencia a' (55) complementaria a la secuencia A en la biomolécula ensayada. La molécula compleja también comprende una porción inhibidora 58, la cual aunque presente en su forma sin modificar, inhibe la actividad catalítica de la ribozima 53. Un ejemplo de una molécula inhibidora es una secuencia de ácido nucleico complementaria para parte de la ribozima. En la presencia de tal secuencia, la ribozima se pliega a una forma tridimensional inactiva. Las moléculas 51 y 52 se dejan hibridar para dar el híbrido inmovilizado 56 y las moléculas 52 libres son separadas por lavado. Para separar el híbrido 56 se agregan sustanciae de modificación, lae cuales son capaces de interactuar con la porción inhibidora 58 y modificarla a una forma sin inhibición. Por ejemplo, donde la porción inhibidora es una secuencia de ácido nucleico, la cual provoca el plegado de la ribozima, la suetancia de modificación puede ser una eecuencia complementaria para la porcidn inhibidora, la cual híbrida y bloquea la porción inhibidora, permitiendo así que la ribozima se vuelva a plegar a su forma activa. Alternativamente, las sustancias de modificación pueden ser sustancias capaces de eliminar o desdoblar la porción inhibidora, terminando así su acción inhibidora. La ribozima activa entonces es capaz de desdoblar la secuencia c, liberando por sí misma del híbrido desdoblado, inmovilizado 57. La ribozima 53 libre, catalíticamente activa entonces sirve como la ribozima de iniciación en el sistema catalítico. Ahora se hace referencia a la Figura 9, la cual muestra otro ejemplo de la modalidad de activación de la invención. La molécula 91 comprende la secuencia de la ribozima de iniciación 90, unida la secuencia c, que se puede desdoblar por la ribozima y para la secuencia a y d, las cuales son capaces de hibridar con la biomolécula ensayada que es, por ejemplo, la secuencia de ADN ensayada de la molécula 94. La molécula 91 además comprende la secuencia de ADN bloqueadora 92 la cual comprende la secuencia B y C, capaz de hibridar a las secuencias b y c de la molécula 91, respectivamente, para dar la estructura de doble cadena. La secuencia de ADN bloqueadora 92 está unida por medio de la secuencia adaptadora 93. La ribozima 90 no es capaz de desdoblar la secuencia c, ya que su región de secuencia es de doble cadena (por medio de hibridación a la secuencia bloqueadora 92) .

La molécula ensayada 94 entonces es introducida a la mezcla de reacción. Si la- biomolécula ensayada es complementaria a y b de la molécula 91, la secuencia bloqueadora 92 es desplazada por la molécula ensayada 94 para dar la molécula híbrida 9,5. En la molécula híbrida 95, la secuencia c que se puede desdoblar es de una sola cadena que permite que la ribozima la desdoble y de esta forma sea liberada a la mezcla de reacción como una ribozima catalíticamente activa 96, la cual sirve como la ribozima de iniciación en el sistema catalítico. De acuerdo con esta modalidad las condiciones tales como temperatura, la longitud de la parte de la biomolécula b de reconocimiento, la cual es de doble cadena, etc. deben ser elegidas con cuidado, de tal manera que la molécula de ensaya sea capaz de desplazar a la molécula bloqueadora 92 esencialmente solo si las secuencias A y B de las biomoléculas de ensayo están perfectamente acopladas a las secuenciae de reconocimiento a y b. Ahora se hace referencia a la Figura 6, la cual muestra la modalidad de transcripción del sistema de detección de la invención apropiado, donde la biomolécula es una secuencia de ácido nucleico. De acuerdo con esta modalidad específica una plantilla de ADN correcta, la cual eventualmente lleva a la transcripción de la ribozima de iniciación, es ensamblada de sus partes solamente en presencia de la secuencia de ácido nucleico ensayada, el sistema de detección comprende una primera molécula de oligonucleótido 61, que es esencialmente ADN, que comprende de 3' -* 5'; un promotor de doble cadena, una secuencia R que codifica para la secuencia complementaria de la ribozima de iniciación, una secuencia C que codifica para una secuencia que se puede desdoblar por una ribozima catalíticamente activa una secuencia de D^ complementaria a la parte 5' de la secuencia de ácido nucleico ensayada. El sistema de detección además comprende una segunda molécula de oligonucleótido 62, que es esencialmente ADN que consiste de 3' -5': una secuencia D2 complementaria a la parte 3 ' de la secuencia de ácido nucleico ensayada y una plantilla de oligonucleótido de activación (TRIG) . Si la secuencia de ácido nucleico ensayada 63 está presente, y bajo condiciones de hibridación apropiadas, la secuencia D1 de la molécula 61 y la molécula D2 de la molécula 62 híbrida con la secuencias D-^ y D2, respectivamente de las secuencia de ácido nucleico ensayada para dar el híbrido 64. En presencia del sistema de transcripción del oligonucleótido 65 de cadena sin plantilla es producido, comprende de 3' -» 5': la secuencia de oligonucleótido de activación trig, lae eecuencias d2 i y d1 , , las secuencias c* r', complementarias con aquellas de las secuencias de ácido nucleico desdoblables