MXPA96004832A

MXPA96004832A - Un metodo para implantar celulas encapsuladas enun hospedero

Info

Publication number: MXPA96004832A
Application number: MXPA/A/1996/004832A
Authority: MX
Inventors: M Holland Laura; E Dionne Keith; P Hammang Joseph; A Rudnick Seth; J Lysaght Michael
Original assignee: Cytotherapeutics Inc
Priority date: 1994-04-15
Filing date: 1996-10-15
Publication date: 1998-10-30

Abstract

La presente invención proporciona métodos de implantación de células encapsuladas en un hospedero, los cuales comprenden la exposición de las células a condiciones restrictivas durante un período de tiempo suficiente para establecer una propiedad celular deseada en respuesta a las condiciones restrictivas y la implantación de las células encapsuladas en un hospedero, siendo conservada substancialmente la propiedad celular después de la implantación. También se proporcionan células producidas por la exposición a condiciones restrictivas.

Description

UN MÉTODO PARA IMPLANTAR CÉLULAS ENCAPSULADAS EN UN HOSPEDERO ANTECEDENTES DEL INVENTO Campa de la Invención La pre-.er.U-» i i wn. J ón >.e r.-f iere a la preparación de célula.. ._n-.ap-->ul ula > para ".u implanta ión en un hospedero por medio de la exposición de la > Lélula-., ya «sea m i vo o - n v j tro. tp a una o más on icione:.. res Lr f >.13 vas que se asemejan lo más ppx x le a aquel la.. *-*n un ..i lio dc¡ i lanta ión deseado, durante un periodo de t n-'inpo uf it H II I 'ii'a t ••-» L Ale er una pr'oµiedad de célula deseada en r.' puesl. a la . ond-u-ón res ictiva. Antecedentes de l fn -ii' ion lr Ge punción i. < r < >*» I u I •• . «nrafi'-u I acia , que producen una molécula biológi amente fi? i i a al ser implantadas en un hospedero para la prevención o A tratamiento de muchas enf rmedades o desordenes o para µrovf*f»r, restaurar o aumentar uno o más fu *onß<> m tab?ljra . en A ho<.µe*? le u. 0 Un enfoque pata wnt apsi.thr células es llamado "microencapsulsc i n", H? ond > una gota mieras- ópxca de una solución que ront i ont- t él 111 <.<•> en encapsulada en esferas minúsculas (Re f ton y a sor ? d'!s?, hio.ttH.hnulot.iy and -.J PiiQinefpnq, página» 1135-11 3 (19R7); Rinj-imori y a -.uc jados, Trans. Am. So . Artf. Intern. Urqan V» , µá.ji a . Vi a 79 (-989... Otro éto o |it? s HI ?( ,??lar c lula», la "macroencapsula ion" comprende l ^ . apsu La> ion de una pluralidad de células en una -.áp.ada --rmap ] ás t p . Esto es realizado típicamente cargando «ulul s en un fibra hueca y sellando después ] a*. r trem? dade-. -5 la i rna . Se conocen en el arte varios tipos de a racápsulas» En parljtular, Dionne y asociados en la (WO 92/19195) se refieren a una acrot psul a que tiene células dispersadas en una itr : y una envoltura de superficie semipermeabl , estando incorporad.- dicho üo' umento a la presente descripción co o referenc i a „ Ver también las Patentes Estadounidense 5,158,881, 0,283,187 y 5,284,761 otorgadas a Aebí scher, las cualo-, •... efie en a una cápsula para células for*"*>da por la oe!. rus ion de una solución poli érica y una suspensión celul r. Tip i cament*-* , si las células usadas para la encapsul ación e i plantu i n son aislarlas ire tamente de un tejido (células primar ?a->>, son desagregadas, lavadas y luego encapsuladas. Ver, por ejemplo el estudio de Aebí cher y asoci dos en Tran-».. Am. Sor:. Artif. Tntern. Qr ans. 32, páginas 134 a 137 (1986); el de ?lt an y asociados en D bete . 35, pá-„íilas 625 a 633 (19B6); la Patente Estadounidense No. 5,084,350 otorgada a Chang y aso i dos, el estudio de Darquay y Reach en DiabetoloQi . 28, páginas 776 a 780 (1985); el de Suga op y Sefton, en Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Ot-üans, 3b, páginas 791 a 799 (1989) . Si se desean e? -ap ul ar e implantar células inmortal i ¡radas o lineas (elulares, estas son aisladas típicamente de cultivos ricos en nutrientes, ver por e .*mpl , el estudio de Aebí cher y asociados en E u a ter íals. 12, páginas 50 a 55 (1981); Exqer J menta 1 Neui'oJ ogy , 111, páginas 269 - 275 (1981) (células PC12 que segregan doµamina) y la WO 93/22417 otorgada a WarAv asociados (célula-. MDPC- 1C que segregan IgG) . Las células erv f)-.>u i acias son incubadas generalmente ín. y i Irg y cara, ter i ¿ada > func i n 11 mente ant.=- de la i mpl antación.

Durante. esta etapa p ecia a la im l ntación, las células encapsuladas son cultivadas much .s veres en un medio definido.

Muchas veces el medio os una -. Jución salina balanceada sin aditivos nutrientes (por ejemplo, Aet) J t her , guiara ; Alt an, o supra; Chang y asociados, suur ) . Alternativamente, las células encasill das son irv libadas en uu medio nutriente, tal como RPMI 1640, el cual conlipn^ varios aminoáci os, vitaminas, sales inorgánicas y glucosa (2 g/l; 11.11 M ) (Cultivo de Células de Animales CAnimal Coll Culture], Fdr>. Pollard y Wall'er, Human 5 Pres.. Inc., ClifAn, Not-i ?r ey , pág?na-> 696 a 700 (3990)), y que es ..upl ementado normal monto > op de un 5'/. al 1 '/. de suero de ternero o caballo fetal. Las células que son encapsuladas e implantadas en un hospedero deben sufrí i poi lo monos dos cambios severos en las '<" condiciones nutrientes en . umparat ion . on l s condiciones ?_n vi tro. El primer cambio se produi e después de la encapsul ción. En rompai ar i ón ion Ja-. condiciones in vx ro, las células en un ambiente on. ap.ulado sufren una disminución de nutrientes. Esta carencia se maní f íesU de dos maneras. Existe 5 un gradiente de nutrionte e?Ao ol ambien a i*;; terna y el interior de la cáp'-.u a formado nal i n a I m> il < > a través de Ja membrana. Este gradiente se acentúa aun m-J .< , dol) i do a ue las molécul s no se difunden libremente entre el to ida del hospedero exterior y las células en cualquier posició >|ontro de la cápsula. las células más arcanas a ia supe icie do la Ap.ula tienen un acceso preferen tal a 1 os ñutí lente-, que se ifunden a través de la envoltura de la ?p.uJa. Además, los produc tos de desecho de las células más cercanas a la supo f i r i de la cápsula son eliminados más fácilmente. Un segundo cambio severo en la concentración de nutrientes, por ejem lo, de 01 ígeno y glucosa, se produce después de la implantación en un hospedero. Esto es asi porque? m v i trot el "?Vel de oxigeno y al mano» algún otro nivel de nutrientes , son generalmente mu ho más altos que in vi o. De este moda, la fuerza de impulso p ia la difusión de estas molécula*» hacia adentro de la cápsula es disminuida tn vivo. Estos cambios en el medio ambiente nutriente pueden resulta! en una l er c ion de una o más propiedades de la célula. Par ejemplo, puede resul tai la muerte celular o una viabilidad reducida de la célula a largo pla-ra. Además, ei cambio en las co.u-.iC iones am iéntal s con la implanta; LÓn, pueden afectar también otras propiedades e la. célula, encapsuladas viables remanente*», tales .orno la velocidad de crecimiento de determinadas subpob I a>_ i one-,. do células pueden resultar en una invasión de la cápsula fior una <-ubpablac ion de células de cre imiento más rápi o, I CD que lleva pa . ene i a 1 mentó , a un cambio aparente en las carac erís icas de produc ión de la cápsula, o en otros efectos, potenc i l ento no deseables. Una diferen ia importante entre las ondiciones de impl ntación ¿n vivo / la', Í n i r i aues de implantación m y itro. es la concentra-, ton e glu-o-.a, a la cual sean adaptadas las cél '"<s cultivadas. Otra diferencia entre las condi iones en un cultivo de tejido y aquellas en un sitio de implantación, es la 5 cantidad de oxigeno disponible para la célula. Otros nutrientes pueden estar en con en aci nes signifi ativamente diferentes en un medio de cultivo y on un sitio de implantación determinado. as céluAs y tejidos que son altamente activos etaból i c menté , -,on par icularmente susc p ibles a los efectos ("i íe una privación de nutrientes y oxigeno (hipoxia). Asimismo, es*"*"*** comportamiento os exhibido por muchos tejidos endocrinos que normalmente están sos ton i do por lechos capilares densas y que son aclimatados, de este modo, para crecer 11. viv, en niveles elevados de oxígeno y nutrientes; Los islotes de Langerhans 5 panc eá icas» y las células adrenales cr? aaf mes, son part i cu] rmente sensibJo-. a ?n hoc. I.ip?xica. Es sabido que los cambios en la presión de oxigeno y el stress nutriente, cambian la expresión de un gran número de genes q?,-- afectan una variedad de fun iones celulares. Tales cambios C, pueden afectar la estabilidad la función de iertos mRNAs. Por ejemplo, la tirasina h i dro,.. i 1 asa mRNA, que codifica para la enzima que catal j ¿a la o tapa limitadora de velocidad en la producción de clopamina, pm-*de ..er afe tada pui el stress nu í cíon l . 5 Además, vario-» yene-, de golpe de calor, y la expresión de en/uní» metaból n as , romo l s implic da» «n «1 mwtabol imma intermedio (por ejemplo, 1 HS secuencias glicoliticas y c glucaneogéniras) , pueden ser afectadas por los* niveles bajos de glucosa o aminoá idos. Resulta i p rAiA* tomar* en cuenta que, tipos celulares altamente d i 1 erenc i aclos , al ser privados del oxigeno, pueden perder sus funciones especificas para los tejidos hasta que se recuperen del shor I o ( r , por ejemplo, eJ estudio de Wolf fe y Tata, eu Fbfc Leí, tors, t/A, páginas 8 a 15 (1984)). Las funciones que son perdidas o disminuidas incluyen la síntesis y la mod i f icar i ón de µrulei ñas « F-Isto puede afectar 3a producción y secreción en juslameido aquellos factores terapéuticos, que las cé Aa deben proveer1 al te ido circundante del hospedero. Además las con ici n.-»-» hipó ras pueden iniciar algunos casos de transformaciones mal icjuas, r» , por ejemplo, el estudio de H. GoJ blatt y asociado'-., en F i » ?c h.'m i ca 1 Med i c i ne , 7 páginas 241 a 252 (1973)). Es deseable desarroll r un método para la implantación, el cual comprenda la o,.po-o< K'JII o la aclimatación de las células a una o más condi iones res tr i c 11 va-"., antes de la i plantación, cc.r el objeto de i educir las alteraciones en las propiedades celulares que son ol r e .u l t ido del efec o del cambio en las condicione., am i nt l -» eu la impl ntación, y reducir de este modo, cualquier consecuenci adversa al hospedero. También es deseable desarroll r* líneas celulares de l s células preparadas si gui ndo este étodo. También e. deseablo proveer un medio para el estudio ex vivo de las v I u I as que han sufrido cambios en el ambiente in vivo.

