MXPA97002000A - Deteccion de productos de amplificacion hidrofobicos por extraccion en una fase organ - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a amplificación de una secuencia blanco es detectada cualitativa o bien cuantitativamente mediante la generación concurrente de productos de amplificación secundarios marcados con un marcador lipofilico. Los productos de amplificación secundarios se diseñan de tal manera que se generen y disocien o corten en una forma dependiente de la amplificación del blanco. Esto reduce el número de nucleótidos hidrofílicos enlazados al marcador lipofilico y permite que el producto secundario de amplificación disociado o cortado que comprende el marcador lipofílico pueda transferirse de la fase de reacción acuosa a una fase orgánica para detección como indicador de amplificación de blan

Description

DETECCIÓN DE PRODUCTOS DE AMP IFICACIÓN HIDROFOBICOS POR EXTRACCIÓN EN UNA FASE ORG NICA CAMPO DE LA INVENCIÓN La r s n e invención se refiere a la detección de la amplificación de ácidos nucleicos y especialmente a la detección de la am lificación de ácidos nucleicos por generación concurrente de productos secundarios de amp 1 i f icac i ón. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las técnicas de amplificación in vi tro de ácidos nucleicos proporcionan herramientas potentes para detectar y analizar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos. La e;< trema sensibilidad de tales métodos ha llevado a intentos para desarrollarlos para diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas, islamientos de genes para análisis, detección de ácidos nucleicos específicos como es el caso en la medicina forense. Las técnicas de amplifica ión de ácidos nucl icos pueden agruparse de conformidad con los requerimientos de temperatura del proce imiento. La reacción en cadena de pol imerasa (PCR; R. K. Sa i.k i , et al. 1985. Science 230, 1350-1354), reacción en cadena de ligasa (LCR; D. Y. Wu, et al. 1989. Genomics 4, 560-569; K. Barringer, et al. 1990. Gene 89, 117-122; F. Barany. 1991. Proc. Nati. Acad. Se i. EUA 88,189-193) y amplificación basada en anscripci n (D. Y. woh , et al. 1989. Proc. Nati. Acad.

Se i . EUA 86, 1173-1177) requieren de ciclos de temperatura. En contraste, métodos como por ejemplo amplificación por desplazamiento de hebra (SDA; G. T. W er, et al. 1992. Proc. Nitl. Aci. EUA 89, 9 - 6? G. T. WaHer, et al. 1992. Nuc. Acíds. Res. 20, 1691-1696; U.S. Patente Norteamericana No. 5,270,184), repli ación autasos enida de secuencias (2SR; J. C. Guatelli, et al. 1990. Proc. Nati. Acad. Se i . EUA 87, 1874-1878) y el sistema de Qß replicasa fP. M. Lizardi, et al. 1988. BioTechnolo 6, 1197-1202) son reacciones isotérmicas. Además, los documentos W0 90/10064 y WQ 91/03573 describen el uso del origen de la replicación phi29 de bacterióf gos para la repli aron isotérmica de ácidos nucl icos. Varios métodos han sido desarrollados para detectar y/o medir la amplificación de ácidos nucl icos. Esencialmente, estos métodos se basan en iniciadores, lo que significa que dependen de la hibridación de un iniciador sobre la secuencia, en algunos casos seguida por la extensión del iniciador. La detección basada en iniciador de ácidos nucl icos an ificados en PCR se basa frecuentemente en la incorporación de un iniciador de amplificación en el producto amplificado (amplicón) durante la reacción de amplifica ión. Cara erísticas int oducidas en el iniciador de amplificación de PCR aparecen por consiguiente en el producto de amplifica i n y pueden emplearse o b en para detectar la secuencia blanco anticipada o bien para inmovilizar el amplicón para detección por otros medios. Sin embargo, los métodos basados en iniciadores de detección de productos -Je am lifica i n por PCP requieren de o reacciones de amplificación para lograr una sensibilidad elevada, es decir, la detección de menos de 100 copias de la secuencia blanco. Es decir, una primera amplificación de la secuencia blanco es seguida por una segunda amplificación usando iniciadores anidados que incorporan las modificaciones deseadas para captura y/a detección. Dos amplificaciones consecutivas son necesarias para evitar niveles inaceptablemente elevados de señal de fondo producida por la amplificaci n de ADN no blanco equivocadamente iniciados con los iniciadores modificados que generan señales. Esta caracterís ica de los métodos de la técnica anterior hace que sean laboriosos y que requieran de mucho tiempo, y las ventajas de los métodos de detección basados en iniciadores son por consiguiente frecuentemente compensadas por el reque imiento de una segunda reacción de amplifica ión consecutiva. P.M. Holland, et al. (1992. Clin. Chem. 38, 162-463) describen un método para detectar productos de amplificación en PCR en donde la actividad 5 ' -3 ' exonucleasa de la pol ímerasa de ADN Taq se emplea para generar una señ l específica para amplificación de blanco mediante detección de una sonda marcada hibridada corriente abajo de un iniciador de amplificaci n. La sonda marcada no puede extenderse, posiblemente porque algunos de los sistemas de detección descritos hacen uso del r idor de e tremos 3'. Además, una sonda marcada que pueda extenderse funcionaría como un iniciador de am lificación en PCR, i ncrementanto así la señal de fondo no específica en la reacción. Fragmentos de sonda disociados se generan durante la amplificación, y pueden dif renci rse de la sonda no disociada de varias manera, según el tipo de marcador de sonda. Los autores sugieren una cromatografía en capa fina o bien captura por un marcador de biotina 3' para separar las sondas disociadas de las sondas no disociadas, o secuene i miento. Estos métodos de detección requieren de manipulaciones laboriosas y que requieren de mucho tiempo de la muestra después de la ampl i f icaci i n. Los presentes métodos para la detección basada en iniciadores de amplificación de blanco hacen también uso de una reacción de amplificación ?nica para generar concurrentemente productos secundarios para detección. En contraste con P. M. Holland, et al. y otros métodos de la técnica anterior, sin embargo,, los productos de amplificación secundarios son detectados en un formato sencillo mediante extracción en una fase orgánica. Como se emplea aquí, los siguientes términos y frases se definen de la siguiente manera: Un iniciador de amplificación es un iniciador para amplificar una secuenca blanco mediante extensión de iniciador. En el caso de SDA, el extremo 3' del iniciador de am li icación (l secuencia de enganche blanco) se híbrida en el extremo 3' de la secuencia blanco. El iniciador de amplificaci n comprende un sitio de reconoci iento para una endonucleasa de restricción cerca de su extremo 5'. El sitio de reconocimiento es para una endonucleasa de restricción que disociará una hebra de un dúplex de ADN cuando el sitio de reconocimiento se encuentra en hemimod i f icado ("nicking"), de conformidad con lo descrito por Walker, et al. (1992, PNAS, supra). Un sitio de reconocimiento he imodi f icado es un sitio de reconocimiento de doble hebra para una endonuc leasa de restricción en donde una hebra contiene cuando menos un n?clótido derivado que provoca que la endonueleasa de restricción corte la primera hebra en vez de disociar ambas hebras del sitio de reconocimiento. Hab i tua lmente, la hebra de iniciador del sitio de reconocimiento hemimod i f icado no contiene nucleótidos derivados y es cortada , por la endonucleasa de restricción. Alternativamente, el iniciador puede contener nucleótidas derivados que provocan que la hebra blanco no modificada esté protegida contra disociación mientras se corta la hebra del iniciador modificado. Tales endonuc leasas de restricción pueden ser iden ificadas en sistemas rutinarios de tamizado en donde un dNTP derivado es incorporado en un sitio de reconocimiento de endanucleasa de restricción para la enzima. Los sitios de reconocimiento hemimod i f icados preferidos -son i i s de reconocimiento he i fosforot loados para las endonuc leasas de restricción HincII, HindII, Aval, Nc i I , Fnu4HI, BsoBI y BsrI. El iniciador de amplificación comprende también un grupo 3 ' -OH que puede extenderse mediante ADN pol imerasa cuando la secuencia de enlace de blanco del iniciador de amplificación es hibridada sobre la secuencia blanco. Para la mayoría de la reacción de SDA , el iniciador de am lificación es responsable de la amplificación exponencial de la secuencia blanco. Puesto que no se requiere de ninguna secuencia ni escritura especial, los iniciadores de amplificación para PCR consisten generalmente solamente de secuencias de enlace con blanco.