y la ribozima de iniciación, respectivamente. A la mezcla de reacción se agregan moléculas del constructo promotor posterior 66 que comprende un promotor de ADN de una sola cadena unido a una secuencia de capaz de hibridar con la secuencia de activación de oligonucleótido TRIG. Bajo condiciones apropiadas, el constructo promotor posterior 66 híbrida con la molécula 65 para dar el híbrido 67. En presencia de una ADN polimeraza, el promotor de una sola cadena es terminado para dar un promotor de doble cadena funcional en el híbrido 68. El híbrido 68 puede servir, en presencia de los reactivos de transcripción, como una plantilla para la producción del transcrito oligonucleótido final 69, que comprende en su extremo 5': una secuencia de ribozima de iniciación r y una secuencia c deedoblable capaz de eer desdoblada por la ribozima. La ribozima r desdobla a la secuencia desdoblable c de esta forma liberándose por sí misma al medio circundante en la forma de la ribozima libre 70. La ribozima libre 70 puede servir como la ribozima de iniciación catalíticamente activa en el sistema catalítico. Un modo de la modalidad de ensamble c montaje de la invención se muestra en la Figura 7 (a). El sistema de detección comprende las biomoléculas 71, que comprende la secuencia de ácido nucleico A?A2 • Además, el sistema de detección comprende una parte de una ribozima 72, que comprende la secuencia de oligonucleótido a'-^ complementaria para la secuencia A-^ y otra parte de una ribozima 73 que comprende la secuencia de oligonucleótido a2 i complementaria para la secuencia A2. Las partes de la ribozima 72 y 73 juntas constituyen una ribozima completa, si las dos partes son ensambladas. Si una molécula 71 ensayada está presente en el medio, puede hibridar a a-^ de la parte de ribozima-72 y a2 de la ribozima - parte 73 que lleva las dos partes juntas para formar la ribozima funcional - híbrido 76 de la secuencia ensayada, la cual puede servir como una ribozima de iniciación en un sistema catalítico, por ejemplo, por desdoblamiento de la molécula 77, cuyo desdoblamiento puede ser requerido para iniciar la cascada de amplificación en el sistema catalítico. Otro modo del modo de montaje de la invención se muestra en la Figura 7 (b) . La ribozima 79 del tipo de cabeza de martillo ha eido conetruida en la cual el Tallo- II ha eido acortado para que tenga solamente un nucleótido complementario (representado por una línea en la Figura 2b) y la porción restante del tallo ha sido abierta para dar brazos a y b. La ribozima 79. es capaz de hibridar con la secuencia 70 para formar el Tallo I y III y luego realizar la actividad catalítica, por ejemplo, desdoblamiento de la secuencia 70. Sin embargo, la ribozima 79 a priori es incapaz de desdoblar la secuencia desdoblada 70 ya que es su Tallo-II esta abierto e inactivo. Los brazos a y b del núcleo abierto han sido construidos para ser complementarios para las secuencias A y B de la secuencia ensayada, por ejemplo, la secuencia de ADN 80. En la presencia de la secuencia de ADN ensayada 80, los brazos a y b del Tallo-II de la ribozima 79 son hibridados a la secuencia ensayada para producir un Tallo- II completamente de doble cadena y de esta forma la ribozima llega a ser catalíticamente activa y puede servir como una ribozima de iniciación en un sistema catalítico, donde por ejemplo, la secuencia 70 desdoblable es parte de una enzima en el sistema catalítico, el cual requiere el desdoblamiento para su activación. EJEMPLOS Ejemplo 1: Detección de la secuencia de ácido nucleico ensayada utilizando una ribozima con un tallo-II abierto. La ribozima HH8 se dividió en dos partee en el bucle del tallo-II. Ca a una de lae doe mitadee de la ribozima de HH8 (HH8-3 y HH8 5) tiene una eecuencia de cola de 17 baees adicional, diferente complementaria para la molécula objetivo de ADN LAMTARO. En la presencia del objetivo, las dos mitades se llevan juntas y forman una ribozima activa. En el objetivo LAMTARO las dos secuencias complementarias para las mitades de la ribozima son continuas. En la otra molécula LAMTAR (LAMTAR1 a LAMTAR4) las dos secuencias están separadas por 1 a 4 bases no complementarias, respectivamente. El sustrato de la ribozima es SB8-24 el cual contiene la secuencia reconocida por HH8. (a) Método: 1. Secuencias Los oligodesoxiribonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied Biosystem 381A de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El equipo Ampliscribe (Epicenter Technologies) se utilizó para todas las síntesis de ARN [a3 P] UTP [3000Ci/mmol] se compró de Rotem Industries Ltd, Israel. ADN objetivos: LAMTARO: S'GCTCCGAGTCCACCTGCACGCCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA 3' L-AMT?IU: S'GCrCCGAGTCCACCTGCACGCrCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA 3' L-AMTAR2: 5'GCTCCGAGTCCACCTGCACGCGGCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA y 1-AMTAR3: 5'GCTCCGAGTCCACCTGCACGCGATCGACCAGTGCCGTGTTCGGGA 3' LAMTAR4: S'GCTCCGAGTCCACCTGCACGCTATACGACCAGTGCCGTGTTCGGGA 3' Subrayado- complementario para la mitad de la ribozima; resaltado-no-complementario para la secuencia adicional.