SUMARIO DEL INVENTO La presente inven, ion i?S re»fu»re» a un método para la i mp ntación de células o.t> ap.uladas en u hospedero, el método comprende la exposi i n de Lis . élulas, ya sea in vibro a jm 5 y i vo. a una o más rnii n ? no- le trn ti vas, (Jurante3 un periodo de tiempo suficiente p.ra es l a b I o. oí una propiedad celular* deseada, en respuesta a la rondn i n re-.tric tiva antes de la implantación en un sitie- de implanta, ion n el hospedero. Preferentemente, la propiedad celular* oslabl*»< M µ>u lus métodos de la presente o invención, es mantenida .ub . lan i al mente después de la i ÍG/' "»ntac i ón. I a--> céluT ?~ o? aµsul adas producen una molécula bioló i mente activa, quo puode .or útil para la prevención a el tratami nto de una > nfo.modad o desorden, o para proveer, restaurar o aumentar* una fpn> i n metabólica ?¡ eL hospedero. Las 5 células oduci 5, do atueirlo >-ou la presente invención, también puedan ser1 úti le., ira api ?< -u ?ono-, i n y 1.1 ro , para diagnóstico o para otr-os propósito-"», BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS '("> l.a Figura l mu » . I i a la *> r?-? i n de NHF (Nf-F -- factor- de crecimiento neurona I Iner o growlh f tor!) por células BHl' (BHK - riñon de un há .ter Lobo I baby hámster . idneyl) en apsul ada , incuLiada.i ?n . i 11 o a 5o mmHg eu médicos que contienen 0.8 g/1 de y Tuco,a a jo <"*s./yl>. Las células BH 5 fueron encapsuladas en cápsulas.- de pie! doble del tipo 4 selladas en 3 c.s ex emos por- el método de "-.el laclo sobre un eje" (hub seaimg, ver más adelanto). I t v»? ?ú?? r-» NGF por cápsula por V 24 horas, indicada por la illup, de la.5, barras fue determinada los dias 3, 7, 14, 21 y 28. La Figura 2 muestra células BH. encapsuladas incubadas i n v i t ru a 142 mml-lq en o i os u contienen 5.5 cj/1 de glucosa (Alto 0-,/gl). a células _:H. fueron encapsuladas eu cápsulas del tifio 4 (T4) selladas l s o,.tremu-_, y la secreción de NGF por cápsula por* hor "., ind.cada por La altura de las barras fue m dida los dia.. "., 7, 11, 21 , 28. La Figura mu 1- Ira la secreción de NGF en función con el tiempo de las células BH. oucapsul acias, incubadas ín i tro en me' * i . de Lia jo OAyl. .orno en la Figura 1, en cápsulas del tipo 4 (T4) selladas en uu w tremo, habiendo si o producidas las cápsulas por o (a) !<>•/, PAN/PVC, (b) 12.5. PAN/PVC, o (c) 15V. PAN/PVC. La secreción de NGF por cápsula ¡tor 24 horas, indicada por la altura de las birras, fue medida los dias 3, /, 14, 21 y 28. La Figura 4 muestra la liberación de Norepinefpna (NE) y opinefpna (FPT), ou func ion de la pre*. i n de oxigeno, de cí-j-ulas adrenales c romoa f i ne-_> oncap.-ul adas cultivadas in y 11 ro durante 14 dias a 2", 4 , 0, BO ó 14<"> mHy 03. La liberación fue odida los ías 2 y 14, ET panel A muestra la liberación basal de NE; el panel B mue tra la liberación de NE evocada por . A el panel C muestra la liberación basal de EPI; el panel D muestra la libera, jón evocada por I-"1" de EPT. La Fiyuí 5 mu*-»--. r a la liberación e cateco I aminas por células adrenales . romo f i nes de ternera, ene psuladas en cápsulas de] tipo 2, previo a la implantación y después de la recuperación, posterior -_ l!fl perjocJu riw implantación de 6 semanas. El panel A muc?-.tr? la liberación ba-_.al de NE y EPI ant, y después del por iodo o implanta' i n. Fl panel B muestra Ta liberación estimulada por' nicotina d*=* l'JF y EP T antes y después 5 del periodo de i plantac ??n„ El panel C (nuestra la liberación evocada pur l-"1" f-' NI" y F-Pl antes y después del periodo de í pl antací ón. La Figura 6 muestra la liberación de ca teco! minas por célula*» adrenales romoafir.es de ternera, encapsuladas en lo cápsulas del tipo 4, previo a la impl nta ión y después de la re» ""oerac ion, poster'ior' a uu periodo de implantación de 6 semanas. El panel A muestra la liberación basal de NE y EP I antes y después del por iodo d.¡ implantación. El panel B muestra la liberación o» l i mu I ada por nicotina de NF y EPT antes y después ?5 del periodo de i planta ión. Fl panel C muestra la liberación evocada por .i* de NF y FP 1 antes y después del p riodcj de i mp 1 ntar i ón. La Figura 7 muest r--? la producción e catecolamí na basal ( ÍM y estimulada por nico ina (B) por células adrenales c romoaf i nes de ternera, antes de la im lan lac ion en el espacio espinal suba ra no ido on rat, ... después de la recuperación posterior* a un periodo de im lanta ión do 6 meses. La Figura 8 muestra la liberación de dopamina y L-dopa de células PC12 y Pt 1 ? previo a i -t implantación y a continuación A d la liberación, póstero:,i . un periodo de implantación de 3 mesen» en el cuerpo on-triado de rata. Lomi pAnwlei. A y B mu*.«trun la produce ion bas l pi via al implante par-a las células PC12 y lo PC12A, respectivamen e. Los paneles 0 y D muestran Ta producción basal posterior al pl-mle µ,( . lis células Pf.12 y PC12A, r si __ti vamente. La Figur'a 9 i lu tra la comparación de la producción de ratecolami na de cé1ul.s-. aclimat da-, ni vwci, con niveles nor*males o niveles disminuidos do dupimiua, causados por lesiones en la substancia nigra de-1 rata put 6 -h i drox ?--clopam?na (6-L1HDA). El panel A muestra la velocidad bastí do producción de I. -dopa por las células PC12 en fmn i 'tn dA tiompo de ar limatatión in vi yo en las áreas lesionadas (barras sombreadas), o en áreas no le'„ tinadas (barras sin -.ombrear ) de la substancia nigra. El panel B muestra la relac ion de las velocidades b sales de producción de L-clupa /dopai?t i na en función del tiempo de aclimatación in vivo en las área., lesionadas (barras sombreadas) en las áreas no lesionada-", (bar as sin sombrear) de la substancia ni ra de la rata. La Figura 10 muestra la producción de catecolami na por celólas PC12 encapsul aci ., e -función del tiempo de aclimatación (en meses) in vivo, en ce bros de primates. los cuadros sin sombrear representan bacal de L-dopa, y los circuios sin sombrear- representan niveles básales de dopamina. La Figura 11 muestra la velocidad de producción de NGF por células clónale» BH. -liNHF- ?7¡ ene ap-,uladas en fibras HF 120794-6 de piel simple?, en matr-i-' Vi t r agen > o ÍII matriz, previo al implante y 14 e-.e-» después del implante. Las células del banco celular (CF-) .on »élula* clónales PH. -hNTF 23 sin acl ima tar- .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO Una "propiedad celular" i nc luye cualquier propiedad de un -„:-not?po que pueda -»er odicla, incluyendo la viabilidad celular-, la velocidad do v tet límenlo y la producción celular de cena molécula bioló i amente activa. Una propiedad celular deseada puede r ferirse a un cambio eu el nivel de producción de una o más moléculas hiologí amenté activas en respuesta a las con ?t.ione-? restri tivas, o -t un cambio en J s relaciones de producción de do. moléculas biol gic mente activas. Además, la pr-upiedad celular clo'.ead=t, uede referi se a la estabilización de ]_( r-uducL i c'ip de ?na molécula b i ol óy i c amen tí? activa, en respuesta a la condición res ri tiva. El término "condición r trictiva" significa que una o más condi ones on la-. > nal s las »-é1 la% son cultivadas normalmente u óptimamente 11. y itro. han sido alteradas para asemejarse lo más posible a las condicione--, reales o esperadas m v i vu en el sitio de implantación deseado del hospedero. Una "molécula biol icamente» activa" es una molécula que puede: (a) fuin icinar dentro de la célula, en la cual es producida (pur ejemplo, b» 1 -2 para prevenir- la apoptosis), (b) sor expresada subte» , . .up^t fie ?o celular y afectar las interacciones de la célula con otra:. células o moléculas biológicamente activa., (por ejemplo, un r ceptor neurotrans isor o una molécula adherida a una célula), o (c) --.er- liberada o segregada de la célula en T i . p.¡ os producida y ejercer su efecto sobre una célul . objetivo -.opar-ada (por ejemplo, un neuro ransmi.se.r , hormona, fai tor de ee i mi nto, i toqui na, u otro transductor do .or, il intri- o intercelular). Las moléculas b i o lógi camen te ac t i t » ¡tu» » -»11 -i" ?'? l- i l s f-?t el tratamiento o pre. H íción de una enfermedad o .or en eu el hospedero, o pueden proveer, restaurar u aumentar una o más 1un? iones etab?licas en el hospedero, Fl términos "l)n,µ?'r|*i|-o" o "receptor" se refiere a un sujeto animal apropiarlo, i n< luyendo mamíferos y pa ticularmente, seres humano... El t entuno " i e» eplor" se refiere a un animal, en ol c al Las célula > o ,t . n > pn>» .la-> a una o más ondi i nes restrictiva-, para exhibir1 una propiedad celular deseada. El té uto "hospedero" e y(Af.e)-e a un animal, en el cual son implantadas Tas lula., em ..¡p que exhiben la propiedad celular deseada. El término "células" ._»--* refiere a élul s en cualquier forma, incluyendo, pet-o no estando limitada a, las células reteñirlas eu un tejido, i . < irnos celulares, y células aisladas individu l s. Las rélul -ts en la presen » invención producen una molécula biológicamente fciva. las células pueden ser células primarias o células ^?^ -o di ulon con la producción natural de la molécula biol gi amente ac i .vi, o que han si o producidas genéti amente1 para icha proclu» c ?ó?t„ "Una cápsula b J cu omp -tt i b 1 e" signific que la cápsula, al ser implantada en un n ,->?ede? o niuinifer-o, no evoca una respuesta suficiente on >¿1 hospedero para afectar de manera perjudicial la función o la cápsul o para hacer-la inoperable. Tal inoperabí 11 dad puede* produc w,y> , por ejemplo, por la formación de una estrm luía fibró. na alrededor de Ta cápsula que de nu l r i • t i e - a l . > el ul as en l i ma . Los efectos pe judiciales- pueden ntc luir l ambl n, el rechazo de la c pA'? o la Jibetac ion de compue tos tóxico*- o pirogénicos (por e jemp 1 u , subprodu tos poliméi i o > i n I ét i c o-- ) desde la cápsula hacia el tejido circundante del ho.pederoi "Una cápsula i n unoa i -. I ante" significa que la cápsula, al ser* implantada en un ho->poclc>r »> m.m . fer-o, mi ni mira los efectos pe udi i les del sistema inmune del h» .perlero sobre las células dentro del núcleo de la cáp-.uTa, de modo que-' la cápsula funciona in vivo durante largos periodo- de tiempo. , El término "lu».lt yej" .ignifica un retículo tridimensional de polimeros It idr of i 1 ic os reticulados. El retículo está en la for-ma de un gel subs tanc. i al mente compuesta de agua, pr ferentemente3, pero i limitado a, geies que contienen más det 90% de aguí. los hidioge-le-, r e t i » ul aclus también pueden ser- considerados «.olidos, eb ido a que no fluyen o no se deforman, sin la api ?."ac??n apreciable de una fuerza de corte. En tin modalidad do la presente invención, las células -.-.o., encapsu I adas en uní < .p .ul - b i oc o pa I i b 1 e y son expuestas» a una o más lonciic iones red rí ti vas ni vo antes de la implantación en un .i io de i mp 1 inlaruip en el hospedero. Las células son expue ,la > <_ i i c omli» ic'.n o la» < ondi ior.es r-estr ict i va.» , dur-ante un pei J?»Jc. de tiempo suficiente para establecer- una propiedad celular deseada en r-espuesta a la condi ión r-estr-ic. t i va . Prefoii-nl 'mente, I:-, propiedad celular es mantenida substau i a 1 eitl o o »puA ^ la i mp J ant ar i n de las células encapsuladas en un sitio de i mp> 1 antac i ón en el hospedero. 1 I La--» conche iones ri--_.tr o I iva.» contempladas incluyen, la alteración de uno o más de lo-, siguiente, t H lores: temperatura, pH, J >res??n baromélne a, i c.nc en trac i ón efec tiva de une. o más me bo] i tos o ca. ctor es, me luyendo ero no estando limitados a; azúcar, alcohol, ac ¡do-» r p bo í J i • o , Aminoá idos, a ide.---, grasos, ácidos nuc 1 ei cor», ga'-, ?>-?ne.-> mt» I a 1 i co-. , u cualquier otro factor-biológico que contribuye ti » rec imipntn, funcionamiento o viabilidad de las células, de modo quo la condición alterada sea lej más semejante po ibl a la » r.ond M iones i 11 w s en el si tic. de implantación deseado. Además, las c ndi iones restrictivas pueden mcí * ficar también la con entración e ctiva de una o más moléculas b lol óg i c antou. e ,¡ I i -a ,, i r.» lu/endo, pero nc- estando limitados a, una hormona, factor de re imiento, neurot ransmi or , citoquina u otro factor biológi amente activo que participa -en el señ lami nto intra™ o intercelular . fie podrá apreciar que lgunos nutrientes y factores biológicamente activos, pueden estar presentes en una concentración menor ti t viv quo 1 A norm l ente encontrada nt v . ' a. Al terna l i vamon te, alguno.» im t v l ntc-s y fac tar*es biológi amente activos, pueden e.tla presentes en una concentración mayor n.t vivo, que la que se encuentra normalmente in v i tr-o . Además, las conche iones rt-.- lriC t i vas contempladas parla presente invención, in luyen la expo i ión de las células encapsul das, ya .»-„a - 1,t v i yo o ín -. i 1r . a célula., objetivo de un sitio de implántete ion ele^ ) para producir la pro iedad celular deseada en las célula.» ene apsul adas. Ver, por ejemplo "Neuronal 1 . Hybr-id Cell Lines: Oeneration, Character i „:at i on and Utility" de Wainer y Heller, f?n Meu ona I Col! I i ne.», ITell T. W?od , TRL Press, pág "" i 20 (1992) . Con los método., de la presente invención, se puede ut?J?_.--?r cualquier m»-'d i o de* oillt .o adecuado. Un experta en el arte, puede modificar un medio >le cultivo minimo de un tejido determinado, can el objeto cte lograr una r onceutrac i ?n deseada de un nutriente ci yas c r ¡tic u otras condir iones restrictivas que carácter i ..an un sitio de i mp 1 tntac IC'JII do,, »JO« BL las c lulas son expuestas a las condiciones ef?-ir 11 vas in *- it o , la . r c-nd i c i ortos del cultivo pueden ser-cambiadas lenta y < out iituanien te , o pueden ser alteradas par cambios de una o más etapas pata <•„ 1 < anrar- la condición r t r i c 11 v deseacJa . En una modo li 'Ja» I preferida, ¡a-> células son expuestas a una u más candi. ?o?t r._-.it p t i vas t n v i vo por- medio de su implanta ión en un receptor en un sitio de i pl nta ión elc-y i do. El ambiente malc-cular en la vecindad del sitio de implantación elí-yidcj, puede afee tai la-» p t > ,p i e> lades e la células implantadas y acl imatadas en este sitio. Por ejemplo, ia t arn.en trac) ón de uno o más factores bioló icamente activos (por ejemplo, hormonas, factores cte ere-1! j miento, neurotransmi sores o ciloquinas) pueden influenciar la capac idad 'te I ¡s eé|u|-¡-. implantadas para crecer, par'a aclimatarse pur la ada tación de l -, perfiles de expresión de genes para la sobrevida >-.n este --.ttio, o para producir los fa ores terapéuti o'» deseado?». Una ve,- que las célula» hayan sido expuestas a las condi. iones r stri ti as irt vivo, dur-ante un tiempo suficiente para exhibir una propiedad celular deseada, las células son recuperada y puoi.en >'>r implantadas en un hospedero. Nosotros pr ferimos la exposic ión a J s condiciones restri tivas tu vivo, debido a que la propiedad deseada de la célula objetivo exhibid-i por las células, •-*-. establecida por el ajuste de todas l s carac ter i .ticas feno t ip i r as celulares que se producen en lab cund i c?>>??e.» restri tiva.-. Al contrario, una aclimatación o exp?sie íe'.u a las condiciones restrictivas in v 11 r-o . puede r-esultar- en el establ imiento de algunas p opiedades celulares deseadas. Rin embargo, si estas células sof-""-" implantadas en el hospedero, se pueden alterar otras propiedades celularo.» y a fe»" bar la propiedad a las propiedades establ cidas, deseadas de la célula objetivo. Pr f rentemente, el receptor y el hospedero, son ambos primates, más pref rentemente eJ hospedero es humano. Pre erentemente, el '-o tío de implantación en el hospedero , es el mismo que en el re ptor. Las células preparadas tu vivo. >-le acuerdo can esta moc/alidad, también pueden ser mantenidas ba o una o más condiciones restri tiva*, y -» r u . ula m i tro para diagnósticos u otros propos i to . En otra modalidad, las células son expuestas a múltiples condicione-»» re»ir i» Uvas ? vi I a , antes de la encap.»ulac ion. Preferentemente, las células son encapsuladas después, y expuestas a condiciones restrictivas adicionales, antes de la implantar ron ,»p el ho .pedero. La exposición a una o más cond ici oríes rest i tivt-» antes »lo la eitcapsul ac ton , permite seleccionar las célul ts sobre v i v i entes d la población ?r,?c?al y encapsular '-.o 3 ámenle >*.la-» c élulas, tí i las células usadas son oíi mitó tcas u »)lt-? . * la olécula biológicamente activa deseada. Si l s células usada ., son células que se dividen activamente, las células sobrev i v lente , nor l ente-1 crecerán por encima de la pob 3 ac i ón i rti c i al „ lo Fl tiempo >uf?e i ent o para establecer la propiedad ce* *\l deseada en respuesta a la ndición restrictiva variará de acuerdo ron la célula tr.ada, asi < orno también, de acuerdo con l s con iciones r-estr te tiva-». fiener a 1 mont , I ai» células pasarán por1 ?n periodo de tr ansie ion il .er e,-pue-,t as inici l mente a la lr- condición o las condicione» re t ictivas», por periodos durante los cuales el fenotipo celular seguirá cambiando hasta que llega a ser establecida l* propiedad celular como r-espuesta a la condición restrictiva. l-.l i mpo ne esario para la transición pui-.de ser determinado por r i mentos de rutina. o En una modalidad preferida, células de riñon de un hámster bebé (célula » Ht ) produc ola-» genéticamente par-a segregar factor de crecimiento neuron >1 (NGF) son suspendí das en una matriz de colágeno/Vi I royen <n J y encapsuladas en fibras huecas semipermeables sellada-» en »us e,, t remos „ l -t ¡trepar-ación de dichas 5 células BHAhNGF ha sido desrpla, por ejemplo, en la PCT/US94/09299, incorporada a la presente descripción como referencia. Las cápsula-» son aclim tada--. 111 v i t rp a condicione*-de bajo oxigeno y ba a glucosa, y la cantidad de NGF liberada de las cápsulas es deter m i na» la como U. W-Í función del tiempo de aol| "ila ión t n y i 11 » ) . I i .olor idad de-- producción de NGF por cápsul aumenta con el tiempo de te l i uta ta> ion tn v 11 r-o (Figura 1 ) . En otra modalidad preferida, se implantan células BH.'-hNGF en los ventrículo- lalei'-l -- de un he.t.. ecle o y se aclimatan i n v i yo . L s cápsulas son es iantadas, 3 as células aclimatadas son extraídas y cultivadas por pasajes repetidos, y luego son reencapsul adas pjra la i p 1 tnla ión nt y i vo en el receptar para si/7 "c3 i ma tar i óu . Las cápsulas con célula". .»?n aclimatar o c:au células aclimatadas ni vi vo »on e-r-sayada-- por la liberación de NGF antes cié la r enttp 1 au t a» U'JII y en varios tiempos después de la reimpl ntación en el receptor (Figura 11 . En otra modalidad preferida, las células PC12 encapsu Jadas en membranas semipermeabl s de una sola piel son expuestas a coudic i one » e i ) ' s > t ivas i n y i yo dut?ante 6 meses en cerebros do primates» Después de un periodo de implantación de 6 meses, las células ethibeu una propiedad celular deseada en respuesta a las . opdir iones rostí n tiva-», es de ir, las células exhiben una producción i amb i tela >Je neur'otr ausmi sor-e , eg?n lo medido por la relación de líber-ación bi-.ul de I. -dop /dopam in , asi como también, los c mino.» en Ja produce i ijp relativa de otras catecolam i ñas , en > ompar i» i óu » .tu lo-, ni >II?. dr» ¡-reimplantación (Figura 7) . Eu otra modalidad preferida, la., célula» HK-hNTF ion implantadas en I c.s ventrículo:- later-ilos de un hospedero y A aclimatadas in vivo. Las c psula. U|) ^µ1 ap üa<_, ?? células acl imatada:» son e¡ traídas c.u J l i va»ta •» p»?r pasajes repetidos, y luía. " san reertca¡>->? ]a» _. p it i i » i p J tnt -te ton m vi vc.) en el receptor para su a> 1 ímatat ?ón« I a-» » .p-»olas con células no aclimatadas o con células ac 1 imatadas i rt vi vo ., son ensayadas parla liberación de N1F antes ió la r-r- 1 mp I an tac i ón y en varios tiempos después de la r ei mp I aiti ar i on en l receptor (Figura 11). En otra modalidad preferida, las células PC12 encapsul adas eu íi?r~->?>bra??as semipermeable*-» de una sola piel son expuestas a conche ?one~. re-,i» o ti a:» 111 viv durante í-, meses en ce* -»bros de primales. Después de un periodo de implantación de » meses, las células exhiben una propiedad celular deseada en respuesta a l s conche iones rostpe t?va->, >--., decir, las células exhiben una producción ami » I =? de neu rotr nsmi «-ores, según lo medido por la relac ion de liberación basal de L-clopa /dopamina , asi como también, 1».-. cambios en la prociuc ión relativa de otras c teco! mi ña , e.u < unípara i. ?>'-u 'l A niveles de pr imp 1 antac ion (Fi ura 7) . En otr-a modalidad prefer-ida, las células PC12 son encapsul acias y aclimatada-» i n vi vo en regiones c rebrales de substancia nigra que tienen novele., normales de dopami na , o que tienen niveles reducidos e dopamina inducidos uní lateral mente por- la administrac ión previa de 6-h i dro; i dopamina (6--0HDA) . Las células PP12 acli at tcJa-.. in i. vo iJur nto un periodo de 28 ó 60 días, producen niveles mayor-e-, el l.-dopa que aquellas aclimatadas dur-ante periodos de tiempo menores. Las células aclimatadas ni vivo en pr esonc i <t de nivele?, normales de dopamina producen relaciones mayores ci l.-dopAdopnmi na , si son reimpl ntadas en un receptor que las células aclimatadas en subí -ncia nigra Asomada con 6-OHDA que tienen niveles redu idos de do¡.amina ?gura 9). 5 En otra modalidad, células adrenales i romoa f i nes encapsuladas en membr-anas semipermeables de doble piel son expuestas in y ,? vo a conche iones re trictiva.» en el espa ie, suba racnoi cte de humano» por- periodos de 55 y 84 clias. Despu s del periodo de rei pl ntación, las células exhiben producción <") cambiada de neur-o I rausmi sores , _ v Fstán contemplados un numero dr- sitios de implantación di rentes. Estos sitios de implantación incluyen e] sistema nervioso central, incluyendo el cerebro y lv. humores acuosos y vitreos del ojo. Lo. -.itio. preferidos* en el cerebro incluyen el 5 cuerpo estriado, la corteja erebt l, núcleos subtalámicos y el núcleo basal de Meynerl. Otros sitios preferidas son el liquido cerebro espinal, más preferentemente el espa io subaracnoide y la ventrículos lateral s. La presente invención también contempla la implantar ion eu el sitio subcap:»ular del riñon, y ó sitios i ntrapop tortea 1 es y subcutáneos, o cualquier sitio terapéuticamente benef u lo o. Fn algunas » a .o •> , ¡mr-»de ser úti I modificar el sitio de implantación antes do, o conjuntamente con, la aclimatación tn v vo para crear- IÍII ambiente óptimo. Por- ejemplo, un modelo 5 conocido pa rp la enfermedad de Parí inson, comprende la administración de-» A -h j drox uApami na eu la substancia nigra cerebral. Esla toxint es selec tiva para neuronas ciopaminérgicas.