Los productos de extensión son ácidos nucl icos que comprenden un iniciador y una hebra recien sintetizada ^ue es el complemento de la secuencia blanco corriente abajo del sitio de epalce del iniciador. Productos de extensión resultan de la hibridación de un iniciador sobre una secuencia, blanco y de la extensión del iniciador por pol imerasa usando al secuencia blanco como templado. Un iniciador de amortiguador es un iniciador que se templa sobre una secuencia blanco corriente arriba del iniciador de amplificación, de tal manera que la extensión del iniciador de amortiguador desplaza el iniciador de amplificación corriente abajo y su producto de extensión. La extensión de los iniciadores de amortiguador es un método para desplazar los p o uctos de ' tensión de los iniciadores de amplificación, pero el tratamiento es también adecuado. Las expresiones blanco o bien secuencia blanco se refieren a las secuencias de ácidos nucl icos a amplificar. Incluyen la secuencia de ácidos nucleicos original a amplificar, su segunda hebra co p lemantaria y cualquier hebra de una copia de la secuencia original producida en la reacci n de amplificación, la secuencia blanca puede también referirse a un templado para e: tensión de iniciadores hibridados. Un iniciador de señal es un iniciador que se hiopda en una secuencia blanco corriente abajo de un iniciador de amplificación de tal manera que la extensión del iniciador de amplificación desplace el iniciador de señal, una parte del iniciador de señal o bien el producto de la extensión del iniciador de señal. El iniciador de señal comprende además un grupo reportero lipofílico o bien marcador que facilita la detección de productos secundarios de amplificación generados a partir del iniciador de señal. Los productos de amplificación, productos amplificados o bien a pl icones son copias de la secuencia blanco generada por hibridación y extensión de un iniciador de amplificación. Este término se refier tanto a los productos de extensión del iniciador de amplificación de hebra única co o de hebra doble que contienen una copia de la secuencia blanco original, incluyendo intermedios de la reacción de a pl i f i cae ion. Productos secunda ios de amplificación o bien product>?s secundarios son ol iganuc leo idos generados a partir de un iniciador de señal en una forma que depende de la amplificación del banco. Estos términos se refieren a productos de hebra única o bien de doble hebra generados a partir de los iniciadores de señal, así como partes de iniciadores de señal o bien productos de extensión de iniciador de señal generados como resultado de la amplific ción de blanco. La disociación de un ol igonucleó ido se refiere al rompimiento de los enlaces fosfodiéster de la molécula de tal manera que se producen dos productos de disociación de ol igonuc leót idos, es decir, el rompimiento de los embaces en ambas hebras de un duples dé ADN o bien el rompimiento del enlace de ADN de hebra única. Esto contrasta con el corte (nicking) que se refiere al rompimiento del enlace de fosfodiéster de solamente una de las dos hebras en un duples de ADN. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para detectar la amplificación de una secuencia blanco. De manera secundaria, productos de amplificación específicos para blanco son generados a partir de iniciadores de señal en una reacción acoplada a la amplificación de blanco. Los productos secundarios de la amplificación pueden por consiguiente emplearse para detectar y/o medir la amplificación de secuencia de blanco. El producto secundario de la amplificación es un ol igonuc léot ido que comprende un marcador lipofílica. El producto secundario de amplificación marcado se diseña lde tal manera que esté disociado o cortado en una forma que depende de la amplificación del blanco durante la amplificación, eligiendo así el número de nucleótidos hidrof í lieos enlazados al marcador lipofílico y permitiendo que el producto de disociación marcado esté transferido de la fase acuosa de la reacción de amplificación en una fase orgánica. El iniciador de señal no disociado o no cortado más hidrofílico permanece en la fase acuosa como resultado del número mayor de nucleótidos hidrof i lieos enlazados al marcador lipofílica. El marcador transferido a la fase orgánica es detectado como indicador de amplificación de blanco. La detección del marcador puede ser una medición cualitativa o bien cuantitativa de la amplificación de una secuencia blanco. Los métodos de la presente invención son especialmente útiles para monitorear reacciones de amplificaci n en situaciones en las cuales la detección directa de a pl icones de secuencia banco pudieran interferir con manipulaciones o procedimientos adicionales. La extracción orgánica para la detección de productos secundarios de amplificación proporciona un sistema de detección altamente sensible en un formato rápido y sene i 1 lo. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la generación de un producto de amplificación secundario concurrentemente con la am lificación de blanco popr medio de SDA, La figura 2 ilustra la generación de un producto de amplificación secundario concurrentemente con SDA, el producto secundario comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción disociado para liberar un producto de disociación lipofílico. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención es un método para detectar o monitorear la amplificación de un blanco mediante la conversión de un iniciador de señal hidrofílico que comprende un marcador lipofílico en un producto de amplificación secundario lipafílieo que se transfiere de la fase de reacción acuosa a una fase orgánica para detección. La conversión se realiza en una forma que depende de la amplificación de blanco. Es decir, la producción del producto secundario de amplificaci n se acopla con la amplificación de la secuencia blanco. Además, el producto de amplificación secundario se genera de manera concurrente con la amplificación de la secuencia blanco. Una vez generado, el producto de amplificaci n secundario no interfiere ni iriliii)'-' 1 J -, p 1 i f i '" * • i J 11 p> j > m - 1 de ) =.?-»?-? ?en>- i a d^ b 1 a ivn deseada. Los métodos son por consiguiente especialmente útiles para la detección de amplificación de la secuencia blanco en situaciones en la cuales la detección directa de la secuencia blanco amplificada en sí inhibiría o haría imposible una reacción o manipulación posterior de los a pl icones. Las propiedades lipofílicas del producto secundario de amplificación permite una separación sencilla de los iniciadores de señal marcados, no reaccionaron, por ejemplo, mediante ransferencia a una fase orgánica. En una modalidad de la presente invención, los iniciadores de amplificación para SDA son hibpdados en una secuencia blanco que es después amplificada generalmente de conformidad con lo descrito por Walfeer, et al. (1992. PNAS ó 1992 Nuc . Acids Res., supra). Como descrito en estas dos publicaciones, la secuencia blanco debe prepararse para SDA ya sea mediante restricción de ADN total con una endonucleasa de restricción apropiada ( r ejemplo, Psal) o mediante la generación de fragmentos blanco que tienen los sitios de reconocimiento endonucleasa de restricción apropí idos en los e;-tremos usando ini iadores de amortiguador e iniciadores de amplificación. Los fragmentos preparados que contienen la secuencia blanco son después amplificados mediante SDA. Sin embargo, al reacción de SDA de la preisnte invención comprende además cuando menos un iniciador de señal que resulta en la generación simultánea o concurrente de un producto secundario de am lificación para su. uso en la detección o el moni toreo de amplificaci n de la secuencia blanco. Para algunas aplicaciones, puede ser preferible incluir un par de iniciadores de señal, cada uno de los cuales se híbrida en una de las dos hebras de una secuencia blanco de doble hebra. El iniciador de señal se híbrida sobre la secuencia blanco corriente abajo del sitio de hibridación del iniciador de amplificación. Puede extenderse mediante pol imerasa de manera similar a la extensión de los iniciadores de amplificación, pero esta carac erís ica no se refiere en todos los sistemas de amplificación (por ejemplo el método PCR del ejemplo 4). Es decir, el iniciador de señal se híbrida en un sitio dentro de la secuencia blanco de tal manera que