ARN transcritos: SB-24 (sustrato para HH8): 5'GGUCACAAUGUCGGUCGAGUUCCA y HH8-3 (mitad de la ribozima): S'GGCGACCCUGAUGAGGCCCCGUGCAGGUGGACUCG 3' HH8-5 (mitad de la ribozima): S'GGAACACGGCACUGGUCGGGCCGAAACAUUAA 3' Subrayado- complementario para el objetivo. 2. Preparación del ARN: Loe oligonucleótidoe de ADN se sintetizaron de acuerdo con (1) anterior. Los oligonucleótidos se purificaron por electrofóresis en gel de poliacrilamida al 15%, 7M urea, se sombrearon con luz UV y eluyeron durante la noche a temperatura ambiente en Tris-Cl 0.5M (pH-7.0), SDS 0.1% y EDTA 0.1 mM. El ADN eluido se precipitó con 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3M y 3 volúmenes de etanol, resuspendido en Tris-Cl 1 mM (pH-7.0) y EDTA 0.1 mM y se almacenó a -20°C hasta su uso. Los oligonucleótidos purificados se recocieron al oligonucleótido promotor de T7ARN polimerasa sin plantilla, complementaria, (TAA TAC GAC TCA CTA TAG G) en 20 mM de cada uno por incubación a 95°C durante 15 segundos y a 70°C, 60°C, 55°C, 50°C, 45°C, 40°C y 37°C durante 5 minutos a cada temperatura. La mezcla de reacción de transcripción (50 mi) tubo dos mg de ADN recocido, amortiguador de reacción IX, ditiotritol 10 mM, ATP, CTP, y GTP 2 M, UTP, 1 mM, 25 mCi [a32P]UTP y MgCl2 1.1 mM. La mezcla se incuba durante 1 hora a 37°C y luego durante 5 minutos a 80-?C para desactivar la enzima. El ARN se precipitó como se describió. Los transcritos se purificaron por electrofóresis en gel de poliacrilamida al 15% 7M urea. El ARN se ubicó por autorradiografía y eluyó como se describió. El ARN se precipitó como se describió, resuspendido en 0.1 X TE y contado en contador de centelleo (Luma LSC) . 3. Reacción de desdoblamiento: La reacción (19 mi) se llevó a cabo normalmente en presencia de 0.5 pmoles de ribozima, Tris-Cl 50 mi (ph-7.5) EDTA 1 mM (pH-7.5), SDS al 0.05% y MgCl2 30 mM. La reacción se preincubó a 95°C durante 1 minuto para eliminar con formaciones de ARN alternativae las cuales pueden haberse formado durante el almacenamiento a -20°C. Las reacciones se incubaron a 37°C durante 1 hora y ee detuvieron agregando una eolución colorante que contiene urea 10 M y EDTA 10 mM se coloca sobre hielo. Las muestras fueron desnaturalizadas a 80°C durante 5 minutos y se corren en gel de poliacrilamida al 15% - urea 7M. (b) Resultados: Loe resultados del gel de poliacrilami?a se mueetran en la Figura 10. La ribozima ein un objetivo no produce desdoblamiento apreciable. Cuando se agrega el objetivo, aumentó el resultado de desdoblamiento. El aumento fue más grande en las Ribozimas LAMTAR4 probadas. Ejemplo 2 Sistema catalítico formado por una molécula compuesta de círculo cerrado La ribozima precursora SLS (Rz) es Rz circular con 11 pb de largo en el tallo-II. Loe dos brazos de reconocimiento están conectados en serie con una base de desdoblamiento extra separándolos. Por lo tanto, esta ribozima no tiene actividad, sino sirve como una plantilla para las ribozimas activas. Una vez que ha sido desdoblada, la ribozima "abierta" llega a ser activa (como se muestra esquemáticamente en la Figura 2 (b) ) . Para iniciar el sistema catalítico una ribozima de iniciación debe estar presente. El desdoblamiento espontáneo del ARN ocurre a una velocidad de 1 evento por 106 moléculas por minuto en MgCl2 30 mM a 37°C. Una ribozima circular desdoblada espontáneamente en el sitio de desdoblamiento llega a ser activa y es capaz de eervir como el activador. (a) Métodos 1. Secuencias: Loe oligodeeoxiribonucleótidoe ee eintetizaron en un eintetizador de ADN Applied Bioeyetem 381A de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante. El equipo Ampliscribe (Epicenter Technologies) ee utilizó para todas las síntesis de ARN [a32 P] UTP [3000Ci/mmol] se compró de Rotem Industries Ltd., Israel. La secuencia precursora de ARN (SLS's) fueron: GGU CAG CAG UCG AA [brazo de reconocimiento I] X [brazo de reconocimiento III] CUG AUG AGA CUG CUG ACC A 3' 2. Preparación del ARN La preparación del ARN ee llevó a cabo como ee deecribió en el Ejemplo 1 anterior. 3. Reacción de desdoblamiento espontáneo: Las reacciones se llevaron a cabo normalmente en presencia de 5 pmoles de la ribozima precursora (SLS-transcritos) , Tris-Cl 50 M (pH-7.5), EDTA 1 mM (pH-7.5), SDS al 0.05% y MgCl2 300 mM. Las reacciones se preincubaron a 95°C durante 1 minuto para eliminar las conformaciones de ARN alternativas las cuales pueden haberse formado durante el almacenamiento a -20°C. Las reacciones se incubaron a 37°C durante 1 hora o durante la noche y se detienen agregando una solución colorante que contiene urea 10 M y EDTA 10 mM y se colocan sobre hielo. Las muestras se desnaturalizan a 80°C durante 5 minutos y se corren sobre gel de poliacrilamida al 15% de urea 7 M. (b) Resultados Los resultados del gel de poliacrilamida se muestran en la Figura 11. Un panel de 8 ribozimas circulares diferentes ee examinó para la actividad en caecada. La cascada se inició por desdoblamiento espontáneo como se describió en lo anterior. Como se muestra en la Figura 1, una de las ribozimas (#313) demostró un funcionamiento catalítico en cascada, que resulta en la amplificación en una forma de retroalimentación positiva. Ejemplo III Inhibición de la ribozima por la sangre y varios materiales utilizados para la preparación del ADN Todas las técnicas de amplificación requieren una etapa de preparación de la muestra para liberar los ácidos nucleicos y eliminar la inhibición de las reacciones por los componentes de la sangre. Varios materiales como SDS, fenol y guanidinio se utilizaron en estae preparaciones. Una reacción de amplificación sin la necesidad de una etapa de preparación de la muestra se va a realizar. La actividad de ribozima en presencia de sangre, con y sin agentes que liberan el ácido nucleico, se probó. Ambos de solamente ARN y las ribozimas modificadas se examinaron. (a) Método 1. Oligonucleótidos: Los oliglodesoxiribonucleótidos se compraron de la unidad para biología molecular de Haddssa Hospital, Mount Scopus, Jerusalem. La ribozima modificada fue sintetizada por RPl, Boulder, Co. El equipo de transcripción Ampliscribe T7 (Epicenter Technologies) se utilizó para todas las síntesis de ARN. [gamma32P] ATP [6000ci/mmol] y [a32P] UTP [3000Ci/mmoles] se compraron de Rotem Industries Ltd., Israel. La T4 Polinucleótido cinasa se compró de NEB, Beverly, Ma. 2. Ribozimas: DS-LS-RZA3-6: 5' GCAACAG GGAGGAAAGCCUACgucUGGUACGUCCA cugaugagGCCGAAAGGCcgaaacGUAGUAAA 3* Casoinfrior- ribonucleotidos; Casosuperíor- Modificación de 2"-O-Metilo; Casosuperior subrayado- desoxiribonucleotidos. HH8 (ARN transcrito): 5' GGCGACCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACAUUAA 3'. 