Las células pueden ser impl ntadas y aclimatadas en esta área lesionada. Las célul ts Pf.12, que --ogr gan r atecolammas al ser imp miadas en un e '- ebro lr-.?onaclo •=»'-, l,e modo, muestran un aumento general de produ c o.n do c at c ol amina después de aproximadame te un mes i n vi vo . Además, la rela ión de las espec: í s de* cate ol am i rías c unluii, decreciendo la relación basal de L-dopa/dopami na despu :» , a r ox? rrta -cénente 1 cJías i n v i vo. El ambiente lo al varía entre los sitios de impl nta ión, entt-e las diferentes espe ies,, Es probable que el ambiente local do c u?lqm» ".itni de implantación determinado v *-*Ará entre individuos de la mi -.ma especial. En general, las concentraciones de elabo J i I o y gas presentes en un sitio de implantación d termínenlo, pueden -»er e-.limadas a partir de la información publicada o pueden ser' deter inada, por* un experto en el arte, sin experimenta' ion excesiva. Por ejemplo, es vahído que en los humanos la presión parcial típica d-1 o; icjeno en el cuerpo, e:.lá compren ida entre-:1 aproximadamente 9ó mirtHej en A ..afhjr-e arterial y mentí*» de 1 mmHg en el tejido del músculo en l raba j»*.. Otras presiones típicas do oxigeno son: tingre vonos. (lo mniHij ) , avidad pe itoueal (47 mmHg), y liquido c t ebro c.~.p i na I (59 mntHy ) , Asimismo, l > valores típico» de glucosa se encuentran entre BO y 1 0 mg/de» i 1 i tro-» < , A a 6,7 mM ) on tejidos irrigados por sangre, y entre V> y <* mg dec i 1 j tro- (2, 2-3, 9 mM) en el liquido cerebro espin l (cAF < (C n "»ul tar C.e i ». / S ientific Tab lev t Vol. I, Units af Mea.-.ureaieiit , Hody Fluids, Compan»! t ion af the Body, Nutrition, 0» lava F-.lic. ion, Fd. C. lentper, C IBA-GE IBY, 1984). Estos y otros ejemplos pueden ser encontradas en las tablas G tqy Hcientifu .oblo-, i ?u or porada » a la presente des.-*" ipción come- r'eferene ? . L-t Tabla I compara las cancerttr-ac i oues de un nt'tmero de c ompue.»tos presente*» en el suero » sanguíneo y o 1 CSF-" . 0 5 o TABLA I Compuesto Liquido Cerebro Espina 1 Sangre (suero) Gx. _ no 59 mmHg 40 mmHg Gluc:osa 1i? _ 1() mg/dl 55 + 15 mg/dL Ga lactosa 1..? ± 99 µM l? 1 µM Gl i cero! 1 .5 + 2.5 µM 120 + 65 µM Acido Láct 1 o 1.6 + ? .2 mM 0.76 + 0.34 mM Aci do p i rúvico 1 I '"' 1 5 µM 32 + 19 µM Fo fol ipidos 5. 1 i 0. JIM 2.9 + 1.2 µM Acidas cjrasos ;..5 µM 500 µM c "' A 1 K nM 11 + 2.4 nM cGMP 2.4 J: i"1.5 nM .5 ± 2.1 nM Cloruro 125 i mM 102.5 + 4.5 mM Fósforo 0.52 + 0.07 M 1.05 + 0.31 mM Sod i o 145 + 3, mM 140 + 2.3E. mM Calcio 1.1 1 . OR mM . 4 + 0.1 mM Magne io 0.09 + o.17 mM 0.78 + 0.04 mM Zi tc o .48 ± 0.12 µM 1 .7 + 3.1 µM Hierro 0... + ("i , 1 µM 17.2 i 0.75 µM Cobre 0.25 + 0„ 06 µM 1 5 + 0.75 µM Manganeso 21 ± h nM 10 + 2.4 nM Ca 11 na P, . "'• + 1 ,, 7 µM 1 .5 ± 2.3 µM Histami na 87 i nM 3.4 + 0.7 nM Nor-epi nef r:ina 1.4 i nM 1. 5 + 1.0 nM Epi nef r i na „24 + nM 0.1 + 0.1 nM Serote-ni na "i .9 + 1 R nM O •+ 20 nM Las Mol culas cjue inc luyen gluco-»a, aminoáci os, lactatos y p bonuc leósidos son l,ransp»>r nocl a travo e la bar-rc- -a sangre- cer I^GO liacia el CSF ¡tara proveer áreas bañadas con CSF, tales como los ventrículo*», ol espar i o subarac oi de y el canal espinal. Las concentrac iones >.e-_ galac tosa son típicamente dier- ver s mayores en el CBF, y los áridos pirú ioo y lácticcj son mas concentrados en el (_BF c¡ue? en e] plasma sanguíneo. Al contrario, la mayoría d»-» Jo-. aminue.c irlos son de? 5 a 30 veces más concentrados en la ">angr>-' c|u - en el CSF" < er G inv Be ifc»nt i f i c Ta les. Vol . I, supr a . página 169). Dtras --ub -» l a uc i a.» "mi» i onulr i entes" , tales como la vitamina C, folato, ún I» nnlp » > - del complejo de vitamina P), desoxi r-i bonuc leós i o". , y pir ?d'.>;,?na ( itamina B<¡_ ) , ean transportados ac i amente a l ravé de la barrera «sangre—cerebro hacia el CBF. A emás, la*. > onr en ( r aciones de iones, tales como sodio, potasio, ctlc ?>"), ma nesio y cloruro, son reguladas estrictamente en ol CSF (Spec. tur1 and Johaiison, Se ient i f ic rfa- ic n. páginas 6 a 74 (no i mb e de .9R ) > . Los metab» )1 i i o:, pie' tte-» ».?? el medio de-' cul tivo son elegidos normalmente para op i i i.'ar el » reí i miento celular y la viabilidad celular' en ejl tejido el'-1 cultivo. La concentración de estos compuesto--, difiere-» de o¡uel A. en mi »?t?o de implantación determinado. Much-ts ve o . , la . » c'-lulas »on cultivadas en cuneent rae i ones >le -»alus y glur .t mayores que aquellas encontradas en los sitio» de implanta*- i ón deseables. Por ejemplo, 1 c.s me ios RPM. 1Mo contienen 1,1.1 mM dw glucemia, mientras que los niveles e gim..»».. -,o?? de apr o;, imadamente 4.5 mm en el suero sanguíneo y solamente de 2, ? a 3, 9 M en el CSF.