la extensión del iniciador de amplificaci n despilaza el iniciador de señal, una parte del iniciador de señal o bien el producto de extensión del iniciador de señal. Cuando menos el extremo 3' del iniciador de señal comprende un secuencia que se híbrida sobre la secuencia blanco. Altern tivamente, el iniciador de señal, entero puede h ib r id izarse en la secuencia blanco, dependiendo del método seleccionado para reducir el número de nucleótidos en el iniciador de señal. El iniciador de señal se marca ad ic lon lmente en su extremo 5' con un marcador lipofílico. El marcadro lipofílico se incorpora en el producto de amplificaci n secuendapa >~omo resultado de la amplificación de blanco. En es* modalidad, los iniciadores de señal no pueden funcionar como iniciadores de amplificación en la reacción de SDA porque no tienen un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que pueda cortarse. Por con iguiente, cualquier producto de extensión formado mediante una extensión errante de un iniciador de señal en un templado no bl nco no puede someterse a una amplificación subsecuente. Puesto que la falla de iniciación en si es un hecho comparativamente poco frecuente, se detecta generalmente solamente después de amplificación subsecuente de la secuencia equi ocadamente iniciada. Por consiguiente, en ausencia de amplificación subsecuente, los iniciadores de señal pueden estar presentes en la reacción de amplificación sin ningún incremento significa i o de los niveles de señal de fondo. En combinación con una extracción orgánica sencilla para separar los productos secundarios de amplificaci n marcados para su análisis, esto significa en gran medida el procedimiento . La generación de un producto secundario de amplificación de doble/ hebra durante SDA se ilustra en la figura 1. La parte superior de la figura 1 ilustra la reacción de amplificación que ocurre en SDA. Camo antes establecido, los fragmentos de ácidos nucleicos que tienen secuencias apropiadas de reconocimiento de endonu leasa de restricción en los extremos y que contienen la secuencia blanco puede ser preparados para SDA ya. sea como lo describe Walker, et al. 1992. PNAS, supra o bien como lo describe Walker, et al. 1992 Nuc . Acids Res., supra. Para mayor sencilles, las ilustraciones de las figuras 1 y 2 empiezan con un fragmento de ácidos nucl icos que puede amplificarse que contiene la secuencia blanco. Si se prepara de conformidad con Walker, et al. 1992. PNAS, supra, representa un ADN de doble hebra restringido que ha sido desnaturalizado. Si se prepara de conformidad con Walker, et al. 1992. Nuc. Acids Res., s?.pra se agregan sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiados al fragmento de conformidad con el esquema de generación de blanco presentado. Durante la generación de blanco de SDA, los iniciadores de amor iguador, amplificación y señal se hibridan sobre una secuencia blanco en el esquema de generación de blanco, con extensión de cada iniciador corriente arriba desplazando el iniciador corriente abajo y generando de manera concurrente unos fragmentos de blanco amp l i f icab les y productos secunda r ios de amp i i f icac ion, La parte inferior de la figura 1 ilustra la conversión concurrente del iniciador de señal de hebra única en una forma de hebra doble. Un iniciador de señal se híbrida en una hebra de la secuencia blanco corriente abajo de un iniciador de amplificaci n (l). Tanto el iniciador de am lificaci n como el iniciador de señal se extienden por pol imerasa de ADN usando la secuencia blanco camo un templado (II). El producto de extensión de iniciador de señal es desplazado del templado por extensión del iniciador de amplificación y a su vez sirve como templado para hibridación y extensión de un segundo iniciador de am lificación (III y IV), lo que hace que el producto de extensión de iniciador de señal sea de doble hebra (V). Un segundo iniciador de señal que se híbrida en la segunda hebra de una secuencia blanco de doble hebra puede opcionalmente estar incluida en la reacción. El segundo iniciador de señal se híbrida sobre la segunda hebra de la secuencia blanco corriente iba jo del segundo iniciador de amplificación y se extiende y se desplaza por extensión del segundo iniciador de amplificación. El producto de extensión del segundo iniciador de señal se vuelve de hebra doble mediante hibridación y extensión del priemr iniciador de amplificación. Será también eviente a partir de la ilustración de la invención en la figura 1 que se pueden emplear varios iniciadores de señal, cada uno h ibr idandose en la secuencia blanco corriente abajo del otro en la misma hebra, y todos los iniciadores de señal se hibridan corriente abajo del iniciador de amplificación. De esta forma, cada iniciador de señal es desplazado por extensión del iniciador de señal corriente arriba \ el iniciador .Je señal más 5' es desplazado por el iniciador de amplificación. Los múltiples iniciadores de señal deberían diseñarse de tal manera que no se hibriden entre ellos o bien con el iniciador de amplificación para la hebra opuesta de la secuencia blanco. El uso de múltiple iniciadora de señal tiene la ventaja de incrementar o bien amplificar la señal generada por el blanco, con un incremento de la sensibilidad del ensayo. El nlimero de nucleótidos enlazados al marcador lipofílico en el producto secundario de amplificación de doble hebra se reduce en forma dependiente de la amplificación de blanco para facilitar la extracción orgánica y la detección del marcador. Es decir, las moléculas de iniciador de señal de hebra única, sin reaccionar con el marcador enlazado no pueden entrar en la fase orgánica debido a su gran número de nucleó idos enlazados, los que proporciona a la molécula propiedades más h idrof 11 ica . En una modalidad, el iniciador de señal comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción colocado de tal manera que la disociación o el corte del producto secundario de amplificación de doble hebra por la endonucleasa de restricción genera un fragmento marcado que comprende un número reducido de nucleótidos que es suficientemente lipofílico para ser transferido de la relación de nnplificicion I M ?I a una f se r>j-5n?c?. Este si o ,j 5 reconocimiento debería ser para una endonucleasa de restricción que no disocia la secuencia blanco. Típicamente, tal sitio de reconocmiento de dendonuc leasa d erestricción se encontrará hacia el extremo 5' del iniciador de señal para minimizar el número de nuclótidos que permanecen 0 enlazados al marcador después de disociación o corte. La endonucleasa de restricción no disocia su sitio de reconocimiento en el iniciador de señal de hebra única. Sin e bargí, el iniciador de señal se vuelve di sociable o bien puede cortarse por la endonucleasa de restricción cuando se 5 convierte de una forma de hebra única a una forma de hebra doble durante la amplificaci n del blanco. Por consiguiente, solamente productos secundarios de amplificación de hebra doble producidos durante la amplificación de blanco serán disociados o bien cortados y transferidos a la fase <"> orgánica. La reacción en l cual un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción es disociado se ilustra en la figura 2, donde el sitio de reconoci iento de endonucleasa •de restricción se muestra como una parte elevada en la hebra 5 de ácidos nucl icos. Los pasos iniciales para generar el producto secundario de amplificación de doble hebra a partir del iniciador de señal de hebra única (estructuras I-V) son los pasos ilustrados en la figura 1 (I-V). La figura 2 ilustra un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de hebra doble en la estructura V 'bloques elevados) que puede disociarse medianta la endonucleasa de restricción para generar los productos dissciables - un producto de disociación lipofílico y un producto de disociación de ol igonuc léo ido no marcado. Además, el sito de reconocimiento de endanucleasa de restricción en el extremo 5' del iniciador S2 extendido en la estructura V puede cortarse y puede desplazarse, produciendo una hebra sobre la cual se puede hibridar en el iniciador de señal (VI). El sitio de reconoc i i nto de endonucleasa de restricción de doble hebra en VI puede también disociarse para generar un producto de disociación lipofílico marcado (VI'), o bien puede ser extendido por polimerasa para generar una molécula completa de doble hebra (VII) antes de disociación y generación del producto de disociación lipofílico marcado (VII'). V, VI' y VII' representan vías de reacción alternativas para la generación de productos secundarios de amplificación lipofílicos marcados. Como se ilustra, el sitio de reconocimiento se vuelve de doble hebra durante la amplificación de blanco y es disociado por la endonucleasa de restricción liberando un producto secundario de disociación de am lificación que comprende el marcador lipofílica enlajado a un número menor de nucleótidos hidrofí lieos que los que se encuentran presentes en el i ??