3. Mareaje de la ribozima modificada: 50 pmoles de la ribozima, 10 unidades de la T4 Polinucleótido cinasa y 20 µCi [gamma32P] ATP se incubaron en amortiguador de reacción IX en un volumen total de 10 µl a 25°C durante 1 hora. La reacción se terminó por incubación a 60°C durante 10 minutos. 4. Preparación del ARN: El ADN oligonucleótido plantilla HH8 se purificó por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% urea 7 M, se sombreó por luz UV y eluyó durante la noche a temperatura ambiente en Tris-Cl 0.5 M (pH-7.5), SDS al 0.1% y EDTA 0.1 mM. El ADN eluido se precipitó con 0.1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 3 volúmenes de etanol, se resuspende en 0.1 XTE (Tris-Cl 1 mM, pH-7.0 y EDTA 0.1 mM) y se almacenó a -20°C hasta que se usa. El oligonucleótido purificado se recoció al promotor T7 ARN polimerasa no plantilla, complementario T7 ARN oligonucleótido (TAATACGACTCACTATAGG) en 20 µM de cada uno por incubación a 95°C durante 15 segundoe y a 70°C, 60°C, 55°C, 50°C, 45°C, 40°C y 37°C durante 5 minutoe a cada temperatura. La mezcla de reacción de tranecripción (50 µl) tuvo 2 µM de ADN recocido, amortiguador de reacción IX, Ditiotreitol 10 mM, ATP 2 mM, CTP y GTP, UTP 1 mM, 25 m i [a32P] UTP y MgCl2 1.1 mM. La mezcla se incubó durante 1 hora a 37°C y luego durante 5 minutos a 80°C para desactivar la enzima. El ARN se precipitó como se describió. Los transcritos se purificaron por electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% - urea 7 M. El ARN se ubicó por autorradiografía y eluyó como se describió. El ARN eluido se precipitó como se describió, se resuspendió en 0. IX TE y se contó un contador de centelleo (Luma LSC) . 5. Reacción de desdoblamiento: Las reacciones (10 µl) se llevaron a cabo normalmente en presencia de 0.5 pmoles de ribozima modificada 0 HH8, Tris-Cl 50 mM (pH-7.5), EDTA 1 mM (pH-7.5), SDS al 0.05% y MgCl2 30 mM. 1 µl de sangre completa o 0.2 µl de sangre completa y el componente adicional se agregaron (Véase la Figura 1) . Las reacciones se incubaron a 37°C durante 1 hora y se detuvieron por adición de una solución colorante que contiene urea 10 M y EDTA 10 mM y se pone sobre hielo. Las muestrae ee deenaturalizan a 80°C durante 5 minutoe y se corren en gel de poliacrilamida al 15% - urea 7 M. (b) Resultados Los resultadoe se muestran en la Figura 12, en la que 0.5 pmoles de ribozimas estuvieron presentee en cada muestra y 1 µl de sangre se mezcló con cualquiera de SDS al 10% - isocianato de guanidina 4 M o fenol-cloroformo 1:1, 1 µl de cada uno de la muestra de sangre tratada o el agente solo se agregaron a la prueba de reacción. El resultado de la actividad de la ribozima no es inhibido por cualquiera de SDS al 1%, guanidina 0.35 M o por 5% de fenollOcloroformo si la sangre está presente o no. La sangre sin tratar degrada parte del ARN de las ribozimas. Estos resultados muestran una de las ventajas del método de detección basado en la ribozima de la invención en que los agentes desnaturalizantes utilizados en la preparación de la muestra catalítica no impide la actividad catalítica de la ribozima.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar la presencia de una ribozima de iniciación, catalíticamente activa en un medio, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) proporcionar un sistema catalítico que comprende (aa) ribozimas las cuales son a priori catalíticamente inactivas o espacialmente confinadas, de tal manera que no pueden ejercer su actividad catalítica sobre su objetivo; el objetivo de las ribozimas es otras ribozimas del sistema catalítico, su actividad catalítica sobre tales de otras ribozimas provocando ya sea: (i) activación de las ribozimas inactivas, (ii) liberación de las ribozimas confinadas espacialmente para permitirles que alcancen sus objetivos; por lo menoe algunae de las ribozimas del sietema catalítico que ee un objetivo de la actividad catalítica de la ribozima de iniciación, la actividad catalítica de la ribozima de iniciación sobre alguna de las ribozimas que es aquella de (i) o (ii) anteriores; y comprenden (ab) una marca detectable que tiene propiedades detectables de tal manera que la actividad catalítica de las ribozimas provoca un cambio en las propiedades detectables; (b) poner en contacto el medio con el sistema catalítico; (c) proporcionar las condiciones que permiten que la ribozima de iniciación catalíticamente activa y las ribozimas catalíticamente activas del sistema catalítico, ejerzan su actividad catalítica, por lo que la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa da un aumento para una cascada de reacción en la cual las ribozimas del sistema catalítico son activadas o liberadas dentro del medio; (d) detectar las propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de la ribozima de iniciación activa en el medio.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) poner en contacto el medio con un sistema catalítico que comprende: - una primera y una segunda ribozima, siendo ambas, a priori , catalíticamente inactivas; - la primera ribozima se vuelve catalíticamente activa por la actividad catalítica de la segunda ribozima y la segunda ribozima se vuelve catalíticamente activa por la actividad catalítica de la primera ribozima; - por lo menos una de la primera o segunda ribozima se--, vuelve catalíticamente activa también por la actividad catalítica de la ribozima de iniciación; - por lo menos una de la primera o la segunda ribozima lleva una marca, de tal manera que por la actividad catalítica de la otra ribozima hay un cambio en las propiedades detectables de la marca; (b) proporcionar las condiciones en las cuales la ribozima de iniciación y la primera y la segunda ribozima pueden ejercer su actividad catalítica; y (c) detectar la propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de una ribozima de iniciación, activa en el medio.