MXPA97005667A - Derivados de insulina con union a zinc incrementada - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a derivados de insulina con unión de zinc incrementada en donde Z representa un resto histidina o un péptido con 2 a 35 restos aminoácidos genéticamente codificables, que contiene 1 a 5 restos histidina, se adecúa para la producción de preparados farmacéuticos para el tratamiento de diabetes. Las insulinas de la fórmula I forman con zinc complejos que contienen un hexámetro de insulina y aproximadamente 5 a 9 moles de zinc por hexámero.

Description

DERIVADOS DE INSULINA CON UNION A ZINC INCREMENTADA La farmacociné ica de insulina aplicada por vía subcutánea depende de su comportamiento de asociación. La insulina forma hexámeros en solución acuosa neutra. Cuando la insulina quiere acceder desde el tejido a la corriente sanguínea y al lugar de acción, la insulina ha de atravesar primeramente las paredes de los capilares. Se supone que esto sólo es posibile para insulina monó era y para insulina dímera - pero nada o muy poco para insulina hexámera o compuestos asociados de elevado peso molecular (Brange et al., Diabetes Care: 13 <1 t:^,, páginas 923-954; Kang et al., Diabetes Cares 14 (1991 >, páginas 942-948). Por lo ta.-4 . la disociación del hexámero es una premisa para la rápida transición desde el tejido subcutáneo a la corriente sanguínea. El comportamiento de asociación y agregación de insulina se ve afectado por zinc++, lo que conduce a una estabilización del hexámero y, en el caso de valores del pH en torno al punto neutro, a la formación de agregados de elevado peso molecular hasta la precipi ación. Sin embargo, el zinc++ como aditivo a una solución de insulina humana na tamponada (pH 4) afecta muy poco al perfil de acción. A pesar de que tal solución es neutralizada rápidamente después de inyección en el tejido subcutáneo y se forman complejos de insulina-zinc, la unión natural de zinc a insulina humana no es suficiente para estabilizar hexámeros y agregados superiores. Por ende, mediante la adición de zinc ++ no se demora notablemente la liberación de insulina y no se consigue un fuerte efecto de depósito. He?ámeros de insulina conocidos muestran un contenido de aproximadamente 2 moles de zinc++ por mol de he?ámero de insulina (Blundell et al., Adv. Protein Chem. s 26 (1972), páginas 323-328). Dos iones zinc por hexá ero de insulina están firmemente unidas con el hexámero de insulina y no pueden separarse mediante una diálisis usual. Ciertamente, se han descrito los denominados cristales de 4-zinc-insul ina , pero estos cristales contienen, por término medio, sólo menos de tres moles de zinc++ por mol de hexámero de insulina (6.D. Smith et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA: 81, páginas 7093-7097). Es misión de la presente invención encontrar derivados de insulina que presenten una capacidad incrementada de unión de zinc, que formen un complejo estable que contiene hexámero de insulina y zinc++ y que muestren un perfil de acción retardado en la inyección subcutánea en comparación con insulina humana. Se han encontrado ahora insulinas de la fórmula I, y/o sales fisiológicamente compatibles de las insulinas de la fórmula I, que cumplen los criterios antes mencionados y que se caracterizan parque Rl representa un resto fenilalanina o un átomo de hidrógeno, R3 representa un resto aminoácido genéticamente codificable, Y representa un resto aminoácido genéticamente codificable, Z representa a) el resto aminoácido His o b) un péptido con 2 a 35 restos aminoácidos genéticamente codificables, que contiene 1 a 5 restos histidina, y los restos A2-A20 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina, y los restos B2-B29 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina. Es especialmente preferida una insulina de la fórmula I, en donde Rl representa un resto fenilalanina, R3 representa un resto aminoácido del grupo Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Slu y Gln, Y representa un resto aminoácido del grupo Ala, Thr, Ser y His, Z representa a) el resto aminoácido His o b) un péptido con 4 a 7 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restos histidina. Además, se prefiere una insulina de la fórmula I, en donde Rl representa un resto fenilalanina, R3 representa un resto aminoácido del grupo Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu y Gln, Y representa un resto aminoácido del grupo Ala, Thr, Ser y His, Z representa a) el resto aminoácido His o b) un péptido con 2 a 7 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restos histidina. Es particularmente preferida una insulina de la fórmula I, en donde Z representa un péptido con 1 a 5 restos aminoácidos, que contienen 1 o 2 restos histidina. Es particularmente preferida una insulina de la fórmula I, en donde Rl representa un resto fenilalanina, R3 representa un resto aminoácido del grupo Asn y Gly, Y representa un resto aminoácido del grupo Thr y His, y Z representa un péptids con 1 a 5 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restos histidina. Ademas, se prefiere una insulina de la fórmula I, en donde Rl representa un resto fenilalanina, R3 representa un resto glicina, Y representa un resto treonina y Z representa un péptido con l a 5 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restos hißtidina. Es muy particularmente preferida una insulina de la fórmula I, en donde Z representa un péptido con la secuencia His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg o Ala Ala His His. La secuencia de aminoácidos de péptidos y proteínas se designa comenzando desde el extremo N-terminal de la cadena de aminoácidos. Los datos que figuran entre paréntesis en la fórmula I, por ejemplo Al, A?>, A7, All, A20, Bl , B7, B19 o B30, corresponden a la posición de restos aminoácidos en las cadenas A o B de la insulina. La expresión "resto aminoácido genéticamente codificable" representa los restos de los aminoácidos Sly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, He, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro y selenocisteina . Por las expresiones "restos A2-A20" y "restos B2-B29" de insulina animal se entienden, por ejemplo, las secuencias de 4 aminoácidos de insulina de ganado vacuno, cerdos o gallinas.