> U'i'ii e -,eñal. Co o re ulti o de su h idrofoh i c idad incrementada y de su 1 ipof 11 ic i dad incrementada, el producto de disociación basado se vuelve soluble en la fase orgánica, preparando el marcador generado como resultado de la amplificación de blanco del marcador del iniciador de señal sin reaccionar. Cuando permanecen muy pocos nucleótidos enlazados al marcador, el producto secundario de disociación de amplificación de doble hebra puede desn turalizarse en hebras únicas. Es tambi n el caso de l s productos de amplificación secundarios cortados, como se describe a continuación. Los productos de disociación de amplificación secundarios más largos pueden ser suficientemente etables para permanecer hibpdados. El hecho de si el producto disoci do es de hebra única o de doble hebra no es esencial para la invención, puesto que ambas formas serán transfenbles a la fase orgánica en base a la 1 ipof 11 íc i dad incrementada. El iniciador de señal de longitud completa sin reaccionar, que es más hidrafílico debido al mayor número de nu leótidos h í rof í 1 ?>~ os enlazados al marcador lipofílico, permanece en la fase acuosa. Por consiguiente no hay amplificaci n de blanco, se detectará poco o ningún marcador en la fase orgánica. Conforme ocurren niveles mayores de amplificación de blanco, se detectará un mayor número de marcador en la fase orgánica. Los métodos de la presente invención pueden por consiguiente emplearse ya sea para la detección > ualititua e la a nl?f?~<a> i ón (presencia o ausencia de blanco) o bien para la cuant i f icac i ón de la amplificación (medición de la cantidad de marcador en la fase orgánica para determinar la cantidad inicial de blanco) . Cuando la amplificación es por medio de SDA, la endonucleasa de restricción empleada para reducir el número de nuc leót idos enlazados a el marcador 1 ipof íl ico puede ser la misma endonucleasa de restricción deseada en la reacción SDA (por ejemplo BsoBI o HinoII). En este caso, el sitio de reconocimiento de endonucleasas de restricción en el iniciador de señal puede ser el itio de reconocimiento alternativo para la endonuc lesas de restricción que no está protegido de la disociación de la hebra doble por incorporaci n de dNTPs modificados durante la amplificación. El sitio de reconocimi nto de endonucleasa de restricción en los iniciadores de amplificación, sin embargo, es un sitio de reconocimiento cortado por la endonucleasa de restricción cuando se encuentra en forma hemimad i f icada . Por ejemplo, el sitio de reconocimiento HincII GTCGAC se encuentra sometido a una disociación de la hebra doble por HincII aún cuando se encuentra hemimod i f icado por la incorporación de alfatio-dATP . El sitio de reconocimiento es por consiguiente adecuado para su uso en el iniciador de señal. En contraste, el sitio de reconocimiento de HincII GTTGAC es cortado cuando es hemimod i f icad por incorporación de alfatio-dATP y es por consiguiente adecuado para su uso en los iniciadores de amplificación. De la misma manera, el sitio de reconocimiento de BsoBI CTCGAG se encuentra sometido a disociación de hebra doble por BsoBI aún cuando es hemimod i f fcado con alfatia-dCTP y es por co iguiente adecuado para su uso en el iniciador de señal. El sitio de reconoci iento de BsoCI CTCGGG es portado cuando es hemimo i f icadon con alfatio-dCTP y es por consiguiente adecuado para su uso en los iniciadores de amplificación. Un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción que puede cortarse en el iniciador de señal puede también emplearse para generar los productos secundarios de amplificación, puesto que segmentos de nucleótidos marcados muy cortos resultando del corte permanecerí n hibridadas y serían liberados en la fae orgánica. Si algunos de los efectos cortados, marcados, cortos permanecen hibridados en el iniciador de señal, el corte puede ubicarse cerca del extremo 5' del iniciador de señal para evitar el inicio de la polimeri ación y el desplazamiento por la pol imerasa. Las polimerasas, en general requieren de apro imadamente 8 a 10 nucleótidos de 5' hasta el corte para la iniciación. Par consiguiente, usando endonucleaßas de restricción como por ejemplo HincII o bien BsoBI, la secuencia blanco puede ser amplificada y el número de nucleótidss en los productos secundarios de amplificación puede reducirse concu entemente por medio de una endonucleasa de restricción única. Al ernativamente, la endonucleasa de restricción para reducir el número de nucleó idos en el producto secundario de amplificación puede ser diferente de la endonucleasa de restricción para SDA. Por ejemplo, un sitio cié reconocimiento EcoRI , o bien cualquier otro tipo de reconocimiento que permanece disociable al incorporarse dNTPs modificados durante SDA, puede incluirse en el iniciador de señal. En este tipo de reacción, tanto la disociación de la endonu leasa de restricción co o el corte de la endonucleasa de restricción pueden estar presentes en la reacción de amplificación para lograr la amplificación concurrente del blanco y la generación de productos de disociación lipofílicos. Métodos de tamizado de rutina que prueban una endonucleasa de restricción contra su sitio de reconocimiento hemimod i f icado pueden emplearse para identificar los sitios de reconocimiento disociados y los sitios de reconocimiento cortados. Será evidente a partir de las reacciones ilustradas en las figuras 1 y 2 que, además de SDA, los métodos de la presentación pueden adaptarse fácilmente a otros métodos de amplificación de extensión y de iniciador (por ejemplo PCP o bien 3SR). Por ejemplo, el remplazo de los iniciadores de amplificación para SDA con iniciadores de amplificación para PCP y una. ADN pol imerasa de PCP que no tiene la actividad endonucleasa 5'-* 3' (por ejemplo Sequencing Grade Taq de Promega o bien exo- Vent o bien exo- Deep Vent de New England BioLabs) en el esquema de reacción de la figura 2, se generan productos secundarios de amplificación que contienen un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de doble hebra, disociable, proporcionado por el iniciador de señal. Puesto que el termociclaje es una caracterís ica de la amplificación por PCR, la endonucleasa de restricción se agrega de preferencia a temperatura baja después del ciclo final de templado y extensión de iniciador, sin embargo, una endonucleasa de restricción termofílica que permanece activo durante el ciclo de alta temperatura de la reacción de PCR podría estar presente durante la amplificación. Como en el caso de los sistemas SDA, la disociación del sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción genera un. producto secundario de amplificación lipofílico. Este producto secundario de amplificación puede transferirse a una fase orgánica para detección como indicador de amplificación del blanco como descr i to aquí . En un método de PCR. preferido, de conformidad con la presente invención, los productos de amplificación secundarios 1 ipof í lieos pueden ser generados a partir de un iniciador de señal hidrofilico en una forma que depende de la amplificación del blanco mediante el e plo de un marcador 1 ipof íl ico en los métodos de PCP de P. M. Holl nd, el al., supra. Con referencia a la figura en la página 462 de la publicación, la ADN pol ímerasa de Taq extiende el iniciador de amplificación y desplaza los primeros pocos nucleótidos de la sonda hibpdada comente abajo (es decir, el iniciador de señal), disociando el iniciador de señal en el enlace de fasfol léster que une la región desplazada con la parte restante de los pares de bases del iniciador de señal. Esto libera un producto marcado de disociación de amplificación secundario con un nivel signific tivamente menor de nucleótidos enlazados al marcador 3 ipof i 1 ico (generalmente 1-2). Este producto