De un modo <»?m? l -, lev» ni ele- de calcio en RPMI 1640 son y e 0.42 mM, mientra-» que los niveles de calcio son de 1.2 mM en el CSF y de 2.44 M en el suet o .languíueo (Tabla 1). Los iones 5 de a??. están presente-» <~>n un > ».ou- etrl r a», ion de 0.5 µM en el CBF", 16.7 µM en el suero sanguíneo, y están ausentes del medio RPMl 1640. Además, la mayn i --- »Je I is A-lulas son cultivadas in v 11ro en niveles de oxigene, ambiente (14? mmHg) o en incubadoras (") con aire ambiente Itu idi f i r ado y del 5*/. al 7V. de C0a. (por e , ".pío, Aibisclter y asoc i ?»Jo". , o- ma Ler i l ». , suu ra f ard y aso iados, su r-a ) . La < OIH entra' ic'tn i]»-- o igeno puc.de ser significativamente-1 mayor- que aquella presente tn vivo en el si io de implantación elegido en el hosp» clero. 5 Además, l o» lo. lo m-d?»)s de ul'ivo 'Je tejido están desprovistos de l.ts moloc ul i » et entera I e:-» que están pr-esentes in vivo. Estas molécula.» efemerales se degradan rápidamente y son constantemente sin fcet i ra a -. o rebabaste»" i das ni vivo. Algunos medios de cultivo son >up I emen tad»>-» » on >uoro fetal de ternero o caballo ínactivado por calor par-a reemplazar algunas substancias, pero el contenido de molécula-» efemera 1 es en el suero, generalmente es bajo i-_mb?ón i nu i o , el medio es supl mentado con suero, t ip i e a ^u le meno- del 'oy« del »ne>l?o tola] es suero, de modo que estas moléculas estarán presentes, en el m--? ar de los casos, en sulamonto una qu.nl - ppr-te de la concentración encontrada en «1 suero. Además, Jos me i os de rul ivo supl mentados con suet o pite» Ion contener moléculas que no sean compatibles, las cuales no existen en un hospedero y por lo tanto, pueden tener efecios no deseado.» sobre las células en vrt su1 adas. Finalmente, .roent--as >.¡ue las concentra»: i one en suero de la mayoría do 1"'» i '.imponentes reflejan su concentraci n en el fluido inter ti i l, la c ncentra i n de substancias específicas, puedo di fot n > , jn i f i c a l i vamente e-Mitre c?l suero y el fluido intersticial. Las célula.» usada-, en la presente invención, pueden ser alogénicas al ho »pedc-r o (es »1»*c ir, pueden per- te*nece-*r a la misma espec le que las cc--l.il a-» >lel hospedero), o pueden ser xenogérucas lf ospedero (es den ir , per tenec r a una especie diferente que el hospedero). Nosotros preferi os implantar células en un hospedero xenogónuo. .» * ¡t no' ,„µ? ou i JO que. la preparar: ícn de células para ? implan! a ion en un hospedero xenagénico, implicará probabl mente condiciones restrictivas diferentes que para un hospedero alogéiiuo, y fjuede producir una pobl ac ion de células de ferie. tipo diferente, con propiedades celulares di Gerentes . Las células pueden ser* preparadas, ya sea a partir de un donador (es de» ir , rólul ¡- primaria » o tejidos., incluyendo células» o tejidos adullo», neonatales y fetales), o a partir de células que se reproducen m vi tro. tales como las células inmortalizadas o la» líneas relujares, incluyendo células mod i f i cadas yene t i r a en te . Las células priman -s pueden provenir de-1 un tejido norma] µo«t~m? fcót J c o (que- -.o subel i v i de ) , de célula1», mitótica.. (que se dividen naturalmen e), .cutio 3 ?s del hígado, o de J s lineas celulares pl un poten tes , co o las del bazo y de la médula ósea. Las célula» mi tutu amento .» ti vas obtenidas in vivo, tarne-. én pueden proven»! d> A-lula-, > anee-rosas (células »:ie tumores) . Las célula . primaria-, que pueden ser usadas de acuerdo con la presento itiveni i n, i n» lu on i Ao _„> celulares pr ogen i toras neurales derivada.-» c 'i i ítems nervioso central (CNS) de mamíferos, que responden a un fartor de crecimiento (ver el estudio de Reynolds y Weiss en A i oiu.e, 255, ¡.aginas 1707 a 1710 (1992); el de Richard-., y d i ados en Proc . N i. Ac d. S i . USA, 9c?*r, páginas 8591 a 8595, (1 91); el de Ray y asociados en F oc . Nati. Acad. Se i . L|.SA, 90, página*. 7,602 a 3606, 1993)), fibrobl s os priman»)-», ee nla > >Jo '¡dtwpii, ast roe i tos , células -.-TC, células Hep- O, c lulas ATT2<-, ol i yo endroc i tos y sus p rer ursores , mi oh 1 as tCD , i o tubos , células adrena les cramoa fines o tejido de médul t adrena! , N'jsotro-.» preferimos las lineas celulares neurales y la » eélul . , nlrenale*. cromoa fines. las células »ie flAm un, también preferidas, pueden ser-preparadas de acuerdo con »--l método de Bunge (Solicitud de Patente PCT publicada No. Wí) 9 >;;;.,.Í ) . L AS células de Schwann encapsuladas pueden ser- i pl ntadas eu áreas apropiadas del cerebro par-a prevenir Ja degenera ían de neuronas dopami nérgi as del pasaje estriad') nigral, a »oe i adas ron la enfermedad de Par-I inson. Generalmen e, el ,?. o> ».o implanta» ion ¡ireferido, se local i -rara en, o cerca de] uerpu e^Lripdo. El encapsulado de las células pu»de aumentar1 1 i ,oc rec i n de fac tores tróficos, debido a que las céln] ?s i» e-. t.i?<» u i ^n eonla» to con las neuronas y no se produ irá Ja mieliuac i n. Oíros tipos de células g] jales fiueden ser- ene ap .u I nlts >> impl-ptlada » '-on este propósito, irte» /endo astr-oc i to-.-» y oliyodendrot ilon. Las técnicas pira ai -..lar1 las células a tejidos que producen un produc l»> ->e 1 e, , ooa io, =>on cumi idas o pueden ser-adaptadas a partir- d>-v pro» e»l i n» i enl o-> c onc>' idos, Por ejemplo, los islotes de Lartgerha ns pueden >et aislados de un gran páncreas anima] (por1 ejemplo, humano o por. ino) usando una ombinación de distensión mecánica y digestí». u con colagena-.a» según lo descrito por ñcharp y aso' i ados eu Ja Patente E-stadouní dense No. 4,'"*^ 8, 121. Los islote.» pueden ser aislados de animales pequeños (tales corno ratas) por el mAodo ».»* Sell -)) y asociados, publicado eu Diabetes 19, supJ,. I, pá ina-, 1 a 7,0 (1 B0). De un modo similar, los hepato it?s pueden ser aislados a partir del tejido >tel hígado u~»ando digestión con colagenasa seguida por- el fra» i i onant i en! o >"!»'J le icJo, sogc'in Jo descrito por' Sun y asociados en Kio at,, Att. Cell . Art. Oro.. 15, páginas 483 a ,496 (1987). Las célula-» adrenales u romoa fines pueden ser-aisladas uti Arando ntéis-do. cono» ¡do-. (Livett, 64, páginas 1103 a 1161 (1 84); tejen y asm jados en la Patente E'stadoum dense No , , 757 , 35 ) . las células i nimir l a 1 i -.adas pueden provenir de fuentes primarias, o puédlo h.b'-r »?do sol c-. e i onacJas e células transformadas con vi us, produc to~> de genos virales, oncogenes, u otros genes i nmortal i rados o productos de genes. Los ejemplos de las lineas celulare-» púb3 ?< miento di ponibles adecuadas para la práctica de la pr sente invención, incluyen: riñ n de hámster bebé (BHA, ovario de hámster ( lllpo <CHD), fibroblasto de ratón (L-~M), embrión de-1 r?t?'»n sui/u NIH (MTH/3T3) , líneas celulares del mor-,,, verde africano (inrluyend». rrr;- , COBA, BBC-1 , BGC-40, BMT-- 10 y Vero), feocromac i tom<> -drena! de ratón (POA), PC12A, células del tumor' qpal de ratc'nt (C6), células RAJI (linfoma humano), células del p 1 as ac i toma ratón MÜPC-31C, células MN9D y MN9H, y células rier?va»la- del ratón transgénic o ripTag. Preler irnos las células BHI y P012. l s técnicas fta a la i nmortal i rac ion de las células están descritas por l mJ y a ->oc lado.» en Nat ure 304, ¡-aginas 596 a í> 7* (1983) y el de Cep.o en Neut ott 1, páginas 345 a 353 (1988). Las líneas ce] ul tres posibles, incluyen lineas celulares beta, producidas gené icamente que -.egregan insulina, tales como l s células N1T (ver el -tud ni d» Ha aguchi y asociados en Diabetes 40, página 842 (1991)) y lar» células RTN (ver estudio de Chict y asociados en Proc. Nati. Acad. Se . USA, 74, páginas 628 a 632 (1977)), l =5 célul-i-» l"f (ven e l *•»*-»tud ?o de Hughes y asociados, Pryc. Nati. Acad. St i . UPA. «9, páginas 688 a 692 (1992)), las células CHO (ver estudio de Matsumoto y asociados en Proc . Nat 1. Acad. Se: i . USA, F.7, píyina-. 9137 a 9137 (1990), y las células ¡3--TC (ver el estudio e» 1 ti y ?-»o» lados en Mol . Ce I l . B to l . , 12, páginas 422 a 432 (1992)). l s células de la presente invención, o producen naturalmente una olécul bi l icamente ac l iva, o pueden ser produ idas genéticamente ¡Jai a dicha roducción. Por ejemplo, los fibroblasto.» pueden sei 11 ans fec lados con un vector de expresión par-a eJ producto elegido (por ejemplo fac or de crecimiento neuronal er i tropoye i i na , insulina, CNTF o Factor VIII). Las ejemplos de las moloc ula-. h i » ti g o ment a»"t?vas que pueden ser usa*, s para el trata iento de en f or odade-» o desordenes, incluyen la insulina, que puede ser usa»Ja para tratar- la diabetes, la hormona parat i roí dea , que puede -.or usada para tratar el h ipoparat i roí d i smo, la eril opoyod uta, que puede ser- usada para tratar- la anemia y el ácido gamma'-am i nobut it-i co para tratar la epi lepsi a . De un modo similar, las moléculas biológicamente activas, tales como fac lores tr?f le o» y e1 c r-ec i ieuto, pueden se- .."Sisadas par'a tratar- o preveni r c ond i c i otte » neurodegenerativas, tales como la c ore-i do Hun 11 ity ton y la enfermedad de Alrheimer, la clemenc i relac ninula ' nn el SIDA, y ]? enfermedad de Parí irisan. Factor.»-» de res ue ta b ?»)lóy i c , tales como la linfoquina o la c i toqui na , pueden fortalec er el sistema inmune de un paciente o ae tuar co o un ai-eide ant i i nf lama torio, y pueden ser titi les para tral tr > lert o- c n > CM mecía dos infee e losas e roñicas u inceres. Además, las c a teco I ano ñas , "IIÜDI1 f i na.», ence fal i ñas , y otros péptidos opioicle., también pueden sc.r provistos por células encapsuladas para oí tr ta i ento del dolor. L s rélula » ene apsul arla •> pueden ser usadas para proveer urta molécula ioló i amente acti a, úti l par-a corregi una deficiencia en-- 1 má 11 »:a . Un ejemplo de una defic iencia tal , es la fal la hepática -fulminante, en la c ua l el tej ido hepático no puede-1 remover más toxinas o e cr tar productos metabólicos de desecho.