Las expresiones "restos A2-A20" y "restos B2-B29" de derivados de insulina representan las correspondientes secuencias de aminoácidos de insulina humana que son formadas por el intercambio de aminoácidos por otros aminoácidos genéticamente codificables. La cadena A de insulina humana tiene la siguiente secuencia (Seq Id nß 1): Gly, He, Val, Glu, Gln, Cys, Cys, Thr, Ser, lie, Cys, Ser, Leu, Tyr, Gln, Leu, Glu, Asn, Tyr, Cys, Asn. La cadena B de insulina humana tiene la siguiente secuencia (Seq Id nß 2): Phe, Val, Asn, Gln, His, Leu, Cys, Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu, Ala, Leu, Try, Leu, Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr, El derivado de insulina de la fórmula I se puede formar con ayuda de una pluralidad de construcciones de tecnología genética en microorganismos (documentos EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 368 187, EP 0 453 969). Las construcciones de tecnología genética se expresan en microorganismos tales como Escherichia coli o estreptomicetos durante la fermentación. Las proteínas formadas se acumulan en el interior de los mi roorganismos (documento EP 0 489 780) o se secretan en la solución de fermentación. Insulinas a título de ejemplo de la fórmula I ßon: Gly(A21)-insulina hu ana-His (B31 )-His (B32)-0H Gly (A21 >-insul ina hu ana-Hi (B31 )-His (B32)-Arg (B33)-0H Gly(A21)-insulina humana-Ala (B31 )-His (B32)-His (B33)-0H 61y(A21)-insulina humana-Ala (B31 )-His (B32)-His (B33)-Arg (B34)-0H Gly(A21)-insulina humana-Ala (B31 )-Ala (B32)-His (B33)-His (B34)-0H Gly(A21)-insulina humana-Ala (B31 )-Ala (B32)-His (B33)-His (B34)-Arg(B35)-0H La preparación de los derivados de insulina de la fórmula I se efectúa, principalmente, por tecnología genética mediante mutagénesis dirigida al lugar según métodos estándares. Para ello, se construye una estructura de gen que codifica el derivado de insulina de la fórmula I deseado y se expresa en una célula hospedante - preferentemente en una bacteria, tal como E. coli, o en una levadura, en particular Saccharomyces cerevisiae - y - en el caso de que la estructura del gen codifique una proteina de fusión - se libera de la proteina de fusión el derivado de insulina de la fórmula I; métodos análogos se describen, por ejemplo, en los documentos EP-A-0 211 299, EP-A-0 227 938, EP-A-0-229 998, EP-A-0 286 956 y en la solicitud de patente alemana P 38 21 159. La separación de insulina se somete entonces a la sulfitolisis o?idativa según el método descrito, por ejemplo, por R.C. Marshall y A.S. ?nglis en "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (compilador A. Darbre) 1986, páginas 49-53 y a continuación se renatural iza en presencia de un tiol con formación de los puentes dißulfuro correctos, por ejemplo según el método descrito por G.H. Dixon y A.C. ardlaw en Nature (1960), páginas 721-724. Sin embargo, los precursores de insulina también se pueden plegar de forma directa (documentos EP-A-0 600 372j EP-A-0 668 292). El péptido C y - si se encuentra presente - la presecuencia (R2 en la fórmula II) se elimina mediante separación tríptica por ejemplo según el método de Kem ler et al., J.B.C. (1971), páginas 6786-6791, y el derivado de insulina de fórmula I se purifica mediante técnicas conocidas, tales como cromatografía - por ejemplo, documento EP-A-0 305 760 -y cristalización. La invención ße refiere, además, a complejos que contienen un hexámero de insulina y aproximadamente 5 a 9 moles de zinc por he?ámero de insulina, preferentemente 5 a 7 moles de zinc++ por hexámero de insulina, consistiendo el he?ámero de insulina en seis moléculas de insulinas de la fórmula I. La unión del zinc al he?ámero de insulina es tan firme que los 5 a 9 moles de zinc++ por mol de he?ámero de insulina no pueden ser separados mediante diálisis usual durante 40 horas, por ejemplo con un tampón Tris/HCl 10 mM acuoso, pH 7.4. Laß insulinas de la fórmula I muestran después de la aplicación subcutánea en un preparado esencialmente exento de zinc (pH 4), una escasa demora del efecto en comparación con la insulina humana. Después de la adición de aproximadamente 20 µg de zinc 2+/ml de preparado, ße observa, después de la aplicación subcutánea, ya una aparición retardada del efecto. La demora del efecto se observa preferentemente en el caso de 40 µg de zinc 2+/ml. Concentraciones de zinc superiores refuerzan este efecto. La invención se refiere, además, a pre-proinsul ina de la fór ula II, R2-Rl-B2-B29-Y-Zl-61y-A2-A20-R3 (II) en donde R3 e Y están definidos como en la fórmula I de acuerdo con una o varias de las rei indicaciones 1 a 6, y Rl representa un resto fepilalanina o un enlace covalente, y R2 representa a) un resto aminoácido gené icamente codificable o b) un péptido con 2 a 45 restos aminoácidos, y los restos A2-A20 y B2-B29 corresponden a las secuencias de aminoácidos de laß cadenas A y B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina y donde Zl representa un péptido con 2 a 40 steres aminoácidos genéticamente codificables con 1 a 5 restos histidina (His). La proinsulina de la fórmula II ße adecúa como compuesto intermedio en la preparación de las insulinas de la fórmula I. Se prefieren proi sulinaß de la fórmula II, en donde R2 representa