de disociación es generado en una forma que depende de la amplificación del blanco (es decir, solamente con hibridación y extensión de los iniciadores de amplificación e iniciadores de señal en una secuencia blanco), puesto que la estructura de "tenedor" parcialmente de doble hebra es el sustrato preferido para la disociación. El marcador lipofílico con el número reducido de nucleótidos enlazados puede después transferirse a una fase orgánica para su detección como un indicador de amplificación de banco. Puesto que la generación de productos de disociación lipofllicos en ese sistema no requiere que el extremo 5' del iniciador de señal tenga doble hebra, el extremo 3' del iniciador de señal puede no ser extendible según lo descrito por los autores. ltern i amente, el ex remo 3' del iniciador de señal puede ser extendible sin interferencia con la generación, transferencia de fase y detección del producto de disociación lipofílico. Sin embargo, un iniciador de señal extensible puede incrementar el fondo/y la extensión del iniciador de señal reduce de manera innecesaria la eficiencia de la pal imerasa en amplificación. El número de nucleó idos enlazados a un marcador lipofílico seleccionado puede variar mediante la variación de la secuencia de nucleótidas del iniciador de señales. Un contenido en un lado de A •+ T en el extremo 5' del iniciador de señal, facilita la generación de productos de disociación mayores, menos 1 ipof í 1 icos, como resultado del desplazamiento más eficiente por polimerasa Taq y/a "respiración" del dúplex-antes de la disociación. A la inversa, un contenido implementado de 6 + C reduce generalmente el tamaño del producto de disociación e incrementa su 1\ ipof i Tic idad . Tal variación de rutina de la secuencia del iniciador de señal puede por consiguiente emplearse para optimizar la longitud del producto de disociación para un marcador seleccionado y una fase orgánica seleccionada. Alternativamente, el número de nucleótidos enlazados al marcador lipof 11 ico en el producto disociado puede ser incrementado mediante la inclusión de una cola no hibpdante en el iniciador de señal entre el marcador 1 ipof 11 ico y la secu n» la de enl ce blanc d l iniciador de señal. Sin embargo, .corno antes establecido, se prefiere generalmente productos secundarios de amplificación s 1 ipof í li os que tienen un número menor de nucleótidos enlazados. Para la adaptación de los métodos de la invención a 3SR , es solamente necesario emplear una transcr íptasa inversa deficiente en hexanucleasa 5'—*• ' con la hebra desplazando la actividad en la reacción 3SP con hibridación de un iniciador de señal en el blanco de ARN corriente ab jo del "iniciador 3'" y/o del "iniciador 5'" de Guatelli et 3l., supra (véase Guatelli 's, figura 1, página 1875). En un esquema de reacción similar a la figura 1 del solicitante, el iniciador de señal hibpdado que contiene la secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción es 1) extendido, y 2) desplazado por extensión del iniciador de ADN comente arriba. El producto de extensión desplazado se vuelve después de doble hebra mediante la hibridación y la extensión del otro iniciador. Esto hace que el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción sea disoeiable, y se genera un producto secundario ele amplificación lipofílieo para ransferencia a la fase orgánica. En forma también similar a SDA, el iniciador de señal para 3SR no contiene una secuencia de promotor de APN polimerasa T7 y por consiguiente no puede funcionar camo un iniciador' de amplí fi ación, reduciendo la .-.eñal de fondo no espec í f ica . Será evidente a partir de los ejemplos siguientes que la característica esencial de la invención es la generación de un producto secundario de amplificación lipofílico a partir de un iniciador de señal hidrofílico mediante una reducción que depende de la amplificación de blanco en cuanto al número de nucleótidos enlazados al marcados lipofílico. Todos os productos secundarios de amplificación, independientemente del mecanismo de reacción mediante el cua se producen durante la amplificación de blanco, podrán transferirse a una fase orgánica como se describe aquí para la detección co o indicador de aplificación de blanco. Los compuestos para su uso cromo marcadores en ol igonucle? idos son bien conocidos en la técnica e incluyen colorantes, enzimas, radiomarcadores , lígandos, ant ígenos/haptenos y anticuerpos. Tales marcadores que son 1 ipof í lieos y que pueden detectarse al transferirse a la fase orgánica están adecuados para su. uso en la invención. Los colorantes son especial ente ú iles debido a la facilidad con la cual pueden detectarse y muchos colorantes calorimétricos y fluorescentes tienen las propiedades .8 lipofilicas necesarias. Ejemplos de tales colorantes se plantean en Molecular Probes Handbaok of Fluarescent Probes and Research Chemicals, 5ta. edición, por Richard P.

Hauglind, Molecular P robes T n>- . OW) y Fluorescept Probe-ín Cellular and Molecular Biology por Tan Slavik, CRC PrßiS (1994). Colorantes lipofílicas específicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, di fem lhexatpeno, Nile Red, N-fen i 1-1-naf 111 ami na , Prodan, Laurodan, Pireno, Pepleno, rodamina, rodamina B, tet rame 11 rodamina , Te: as Red, sul forodami na , perclorato de 1 , 1 '-d idodeci 1-3,3,3 ' ,3 ' -tetrameti 1 indocarboc i aniñ , ac adec 11 roda i na B y los colorantes BODIPY disponibles en Molecular Prabes Inc. (por ejemplo BQDIPY 558/568, BODIPY D-3921, BODIPY D-3935 , BODIPY D-3933 , BODLPY B-3930, BODIPY B-3932, BODIPY B- 1 2, BODIPY B-2188, BODIPY B-2223, BODIPY B-2226, BODIPY B-2229, y BODIPY B-2185). Para un marcador lipofílico seleccionado, el número apropiado de nucleótidos enlazados en el iniciador de señal para obtener propiedades hidrofílicas y el número apropiado de nucleótidos enlazados en producto secundario de ampl ificación para obtener propiedades lipofílicas pueden determinarse de manera rutinaria usando métodos de tamizado sencillos tales como los d s ritos en el ejemplo 1. Es decir, enlazando un número variable de núcle *' idas sobre el marcador lipofílico seleccionado y probando la solubilidad en fase orgánica o bien en fase acuosa, el practicante puede diseñar un iniciador de señal adecuado para su uso en los métodos de la presente invención. El marcador asociado con el producto secundario de amplificaci n puede de ou s detectarse después ci run- fer-enci a la a-ie >>ryáni a usando métodos copocido-. en la técnica apropiados para el marcador s leccionado. En el ca sa de colorantes calorimétricos, la absorbencia de la luz se emplea típicamente para detectar, por ejemplo, mediante el uso de un espec rofotóme ro . Colorantes fluorescentes pueden también ser detectados por absorbencia. Alternati amente, colorantes fluorescentes pueden ser exitados por una luz de longitud de onda apropiada y detectados mediante la emisión de f luoresenc ía , por ejemplo en un fluoró etro o bien por espec roscopia de fluorescencia. De la misma manera, varias fases orgánicas pueden ser tamizadas por métodos rutinarios para determinar la solubilidad de un iniciador de señal o bien producto secundario de amplificación que incorpora un marcador seleccionado. Es decir, aún cuando diferentes iniciadores de señal y productos secundarios de amplificaci n que incorporan diferentes marcadores", lipafi lieos pueden presentar características de solubilidad diferentes en fases or'gáfii C3 -s diferentes, si o no una fase orgánica seleccionada es útil en los métodos de la presente invención puede determinarse usando ensayos sencillos de tamizado co o por ejemplo los descritos en el ejemplo 1. Cualquier fase orgánica en la cual, el producto secundario de amplificación s soluble „ el iniciador de señal ín-iilnble (,-? i n soluble en forma mínima, de preferencia debajo del nivel de detección) es adecuada para su uso en los métodos de la presente invención, por ejemplo, cloroformo, f nol, butanol, cloruro de etileno y mezclas de los mismos. Las proporciones de los componentes en una fase orgánica mi: ta no son generalmente críticas y pueden optimizarse según lo necesario usando ensayos de tamizados sencillos como arriba descrito. El producto secundario de amplificaci n ipofílico es típicamente transferido a la fase orgánica mediante la /mezcla de la fase orgánica con la fase de reacción de acuosa para extraerlo. Las fases acuosa y orgánica se separan después, naturalmente o bien con el auxilio de la centrifugación, y cualquier marcador extraído en la fase orgánica se detecta. Si la solubilidad del producto secundario de amplifica ión 1 ipof 11 ico en la fase orgánica es inadecuada para proporcionar la sensibilidad deseada o bien si se desea de otra forma i rementar la solubilidad, e pueden incluir aditivos en la fase acuosa para incrementar su fuerza ?