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el medio con un sistema catalítico que comprende: - una primera molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una primera ribozima de una clase capaz de desdoblar una primera secuencia de ácido nucleico desdoblable, unida a una segunda secuencia de ácido nucleico deedoblable, desdoblar de la segunda secuencia liberando la primera ribozima de la primera molécula compuesta; - una segunda molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una segunda ribozima de una clase capaz de desdoblar la segunda secuencia de ácido nucleico desdoblable, unida a una primera secuencia de ácido nucleico desdoblable, el desdoblamiento de la primera secuencia libera la segunda ribozima de la segunda molécula compuesta; - por lo menos una de la primera o segunda secuencias de desdoblamiento que es capaz de desdoblarse también por la ribozima de iniciación; la primera y la segunda moléculas de ácido nucleico compuestas que son separadas una de la otra para evitar el contacto entre las dos moléculas compuestas; - por lo menos una de la primera y la segundas moléculas compuestas lleva una marca detectable, la marca que es liberada al medio de reacción despuée del desdoblamiento por la ribozima, comprendida en la otra molécula compuesta; (b) proporcionar condiciones las cuales permitan que una ribozima se desdoble y las cuales permitan la migración de las ribozimas desdobladas entre la primera y segunda moléculas de ácido nucleico compuestas; y (c) detectar la presencia de marcas liberadas, la presencia de la marca liberada en el medio que indica la presencia de la ribozima catalíticamente activa en el medio.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la etapa de: (a) poner en contacto el medio con un sistema catalítico, que comprende una tercera ribozima que es, a priori , catalíticamente inactiva; - cada molécula de una tercera ribozima a priori catalíticamente inactiva llega a ser activa por la actividad catalítica de otra molécula de las terceras ribozimas catalíticamente activas; - la tercera ribozima catalíticamente inactiva a priori se vuelve activa también por la actividad catalítica de la ribozima de iniciación; - la tercera ribozima lleva una marca de tal manera que por la actividad catalítica de otra tercera molécula de ribozima sobre ella, hay un cambio en las propiedades detectables de la marca; (b) proporcionar condiciones adecuadas para la tercera ribozima y la ribozima de iniciación para ejercer su actividad catalítica; y (c) detectar las propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de una ribozima de iniciación activa en el medio.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el medio con un sistema catalizador, que comprende: - una molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una ribozima marcada unida a una secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar en una orientación o en una ubicación, la cual evita el desdoblamiento de la secuencia de ácido nucleico por la ribozima mientras que está presente en la molécula compuesta, la secuencia de ácido nucleico que es desdoblable por la ribozima cuando está presente en forma libre por lo que libera la ribozima marcada de la molécula compuesta; - la secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar que es desdoblable también por la ribozima de iniciación; - la molécula compuesta que es separada una de la otra para evitar el contacto entre ellas; (b) proporcionar las condiciones, lae cualee permitan que la ribozima ee desdoble y las cuales permitan la migración de las ribozimas desdobladas entre moléculas compuestas separadae; y (c) detectar la preeencia de marcas liberadas, la presencia de la marca liberada en el medio indica la presencia de la ribozima catalíticamente activa en el medio.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, para detectar la preeencia en un medio de una ribozima catalíticamente activa que tiene actividad catalítica de deedoblamiento, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el medio con un sietema catalítico que comprende: - una molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una ribozima la cual tiene una secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar, la molécula compuesta que está en la forma de un círculo cerrado y la secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar que es desdoblable por la molécula compuesta en una forma abierta; la secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar ee desdoblable también por la ribozima de iniciación; la molécula compuesta que lleva una marca detectable, la cual cambia sus propiedades detectables por la abertura de la molécula compuesta cerrada; (b) proporcionar condiciones las cuales permiten que la ribozima se desdoble y migre; y (c) detectar por las propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de la ribozima catalíticamente activa en el medio.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, para detectar la presencia en un medio de una ribozima de iniciación catalíticamente activa que tiene actividad catalítica de corte, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el medio con un sietema catalítico que comprende: - una sexta ribozima que tiene, en una región de la misma esencial para su actividad catalítica, una secuencia de ácido nucleico extra, la secuencia de ácido nucleico hace a la ribozima inactiva; - corta de la secuencia de ácido nucleico extra haciendo la sexta ribozima activa; - la secuencia de ácido nucleico extra es capaz de ser cortada de la molécula compuesta por la sexta ribozima catalíticamente activa; - la secuencia de ácido nucleico extra también es capaz de ser cortada por la marca detectable catalíticamente activa; - la sexta ribozima que lleva una marca detectable, la cual cambia sus propiedades detectables por el corte de la secuencia de ácido nucleico extra; (b) proporcionar condiciones las cuales permitan que la ribozima ee corte; y (c) detectar lae propiedades detectables un cambio en las propiedades que es indicación de la preeencia de la ribozima catalíticamente activa en el medio.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la primera y eegunda moléculae de ácido nucleico compuestas están ubicadas en lados opuestos de una membrana porosa que bloquea su paeo a travée de ella, mientras que permite el paso de la primera y segunda ribozimas libres. -
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la primera y segunda moléculas de ácido nucleico compuestas están inmovilizadas sobre un sustrato.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque cada molécula compuesta está inmovilizada sobre un sustrato.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el sustrato es una cuenta o perla.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la primera y segunda moléculas de ácido nucleico compuestas están unidas a porciones que tienen las ismae cargae eléctricae.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque cada molécula compuesta está unida a una porción cargada, todas las porciones en la mezcla de reacción tienen la misma carga.