Otro ejemplo, os la f m 1 r tonup , en donde se forma el aminoácido f eru 1 a 1 au i na , h-o-la niveles peí i grosas en la corriente sanguínea de un ruño afectado- Alternativamente, las células encapsuladas pueden pro» cir molécula--» biológicamente-* activas que remueven productos perjudi ial s, o uo deseable-, d»-*! hospedero. Por ejemplo, las células e-ncapsulacla » pueden pr»>duc ir moléculas biológicamente activas que "barren" el colesterol del hospedera. las moléculas I. i olc.y i e ámenle activas de la presente invención incluyen hormonas, i i toqui rías, fae lores de crecimiento, factores tróficos, factores ano i ogcíitési os, anticuerpos, factores coaguladores de-* sangre, 3 i n faquí ñas , encimas, y otros agentes t» péuticos o agoui »ta >, pro» ursores, análogos activos e-> fragmentos activos de los mir>mos„ Fstos incluyen c ateco! ami rías, endor finas, encefalinas, oíros péptidos opioicles, dinorfina, insulina, factor VIH, er i ( r opoye I i na , substancia P, factor de crecimiento neurona] (NGF), fae tor neurolrófico derivado de la linea celular glial (GDNF), f n.biir de r r ec i miento derivado de plaqueta (PDGF), fartor- de c -ec?m?ento epidermial (FTP), factor ?ift!í..--otr'óf i co der-ivado .I».»I eer»'bro (F-iDMf ) , neurotrof ?na-3 (NT-3), neuratraf iría- 4/5 (NT- /5), un conjunte.) de factores de crecimiento de fibroblasto, factor neurot ófi o ciliar (CNTF), moléculas relacionadas con ol ONÍF y fac lores de crecimiento I, II y III semejantes» a la i. nsu I. ina. En una modalidad, la molécula biológi amente activa es un neuratransmisor . Dichos neur t raíis t ores incluyen dopamipa, ácido gamma-ami nobut i r?> o (HABA), -,em ton i na , acet 11 r ol iría , narepi nefriña , epirtefrina, ir ido glutámico y otros péptidas neurotransmi sores, preferentemente elopami na, nore ine fr i na o epinefpna. Además, la ole» ol biológi amente activa puede ser un agonista, análogo, .11-->T I vado o f i aijmonlo e1 un neurotrausmi sor , i nc' -yendo, por ejemplo, I - elopa , un precursor ele la dopamina. Fn otra ?tto>la 1 i da»l , 1 v> células aclimatadas segregan agentes ant i ñor i »-ep t i v» )s , i n» luy»>u»lo c a to». ol a i na'-», encefalinas, péptidas opioides o agouiAa » o -nálocjo-» de Ion mismos. También pueden usarse mp;? Jas o los agentes mencionados.