ónic.4. Mediante el incremento de la fuerza iónica de la fase acuos , reduce la solubilidad del producto de amplificación secundario lipafilico. Tales aditivos incluyen compuestos que ionizan en solución acuosa. Tales compuestos incluyen, sin limitación, ácidos minerales (por ejemplo ? i 'i fo fóricp, a>'ida clor íd ico, *»c?do sulfúrico) sci ni oryámcos (por ejemplo áci acético , otros ácidos carbo)>l cos) , sales de cloruro (por ejemplo cloruros de sodio, potasio, calcio o bien magnesio) sales de carbonato (por ejemplo, carbonato de sodio, potasio, calcio o bien magnesio), sales de sulfato (por ejemplo, sulfato de sodio, de potasio, de calcio o de magnesio) y sales de fosfato (por ejemplo fosfato de sodio, potasio, calcio o bien magnesio). Para cualquier combinación seleccionada de iniciador de señal, el producto secundario de amplificación y la fase orgánica, la cantidad del aditivo seleccionado a incluir en la fase acuosa para incrementar la transferencia del producto secundario de amplificación lipafílica a la fase orgánica puede determinarse por ensayos rutinarios de tamizado en donde la ansferencia es moni toreada en presencia de un rango de fuerzas iónicas en fase acuosa. EJEMPLO 1 Se tamizaron varios ol igodeso i nuc leót idos conjugados con colorante para determinar su solubilidad en varias fases orgánicas. 01 igodesox i nu> leót idos cortos de vanas IU?QI udes fueron sintetizados y marcados en el e- tremo 5' con BO IPY 558/568 (Molecular Probes, Inc. número cié catálogo 2218) según lo recomendado por el fabricante: colarante-1-mer 5'-B0DIPY-dG colarante-2-mer 5 '-BODIPY-dGG colorant -3-mer 5 ' -BODTPY-dGGA c.olorante-4-mer 5 ' -BO IPY-dGGAA colorante-33-mer 5'-B0DIPY- dGGAATTCATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA (SEO ID N0:1) Los ol igodesox i núcle t idos marcados el colorante libre fueron después probados para determinar su. capacidad de división de la fase acuosa en cada una de varias fases orgánicas. Los oligos o bien los colorantes libres fueron disueltos en 100 µl. de 50 M K2P04, pH 7.5, y se agregó un volumen igual de solvente orgánico. Las muestras fueron mezcladas mediante aplicación de vórtice y las dos fases fueron separadas por centrifugación. La cantidad de B0DIPY-ol igodeso i nuc leót ido (o bien colorante libre) en cada una de las dos fases se determinó por medio de espectroscopia de f luroscenc ia . El porcentaje de BODIPY-ol igodesox inuc leo ido (o colorante libre) transferido de la fase acuosa a la fase orgánica se presenta en la tabla 1. TABLA I COLORANTE CLOROFORMO BUTAN0L FENOL/ CLORURO DE -0LIG0 CLOROFORMO METILEN0 (50:50) colorante solo 92'/» 90'/. 79*/. 817, colorante- 1-mer 18V. 71 V* 78% 5% colorante-2-mer 5% IV. '/. 7 colorante-3-mer 5'/. 26'? 5'/. colarante-4-mer 3% IV. 5% VA colorante-33-mer 6% 4% 3V« 10V.

En el experimento, la mezcla fenol/cloroformo fue especialmente bien adecuada para extraer 1-3-mers marcados con BODIPY. El butanol funcionó bien para la extracción de l~mer marcado con BODIPY. Ninguna de las fases orgánicas trajo exitosamente 33-mer marcado con BODIPY ni 4-mer marcado con BODIPY. Este ensayo de tamizado demuestra que para este colorante un producto secundario de amplificación 1 2, o bien -3 ,er será transferido de la fase acuosa a fenol /cloroformo (o bien butanol si el producto secundario de amplificación es 1-mer). Además, un iniciador de señal que tiene una longitud de cuando menos 4 nucleótidos es suficientemente hidrofílico en este sistema para permanecer en la fase acuosa. Varios aditivos de fase acuosa fueron probados en el ensayo para determinar su capacidad de incrementar la extracción de fenol/cloroformo de colorante -3-mer sin resultar en la extracción del colorante -33-mer. Los colorantes -ol igodeso i nuc léot idos o bien el colorante libre fueron disueltos en 100 µL de 50 mM K2P04, pH 7.5 y se agregaron 10 µL del ácido o sal indicada. Un volumen igual de fenol /cloroformo (50:50) se agregó y las fases fueron mep'-l i'lit me iante* ót tice y separada ; i nte cen fugación. La cantidad B0DIFY--ol ígodeso- inucleótida o bien colorante libre en cada una de las dos fases fue determinada por espect oscopia de fluorescencia. El porcentaje de B0DIPY~ol igodeso i nuc leót ido o bien colorante libre transferido de la fase acuosa a la fase orgánica aparece en la tabla II. TABLA II COLORANTE ACIDO ACÉTICO 0.1M CH1 ACIDO 5M NaCl 0LIG0 CONCENTRADO FOSFÓRICO CONCENTRADO colorante solo 97% 98% 97% 98% colorante-3-mer 96% 96% 85% colsrante-33-mer 2% 11% 5% 1 % En comparación con el solvente solo, los cuatro aditivos incrementaron sustanc i lmente la extracción del colorante -3-mer en la fase orgánica (hasta esencialmente el nivel del colorante solo) si ningún incremento notable de la extraición del colorante -33-?er. La adición de tales di ti vu-3 es generalmente aplicable y se puede esperar que incremente también la extracción de los BODIPY-ol igonuc leó idos más pequeños. Además, se puede esperar que la adición de aditivos para incrementar la fuerza iónica de la fase acuosa increment se la transf rencia de producto secundario de amplificaci n hacia otras fases orgánicas t d b i én . EJEMPLO 2 Se sintetizaron al igodesax muc leo idos en un sintetizadar de ADN (modelo 380B) de Applied Biosystems Inc., los cuales fueron purificados mediante desnaturalización en electrofóresis en gel. Un iniciador de señal de ol igodeso:- inucleót idas fue sintetizado para su hibridación en los nucleótidos 985-1010 del elemento IS6110 de M. tuberculosis (Thierry, et al. 1990. Nucí. Acids Res. 18, 188). Esta secuencia se encuentra dentro de la secuencia SS6110 amplificar (nucleótidos 970-1O25 del elemento IS6110). La secuencia de iniciador de señal fue la siguiente : 5 ' dGC/TCGAGTTGTCTACATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCA (SEQ ID N0:2) El iniciador de señal fue marcado en el extremo 5' con B0DIPY 558/568 (Molecular Probes, Inc.) de conformidad con lo recomendado por el fabricante. Se sintetizaron también los siguientes iniciadores de am lificaci n y amor iguación: Inici dor de amplificación SI SEO ID NO: 3'< SI iniciador de amplifica ión (SEQ ID N0:3) 5 ' dCGATTCCGCTCCAGCTTCTCGGGTGTACTGAGATCCCCT S2 iniciador de amplificación (SEQ ID N0:4) 5 ' dACCGCTCGAATGCTGTCTCGGGTAAGGCGTACTCGACC Bl iniciador de amortiguador (SEQ ID NO : ) 5'dCGCTGAACCGGAT B2 iniciador de amortiguador (SEQ ID N0:6) 5'dTGGACCCGCCAAC Los sitios BssBI se indican en itálicas en negrillas y el sitio de disociación se indica por medio de la diagonal en SEQ IN NO: 1. Las regiones de enlace de blanco están subray da . Se realizó la amplificación por desplazamiento de hebra generalmente de conformidad con lo descrito por Walker et al., 1992. Nucí. Acids Res., supra). Muestras para amplificación fueron inicialmente preparadas como 35 µL de 50 mM de 2P04 (ph 7.5), 10.7 mM de MgC12, 2mM cada uno de dGTP, dATP, TTP y a 1 fa t io-dCTP , 0.14 mg/mL de albúmina sérica bovina, a 143 nM de iniciador SI, 714 nM de iniciador S2, 57 nM de cada uno de los iniciadores Bl y B2, y 29 nM del iniciador de señal marcado con 5'~B0DIPY. Vanas cantidades de ADN blanco de M. tuberculosis fueron después agrecjadas a cada muestra en alícuotas de 5 µL de 10 mM TFIS--HC1 íph 7.9), 10 M MgC12, 50 M NaCl , 1 mM DTT y 500 ng de ADN placenta 1 humano. Estas muestras de 40 µL fueron desnatur li adas mediante c lentamiento durante 2 minutos en un baño de agua hirviente y equilibradas durante 3 minutos a 60*C para templado de iniciador. BsoBI y una forma deficiente en exonueleasa ' -3 ' de ADN poli erasa de Bacillns >~ a 1 dotenax (5 ' -3 P :o-Bc I , Pan era) se diluyeron juntos con 16 unidades/µL y u.4 unidades/µL, respectivamente, en 10 M de TPIS-HC1 (pH 7.9 , 10 mM de MgC12, 50 mM de NaCl , 1 M de DTT . La mezcla de enzimas se preparó a temperatura ambiente inmediat mente antes de la adición de una alícuota de 10 µL a cada una de las muestras de 40 µL equilibradas. La mezcla final de la reacción de 50 µL contenía 35 M de 2P02 (pH ^. ), 3 M de TPIS-HCL fpH 7. 