un péptido con 2 a 25 restoe aminoácidos. Son particularmente preferidas proinsulinas de la fórmula II , en donde R2 representa un péptido con 2 a 15 restos aminoácidos, en donde en el extremo carboxilo se encuentra un resto aminoácido del grupo Met, Lys y Arg. Los derivados de insulina de la fórmula I de acuerdo con la invención y/o los complejos que contienen un hexámero de insulina y 5 a 9 moles de zinc++ de hexámero y/o sus sales fisiológicamente compatibles (por ejemplo las sales de metales alcalinos o de amonio) se utilizan principalmente como sustancias activas para un preparado farmacéutico para el tratamiento de la diabetes, en particular de la diabetes me11 i tus. El preparado farmacéutico es preferiblemente una solución o suspensión para fines de inyección; se caracteriza por un contenido en al menoß un derivado de insulina de la fórmula I y/o el complejo de acuerdo con la invención y/o al menos una de sus sales fisiológicamente compatibles en forma disuelta, amorfa y/o cristalina - preferentemente en forma disuelta -. El preparado presenta preferentemente un valor del pH de aproximadamente 2,5 a 8,5 en particular de aproximadamente 4,0 a 8,5, contiene un agente ißotónico adecuado, un agente conservante adecuado y, eventualmente, un tampón adecuado, asi como, preferentemente, también una determinada concentración de iones zinc, todo ello naturalmente en solución acuosa estéril. La totalidad de los componentes del preparado, a excepción de la sustancia activa, forma la solución de vehículo del preparado. Preparados que contienen soluciones de la insulina de la fórmula I presentan un valor del pH de 2,5 a 4,5, en particular de 3,5 a 4,5, de preferencia 4,0. Preparados que contienen suspensiones de insulina de la fórmula I presentan un valor del pH de 6,5 a 8,5, en particular de 7,0 a 8,0, preferentemente 7,4. Ageptes ißotónicoß adecuados son, por ejemplo, glicerol, glucosa, anita, NaCl , compuestos de calcio o magnesio, tales como CaC12 o MgC12. Mediante la elección del agente isotónico y/o de la ßustancia conservante, se influye sobre la solubilidad del derivado de insulina o de s? sal fisiológicamente compatible en los valores del pH débilmente ácidos. Agentes conservantes adecuados son, por ejemplo, fenol, m-creßol, alcohol bencílico y/o éster de ácido p-hidro?ibenzoico. Como sustancias tampón, en particular para el ajuste de un valor del pH entre aproximadamente 4,0 y 8,5, se pueden utilizar, por ejemplo, acetato de sodio, citrato de sodio o fosfato de sodio. Por lo demás, para el ajuste del valor del pH son también adecuados ácidos diluidos fisiológicamente inocuos (típicamente HCl) a bases (típicamente NaOH). Cuando el preparado posee un contenido en zinc, éste ße prefiere que sea de 1 µg a 2 mg de zinc++/ml, en particular de 5 µg a 200 µg de zinc/ml. Con el fin de la variación del perfil de acción del preparado de acuerdo con la invención, también puede aportarse por mezcladura insulina no modificada, preferentemente insulina de ganado vacuno, cerdo o humana, en particular insulina humana, o insulinas modificadas, por ejemplo insulinas monómeras, insulinas de rápido efecto o Gly (A21 )-Arg(B31 )-Arg (B32)-insul ina humana. Concentraciones de sustancia activa preferidas son aquellas correspondientes a aproximadamente 1-1500, más de preferencia aproximadamente 5-1000 y, en particular, aproximadamente 40-400 unidades internacionales/ml . EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE Gly (A21 )-INSULINA HUMANA-His (B31 )-His (B32)-0H La preparación del sißtema de expreßión ße efectuó en esencia de acuerdo con el documento US 5.358.857. Ahí se describen también los vectores pINT 90d y pINT 91d (véase el Ejemplo 17) y los cebadores de PCR TIR e Inßull. Estos cuatro componentes sirven, entre otros, como material de partida para las construc iones de vectores descritas en lo que sigue.

Primeramente se introduce en la secuencia que codifica la mini-proinsulina el codón para Gly(A21). Para ello, se utiliza como molde pINT 91d y se lleva a cabo una reacción de PCR con los cebadores TIR e Insu31. 5 'TTT TTT GTC GAC CTA TTA fiCC GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3' El ciclo de PRC se lleva a cabo como sigue. 1er. minuto, 94ßC, 2* minuto, 55ßC, 3er. minuto, 72ßC. Este ciclo se repite 25 veces y luego se incuba durante 7 minutos a 72ßC y a continuación durante una noche a 4ßC. El fragmento PCR resultante se precipita en etanol para la purificación, se ßeca y a continuación ße digiere en el tampón de restricción de manera correspondiente a los datos del fabricante con las enzimaß de reßtricción NcOl y Salí. La mezcla de reacción se separa a continuación por electrsfóresiß en gel y ße aisla el fragmento NcOl-pre-proinßul ina-Sall. El ADN del plásmido pINT 90d se separa asi mismo con NcOl y Salí y el fragmento de proinsulina de mono ße libera de eßta forma del pláßmido residual pINT. Loe dos fragmentoß se ßeparan por electroforeßiß en gel y se aisla el ADN del plásmido residual. Este ADN se hace reaccionar con el fragmento NcOl-Sal 1-PCR en una reacción con ligasa. De esta forma, se obtiene un plásmids pSNT 150d que, después de la transformación en E. coli, se multiplica ahí y a continuación se rea isla.