Pref rentemente, son segregado"- e a teco! ami ñas a encefalinas, más pref rentemente, una o-ícla de r a tec o] arrp i .as y encefalinas. Las cápsulas útiles de la presente invención tienen ne? talmente, por lo tríenos en la superficie exterior, una membrana o envoltura serru peí moab 1 n ue >'>)d>-? . un rn'tr.1 *»u »-¡ue contiene la célula. La envoltura permití- la difusión de nutrientes, moléculas biológicamente ac ti vas y otros productos sel c ionados a través de la < ?p >ttla„ I » ' lp;»ula es b to ompa t ible, y preferentemente, i umon»->a i si an te. l núcleo contiene células aisladas, o suspendidas en un me io liquido o i nmoví 1 i zadas deotro de una malp;1 do hidrogo]. La-. selee». i n de Tu, materiales usados para construir* la cápsula es determinada (tor un número de factor-es y se encuentra descrita detall damente en la Patente WO 92/19195 de Dionne. Brevemente, se pueden usar- varios polímeros y mezclas de polimeros para fabricar1 la envoltura de la cápsula. Las membranas poliméncas que forman la 'ápsula pueden incluir pol íacr-i ] atos (incluyendo e opul í mero-» acri lieos) pal i v i ni 3 idenos, copal i mera» de e lopno cj»» poli vi ni lo, pul itirßtßno*, pol íest renas, polia idas, a» ótalo-» de e. o] ulosa , nitratos de celulosa, pol i sul fon e», ¡ >»•-) 1 i fo?o/eiios , pal i ac r i 1 om tr i los , PAN/PVC, asi como también, deri ado-»-, '-e:tpol im ros y mezclas de 1os i smo . l s cápsulas pueden ser formatia siguiendo cualquier método adecuado conocido en >--! arle. Uno de dichos métodos comprende la cae?;; trust ón de una solución pal ímépca de colada y un coagulante que puede-» titc luir1 -fragmentos de tejido, organelas o suspensiones e células y/u otro» a entes terapéuticos. La envoltura puede tener una sola piel (tipo 1, 2) o una piel doble» (tipo 4). Una fibra hu»?ca de iel simple, puede ser producida st* ".urgiendo solamente una le 1 i > >uper f i c i es de la -.elución polimépca durante Ja c oo trusión. Una fibra hueca de piel doble puede ser produi ida sumer >j i enclo las dos superficies de la solución pol i mér i c a al »"i c o fcr u-» 1 ouach» . Nor' a 1 mente, un mayor porc ntaje de la -.uper-fie le de la > fibras huecas del tipo 1, es ocupado por macruporas en c o para i n con la superficie de las fibras huecas del tipo 4. la- fibras huecas del tipo 2 son int rme iaria-.. Ve-t, pot c <e?ttp3o, la patente WD 92/19195 de D .me, y la» Patentes Es ladouniden-..es Nos. 5,158,881; 5,283,187 y 5,284,761, todos *"*sl.o documentos están incorporados a la presente-» descr i pr ion r c-mo r e fer en» i <•» » ñon postbies numerosa:» c on f . gur-te iones de la cápsula, tales como cilindrica, en forma de isco o esféricas. La envoltura do l vehículo t»- t»1t-á un tamaño de poro que determina el tamaño do coi l»-1 quo permite el pasaje de moléculas hasta un determinado pe**o molecular (MWCO), c arac lerí st ico de la membrana de* permeabilidad sele tiva. la-a moléculas mayores que el MWCO no pueden atravesar físicamente \? membrana. Fl tamaño del poro de la membrana . elegi o para per'mitir la difusión IIAL. , afuera de lo-» far. oír.» par t i c.ul ai-'"» producidos por las células del vehículo, sin >--* . Init 1 a entrada hacia adentr-o de factores de respuesta inmune del hospedero. Normalmente, el MWCO está comprendido entre 50 20o ID, preferentemente entre 50 y 10? ID. La compuso ton membr ti . más adecuada también minimizará la reactividad entt»* 1 --» molécul s del hospedero con efectcD inmune presentes en ol sitio de implantación seleccionado y los componen lev» de la uteettbt ana e tenor del vehículo. El núcleo del vehí» i o i n unoa i si ante está construido para proveer un ambiente lo al adecuado para las células particulares aislarla » on v?l mismo. Fl nú leo puede comprender un medio liquido suf te l nte p-tra mantener el c re-íc tímenlo celular, Los núcleos liqui o:, son par ticular enle adc?ruados para mantener las li eas celulares transfor adas ro o las células PC12. Alterna i amente, el núc l o puede c mprender una matp." gelosa. 1.4.^ matriz gelosa puede estar compuesta por leas componentes del h rogel (alginato, "Vi trogen" , etc.) o por componentes extracelulares cíe la malí i;. Vet , por ejemplo la patente WO 92/19195 de Diorine. Las composiciones que forertan lo hi drogeles pertenecen a tres lases generales, la primera clase lleva una carga negativa neta (por ejemplo, algí nales). l.a segunda ciase 1 lev -t una carga positiva neta (por ejemplo, colágeno y larrpnina). Los ejemplo» de Ion» r ?mpo ßnte.1. «.«tricelular** d« ia m*tr i«r disponibles en el mercado i rv luyen Matpgel™ y Vi trogen™. La teroar? clase tiene mu carga netament-» neutral (par ejemplo, óxido cje poli eti leño altamente reticulaclo, CJ alcohol pol » ni 11 cn ) . Los núcl o-, preparado-» de una matru de hidrugel son pa i ularmente adecuado:» para mantener- las células o tejidos que tienen tendencia a form ir ag 3 o eradns o agregados, tales co o l s células en los ?=»lolo» de I angerha ns, o las células adrenales cromoa f mes. Los factor-es que tic-Míen influencia sobre el número de o células o la cantidad 'Je tejólos a ser cargados en el núcleo de l? " **•tápsula incluyen ¡ 1 ) tamaño y geometría de la cápsula; (?) actividad mit?tica de las células dentro de la cápsula; y ( ) los requerimientos de vi cosi ad para la preparación o la carga del núcleo. Fustas factor-es e"-»t?n descritos det lladamente en la 5 Patente WO 92/19195 de Di -trine. Las cim o»- psul as implantadas pueden ser recuperadas fácilmente usando un filamente-) fijado en la cápsula (tether). La*" i rc.cap--.ul as pueden ->et- recuperadas por criedlo de aspiración o ualquier otro me io adecuado. En particular1, la recuperación o de las icrocápsul a.» e»s fac i 1 i ta»Ja por el uso de un dispositivo de bolsa, tal como el de-->< rito en la ¡.atente PCT /US93/07076. Para sellar la cápsula -,o pue-.de usar cualquier método adecuado, incluyendo ol emplee") e adhe ivos poli meneos y/o el plegado, anudado o sellado por calor. F'--la_. técnicas de sellado 5 son conocida» en ol arlo, Alienta.», también puede usarse cualquier método de sellado "••.eco". En ichos métodos está prav ista un accesorio substanc talmente no poroso, a través- del cual, se introduce la solución »¡ue l onliene las células. Después del llenado, la cápsula e=» ¡sel lada. Dicho método está descrito en l á pat__ «te PCI /US9 /07( '1 , i nc or-|)orada a la presente descripción como referenc i a . Con el objeto de establecer la funcionalidad de las cápsulas antes d la impl nta ión tu vivo. se usan preferentemente, uno o á--- ensayos tp v.it ?i. Con este propósito pueden usarse pruebas y ensayos diagnós icos bien conoc idos en el arte. Ver1, por* ejemplo, Method a In Fna-ymolouv. de Abel son (Ed), Acade ic Pre-"»s, 1993. Por1 eje pJo, puede» usarse un ensayo ELISA (í>, --«ayo inmunosorbeule » on ei ima ligada), un ensayo croma tagráf ico o en,.- i mát i ro , o un bioensayo especifico para el producto segregado. 5 1 se desea, la func ic'tn >ie «secre ión de un implante, puede »er moni toreada >- I funciciit del tiempo, por1 medio de la r co1 ece i c'in de-» muestras apropiarían (por ejemplo, suero) ele-»! receptor y el ens-iyo de las ?t??~»mas. i el receptor es un primate, se puede usar- la u rod i á 1 i sis. Además, la actividad rnelabólica de las células puede s» seguida por el moni toreo dee funciones» tales, como A absorción de» oxígeno, 1 a utilización de glucosa o la función mi tocondrí al . l as vel o i da»1es ie-» absorción de oxígeno, pueden sear medidas con métodos cone)». i os en el arte (por e etrtplo, usando un sistema de absorción de oxigeno Diamond Teneral (W-1271) y un electrodo de tipeD Cl.t?-1- (1173 I ) ron una meptliraria de pol i et 13 eno) . La est bil idad genética de las células producidas» par-a expresar productos genéticoiFt heter logo* , úntele «er evaluada prjr 3a determinación del nómero de copia dejl inserto de gen, usando técnicas cono i as en el irte. ejemplo, el número jw copia del plásmid'), puede-' -.»er medido por1 1 . digestión enzimática del ADN ¿nómico, blotting, colo ación de concia y comparación de la señal con standar ds e onoe idos, usando un Pho hor Imager <R > (Molecul r Dyna ic-»). El número y tamaño dt.» cápsulas suficientes para producir un ef'-'cto terapéeitico por la impl ntación, son determinados por l-t ».anl ?da»l d .s ae. I ividad biológica requerida para 1 A ap] icar on ¡.tai"! icul ti . Fu el c aso de > élulas c¡ue liberan substancias terapéuticas, se-» usan considera iones» de dosificación st darcl y criterios cono'- i dos >jn el arte» para determinar la cantidad requerida »1e 1.s •» >ub »1au» ía-» segregadas, l't'» factores c¡ue deben tomarse en cuenta son discutido» en la patente WO 92/191 5 de Di orine. la implantar i ón »1<» célul ts encapsul das es efectuada bajo condiciones c*si1-ér i 1 e .. faenera 1 mente , la cáps.ula es implantada en up sitio en el hospedero, que permitirá lu entrega propiada del produc lo s rega o -t J y la entrega de? ríe lentes» a la.» célul ts o te jólos i plantado.», y que también permitirá el acceso a la cápsula para su recuperación o ree p 1 azo. A Continuación -,»e ilustrará con mayor1 detalle la invención, por edí») de ¡o» -»? go i enl e-> ejemplos, que-* de ningún modo, deben ser cansí deradon- corno 1 i mi tan tos del alc nce» de la misma .

