MXPA97002403A - Procedimiento selectivo para la desacilacion decompuestos acilados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para mejorar la recuperación de lovastatina, pravastatina o compactina de un filtrado de caldo, que comprende:el cultivo en un medio de microorganismos que producen un miembro del grupo que consiste de lovastatina, compactina o pravastatina dando por resultado un medio de producto, la remoción de la biomasa del medio de producto pra obtener un filtrado de caldo clarificado, el aislamiento de la lovastatina, compactina o pravastatina purificada, respectivamente, caracterizado por el ajuste del pH del filtrado de caldo clarificado arriba de aproximadamente pH 10.

Description

PROCEDIMIENTO SELECTIVO PARA LA DESACILACION DE COMPUESTOS ACILADOS CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un mejoramiento para la recuperación de lovastatina, compactina o pravastatina de caldos de fermentación. La lovastatina por ejemplo se produce como un etabolito secundario por diversos microorganismos tales como Aspergillus terreus (patent.; norteamericana No. 4231938) o Monascus ruber (patente norteamericana No. 4323648). Durante la fermentación también se producen subproductos relacionados con la lovastatina tales como 4-acetil-lovasta ina . La lovastatina, usualmente en la forma de ácido, se puede aislar del caldo de fermentación de diferentes maneras. La primera etapa se forma mediants la purificación que produce cristales crudos. Estos cristales crudos comprenden aun compuestos relacionados similares a la 4-acetil-lovastatina. Como lovastatina es un compuesto farmacéutico que tiene que cumplir con requerimientos de alta pureza, es necesaria la REF: 24402 purificación adicional a fin de remover las impurezas relacionadas con la lovastatina. Las impurezas relacionadas con la lovastatina se remueven e*n general mediante recristalizaciones múltiples, mediante la cromatografía en columna como se describe en la patente norteamericana No. 4231938 o la C LAP preparativa (WO 92/16276), disminuyendo significantemente el rendimiento. Mediante el procedimiento de la presente invención, se remueven las impurezas presentes en el filtraco de caldo, previniendo de esta manera la necesicad por su remoción por medio de recristalizaciones adicionales y dando por resultado un rencimiento incrementado. Durante la aplicación del procedimiento de la presente invención, a un filtrado de caldo de un microorganismo que producen cepas tales como por ejemplc Aspergillus terreus, sorprendentemente la 4-acetil- lovastatina se convierte de manera selectiva en lovastatina en lugar de ser convertida en deshidio lovastatina por medio de la deshidratación que oc rre para la 4-acetil-lovastatina pura (ver Figura I) . Otro hecho sorprendente es que el grupo 2-metil -butanoato no se remueve durante la aplicación de la invención.