1., 15 M de NaCl , 0.3 M de DTT, 105 mM de MgC12, 1.4 M cada uno de dGTP , dATP , TTP y a 1 fa 110-dCTP , 0.1 mg mL de albúmina sérica bovina, 500 ng de ADN de placenta humana, 100 nM de iniciador SI, 500 nM de iniciador S2, 40 nM de cada iniciador Bl y B2, 160 unidades BsoBI (New England BioLabs), 4 unidades de 5'-3' exo-Bca, 20 nM de un iniciador de señal marcado con 5'-BQDIPY y varias cantidades de ADN de M. tuberculosis. Después de la adición de en imas, la reacción de SDA prosiguió durante 30 minutos a 60'C y fue terminada mediante la adición de 3 µL de 0.5 M de EDTA . Las muestras fueron después diluida-s con 350 µL de NaCl o.5 M, 10 mM de TRSS-HC1 fpH 7. '' y extraídas con 40<> µL de alcohol de fenol /cloroformo/ isoami lo (25:24:1). La intensidad de la 58 fluorescencia de la fase orgánica fue medida a 579 nm después de excitación a 556 nm. Los valores de intensidad de fluorescencia para la fase orgánica para cada del blanco de M. tuberculosis inicial se presentan en la tabla I. Una intensidad de fluorescencia incrementad-a arriba del fondo indica la conversión específica para blanco del iniciador de señal de hebra única hasta una forma de hebra doble que fue disociado mediante BsoBI, lo que resultó en la liberación de transferencia de un d i nuc leo t ido marcado con BODIPY a la fase orgánica. Todos los niveles de M. tuberculosis probados fueron detectables en la muestra de control negativo 'u no contenía ADN blanco de M. tuberculosis. El incremento de la fluorescencia con niveles incrementados de blanco demostró que los métodos de la invención pueden emplearse para la cuan i f icae ion de blanco en relaciones de amplificación.

TABLA I Número de geno as Intensidad de f luoroscenc ia blanco de M. de la fase orgánica tuberculosis 50000 100842 5000 91485 500 86334 0 75253 EJEMPLO 3 Ee realizó SDA de conformidad con lo descrito por Walfcer et al. (1992. Nucí. Acids Res., supra), usando los iniciadores SI, S2, Bl y B2 para la amplificación de la secuencia IS6110 presentada aquí. La reacción de amplificaci n incluye toiiibién un iniciador de señ,al marcado con 5'-FUD[FY que tiene una longitud de 33 nucleótidos (5'-dGGAATTCATCCGTATGGTGGATACGTCTTTCA - SEQ ID NO: 7). Los 26 nucleótidos en el extremo 3' del iniciador de señal (la secuencia de enlace de blanco) se bridan con la secuencia de blanco IS6110 en las posiciones de nucleótidos 985-1010, entre los iniciadores de amplificación. 5' hasta la secuencia de en base de blanco es un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción EcoPI (caracteres itálicos en negrillas). Después de SDA, se agrega EcoPI a la reacción de amplificación y las muestras se incuban a 37°C durante un tiempo suficiente para permitir la disociación del producto secundario de amplificación. Durante la reacción de . SDA, el iniciador de señal es extendido por la poli erasa hasta una longitud de 49 nucleótidos. Este 49-mer es desplazado por es tensión del iniciador de am lificación corriente arriba. El extr mo 3' y\ el 49— er se hibpdan sobre el estremo 3 del otro iniciador de amplificación, formando un 70-mer de doble hebra después de extensión por polimerasa. El si io de reconocimiento EcoPI de hebra única en el extremo 5 de iniciador de señal podrá disociarse mediante EcoRI al formarse el 70-mer de dos hebras. La disociación de EcoRI del 70-mer de doble hebra producirá un producto de disociación que es un d i nuc leo t ido marcado con 5'—BODIPY. Este d i nuc leót ido puede detectarse como producto secundario de amplificación por medio del colorante enlazado. El. producto secundario de amplificación disociado (el dinucleótido marcado con BODIPY) se detecta mediante la mezcla de la reacción acuosa con fenol/cloroformo y la separación de las fases acuosa y orgánica, por ejemplo, mediante centrifugación. La fluorescencia en la fase orgánica se detecta después, por ejemplo mediante espec roscopia de fluorescencia. Un incremento de la fluorescencia transferida a la fase orgánica después de amplificación (de conformidad con lo comparado con un control no amplificada) indicará que la secuencia blanco IS6110 se encuentra presente y ha sido amplificada. Si no se detecta ningún incremento de la fluorescencia en la fase orgánica, la secuencia blanco no se encuentra presente o bien se encuentra presente pero no ha sido amplificada. EJEMPLO 4 La secuencia blanco IS6110 es amplificada por PCR con generación de un producto secundario de amplificación de conformidad con lo descrito por F. M. Holland et al., supra. El par de iniciadores de amplificación consiste de las regiones de enlace de blanco de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, o bien el par de iniciador de amplificación puede consistir de las regiones de enlace de blanco de los iniciadores SI y 32 de Wal er et al ., (19Q , Nucí. Acids Res,, --upra). El iniciador de señal incluido en la reacción de amplificación es marcado en el extremo 5' con un colorante lipofílico y tiene una secuencia basada en la región de enlace de blanco de SEQ ID NO: 2 (que es idéntica a la región de enlace de blanco de SEQ ID NO: 7). La secuencia del iniciador de señal puede incluir toda la región de enlace de blanco, pero es preferible que sea un segmento de la región de enlace de blanco que contiene una gran cantidad de GC en el extremo 5'. Puesto que el extremo 5' de la región de enlace de blanco/de SEQ ID NO; 2 y SEQ ID NO: 7 empieza con la secuencia ATCCG, puede ser preferible eliminar el AT de 5' y empezar la secuencia del iniciador de señal con 5'-CCG. El diseño de un iniciador de señal con una región que contiene una gran cantidad de GC en el extremo 5' promueve la producción de productos de disociación de polimerasa más pequeños (mononucleót idos y di nuc leót idos ) , lo que asegura que el producto de disociación será suficientemente lipofílica para su. transf rencia a la fase orgánica. Al ernativamente, el extremo 5' del iniciador de señal puede comprender un nu.cleóiido muy corto "cola" que no se híbrida sobre la secuencia blanco (de preferencia no más de aproximadamente 1-3 nucleótido<3 de longitud) de tal manera que la polimerasa encuentra la estructura de "tenedor" preferida sin necesidad de desplazar los nucleótidos hibridadas en iniciador de señal. La secuencia blanco 156110 es amplifica- la por PCP en presencia de iniciadores de amplificación y el iniciador de señal, esencialmente de conformidad con lo descrito por R. K. Saiki et al., (1985. Science 230, 1350-1354) y .B. Mullís, et al., (1987. Methods EnzymoJ, 155, 335-350"' utilizando la actividad exonucleasa 5 ? ' de ADN polimerasa Taq para generar unos productos de disociación de iniciador de señal específicos para amplificación de blanco de conformidad con lo descrito por Holland, et al., supra. Después de suspender la reacción de amplificación, se agrega un solvente orgánica a la fase de reacción acuosa y se mezcla. Las fases son separadas (. par ejemplo mediante centrifugación) y la fase orgánica es ensayada para determinar la presencia de colorante usando métodos apropiados para la detección del colorante seleccionado. Si se detecta un incremento de la cantidad de colorante transferido a la fase orgánica en comparación con la reacción de control no amplificada, la secuencia blanco se encuentra presente y ha sido amplificada. Si no se detecta ningún incremento, la secuencia blanco no está presente o bien se encuentra presente pero no ha sido amplificado.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Walker, George T. íii) TITULO DE LA INVENCIÓN: DETECCIÓN DE AMP IFICACIÓN DE CIDOS NUCLEICOS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 7 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Richard J. Rodrick, Bectan Dickinson and Company (B) CALLE: 1 Becton Drive (C) CIUDAD: Fran lin Lakes (D) ESTADO: NJ (E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA íF) CÓDIGO POSTAL: 07417 (v) FORMATO LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco blando (B) COMPUTADORA: compatible xon IBM PC (O SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS <D> PROGRAMA: Patentln Pelease No. 1.0, Versión No. 1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: - (A) NUMERO DE SOLICITUD: - (B) FECHA DE PP.ESNTACIÓN: - (C) CLASIFICACIÓN: - < v i i i ) I FORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE : (A) NOMBRE: Fug i t , Donna R.