V EJEMPLOS Ejemú lo 1 i Secreción de NGF por células BHK encapsuladaß expuestas a un ambiente de ba o oxigeno y glucosa. r Producción de uu linea '..o luí u BHI iiMOF". Fue produc s una linea c.e» luí A V BHI- que segrega NBF y expuesta a un ambi nte de b jo 01 i" geno y glucosa. Un fragmento de 2.51 |fa que contiene aproximadamente Z7 bp del extremo 3' d»»l primar introu, la secuencia doble ATO 0 considerada como el inicio de lo lrart:,la? i ón de la proteína para P - ro-NGF y la secuencia c od ?1 i e adora completa y la región no trasladada 3' completa d».-»l >j>-»n humano (ver ?»l estudio de Hoyle y asociadas, Nu ron. 10, páginas 101 a 1034, 1993), fue? subclanada en el vectar de expresión pNUT basado en DHFR inmediatamente 5 corriente abajo del promotor' meta] ot i on i na-1 de ratón (-650 a •+7) y el pr'i rai mlrn dol »j»-*l insulina TI de rata (ver el estudio de Paetge y asoc íado . , roc. Nati . Acad. S i . 83, páginas 5454 a 5458 (1986) . Se trau fectaron célula*-» do riñon de hámster bebé o (BHl ) , con la con tru ción de pNUl -ßNGF" usando el método de fosfato de calcio. Las células» BHl fueron cultivada» en DMEM que contiene el 10*/. »Je -»u».»? o bovino f>-»t?l, 1 •' |)en/st rep/amph ß ( . (")R g/l) y L-glutarrnna (G?BCO) >- I COy. i 57, y a una temperatura de» 37" C. Las células ?-H\ trait-» fec laclan fueron sel c ionadas en un 5 írtedio que contiene-* 20u µM de-» metotrex lo (ñigma) durante un periodo de 3 a 4 semanas, y la-i célula-» resistentes fueron mantenidas como poblac ?».'>n polic lona! con o sin 200 µM de metotrexato. Preparación de fibra-» PAN/PVC. Las fibras huecas con permeabilidad selectiva, fueron preparada-» e:ou una té'.nica de chorro seco - tejido húmeda (dry 5 jet - wet spinniug t ehniqu» ) V , Hollo» F titer N mb VA Iíes . Vol. 12 de Cabasso, en i r --D th r f-.ncy] copedia of Chemical Technolocjy, iley, Nei Yor1!- , "'a. E-d. páginas 492 a 517, 1980, Patente WO 92/19J95 do Dionn ). I ts fibras hueseas asimétricas fueron coladas a partir de-* .olui. i one > al 10V¡ (p/p) del copolímero I O po] lacr i ] oni tr i 1 o/c 1 oruro do pol i virolo (PAN/PVC) en d „*? I 1 su I fÓ!, i do y extingui as directamente en un baño coagulante. Las f?br?-» do piel doblo (tipo A ) resultantes fueron recolectadas en un bario de agua sin ->o3 vente, gl icen nadas y Preparación d la m lri. / 8 ml. de o láge-Mio »1e rola de ratón (tipo TV, Col labora ti ve, lote 1-- 108"') se a regaron a 1 ml de rojo de fí^l l /soluc I ón salina regulada con fosfato (PFS), y la solución "f _ ajustada al ¡)H t,o„ '•>»-' -"jt a aron f-l ml de Vi trogeri < n * 0 (CeltriK, Palo Alto, C ; lote 2H1/6) a 2 mi de rojo de rehal/PBS. Se mezclaron vol i'imene-:. iguales de las soluciones de colágeno y Vi trogen < n ' para forma la s»")l u»- 1 ón de la ptatp:. Procedimiento de carcha v s ll do Se enjuagaron con PBS (s n calcio y magnesio), las 5 suspensiones de células individuales de células BHK productoras de NGF, cultivadas ha -»ta una ronfluenc ta del 90'/., se tp psimzaron durante aproximadamente 1 minuto y se peleti aron -'i í por cnedio de centrifugación a 1 oOO rpm durante 3 minutos. Las células se volvieton a .»n.p n er en el medio hasta una con /ntraci?n celulai finil do 2 ' 10"-" c lulas/ml. Luego, esta suspensión celular' fue* me c 1 "ida >»?? una proporción de 1:1 con la 5 solución de la matriz » o l?g^rto/Vi trogen <R> , llevando la concentración e.elulai fin l » I )(••' » é I u l<?-»/ml . las élulan fueran mr*,*e laclas suavemente en la matriz para asegurar una di -¿trihue n'iit pareja de la suspensión antes de la encapsul ac. í'ji i , -ni* c rgaron 2.5 m u rol i tros (µl) de la l? suspensión célul a/ma Ir i ** < 1 u , 000 e->l ul <t'-» µl "» , en una fibra usando u t punta de-» catéter bi vela a do »-al?t)re 24 y una jeringa Hami 1 ton. las c psulas fu»»r»>n -»ei la as montando una fibra hueca seca de 1 a 1.1 cm de longitud, sobre» un eje r on un soporte 15 septal en el extremo >Je ( artja pa las células a ser inyectadas en la luz dol cl ispo »? I i v>) , Después de introducir 2.5 µl de la sur»pert:-»? ón celular, el ,t¡|iln??? fu.» quebrado y la apertur-a de aí;*--Osa fue sellada u-siiido un ae rilato ligeramente curado (?_xtr l™ ICM 24, T I Re-=» i ns US, Wil in ton, MA) (sellado "sobre <¡ un '-» e" f huí) sealing".!). A ion! iimar ic'ni, la cápsulas fueron provistas con un fila ent»; d> fi a' ton ( " i > > I her " ) , colocando uu tubo sil leonado de 1.5 c de longitud y 0.020" de diámetro sobre el &je* a rí i i e o. las cápsula.-» (ueion a» lima lacl n durante tres días a 5 niveles de oxígeno ambiente y ensayadas fiara la secreción base de NRF. Después de 3 días, o] medio fue reemplazado con 1 ml de-» mc»d?o fresco.

Luego, la,, cápsula., fueron ( ol()(_Ht :, en upa µ]d l dß 24 cavidades que-» contiene n?v»l>"*> ele-» baja glucosa (0.8 mej/1) y bajo o í^.'nu (50 mmHg) o de ?|l t cjluco-»a (5.5 g 1^ y oícigeno ambiente (142 mmHg). los me»i?o-3 fuet on cambiados y los ensayas de NGF realizados cada 7 día-». Hit ia antes de cada cambio, los medios frescos fueron Mova»fos a la-» concentraciones apropiadas de oxigeno para cada c»)nd?c?ó?t ele aclimatación» Las células encapsuladas fueron cultivadas ele e*»t oda durante cuatro sem nas. l os niveles de NfiF fueron determinados por- FLISA ( *aya inmunosorbente con enzima ligada) los dias 0, 3, 7, 14, 21 y 28. Se fijaron cápsulas representati a» con para-forma 1 delt i do al 4'/. i a la delt»rm? na» i ón histológic de los perfiles de viabilidad celular, Después de la fijación con ¡¡ara forma Ideh i do al 4'/., las cápsulas recuperada i fu'.' n enjuagadas con solución salina regulada c on fosfato (PBS), tl»"» i dr a ta» las en alcohol do hasta 95'/* y embebidas con una solm ion de infiltración de glicol e-sacr i 1 ato (Medio de montaje de historesina, Reí cher t-Jung ) . SE cortaron uecpun'W con uu espesot de tres mi ras, con un micratoma (Supure ut 20? , loica), que fueron montadas sobre platinas de vidrio y coloreadas con violeta de cresilo. ELISA NGF La (uantiiicac i ón >le ItNGF 1 iluta o de las células encapwuJadas BHl /NGF se real i ¿ó de la manera siguiente. Se recubrieron placas Fl TSA Nunc-In uno Maxisorp con 150 µl por cavidad de NGF an t i - ra I ón- 1. (2.5 S) a I ug/ml en regulador de recubrimi nto (1 v PBS .»?n CiCls- sin MgCJa/Q.lVÍ a/, ida sódica; pH 9.6) K) incubadas a W \A. > empe*ra l ura de 37* C al menos durante 2 l?orß »j <? 1 lerna l i v un» O ¿ i una temperatura de 4" C durante la nuche. la solución de r cubrimi nto fue descartada, las cavidades fueron la a»las l-r»-*'» veces ron 300 µl de regulador de lavado (50 m Tr i -» -H 1 /20o mm N-tCj/l'/. Ti i ton X-lOo/o, 17, asida sádica; pH 7.0) y bloqueada-» e»tn 3/00 µl de una solución de recubrimiento que contiene 10 mg/ l de BSA a temper tura ambiente durante 30 minutos. Después, las cavidades fueron lavadas tres v -*s c on 300 µl ».Je regul do de lavado. Las mue*stras acondi ionadas fueron diluidas l si en 2 x regulador do muestr (el regulador d'-* mu»"»'»tra »-»--> el mi -uno que el regulador1 de lavado solamente con do U A > , cargándose lo µl de la.» muestras preparadas e?n l s cavidades. l s placas fueron incubadas durante-» al menos 2 hora'-» a una temperatura de 37° C a durante-* la noche a una temperatura de 4" C. Cada una dw las c a v 1 d-idos fue vac tacla, lavada tres epres con 3(50 µl de regulador de lavado y se agregaron 10O µl de* conjugado NGF--Í3 -ga 1 anti-rat?n-ñ (2.5 S) de 4Y/ml. Las placas fueron incubada -. a una t '-*ntper a tur a e 37' C dur-ante por 1 o menos 1 hora, Cada cavidad fue variada, lavada lr»2s vece» on 300 µl de regulador de lavado, y se agrega on 200 µl de solución de rojo de c lor ofenol - -iub.it r i to-ñ- ->ja I ar laµ i r a nóc i do (4? mg CPRG en 1 0 mm Hepos/150 mrn Nad /',? mm MgCia'o.1 ?, ,!l UJ-t sódica/1 Y, BSA; pH 7.0). Las placas -se incubaron a una temperatura de 37° C durante un periodo de tiempo de 3n minutos a 1 hora, o hasta que el desarrollo de color fue suficiente para urta determinación fatométrica a 570 nm. ^ .tados l ns Figui -ts 1 y 2 muestran la liberación de-* NGF por cápsula en fuñe ion elel tiempo, ba o las dos condiciones ambi ntal s», para la filtra del ti o 4 al X OY, con sellado tipo "e e" ("hub se ling"). I o- datos son ei presados como ng de NGF liberadas por- cápsula por 24 horas. La produc ión de NGF por cápsula aument') durante.» ,al per-iodo de evaluación. 10 £ jplo 2 Secreción de NGF por células BHK aclimatadas después de la encapßulaci?n en cápsulas que tienen permeabilidades hidráulicas variadas. 15 Par-a este ejemplo se usaron cc ulas H -hNGF como l s descritas en el fjemplo 1. I a fibras huecas fueron preparadas de acuerdo con el prae ed i mi ento lo descrito en el Ejemplo 1, con í»¡-;cepc i n de» que las ma».r ocápsul a ? se prepararon usando la solución de calada PAN/PVC >>-» 12.5% y 15*/., asi como también PAN/PVC del t<T/,, la", fibras PAN/PVC de doble piel (T3) tenían una longitud de 1 cm y tenían las >? gu i ntes, carac erísti as: Sólidos Diámetro Permeabilidad l? ripr (µM) hidráulica '"'5 10 721 Ao 12.5 733 20 15 74A 13 (permeabilidad hidráulica en ml /m i n/mß/mmH ) l s célula» F-fHt- -- Nt JF feteron c a rejadas en ley--» tres tipos de macrocápsula y se»! laclas de-» ac erdo con la descripción del E e^ia 1. I as capsula» fueron expuestas a condiciones de baja glucosa y bajo o¡ f ». to durante 4 -.emanas y ensayadas por liberación de NGF, de acuerdo con la descripción del Fjemplu 1» La Figura 3 muestra la producción de NSF para los tres diferentes tipos de-» cápsula en func t n de.*l. tiempo. La liberación promedio de NGF de-» la c'?.»ula PAN/VIC 10*/* fue de aprox i Atadamente 5o ng/cápsula/24 horas para la cápsula PAN/PVC del 12.5 . La cápsula PAN/PVC 1 % no produjo niveles detectables (Je NGF después d^ 1, 2, 3 ó 4 :»ema roí -» . Fl o-,- tmen h i '-> tológ i e o de la-» cápsulas confirmó la presen ia do rac irnos do recluías sanas en las cápsulas PAN/PVC de 10% y de 12.5%. m las cápsulas PAN/PCV de 15% solamente estaban presentías células muertas después de 4 semanas.