14. 14. Un método de detección de la presencia de una biomolécula ensayada en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende las etapae de : (a) poner en contacto la mueetra con un sistema de detección bajo condiciones, las cuales permiten la producción de la ribozima de iniciación catalíticamente activa, solamente si están presentes en la muestra las biomoléculas ensayadas ; y (b) detectar la presencia de la . ribozima de iniciación catalíticamente activa de conformidad con el método de la reivindicación 1, la presencia de la misma indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una primera molécula que comprende: una ribozima de iniciación bajo condiciones, en las que la ribozima es catalíticamente inactiva y una biomolécula de reconocimiento capaz de reconocer específicamente y unir la biomolécula ensayada; (b) poner en contacto la primera molécula completa con la muestra de prueba bajo condiciones las cuales permiten la unión entre la biomolécula de reconocimiento y la biomolécula ensayada, mientras. que mantiene las condiciones las cuales hacen a la ribozima catalíticamente inactiva; (c) eliminar las primeras moléculas complejas sin unir; (d) proporcionar diferentes condiciones, en las que la ribozima de iniciación se vuelve activa; y (e) detectar la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1, la presencia de la misma que indica la presencia de la biomolécula eneayada en la muestra .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una primera molécula compleja que comprende: una ribozima de iniciación, bajo condiciones en las que la ribozima es catalíticamente inactiva y una biomolécula de reconocimiento capaz de reconocer específicamente y unir la biomolécula ensayada, la ribozima que está unida a una secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar capaz de ser desdoblado por una ribozima de iniciación catalíticamente activada en la que el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar libera la ribozima de iniciación catalíticamente activa al medio circundante; (b) poner en contacto la primera molécula compleja con la muestra de prueba bajo condiciones las cuales permitan la unión entre la biomolécula de reconocimiento y la biomolécula, mientras que se mantienen las condiciones las cuales hacen a la ribozima catalíticamente inactiva; (c) eliminar las primeras moléculas complejas sin unir; (d) proporcionar diferentes condicionee, en las que la ribozima de iniciación se vuelve catalíticamente activa para provocar el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar y de esta forma liberar la ribozima de iniciación -en el medio circundante; y (e) detectar la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa, de conformidad con el método de la reivindicación 1, la presencia de la misma que indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una molécula híbrida que comprende: una ribozima de iniciación unida a una secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar, la cual es capaz, cuando es de una sola cadena, de ser desdoblada por la ribozima de iniciación, el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar que libera la ribozima de iniciación catalíticamente activa al medio circundante, la molécula híbrida además comprende una biomolécula de reconocimiento que además comprende una biomolécula de reconocimiento capaz de reconocer específicamente y unir la biomolécula ensayada a la secuencia que se puede deedoblar y una parte de la biomolécula de reconocimiento que es a priori , de doble cadena ; (b) poner en contacto la molécula híbrida con la muestra de prueba bajo condiciones las cuales permiten el desplazamiento de una cadena de la parte de doble cadena de la biomolécula de reconocimiento y la secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar por una biomolécula ensayada acoplada esencialmente en forma perfecta; (c) proporcionar condiciones que permitan el desdoblamiento por las ribozimas catalíticamente activas para provocar el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar de una sola cadena, por lo que libera la ribozima de iniciación catalíticamente activa en el medio circundante; y (d) detectar la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa de conformidad con el método de la reivindicación 1, la presencia de la misma, indicando la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una segunda molécula compleja que comprende una ribozima de iniciación y una biomolécula de reconocimiento, capaz de reconocer eepecíficamente y unir la biomolécula eneayada, la ribozima unida a una eecuencia de ácido nucleico que ee puede desdoblar capaz de ser desdoblada por la ribozima de iniciación catalíticamente activa, desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar que libera la ribozima de iniciación catalíticamente activa al medio circundante, la segunda molécula compleja también comprende una porción inhibidora capaz de inhibir la actividad catalítica de la ribozima de iniciación; (b) poner en contacto la segunda molécula compleja con la muestra de prueba bajo condiciones las cuales permitan la unión entre la molécula de reconocimiento y la biomolécula ensayada, mientras que mantiene la porción inhibidora en su forma inhibida; (c) eliminar las segundas moléculas complejas sin unir; (d) modificar la porción inhibidora en las segundas moléculas unidas para eliminar su efecto inhibidor, por lo que provocan el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar y liberan la ribozima de iniciación dentro del medio circundante; y (e) detectar la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa de conformidad con el método de la reivindicación 1, la presencia de la misma, que indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las condiciones en (a) parecen esencialmente de iones magnesio y la etapa (d) comprende agregar al medio de reacción iones magnesio en una concentración suficiente para hacer a la ribozima de iniciación catalíticamente activa.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 14, en el que La biomolécula ensayada es una secuencia de ácido nucleico y eL método está raí acLe-r izado porque comprende las etapas e : (a) poner en contacto la muestra con un sistema de detección que comprende: - un primera moJ écu] a de oligonucleótido que tiene un promotor de doble cadena, una secuencia de oligonucleótido de una sola cadena que es esencialmente ADN, el cual es esencialmente idéntico con la secuencia de la ribozima de iniciación; una secuencia de una sola cadena que es esencialmente ADN, el cual es esencialmente idéntico con una secuencia que se puede desdoblar, capaz de ser desdoblada por una ribozima de iniciación catalíticamente activa y una secuencia de una sola cadena, la cual es complementaria a la parte 5' de la secuencia de ácido nucleico ensayada; - una segunda molécula de oligonucleótido que tiene una secuencia de una sola cadena que es complementaria para la parte 3 ' de la secuencia de ácido nucleico ensayado y además comprende una plantilla de oligonucleótido de activación de una sola