(B) NUMERO DE REGISTRO: 32,135 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CÉDULA: P-3039 (2) INFORMACIÓN PAPA SEQ ID NO: 1: (i.) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: ':. i A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucl ico (O NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 0 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEO ID NO: 1: GGAATTCATC CGTATGGTGG ATAACGTCTT TCA (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: 0 6CTCGAGTTG TCTACATCCG TATGGTGGAT AACGTCTTTC A (2) INFORMACIÓN PAPA SEQ ID NO: 3: <i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 pares de bases ÍB'1 TIPO: áci o nucl ico 5 (C) NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTGTACT GA6ATCCCCT (2) INFORMACIÓN PAPA SEO ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (il) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 pares de bases (B) TIPO: ácido nucl ico (C) NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: CGCTGAACCG GAT (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 130 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal di) TIPO DF MOLÉCULA: ADN (genómico) í i) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEO ID NO: 6: TGGACCCGCC AAC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NUMERO DE HEBRAS: única (D) TOPOLOGÍA: lineal di TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genó ica; (xi ) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7; GGAATTCATC CGTAT6GTGG ATAAC6TCTT TCA

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar la amplificar ion de una secuencia blanco que comprencie: a) hibpdar e la secuencia blanco, en una solución acuosa, i i ? i ? ? I I i i 1 T. 1 ' H i i - ' > '" 1 I 1 > I r i í f i J l n ] < > >• i > i i IU I <- ' i > ' 1 • nucleótidos enlazados a un marcador lipafílico, y (n) un iniciador de amplificación; b) extender el iniciador de amplificación hibpdado en la secuencia blanco con una polimerasa, por lo que la e: ension del iniciador de amplificación desplaza el iniciador de señal, o bien una porción del mismo, a partir de la secuenci blanco; c) disociar o cortar el iniciador e señal desplazado, o bi n la parte desplazada del mismo, reduciendo asi el número de nucleótidos enlazados al marcador 1 ipof íl ico y generando un producto secundario de amplificación 1 ipof í 1 ico; d) transferir el producto secundario de amplificación lipafílico un3 fase orgánica, y; e1 detectar el marcador del producto secundario de amplificación 1 ipof íl ico transferido a la fase orgánica como indicador de amplificación de la secuencia blanco. 2. F método de la rei in icación 1 , donde el iniciador de señal desplacido se vuelve de doble hebra mediante hibridación y extensión de un segundo iniciador ae amplifica" i n, y el producto sec n n^ d amplifica- ??n 1 ipof íl ico es generado mediante la -disociación d<^l iniciador de señal de hebra única on un endonucleasa -de restricción. 3. El método de 1,3 reivindicación t, donde el iniciador de señal spla a o 3 .;??el ? e ,-j,?|jle liulip ?? ü : ii I rf a hibridat. ion y la t r>-ji..n de un ^ -jnnij-i iniciador -1-r-am lificación, y el producto secundario de am lificaci n l pof 11 ico es genera-do mediante el corte del iniciador de señal de doble hebra ron una endonucleasa de restricci n. 4. El método de la rei in icación 1, donde el producto secundario de amp ificaci n lipofilico es generado mediante la disociación del iniciador de señal desplazado, o bien la parte desplazada del mismo con una e;onucleasa. 5. El é odo de la i e i nd ic ac ion 4, donde la e: onuc i e sa es la pol unerasa . 6. El método de la rei in icación 5, donde la secuencia blanco es amplificada por reacción en cadena de pol ímerasa . 7. El método de la rei indicación 1 , donde el marcador lipofílica es un colorante calori é rico. 8. El método de la reivindicación 7, donde el marcador del producto de amplificaci n secundario 1 ipo l l ico es detectado por espectrofotometr la . 9. El método de la reí v i n-.l i ac i n 1 , donde el marcador 1 ipof íl ico es un colorante f 3 ' mi escei ite , ]("-. El método de 1^ r e i n-i ícar i n Q, donde el -.clorante fluorescente e un colóranle BODIPY» 11. El método de la reivindicación 10, donde el marcador del producto de amplificación secundario lipofílica es detectado mediante espectroscopia de fluorescencia. 12. El método de la reivindicación 1, donde el producto de amp 1 i f J c ic i n ->e- - n i-J- ¡ • i n 1 , ¡.n if ¡ 1 11 o -, I- r T n-, T vi- i ?:l? i i , f ¡ -e orgánica por extracción con fenol /cloroformo. 13. El método de la rei i dicación 1, donde? la fase acuosa comprende además un compuesto que incrementa la fuerza iónica de la fas ^acuos . 14. El método de la rei indicación 13, donde el producto de amplificación secundario lipofílico es transferido a la fase orgánica mediante la mezcla de la solución acuosa con la fase orgánica y mediante la separación de la fase orgánica e l fa e cuo . 15. El método de la rei indicación 13, donde el compuesto que incrementa la fuerza iónica de la fase acuosa se selecciona dentro del grupo que consiste de ácidos minerales, ácidos orgánicos y sales. 16. El método de la reivindicación 15, donde el. compuesto que incrementa la fuerza iónica de la fase acuosa se selecciona dentro del grupo que consiste de ácido acético, ácido fosfórico, ácido clorhídrico y cloruro de sodio. 17. El método de la reivindicación 1, donde el producto secundario de amplificaci n 1. ipof íl ico es transferido a la fase orgánica mediante la mezcla de la solución acuosa con la fase orgánica y mediante la separación de la fase orgánica de la fase acuosa. 18. El método de la reivindicación 1, -donde la secuencia h 1 a n>" o es aiiipl i f i ^i p r amp 1 i f i >- - < - 1 .11 ñor i fl ?,'<mu'!if i de hebra. 19. El método de la rei indicación 1, donde la secuencia blanco es amplificada por reacción en cadena de poli erasa.
2. 2 . El método de la reivindicación 1, donde la secuencia blanco es amplificada por replicación utosasten ida de secuencias (3SP).