El procedimiento de la presente invención no ha sido descrito ni sugerido en la técnica anterior .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN I: Esquema de reacción de la desacilación de ácido 4-acetil-lovastatínico a ácido lovastatínico (a) la deshidratación del ácido 4-acetil-lovastatínico a ácido deshidrolovastatínico (b) II. La cromatografía de capa delgada (CCD) que muestra la reducción de impurezas en cristales de lovastatina cruda después de aplicar el procedimiento de la invención. Eluyente: cloroformo/metanol=9/l ; detección: teñido con agua; producto de corrida: 2 µl de una solución que consiste de cristales de lovastatina cruda en tolueno, concentración de 50 g/1. Lado derecho: cristal crudo de filtrado de caldo sin tratar; lado izquierdo: cristal crudo de filtrado de caldo que ha sido agitado durante 2 horas a 50°C y pH 12.5.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para mejorar la recuperación de lovastatina, pravastatina o compactina de un filtrado de caldo. Este procedimiento comprende: - el cultivo en un medio de microorganismos que produce un miembro del grupo que consiste de lovastatina, compactina o pravastatina dando por resultado un medio de producto la remoción de la biomasa de n medio de producto para obtener un filtrado de caldo clarificado - el aislamiento de la lovastatina, compactina o pravastatina purificadas, respectivamente, caracterizado por el ajuste del pH del filtrado de caldo clarificado arriba de aproximadamente pH 10. En forma preferente, el método también comprende calentar el filtrado de caldo clarificado arriba de aproximadamente 50°C. El procedimiento de la invención ofrece un método simple y selectivo de la desacilación de estatizas 4-aciladas en filtrados de caldo, que da por resultado un rendimiento y pureza mejorados de los cristales. Durante el tratamiento en un pH alto, la estatina 4-acilada se convierte en estatina relacionada. La proporción de conversión de, por ejemplo,. 4-acetil-lovastatina en lovastatina en el filtrado de caldo es dependiente del pH y la temperatura de reacción. En una modalidad preferida de la presente invención, el tratamiento se lleva a cabo en valores de pH arriba de pH=10, en forma más prefereite entre pH=10 y pH=13, en forma más prefere te entre pH=ll y pH=12.5. También se prefieran las temperaturas entre 60°C y 95°C. Al aplicar valores de pH más altos y/o temperaturas más altas, el tiempo de reacción para completar la desacilición disminuye. El procedimiento del incremento del pH se puede aolicar de manera ventajosa a los filtrados de caldos de fermentación de cualquier microorganismo que sea capaz de producir un miembro del grupo que consistí de lovastatina, pravastatina o compactina. Los microorganismos capaces de producir estatinas pueden ser una de las siguientes especies: Penicillium, Hipomyces, Paecilomyces, Eupenicillium, Trichodarma, Aspergillus, Monascus, Phoma, Doratomyces, Gymnoascus o Pleurotus . La fermentación de estos microorganismos a fin de producir estatinas se lleva a cabo en medios acuosos similares a aquellos empleados para la producción de otros productos de fermentación. Tales medios contienen fuentes de carbón, nitrógeno y sales inorgánicas que se pueden asimilar por los microorganismos. En general, los carbohidratos tales como azúcares, por ejemplo glucosa, maltosa, sacarosa, xilosa, manitol y similares y almidones tales como granos, por ejemplo, avena, centeno, almidón de maíz, harina de maíz y similares se pueden utilizar ya see solos o en combinación como fuentes de carbonc que se puede asimilar en el medio nutriente. Estas fuentes de carbono se pueden utilizar individualmente, o se pueden combinar varias fuentes de carroño de esta clase en el medio. En general, se pueden utilizar muchos materiales de proteína como fuentes de nitrógeno en el procedimiento de fermentación. Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen por ejemplo, hidrolizados de levadura, levadura primaria, extractos de levadura, harina de soya, harina de semilla de algodón, hidrolizados de caseína, licor o solución acuosa de baño o infusión de maíz, productos de recuperación de desperdicios o pasta de tomate y similares. Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar ya sea solas o en combinación. Entre las sales inorgánicas nutrientes que se pueden incorporar en el medio de cultivo están las sales ordinarias capaces de producir iones de sodio, potasio, amonio, calcio, fosfato, sulfato, cloro, carbonato y similares. También están incluidos los metales traza tales como cobalto, manganeso, hierro y magnesio. Se debe observar que los medios descritos en los Ejemplos son únicamente ilustrativos de la amplia variedad de medios que se pueden emplear, y además no se propone que sean limitantes. Específicamente, las fuentes de carbón utilizadas en los medios de cultivo para producir lovastatina incluyeron dextrosa, dextrina, glucosa, sacarosa, harina de avena, harina o gachas de avena, melasa, citrato, acetato, aceite de soya, glicerol, extracto de malta, aceite de hígado de bacalao, almidón, etanol, higos, ascorbato, y aceite de tocino. Incluidas como fuentes de nitrógeno fueron la leche peptonizada, levadura autolizadas, extracto de levadura, ARN de levadura, pasta de tomate, caseína, levadura primaria, harina de cacahuate, productos de recuperación de desperdicios, licor de infusión de maíz, larina de soya, harina de maíz, NZ amina, extracto de carne de res, asparagina, harina de semilla de algodón, amonio y sulfato de amonio. Los componentes iónicos principales, CaC03, KH2PO<?, MgS04.7H20 y NaCl, también se pueden adicionar así como también cantidades pequeñas de CoCl .6H20 y trazas de Fe, Mn, Mo, B y Cu. Los nutrientes pueden ser ya sea dosificados en el medio de lote o se pueden alimentar (parcialmente) durante la fermentación. El procedimiento de la presente invención se aplica directamente al caldo después de la remoción, de la biomasa, antes de los pasos de purificación adicionales. Por ejemplo, una solución acuosa de hidróxido alcalino terreo o hidróxido de amonio se puede utilizar de manera conveniente para una reacción de esta clase. El filtrado de caldo se trata en un pH alto y en forma preferente a temperaturas altas. Además, durante este tratamiento en pH alto, las proteínas presentes en el filtrado de caLdo de fermentación se desnaturalizan, facilitando su remoción del producto en los pasos de reacción subsecuentes. Los pasos de purificación adicionales pueden comprenden extracción, adsorción a una resina hidrofóbica, intercambio de iones, cromatografía en columna, etc. Los siguientes ejemplos ilustrarán la invención y se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. Los Experimentos II a IV se llevan a cabo bajo una atmósfera de nitrógeno.