cadena, la cual puede ser transcrita para dar una secuencia de oligonucleótido de activación, la secuencia de oligonucleótido de activación, capaz, en presencia de un constructo promotor posterior y la ADN polimerasa, para activar una reacción en un sistema de transcripción, en el que la secuencia para la cual está unido es transcrita; (b) propot ci nar las condiciones, las cuales permiten la hibridación de la primera y la segunda moléculas de oligonucleótido para La secuencia de ácido nucleico ensayada; (c) agregar un sistema de transcripción, bajo condiciones las cuales permitan la transcripción, por lo que la secuencia de oligonucleótido de activación es transcrita, la secuencia de oligonucleótido de activación en presencia de un promotor posterior, la ADN polimerasa y el sistema de transcripción y bajo condiciones que permitan la hibridación, la polimerización y transcripción del ADN, que lleva a la transcripción de un transcrito oligonucleótido final comprende la ribozima de iniciación unida a la secuencia que se puede desdoblar, capaz de ser desdoblada por la ribozima de iniciación catalíticamente activa; (d) proporcionar condiciones las cuales permitan el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar por la ribozima catalíticamente activa, para provocar el desdoblamiento de la secuencia que se puede desdoblar y de esta forma liberar por sí misma dentro del medio circundante; Y (e) detectar la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa de conformidad con la reivindicación 1, la presencia de la misma, que indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 14, en el que la biomoiécula ensayada es una secuencia de ácido nucleico y el método es a r-aiactcrizado porque comprende las etapas de : (a) incubar la muestra de prueba con un sistema de detección que comprende: - una Lerceía molécula compuesta que comprende una tercera secuencia de oligonucleótido de una sola cadena que es complementaria para la parte 5 ' de la secuencia de ácido nucleico ensayada, la tercera secuencia de oligonucleótido está unida a una parte de la ribozima de iniciación; - una cuarta molécula compuesta que comprende una cuarta secuencia de oligonucleótido de una sola cadena que es complementaria para la parte 3 ' restante de la secuencia de ácido nucleico ensayada, la cuarta secuencia de oligonucleótido está unida a una parte de la ribozima de iniciación requerida para completar la ribozima unida a la tercera secuencia de oligonucleótido para dar una ribozima de iniciación completa; (b) proporcionar condiciones que permitan la hibridación de la tercera y cuarta secuencias de oligonucleótido con la secuencia de ácido nucleico ensayada y lo cual permite el montaje de una ribozima de iniciación completa a partir de sus partes; y (c) detectar la presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa de conformidad con el método de la reivindicación 1, la presencia de la misma que indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 14, en el que la biomolécula ensayada es una secuencia de ácido nucleico y el método está caracterizado porque comprende las etapas de: (a) incubar la muestra de prueba con un sistema de detección que comprende : - una ribozima del tipo de cabeza de martillo, en la que algo de la porción de doble cadena del Tallo- 11 ha sido cortada y en la que el Tallo- II de doble cadena, restante está unido a dos secuencias de una sola cadena, una que es complementaria para el extremo 3 ' de la secuencia de ácido nucleico ensayado y la otra que es complementaria para el extremo 5' de ia secuencia de ácido nucleico; - la ribozima que es inactiva a priori ; - hibridación de las dos secuencias de una sola cadena a las secuencias complementarias que hace a la ribozima catalíticamente activa; (b) proporcionar condiciones que permiten la hibridación de la ribozima ron l secuencia de ácido nucleico ensayada; y (c) detectar La presencia de la ribozima de iniciación catalíticamente activa de conformidad con el método de la reivindicación 1, la presencia de la misma que indica la presencia de la biomolécula ensayada en la muestra.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 1, para detectar la presencia en el medio de una ribozima de iniciación catalíticamente activa que tiene la actividad de desdoblamiento, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el medio con un sistema catalítico que comprende: - una cuarta ribozima de una clase capaz de ligar partes de una quinta ribozima, unida a una secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar por la ribozima de iniciación, que se puede desdoblar por la ribozima de iniciación, el desdoblamiento de la secuencia de ácido nucleico libera la cuarta ribozima catalíticamente activa al medio circundante; - dos partes de una quina ribozima las cuales son capaces de ser unidas por la cuarta ribozima para dar una quinta ribozima catalíticamente activa, la quinta ribozima es de una clase capaz de ligar partes de una cuarta ribozima; - dos partes de una cuarta ribozima las cuales son capaces de ser -ligadas por la quina ribozima para dar la cuarta ribozima catalíticamente activa; - la cuarta molécula es a priori separada de las dos partes de la quinta ribozima para evitar el contacto entre ellas; - por lo menos una de la cuarta o quinta ribozima lleva marcas, las cuales cambian sus propiedades detectables por la ligazón; (b) proporcionar condiciones, las cuales permiten el desdoblamiento de la ribozima y lo cual permite la migración de la cuarta molécula totalmente desdoblada a las dos partes de la quinta ribozima; (c) proporcionar o mantener las condiciones que permiten la ligazón de la ribozima; y (d) detectar las propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de la ribozima de iniciación en el medio.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1, para la detección de la presencia en el medio de una ribozima de iniciación catalíticamente activa que tiene la actividad de ligazón, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto el medio con un sistema catalítico que comprende: - dos partes de una quinta ribozima las cuales son capaces de ser ligadas por una cuarta ribozima para producir una quinta ribozima catalíticamente activa, la quinta ribozima que es de una clase capaz de ligar partes de una cuarta ribozima; - dos partes de una cuarta ribozima las cuales son capaces de ser ligadas por la quinta ribozima para producir una cuarta ribozima catalíticamente activa; la cuarta ribozima que es de una clase capaz de ligar partes de la quinta ribozima; - cualquiera de dos partes de la quinta ribozima o dos partes de la cuarta ribozima son capaces de ser ligadas por la ribozima de iniciación catalíticamente activa; por lo menos una de la cuarta o la quinta ribozima lleva marcas, las cuales cambian sus propiedades detectables por la ligazón; (b) proporcionar condiciones que permiten la ligazón de la ribozima; (c) detectar las propiedades detectables, un cambio en las propiedades que es una indicación de la presencia de la ribozima de iniciación en el medio.