El ADN del plásmido pINT 150d sirve como material de partida para el pláßmido pINT 302 que permite la preparación de la variante de insulina deseada. Para la construcción de este plásmido, se sigue el camino descrito en el documento US 5.358.857 (véase el Ejemplo 6). Para ello, se llevan a cabo dos reacciones de PCR independientes entre sí, para laß que ßirve el ADN del pláßmido pINT 150d como molde. Una de las reacciones se lleva a cabo con el par de cebadores TIR y pINT B5 (Seq Id no. 11): 5 GAT GCC GCG GTG J3TG GGT CTT GGG TGT 6TAG 3 * y la otra reacción con el para de cebadores Insull y pINT B6 (Seq Id no. 12): 5'A CCC AAG ACC £fiC £A£ CGC GGC ATC GTG GAG 3* Los fragmentos de PCR que resultan son parcialmente complementarios, de modo que conducen, en una tercera reacción de PCR, a un fragmento que codifica una mini-proinßulina 61y(A21) prolongada en laß posiciones B31 y B32. Este fragmento ße separa con NcOi y Salí y, a continuación, ße hace reaccionar con el ADN del plásmido residual pINT 90d descrito en una reacción con ligasa, para dar el plásmida pINT 302. A continuación, una E. coli K12 31110 tranßformada con este plásmida ße fermenta y ße elabora como en el Ejemplo 4 del documento US 5.227.293. El derivado de pre-proi nsul ina obtenido como producto intermedio (antes de la separación de tripsina) tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Pre-proinsulina 1 (Seq Id no. 3): -3. ! Mßt Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg ' Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Gl? Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly La pre-proi nsul ina 1 corresponde a la fórmula II, en que R2 es un péptids con 11 restos aminoácidos, Rl es Phe(Bl), Y es Thr(B30), Zl es His His Arg (B31-B33), R3 es Gly(A21) y A2-A20 son la secuencia de aminoácidos de la cadena A dß insulina humana (restos de aminoácidos 2 a 20), y B2-B29 son la secuencia de aminoácidos de la cadena B de la insulina humana (restos de aminoácidos 2 a 29). La pre-proi nsul ina 1 se separa con tripsina como en el documento US 5.227.293 de acuerdo con el Ejemplo 4. El producto obtenido se hace reaccionar a continuación con carbo?ipeptidasa B de acuerdo con el Ejemplo 11 para dar insulina 1. La insulina 1 corresponde a la fórmula I, en donde Rl es Phe (Bl), Y es Thr (B30), Z es His His (B31-B32), R3 es Gly (A21) y A2-A20 son la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana (restos aminoácidos 2 a 20) y B2-B29 son la ßecuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana (restos aminoácidos 2 a 29). La insulina 1 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Insulina 1 (Seq Id No. 4): Cadena B: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His cadena A: G,Y ,lß Val G,u G,n CVS CVS Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (Puentes disul furo ßegún lo i lußtrado en la fórmula I . EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE Gly (A21 )-INSULINA HUMANA-Ala (B31 )-Hie (B32)-His(B33)-Arg(B34)-0H El vector de e?preßión se construye de manera correspondiente al Ejemplo 1. El plásmido pINT 150d sirve como molde para dos reacciones PCR independientes entre ßí con los pares de cebadores TIR y pINT B7 (Seq Id No. 13). 5' GAT GCC GCG GTG GTG CGC GGT CTT GGG TGT GTAG 3' o Inßu 11 y pINT B8 (Seq Id No. 14): 5'ACCC AAG ACC SCS ££ £ C CGC GGC ATC GTC GAG 3'. Los fragmentos de PRC, a los que conducen laß dos reacciones, son parcialmente complementarios y proporcionan, en una tercera reacción de PCR, la ßecuencia completa que codifica la variante de inßulina deseada. El fragmento de la reacción ße trata con laß enzimaß NcOl y Salí y a continuación ße liga en el pláßmido residual abierto NcOl/Sall del ADN de pINT 90d. Se forma el plásmido pINT 303 que, despuéß de la tranßfor ac ion de E. coli K12 3H0, ßirve como baße para la expresión de la pre-miniproinsul ina deseada. La fermentación y elaboración ße efectúa como en el Ejemplo 1, ßuprimiéndoße la reacción con carbo?ipeptidaßa B. El derivado de pre-proinsul ina obtenido tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Pre-insulina 2 (Seq Id No. 5): Mßt Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phß Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Gly lie Val Gh. Gln Cys Cys Thr Ser lie Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly La p e-proinßulina 2 corresponde a la fórmula II, en la que Rl es Phe (Bl > , R2 es un péptido con 11 restos aminoácidos, Y es Thr (B30), Zl eß Ala His Hiß Arg (B31-B34), R3 es Gly (A21 ) y A2-A20 son la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana (restos aminoácidos 2 a 20) y B2-B29 son la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana (restoß aminoácidaß 2 a 29), La pre-proinßulina 2 ße hace reaccionar, a continuación, con tripßina para dar inßulina 2. La inßulina 2 corresponde a la fórmula II, en la que Rl es Phe (Bl ) , Y es Thr (B30), Zl es Ala Hiß Hiß Arg (B31-B34), R3 es Gly (A21 ) y A2-A20 ßon la secuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana (restoß aminoácidos 2 a 20) y B2-B29 son la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana (resto aminoácidos 2 a 29). La insulina 2 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Insulina 2 (Seq Id No. 6): Cadena B : phß Va| A§n Q|n H¡s Leu Cyg Q(y Sef H¡s Lßu Va| G,u A|a Leu | Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg Cadena A: Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (Puentes de disulfuro según la ilustrado en la fórmula I) EJEMPLO 3 PREPARACIÓN DE Gl (A21 )-INSULINA HUMANA-Ala (B31 )-Ala (B32)- El vector de expresión se construye de manera correspondiente ai Ejemplo 1. El plásmido pINT 150d sirve como molde para dos reacciones de PCR independientes entre sí con los pares de cebadores TIR y pINT 316a (Seq Id No. 15): 5 'GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3' o Insull y pINT 316b (Seq Id No. 16): 5'A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3'. Los fragmentos de PCR, a los que conducen las dos reacciones, ßon parcialmente co plementarioß y proporcionan, en una tercera reacción de PCR, la ßecuencia completa que codifica la variante de inßulina deßeada. El fragmento de la reacción ße trata con laß enzimas NcOl y Salí y a continuación se liga en el plásmido residual abierto NcOl /Salí del ADN de pINT 90d. Se forma el pláßmido pINT 316 que, deßpués de la transformación de E. coli K12 3110, sirve como base para la expreßión de la pre- inoproinßul ina deßeada. La fermentación y elaboración se efectúa como en el Ejemplo 1, suprimiéndose la reacción con carboxipeptidasa B. La p e-proinsul ina 3 obtenida tiene la siguiente secuencia de aminoác idos : P re-pro i nsul i na 3 (Seq Id No. 7) : et Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser A Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser te Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe le Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His Arg Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser HCys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly La pre-proi nsul i na 3 corresponde a la fórmula I I , en la que Rl es Phe (Bl ) , R2 es un péptido con 11 restos aminoácidos, Y es Thr (B30), Zl es Ala Ala His His Arg (B31-B35), A2-A20 son la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana (restos aminoácidos 2 a 20) y B2-B29 son la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana (reßtoß aminoácidoß 2 a 29). La pre-proinßul ina 3 ße hace reaccionar a continuación con tripsina y carboxipeptidasa B como en el ejemplo 11 para dar insulina 3. La insulina 3 corresponde a la fórmula I, en la que Y eß Thr (B30), Z es Ala Ala Hiß His (B31-B34), A2-A20 ßon la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana (restoß aminoácidos 2 a 20) y B2-B29 ßon ia ßecuencia de aminoácidoß de la cadena B de inßulina humana (reßtoß aminoácidos 2 a 29). La insulina 3 tiene la siguiente secuencia de aminoácidoß: Inßu1 ina 3 (Seq Id No . 8) : Cadena B: Pn© va' Asn G!n His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu ( Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr' Ala Ala His His Cadena A: Gly He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys Ser Leu Tyr GJn Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (Puentes dißulfuro según lo ilustrado en la fórmula I) EJEMPLO 4 La insulina 2, preparada según el Ejemplo 2, se hace reaccionar con carbs?ipeptidasa B ßegún el Ejemplo 11 para dar inßulina 4. La insulina 4 corresponde a la fórmula I, en la que Rl es Phe (Bl), Y es Thr (B30), Z es Ala His Hiß (B31-B33) , R3 es Gly (A21) y A2-A20 ßon la secuencia de aminoácidos de la cadena A de la insulina humana (restos aminoácidoß 2 a 20) y B2-B29 son la secuencia de aminoácidos de la cadena B de inßulina humana (restos aminoácidos 2 a 29). La insulina 4 tiene la siguiente ßecuencia de aminoácidos: Insulina 4 (Seq Id No. 9): Cadena B: Phe Val Asp Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr! Ala His His cadena A: ? He Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser He Cys SerJ Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly (Puentes disulfuro según lo ilustrado en la fórmula I) EJEMPLO 5 UNION DE ZINC DE DERIVADOS DE INSULINA Un preparado de insulina (insulina humana 0.243 mM, NaCl 0.13 M, fenol al 0.1X, 80 µg/ml (1,22 M) de zinc++, Tris/HCl 10 mM, pH 7,4) se dializa a 15"C frente a Tris/HCl 10 M pH 7,4 en total durante 40 horas (cambio del tampón después de 16 h y 24 h). Después, los dializados se acidifican, y la concentración de insulina se determina mediante HPLC y el zinc mediante espectroscopia por absorción de átomos. Los valores de zinc se corrigen con el contenido en zinc de una tanda teßtigo que no contiene nada de inßulina. La Tabla 1 muestra los reßultados: Tabla 1: Inßulina comparativa mol de Zn/rool de hexámero de insulina Insulina humana (Hl ) 1,98 Gly(A21)Des(B30)-HI 1,8 Gly(A21)Arg(B31)-Arg(B32)-HI 2,1 Insulinaß de la fórmula I de acuerdo con la invención: Insulina de la fórmula I mol de Zn/mol de he?ámero de inßul ina Gly(A21)His(B31)His(B32)-HI 6,53 Gly(A21 )His(B31 )Hiß(B32)Ar (B33)-HI 5,29 G y(A21)Ala(B31)Hiß(B32)His(B33)-HI 6,73 61y(A21)Ala(B31)His(B32)His(B33)Arg(B34)-HI 5,01 EJEMPLO 6 DEPENDENCIA DEL ZINC DEL PERFIL DE ACCIÓN. DE INSULINA HUMANA EN EL PERRO Aplicación: subcutánea Dosis: 0,3 Ul/kgj pH del preparado, 4,0 El número de perros (n) por ensayo es 6. La Tabla 2 muestra la glucoßa en sangre en V* del valor de partida. TABLA 2 le z i nc í 30 µg de Zn/ l 160 µg de Zn/ml 0 LOO 100 100 0.5 88,66 94,06 101,48 1 59,73 72,31 76,87 1,5 50,61 58,6 67,44 54,32 54,05 61,49 3 61,94 58,84 62,8 4 85,59 70,03 71,32 5 100,46 78,97 81,65 6 105,33 94,63 96,19 7 106 102,46 100,27 8 108,39 106,12 104,34 10 102,72 105,11 105,1 12 105,03 107,14 103,02 EJEMPLO 7 PERFIL DE ACCIÓN DE Gly(A21)Ala(B31)His(B32),His(B33) ,Ar (B34)-INSULINA HUMANA EN EL PERRO (INSULINA 2) La insulina 2, preparada según el Ejemplo 2, se emplea en la siguiente formulación: Glicerol, 20 mg/ml, -cresol 2,7 mg/ml, insulina 2 40 Ul/ml.