EJEMPLOS EJEMPLO I: PRODUCCIÓN DE LOVASTATINA POR MEDIO DE LA FERMENTACIÓN DE LA CEPA AD43 DE ASPERGILLUS TERREUS La cepa AD43 de Aspergillus terreus, DS número 28373 ha sido depositada con la Centraal Bureau voor Schimmelcutures (CBS, Delft, The Netherlands) , y ha sido acordado el número de acceso CBS como CBS 456.95. Un frasquito de 1 mi de una suspensión de espora de la cepa AD43 de Aspergillus terreus, almacenada en glicerol a -80°C se abrió asépticamente, y los contenidos se suspendieron en un matraz sacudidor de 2 litros que contiene 500 mi del sicuiente medio (calentado en autoclave durante 20 minutos a 121°C) : Ingrediente Cantidad por kg Glucosa.1H20 10 g Harina de avena 10 g Pasta de tomate 40 g Sólidos de infusión de maíz 5 g Elementos trazas u oligoelementos 1 g Composición de la solución de los elementos traza u oligoelementos (por 100 mi de agua destilada): FeS04.7H20, 1 g; MnS04.1H20, 1 g; CuCl2.2H20, 0.025 g; CaCl2.2H20, 0.1 g; H3BO4, 0.056 g; (NH4 ) 6M? ?24.4H20, 0.19 g; ZnS04.7H20, 0.2 g. El matraz sacudidor se incubó a 28°C durante 24 horas en un sacudidor rotatorio a 280 rpm (desplazamiento de 3.5 cm) . Luego se incubaron 20 mi del caldo del matraz sacudidor (diluido en 100 mi de solución salina) en un fermentador con 10 kg de caldo en peso. La composición del caldo de fermentación fué como sigue: Ingrediente Cantidad por kg Glucosa.1H20 20 g Pasta de extracto de levadura 33 g Polipropilenglicol 2000 2.5 mi La glucosa y la solución de extracto de levadura/polipropilenglicol se esterilizaron en forma separada (20 minutos a 121°C). Las condiciones de fermentación fueron como sigue : El pH se mantuvo constante a 6.5, utilizando H2S04 y NaOH La temperatura fué de 28°C El suministro de aire fué 1 vvm Tan pronto como toda la glucosa se consumió, se inició una alimentación de glucosa/extracto de levadura a una velocidad de 1.2 g de glucosa por kg de caldo por hora. La composición de la alimentación: Ingrediente Cantidad por kg Glucosa.1H20 500 g Pasta de extracto dß levadura 17 g Polipropilenglicol 2000 14 mi Después de 192 horas de fermentación, el pH del caldo se elevó a pH 10 con NaOH y el caldo se diluyó con 4 litros de agua. Esta fermentación produjo 385 mg de ácido de lovastatina por litro de caldo de fermentación antes de la dilución. Después de la dilución, se midió un contenido de ácido de lovastatina de 411 mg/1.