25. 25. Un equipo para detectar la presencia de una ribozima de iniciación catalíticamente activa en un medio, caracterizado porque comprende: un sistema catalítico que comprende: (a) ensayar las ribozimas las cuales son a priori catalíticamente inactivas o confinadas espacialmente de tal manera que no pueden ejercer su actividad catalítica sobre su objetivo; el objetivo de -Las ribozimas que es otras ribozimas del sistema catalítico, su actividad catalítica sobre tales otras ribozimas provocando ya sea: (i) activación de las ribozimas de ensayo inactivas, (ii) liberación de las ribozimas de ensayo confinadas espaci almente para permitirles que alcancen sus objetivos ; por lo menos algo de las ribozimas de ensayo del sistema catalítico que es un objetivo de la actividad catalítica de la ribozima de iniciación, la actividad catalítica de la ribozima de iniciación sobre algunas de las ribozimas de ensayo que es aquel de (i) o (ii) anteriores; y que comprende : (b) una marca detectable que tiene propiedades detectables, la actividad catalítica de las ribozimas de ensayo provoca un cambio en las propiedades detectables.
26. 26. El equipo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sistema catalítico comprende: una primera y segunda ribozimas de ensayo, ambas que son a priori catalíticamente inactivas; la primera ribozima de ensayo se vuelve catalíticamente activa por la actividad catalítica de una segunda ribozima de ensayo y la segunda ribozima de ensayo que se vuelve catalíticamente activa por la actividad catalítica de la primera ribozima de ensayo; por lo menos una de la primera o la segunda ribozima de ensayo que se vuelve catalíticamente activa también por la actividad catalítica de la ribozima de iniciación; por lo menos una de la primera o la segunda ribozima de ensayo lleva una marca, de tal manera que por la actividad catalítica de la otra de la primera o la segunda ribozima de ensayo hay un cambio en las propiedades detectables de la marca.
27. 27. El equipo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sistema catalítico está caracterizado porque comprende: una primera molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una primera ribozima de ensayo de una clase de desdoblamiento de una primera secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar, unida a una segunda secuencia de ácido nucleico, el desdoblamiento de la segunda libera la primera ribozima de ensayo de la primera molécula compuesta; una segunda molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una segunda ribozima de ensayo de una clase capaz de desdoblar la segunda secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar, unida a una primera secuencia que libera la segunda ribozima de ensayo de la segunda molécula compuesta; por l o menos una de la primera o segunda secuencias que se pueden desdoblar que es desdoblable también por la ribozima de iniciación; la primera molécula de ácido compuesta y la segunda molécula de ácido nucleico compuesta que están separadas entre sí para evitar el contacto entre las dos moléculas compuestas; por lo menos una de la primera y la segunda moléculas compuestas lleva una marca detectable, la marca que es liberada al medio de reacción después del desdoblamiento por la ribozima comprendida en la otra molécula compuesta.
28. 28. El equipo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sistema catalítico comprende: una tercera ribozima de ensayo que es, a priori , catalíticamente inactiva; cada molécula de la tercera ribozima de ensayo inactiva catalíticamente a priori se vuelve activa por la actividad catalítica de otra molécula de las terceras moléculas de ensayo catalíticamente activas; la tercera ribozima de ensayo catalíticamente inactiva a priori , llega a ser activa también por la actividad catalítica de la ribozima de iniciación; el tercer ensayo lleva una marca de tal manera que por la actividad catalítica de la otra tercera molécula de ribozima sobre ella, hay un cambio en las propiedades detectables de la marca.
29. 29. El equipo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sistema catalítico comprende: una molécula de ácido nucleico compuesta, que comprende una ribozima de ensayo marcada unida a una secuencia de ácido nucleico desdoblable en una orientación o en una ubicación, la cual evita el desdoblamiento de la secuencia de ácido nucleico por la ribozima de ensayo, aunque presente en la molécula compuesta, la secuencia de ácido nucleico desdoblable por la ribozima de ensayo, cuando está presente en una forma libre, por lo que libera a la ribozima de ensayo marcada de la molécula compuesta; la secuencia de ácido nucleico que se puede desdoblar que es desdoblable también por la ribozima de iniciación; las moléculas compuestas que son separadas entre sí para evitar el contacto entre ellas.