Ul representa unidades internacionales y corresponde a aproximadamente 6 nmol de insulina, por ejemplo insulina humana o insulina de la fórmula I. El pH ße ajußta con NaOH o HCl. Aplicación: ßubcutáneaí dosis 0,3 UI/kgj el número de los perros sometidos a ensayo es 6; el pH del preparado eß 4,0. La Tabla 3 mueßtra la glucoßa en sangre en % del valor de partida. Tabla 3 Tiempo exenta de 20 µg de 40 µg de 80 µg de (h) zinc Zn/ml Zn/ml Zn/ml 0 100 100 100 100 1 74,38 95,24 95,6 102,06 2 48,27 90,11 78,74 97,44 3 57,67 89,96 84,81 90,44 4 74,2 81,35 74,66 88,69 91,68 74,43 75,71 79,7 6 100,79 71,61 67,37 65,26 7 98,5 67,73 66,05 62,17 8 100,54 68,92 64,97 47,71 EJEMPLO 8 PERFIL DE ACCIÓN DE Gly (A21 )Ala (B31 )Hiß (B32) , Hiß(B33)- INSULINA HUMANA EN EL PERRO (INSULINA 4) La inßulina 4, preparada de acuerdo con el Ejemplo 4, se formula como en el Ejemplo 7 y se emplea. Aplicación: subcutánea; dosis: 0,3 US/kg; n = 6; pH del preparado, 4,0 La Tabla 4 mueßtra la glucoßa en ßangre en ' del valor de partida. Tabla 4 Ti mpc > exenta de 20 µg de 40 µg de 80 µg de (h) zinc Zn/ml Zn/ml Zn/ml 0 100 100 100 100 1 61,51 70 96,52 101,77 49,82 52,55 89,28 90,01 55,66 60,13 80,23 70,79 4 78,09 78,46 73,03 68,48 5 94,27 97,7 70,3 74,94 6 103,69 105,27 61,86 74,1 7 105,51 106,48 62,28 76,42 8 108,05 104,51 81,68 88 EJEMPLO 9 PERFIL DE ACCIÓN DE Gl (A21 )His (B31 ) , Hiß (B32>-INSULINA HUMANA EN EL PERRO (INSULINA 1) La inßulina 1, preparada ßegún el Ejemplo 1, ße formula como en el Ejemplo 7 y ße emplea. Aplicación: ßubcutáneaj dosiß: 0,3 Ul/kg; n = 6; pH del preparado, 4,0 La Tabla 5 mueßtra la glucoßa en ßangre en Y, del valor de partida . Tabla 5 Tiempo exenta de !0 µg de 40 µg de 80 µg de (h) zinc Zn/ml Zn/ml Zn/ml 0 100 100 100 100 1 60,71 73,16 100,25 102,86 2 52,29 55,43 94,86 100,19 3 61,74 61,6 89,37 89,12 4 79,93 81,53 81,55 79,19 96,17 96,84 73,06 70,67 6 103,2 102,43 74,58 75,75 7 110,86 104,75 77,68 79,36 8 113,42 108,14 84,87 78,74 EJEMPLO 10 PERFIL DE ACCIÓN DE Gly(A21)Ala(B31)Ala(B32)-Hiß(B33)-Hiß(B34)-INSULINA HUMANA EN EL PERRO (INSULINA 3) La inßulina 3, preparada ßegún el Ejemplo 1, ße formula como en el Ejemplo 7 y ße emplea. Aplicación: ßubcutánea; doßis: 0,3 Ul/kg; n = 6; pH del preparado, 4,0 La Tabla 6 muestra la glucosa en sangre en *A del valor de partida. Tabla 6 Tiempo exenta de 20 µg de 40 µg de 80 µg de (h) zinc Zn/ml Zn/ml Zn/ml 0 100 100 100 1 0 1 75 99 101 99 2 57 77 96 91 3 58 64 84 80 4 82 65 73 79 5 94 70 68 77 6 100 74 72 76 7 96 81 80 69 8 1 0 90 88 75 9 100 96 94 83 10 95 98 92 87 12 98 99 95 94 14 95 100 94 93 EJEMPLO 11 PREPARACIÓN DE INSULINA 1 A PARTIR DE PRE-PROINSULINA 1 200 mg de la insulina, estando Arg en el e?tremo carboxi de la cadena B, preparada según el Ejemplo 1, se disuelve en 95 ml de HCi 10 mM. Despuéß de la adición de 5 ml de Triß/HCl 1 M (Triß(hidro?imetil )aminometano) pH 8, ße ajußta el valor del pH con HCl o NaOH a 8. Se añaden 0,1 mg de carbo?ipept idaßa B. Deßpuéß de 90 minutoß, ße ha completado la ßeparación de la arginina. La tanda se ajusta a pH 3,5 mediante la adición HCl y se bombea en una columna de fase inversa (PLRP-S RP 300 10 µ, 2,5 x 30 cm Polymer Laboratories A herst, MA, EE.UU.). La fase A móvil eß agua con ácido trifluoroacético al 0,1 Y,. La faße B conßißte en acetonitrilo con ácido trifluoroacé ico al 0,09'/.. La columna ße hace funcionar con un caudal de 5 ml/min. Después de la aplicación, la columna se lava con 150 ml de A. La elución fraccionada se efectúa mediante la aplicación de un gradiente lineal de 22,5 a 40'/. de B en 400 minutos. Las fracciones ße analizan por separado mediante HPLC de fase inversa analítica y aquellas que contienen Deß-Arg-inßulina de una pureza ßuficiente, se reúnen. El valor del pH ße ajußta a 3,5 con NaOH y el acetonitrilo ße separa en el evaporador rotatorio. A continuación, se precipita la Des-Arg-insul ina mediante ajuste de pH 6,5. El precipitado se separa por centrifugación, se lava doß veces en cada caso con 50 ml de agua y, por último, se liofiliza. El rendimiento eß de 60 a BOY, de inßulina 1.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Hoechßt Aktiengeßel Ißchaft (B) CALLE: (C) CIUDAD: Frankfurt am Main (D) ESTADO FEDERAL: (E) PAÍS: República Federal de Alemania (F) CÓDIGO POSTAL: 65926 (G) TELEFONO: 069-305-6047 (H) TELEFAX: 069-35-7175 (I) TELEX: 041234-700 hod (i i) TITULO DE LA INVENCIÓN: Derivadoß de inßulina con unión a zinc incrementada (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 16 (iv) FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disquette flotante (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SISTEMA LÓGICO: Patentln Releaße no 1.0, versión no 1.25 (EPA) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACIONs 1..21 ( ? i ) DESCR IPC I ÓN DE LA SECUENC I A S SEQ ID N0 : 1 Gly lie Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser II* Cys Ser Leu Tyr 0 .- ' «*«• 1 5 10 1S Glu Aßn Tyr Cys ?sn (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NOi 2: (i) CARACTE ÍSTICAS DE LA SECUENCIA! (A) LONGITUD: 30 aminoácidoß (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla <D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALSZACION: 1..30 (?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:2: Phß Val ?sn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu ?la Leu Tyr 5 10 15 Leu Val Cyß Gly Glu ?rg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lyß Thr 20 25 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 65 aminoácidoß (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Eßcherichia coli (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteina (B) LOCALIZACION: 1..65 (?