EJEMPLO II: EFECTO DEL TRATAMIENTO CON CALOR DEL FILTRADO DE CALDO SOBRE LA PUREZA DE LOS CRISTALES DE LOVASTATINA 1,000 mi de filtrado de caldo de la cepa AD43 (concentración del ácido de lovastatina 0.4 g/1, producido de acuerdo con el ejemplo I) se llevaron a pH 12.5 con NaOH 2 N a 25°C, y se llevaron subsecuentemente a 50°C durante 2 horas. Después de 2 horas, la reacción se completó y la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente. Luego el pH se disminuyó a pH 4 utilizando ácido sulfúrico, se adicionaron 3,000 mi de tolueno en mezclado durante 30 minutos. La capa de tolueno se separó de la capa de agua, y se concentró subsecuentemente a un volumen de 80 mi mediante la evaporación a 40°C bajo vacío. El ácido de lovastatina en el extracto se convirtió en la lactona al calentarlo a 90°C durante 3 horas (el rendimiento de conversión fué 99.2%). Después del enfriamiento a temperatura ambiente, el tolueno se mezcló con 80 mi de agua, mientras que el pH se ajustó a pH=10 con NaOH. Después de la separación de las capas, la capa de tolueno se mezcló nuevamente con 80 mi de agua fresca, mientras que el pH se ajustó a pH=4 con ácido sulfúrico. Después de la separación de las capas, la capa de tolueno se trató con 0.1 g de carbón activo, Norti SX ultra. Subsecuentemente, la solución de tolueno se filtró y se concentró adicionalmente a 15 mi mediante la evaporación. El enfriamiento a -10°C dio por resultado la cristalización. Los cristales se lavaron con 5 mi de tolueno frío, y se secaron bajo vacío a temperatura ambiente. En estos cristales no se pudo detectar la 4-acetil-lovastatina, ni mediants la CCD, ni mediante la RMN de protones. En contraste, los cristales obtenidos del caldo ce fermentación por medio del procedimiento descrita anteriormente, pero sin un tratamiento con calor del filtrado de caldo a pH 12, contuvieron 4-aceti 1-lovastatina como se detectó por la CCD (ver la Fig ra II) . También el análisis de RMN de protones mostró la presencia de 1.1% de 4-acetil-lovastatina en estos cristales.

EJEMPLO III. COMPARACIÓN DE DIVERSAS CONDICIONES DE TRATAMIENTO CON CALOR DEL FILTRADO DE CALDO SOBRE LA PUREZA DE LOS CRISTALES DE LOVASTATINA Varias porciones de filtrado de caldo se trataron en diferentes valores de pH y temperaturas y de di íerente duración, como se muestra en la Tabla 1. Para cada conjunto de parámetros, se utilizaron 1,000 mi de un filtrado de caldo de la cepa AD43 (concentración ácido de lovastatina de 0.4 g/1). Después del tratamiento, el filtrado se llevó a pH=4 utilizando ácido sulfúrico, y se mezclaron 1,000 mi de tolueno con el filtrado durante 30 minutos. Las capas se separaron subsecuentemente, y la capa de tolueno se concentró a un volumen de 80 mi mediante la evaporación, y se mantuvo a 90°C durante 3 horas. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, el tolueno se mezcló con 40 mi de agua, mientras que el pH se ajustó a pH=10 con NaOH. Después de la separación de las capas, el tolueno se mezcló con otros '10 mi de agua, mientras que el pH se ajustó a pH=4 utilizando ácido sulfúrico. Después de la separac ion de las capas, se adicionó a la solución de tolueno 0.1 g de carbón activo, Norit SX Ultra. La solí ción de tolueno se filtró a fin de remover el carbón activo, y se concentró subsecuentemente a 15 mi med:.ante la evaporación. El enfriamiento a -10°C dio poi: resultado la cristalización. Los cristales se filt raron, se lavaron con 5 mi de tolueno frío y luego se secaron bajo vacío a temperatura ambiente. Los cristales se analizaron cualitativamente mediante la CCD (gel de sílice Merck 60F, d=0.25 mm, art.nr. 5715; fase móvil cloroformo/metanol en una relación de 30/1), detección mediante UV a 254 nm (la sensibilidad es 0.3% a 0.1 mg de un producto de corrida) y mediante el teñido con yodo (sensibilidad de 0.1% a 0.1 mg de producto de corrida) . Los resultados de estos tratamientos se muestran en la Tabla I .