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:3? Met ?la Thr Thr Ser Thr Gly ?sn Ser ?la ?rg Phe Val ?sn Gln Hia 5 10 15 Leu Cys Gly Ser Hiß Leu Val Glu ?la Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu ] 25 30 ?rg Gly Phß Phe Tyr Thr Pro Lyß Thr Hiß Hiß ?rg Gly lie Val Glu 40 4S Gln Cyß Cyß Thr Ser He Cyß Ser Leu Tyr Gln Leu Glu ?sn Tyr Cyß 50 55 60 Giy, 65 1 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 53 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Eßcherichia coli (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACION: 1..53 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:4: Phe Val ?ßn Gln Hiß Leu Cyß Gly ser His Leu val Glu ?la Leu Tyr 5 10 15 Leu Val Cyß Gly Glu ?rg Giy Phß Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Hiß Hiß 20 25 JO Gly 11. Val Glu Gln Cyß Cys Thr Ser Ilß cyß Ser Leu Tyr ßln Leu " 45 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA! (A) LONGITUD: 66 aminoácidoß (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: ßencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteina (B) LOCALIZACION: 1..66 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:5: Met ?la Thr Thr Ser Thr Gly ?sn Ser ?la ?rg Phe Val ?ßn Gln Hlß 1 S , ?o 1S Leu Cyß Gly Ser Hiß Leu Val Glu ?la Leu Tyr Leu Val Cys Glv Glu 20 25 30 ?rg Gly Phß Phe Tyr Thr Pro Lys Thr ?la His Hiß ?rg Gly lie Val 35 40 45 n Leu Glu ?ßn Tyr (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (O TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALSZACION: 1..55 ( x i ) DESCRIPC IÓN DE LA SECUENCIA : SEQ I D N0: 6: Phe Val ?sn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu ?la Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cyß Gly Glu ?rg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr ?la Hiß 20 25 30 Hiß ?rg Gly He Val Glu Gln Cyß Cyß Thr Ser He Cyß Ser Leu Tyr .- 40 45 Gln Leu Glu ?ßn Tyr Cyß Gly 50 55 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 67 aminoácidoß (B) TIPO: aminoácido (O TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACION: 1..67 ( ? i ) DESCRIPC IÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7 : Met ?la Thr Thr Ser Thr Gly ?sn Ser ?la ?rg Phe Val ?ßn Gln Hiß 10 ls Leu Cyß Gly Ser Hiß Leu Val Glu ?la Leu Tyr Leu Val Cy. Gly Glu 25 30 ?rg Gly Phe Phß Tyr Thr Pro Lyß Thr ?la ?la Hi. His ?rg Gly He 40 45 Val Clu Gln Cy. Cyß Thr Ser He Cyß Ser Leu Tyr Gln Leu Glu ?ßn 60 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (O TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteina (B> LOCALIZACION: 1..55 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:8: Phß Val ?ßn Gln Hiß Leu Cyß Gly Ser His Leu Val Clu ?la Leu iví" 1 5 ?o 15 yr Leu Val Cyß Gly Glu ?rg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lyß Thr ?la ?la 20 25 3o Hiß Hiß Gly lie Val Glu Gln Cyß Cyß Thr Ser He Cyß Ser Leu Tyr 45 Gln Leu Glu ?ßn Tyr Cyß Gly 50 ss (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 54 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (O TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteina (vi) PROCEDENCIA ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Escherichia coli (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteina (B) LOCALIZACION: 1..54 ( xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0: 9: Phe Val ?ßn Gln Hiß Leu Cyß Gly Ser His Leu Val Glu ?la Leu Tvr 1 . 5 10 15 Leu Val Cyß Gly Glu ?rg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lyß Thr ?la Hiß 20 25 30 Hiß Gly He Val Glu Gln Cyß Cys Thr Ser He Cyß Ser Leu Tyr Gln 35 40 45 Leu Glu ?ßn Tyr Cyß Gly (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 10: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A ) LONGITUD: 39 pares de baseß (B ) TIPO : ác ido nuc leico (C ) TIPO DE CADENA: ßenc i l la (D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Exón (B) LOCALIZACION: 1..39 (?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:10¡ TTTTTTGTCG ?CCT?TT?GC CGC?GT?GTT CTCC?GCTG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 paree de baßes (B) TIPO: ácido nucleico (O TIPO DE CADENA: ßenciila (D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Exón (B) LOCALIZACION: 1..31 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11* G?TGCCGCGG TGGTGGGTCT TGGGTGTGT? G (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 paree de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla <D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: E?ón (B) LOCALIZACION: l ..31 (?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: ?CCC?G?CC C?CC?CCGCG GC?TCGTGG? G (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO» 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIAS (A) LONGITUD: 34 pares de baseß (B) TIPO: ácido nucleico (O TIPO DE CADENA: ßencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Exón (B) LOCALIZACI0N: 1..34 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: GATGCCGCGG TGGTGCGCGG TCTTGGGTGT GT?G (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 paree de baßee (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: ßencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Exón (B) LOCALIZACION: 1..34 (?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: ?CCC??G?CC GCGC?CC?CC GCGGC?TCGT GG?G (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 37 paree de baseß (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: ßencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico) (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Exón (B) LOCALIZACION: 1..37 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: G?TGCCGCG? TG?TGCGCCG CGGTCTTGGG TGTGTAG (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 37 paree de baßeß (B) TIPO: ácida nucleico (C) TIPO DE CADENA: ßencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (i i) TIPO DE MOLÉCULA: DNS {genómico) (i?) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Exón (B) LOCAL I ZACION: 1..37 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:16? ACCCA?G?CC GCGGCGC?TC ATCGCGGCAT CGTGGAG

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1.- Insulina de la fórmula
2. (B1) (87) (B19) (B30) y/o una sal fisiológicamente compatible de la insulina de la fórmula I , en donde Rl representa un resto fenilalanina o un átomo de hidrógeno, R3 representa un resto aminoácido genéticamente codificable, Y representa un resto aminoácido genéticamente codificable, Z representa a) el resto histidina o b) un péptido con 2 a 35 restos aminoácidos genéticamente codificables, que contiene 1 a 5 restos histidina, y los restos A2-A20 corresponden a la ßecuencia de aminoácidos de la cadena A de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina, y los restos B2-B29 corresponden a la secuencia de aminoácidos de la cadena B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina. 2.- Insulina de la fórmula I según la reivindicación 1, en donde P.1 representa un resto fenil lanina, R3 representa un resto aminoácido del grupo Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu y Gln, Y representa un resto aminoácido del grupo Ala, Thr, Ser y His, Z representa a) el resto hißtidina o b) un péptido con 4 a 7 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restoß hißtidina. 3.- Inßulina de la fórmula I según la reivindicación 1, en donde Rl representa un resto fenilalanina, R3 representa un resto aminoácido del grupo Asn, Gly, Ser, Y repreßenta un resto aminoácido del grupo Ala, Thr, Ser
3. Z repreßenta a) el resto histidina o b) un péptido con 2 a 7 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restos histidina.
4. 4.- Insulina de la fórmula I según la rei indicación 3, en donde Z representa un péptido con 1 a 5 restoß aminoácidoß, que contiene 1 o 2 restos histidina.
5. 5.- Insulina de la fórmula I según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en donde Rl representa un resto fenilalanina, R3 representa un resto aminoácido del grupo Asn y Gly, Y representa un resto aminoácido del grupo Thr y His, y
6. Z representa un péptido con 1 a 5 restos aminoácidos, que contiene 1 o 2 restos histidina. 6.- Insulina de la fórmula I según la reivindicación 1, en donde Rl rep esenta un resto fenilalanina, R3 representa un resto glicina, Y representa un resto tronina y Z representa un péptido con 1 a 5 restos aminoácidos.
7. 7.- Insulina de la fórmula 1 según la reivindicación 6, en donde Z repreßenta un péptido con la ßecuencia Hiß His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg o
8. 8.- Complejoß que contienen un hexámero de inßulina y 5 a 9 moles de zinc por hexámetro de inßulina, en particular 5 a 7 moles de zinc por hexámetro de insulina, conßistiendo el hexámetro de insulina en seis moléculas de insulina de la fórmula I según una o varias de laß reivindicaciones 1 a 7.
9. 9.- Preparado farmacéutico, caracterizado por una cantidad eficaz de al menos una inßulina de la fórmula general I y/o al menos una sal fisiológicamente compatible de la inßulina de la fórmula I según una o varias de laß reivindicacioneß 1 a 8 en forma dißuelta, amorfa y/o crißtalina.
10. 10.- Preparado farmacéutico según la rei indicación 9, caracte izado por un contenido adicional de 1 µg a 2 mg, de preferencia de 5 µg a 200 µg de zinc/ml.
11. 11.- Preparado farmacéutico según la reivindicación 9 o 10, caracte izado por un pH de 2,5 a 8,5.
12. 12.- Preparado farmacéutico según una o varias de las reivindicacisneß 9 a 11, caracterizado por un pH de 2,5 a 4,5.
13. 13.- Preparado farmacéutico ßegún una o varias de laß reivindicacioneß 9 a 12, caracterizado por un contenido adicional de insulina na modificada, preferentemente inßulina humana no modificada .o insulina modificada, preferentemente Gly (A21 )-Arg (B31 )-Arg (B32)-insul ina humana.
14. 14.- Proinsulina de la fórmula II, R2-Rl-B2-B29-Y-Zl-Gl -A2-A20-R3 (II) en donde R3 e Y están definidos co o en la fórmula I de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, y Rl representa un resto fenilalanina o un enlace csvalente, y R2 representa a) un resto aminoácido genéticamente codificable o b) un péptido con 2 a 45 restos aminoácidos, y los restoß A2-A20 y B2-B29 corresponden a laß secuencias de aminoácidos de las cadenas A y B de insulina humana, insulina animal o un derivado de insulina, y Zl representa un péptido con 2 a 40 esteres a inácidos genéticamente codificables con 1 a 5 restoß histidina.
15. 15.- Proinsulina de la fórmula II, según la reivindicación 14, en donde R2 representa un péptido con 2 a 25 restos aminoácidoß.
16. 16.- Proinßulina de la fórmula II, ßegún la reivindicación 14 o 15, en donde R2 repreßenta un péptido con 2 a 15 reßtoß aminoácidoß, en donde en el extremo carboxi io ße encuentra un resto aminoácido del grupo Met, Lys y Arg.