Tabla 1. Efecto de diversos parámetros de tratamiento con calor sobre la pureza de los cristales de lovastatina. Análisis cualitativo mediante la CCD con la detección con UV (sensibilidad 0.3% para 0.1 mg de producto de corrida' y el teñido con yodo (sensibilidad 0.1% para 0.1. mg de producto de corrida) pH Temperatura Tiempo/ 4-acetil-lovastatina / °C minutos en cristal UV- yodólo 21 30 + + 10 60 30 10 90 10 11 90 10 11 90 5 o 12 21 90 12 60 30 12 60 10 12 90 10 12 90 5 o • - no detectable o mancha débil + detectable EJEMPLO IV: REACCIÓN DEL COMPUESTO PURO DE 4-ACETIL-LOVASTATINA EN EL TRATAMIENTO CON CALOR EN SOLUCIÓN ACUOSA EN pH ALTO (a) Preparación de la 4-acetil-lovastatina Se adicionó anhídrido acético (7 mi; 0.073 moles) en un chorro a lovastatina pura (25 g; 0.062 moles) y 4-dimetilamino piridina (1.53 g; 0.013 moles, 20%) en piridina seca (120 mL a 0°C bajo nitrógeno) . La mezcla se agitó a 0°C durante 6 horas. Mediante el análisis de CCD (ver el Ejemplo 3 para la descripción del método) de la mezcla de reacción, éste mostró que toda la lovastatina ha desaparecido, cambiada presumiblemente en 4-acetil-lovastaitina . Subsecuentemente, la piridina se removió mediante la evaporación y se adicionó acetato de etilo (240 mL) . La solución se lavó con 240 mL de una solución saturada de NaCl. Las capas se separaron y la capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro. La capa orgánica se filtró y se evaporé subsecuentemente el acetato de etilo, produciendo un aceite amarillo claro. Este aceite se identificó como una mezcla 1/1 de 4-acetil-lovastarina y deshidro lovastatina mediante la RMN de protones. La 4-acetil-lovastatina pareció no ser estable en el almacenamiento bajo N; y ocurrió una conversión adicional de la 4-acetil-lovastatina a deshidro lovastatina. (b) Purificación de la 4-acetil-lovastatina mediante la cromatografía Se disolvieron 3 g de una mezcla 1/2 de 4-acetil-.Lovastatina y deshidro lovastatina en 2 mi de cloroformo/metanol (40/1). Subsecuentemente, la solución se absorvió en 120 g de gel de sílice (Baker 533) , la cual a su vez se desarrolló bajo presión (0.3 bar) con una mezcla de cloroformo/metanol (relación 40/1). Se colectaron cuatro fracciones de las cuales el solvente se removió mediante la evaporación. La tercera fracción contuvo 4-acetil-lovastatina con una traza de deshidro lovastatina (0.28 g) , y la cuarta contuvo únicamente 4-acetil-lovastatina (0.3 g) . (c) Reacción de la 4-acetil-lovastatina en una solución acuosa en alto pH y temperatura elevada.

Se disolvieron 0.3 g de 4-acetil-lovastatina (cuarta fracción del Ejemplo IV b) en una mezcla de 2 mL de N, N-dimetilformamida (DMF, Merck) y 98 L de agua desmineralizada. El pH se ajustó a pH 12.5 con HaOH, y la solución se agitó a 60°C durante 1 hora. Subsecuentemente, la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, luego el pH se ajustó a pH=4 con ácido sulfúrico y se mezclaron 60 mL de tolueno con la solución acuosa durante 0.5 horas a fin de extraer los productos de reacción. Después de la separación de las capas, la solución de tolueno se calentó a 90°C durante 6 horas. El tolueno luego se removió mediante la evaporación, produciendo una pequeña cantidad de producto. Este producto se identificó mediante la RMN de protones predominantemente deshidro lovastcitina, mientras que no contuvo ninguna lovastatina .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que reí-ulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para mejorar la recuperación de lovastatina, pravastatina o compactina de un filtrado de caldo, que comprende: - el cultivo en un medio de microorganismos que producen un miembro del grupo que consiste de lovastatina, compactina o pravastatina dando por resultado un medio de producto - la remoción de la biomasa del medio de producto para obtener un filtrado de caldo clarificado - el aislamiento de la lovastatina, compactina o pravastatina purificada, respectivamente, caracterizado por el ajuste del pH del filtrado de caldo clarificado arriba de aproximadamente pH 10.

2. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el pH está entre pH=10 y ?H=13.

3. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el pH está entre pH=ll y pH=12.5.

4. Un procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracte izado por el calentamiento del filtrado de caldo acriba de aproximadamente 50°C.

5. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la temperatura está entre 60 y 90°C.