Ejemp 1 o 3 Células BHK-hNSF encapßuladas son implantadas en un z hospedero l aí> célula:» eneapsu 1 arla » del Fjemplo 1, son o,,puestas a las ooncentrae lone-» e1 bajo oxigeno y glucosa d l Ejemplo 1, hasta que el n?v»-.»l >]»> sec r»-»c irán >le NGF o las células BHK, se haya e»tab?l??ado baj») >.?-sta , c ond i c i unes restpc tivas. l s c:élulas encapsuladas -»on implantada;» e-»n un hospedero humano. los sitios de-» implantación incluyen los ventrículos laterales y el cuerpo estriado del cerebro,. lo.» pr oc ed i mi entci5» para la implantación do cáp-»ulas eu el » erebro e«tin publicados eu la Patente WO 93/00127 olor atla a Aebí scher y asociados, incorporada ? 5 a 3 a presente desc p pc i ón c o r f er-enc i a . E J fe-? • i o 4 Células adrenales cro aa fines encapsuladas expuestas a condiciones restrictivas in vitro. Se reeuporatou célula-» adrena 1 e c ro oaf i ríes bovinas de las glándulas achínal -» por d? o-»l?»'>n c on < o] agenasa sc?g?n le"j descrito por- I ivet , en Phy niol . Re . , 64, páginas 110Z a 1162 (198¿l). So inmovilizaron agrega»to<3 dt? células adrenales en una matr-i:' de a 1 g i nato al 1.5% roto 'l do con CaCla y encapsul ados en me w < rana*» de f?bt-a hueca PAN/PVC i nertunoa i s J ante-*s, t?¡)ü . dt» piel doble (diámetro interior 750 µl , pared 85 µ] , MWCO 60 ID), si ui ndo =>ub:»la?te ?a3 monte» >»1 pro» oclimienlo descr i to en la Patente Wü 92/19195,, Las células eucapsuladas se cultivaron >Jn r ule 2 semanas a pOM, de» 20, -10, 6o, 8o y 1-12 mmHg. t s células fueron ensayadas por liboiat IOM l><¡ >?l 3 »»vo? a»la con I* de e a ten.» >1 aminas días 2 y 14. Do-.»pu s do 1 día.», la-a c ?p-»u las fueron fijadas en par'aforma ] deh i do al Y. y procesadas ¡jara la histología, aleccionada » y ?-v ilu-nl ¡ » mol fe) I )eji' -toen I >-> „ Se anali/aroo 1 -ts e a lee ul ami na-> por HPLC usando detección ele troquímic . I- I sistema c omatogr fi o usó un detector e ol oromét r i c o e o l er troció múltiple (modelo 5100A, ESA, Inc.), una bomba Hitachi L62po (Hitaohi, Tn»..), y una columna Hypersil de 1 0 m j; A .6 men, ', mi» roñes ÜDF5 O eystane F/Cient?f?c, Inc.), equipada con una columna MPLC NewGuarcl (Applied E*i osys tem-», Inc.). la-» e.o. r ida--» >o roa 3 i „a von a una temperatura de 26° C. l a f se m vil cau .istió de M de NaHaPO , 1.4 mM áci, J o t nosul fono o, 0. 7/1 mM F-DTA y 100 ml /L CH3CN. El pH fue ajustado a 3.0 cesando ácido fo-alór i c o concentrado. La velocidad de flujo fue mantenida a 1.o ml/min. TJ ele» tor e=>taba equif)a»io • on una celda protectora de preinyección (modelo 50"0) op»- -a?tdo a +45o mV y con una celda analítica dual do alta resoluc ión (modelo 5011 ) que se operó eu una modalidad do pantalla espi ti va a --40 mV y +400 mV para los elec trodos 1 y 2, r e-»per 11 vamentr*-» . La-» muestras fueron medidas r-, '1 deí tec tor1 2. Se usaron standard-» pc,)r triplicado ¡Dar-a los umbrales de deteece ion do ritóla - para la L-dopa (-3,4-di hi drox i f eni la laiti na ) , "I Do -te (ácido 3,4--dihidrox i f eni 1 acét i co) , la ñor ep i nef r i na (Nf- ) y 1A clopami na (DA), y de 104 fmolos -.obre» lá (.olumna para HVA (ácido ho ovani 1 ico) con márgenes de desv i ae i ón -> I anda reí por r- entual o:-» del umbral de 2 ^^%, 9 a 12%, 15 a 24% y 6 a 17%, respecti amente. Las curvas standard de 7 punto» fueron 1 lucíales a Jo largo de una gama analítica sobre la r olumna »Je 52 330o 1 moles para L-dopa, Dopae, NE y DA, y de 104 a 66(5 f m le i par-a HV?, con valores r35 de 0.999, 0.998, 0.999 y 0.999, respe ti amente. Los dalos fueron ca turados y las áreas pic o integradas usando una e:»tae ?e')n e trabajo c r orna logr f i c o Water1:» R45 VAX. Los r-esultados se mués i ran en la Figura 4. t os datas son expresados omo pie ornóle » por 3o minutos (producción basal ) o pícameles por- ¡"^ minuto » (pro»luce ion evocada con 1'* ) . En concentraciones de ()2 mayor-e»s, la liberación basa!, y ma^ particularmente*, la liberación evocada eon l-*- de norep i nef riña (NE) y ep i nef ri na (t-P l ) fueron mayores c»l día 14 quo el día 2. Por lo tanteo, 1 i exposición dr» las célul s encapsuladas a condiciones restrictivas dio como resultado la alteración de una o más propiedades celulares.

Ejemplo 5 Células adrenalßs cromoafines encapsuladas expuestas a condiciones restrictivas in vivo Se preparamn célula.» adreuales c romoa fines bovinas, de acuerdo con el procedi i nto >Jel Fjemplo 4. Se inmovilizaron agregados de célula--, adren les en una matri de alginato al 1.5% recti culada ron l?í y fueron en» apsu 3 adas en membranas de fibra hueca PAN/PVC inmunoa i slante » , tipo 2, de una sola piel (diámetro interio 500 µM, pared 70 a 90 µM, MWCO 60 ID), o en membranas de fibra hueca PAN/PVC i nmunoa i si ante » del tipo 4, de piel doble (^ lro interior- 50o µM , pared de /O a 90 ¡(M, MWCO 6? ID), siguiendo substanc lal ^nte el procedimiento descrito en la Patente WO 92/19195. La:» células ene < -»ul ada fu<-»t on expuestas a condiciones restrictiva-» irt vt vo ¡tara la implan tac t»')i? en c-»l c uerpo estriado de receptores de rala. Se implantaron dos cápsulas por rata bi 1 atora 1 men te. De-»puós de 1 i i nc i » ton en la linea media, se perfore') un agujero en el er rte-»»-) »»n la poste ion correspondi nte a las roardenadas H/„ mm con if.'aµ c lo al bregma, 3.0 mm laterales, con l a barra m i sor-a ajustada en -0,3 mm por debajo de la linea 4F-1 intra-aur-al . La» c ápsulas fueron introducidas a una profundidad de 7 mm de l dur a . Las »:ápsula--> fueran ensayadas par la producción de-* ratee tilamuia ante»-» de* la implanlac ion y despcié de-» un período de 6 semana m vivo. fl >»n ->)/»•) »?>» l-i-, r a tec ol aun ñas fue efectuado, siguiendo el procedimiento cln J». p Ui en el Kjemplo A . La Figura 5 (nuestra los resultados obtenidos usando membranas del tipo 2. Los ditos están expresados como pi como les por cápsula por 15 minutos. l os niveles de liberación basal (panel A) y de la liberac i n evocada por l* (panel C) de» NE y KPI f? .-on similares ante y ele=5pués de un periodo de i plantación de 6 semanas. Sin embargo, el nivel do liberac ) ón evocada con nicotina (panel H) de-» NE y GPT después de un per-iodo de exposición de 6 '.Pininas 111 vivo, fue mayor que el nivel previo a l a F"?gura A muo*->tra los resultados obtenidos con el uso de membranas de 11 po A- , Los niveles de libera ión evocada con l"1" (í-^uel C) de-» Nf" Í P l fucr-ou similares antes y después del período de i planlac ion ele A »em?na->. S-I111 embargo, el nivel de liberación evocada c on nicotina (pane3 P) e NE" y FZP J después útí l periodo de* exposic i n do A re anas n v t v , fue* mayar que el nivel previo a la i planta ión» Además, se observaron diferencias entre» el ?nv»»i >!>-» J i b»-*rac i »'>u ba.-»al de catecolamina antes y después del periodo de implanta ión durante 6 semanas (panel A) . ? <-7 Ejemplo & Céluliß «drénales cromoafines encapsuladas expuestas a condiciones restrictivas in vivo. Se prepararen o ul t-» c romoa f i nes «drénale:» bovinas de 5 acuerdo eun el pro» edimienlo del F" emplu 4. Se inmovilizaron agregados de célula:» adr-enale-» en una matr-i de algí ítalo al 1.5'/. reticulada can CaCls y se enrapsularon en membranas de fibra hueca PAN/PVC i nmunoa i slantos , t po 4, >le piel doble-1 (diámetro interior 500 µM, ¡tare-'cJ 7<) i 90 µ , MWCO i' D 5 , siguiendo 1 ü substancia] mente el proc di i nto descrito en la Patente WC) 9 60127. l s célula.» ene apsul adas fueron e pue'-s l r» a crinc r iones restrictivas tu. vivo, P VA \ A implanta! ic'tn en el espacio subaracnoide espinal eu rec ptores de rala. Los procedimi ntos ! r> quirúrgicos so real izaron siguiendo subs tanc i a 1 men te el método descrito en la P<t lente Wfl ( o?l?7 otor-gada a ?ebischer y asoc lados. <-*" Las cápsulas fueron ensayadas por la producción de catee tj] am ina .» ante.» de-* la implantat i ón y después de un periodo de o 6 semanas m vivo. Las c ateroJ a i na-> -.o ensayaron siguiendo el procedimiento descrito en el Fljemplo 4. Los datos fueran expr-esaclos como pie ornóles por cápsul por 0 minutos. La Figura 7 muestr-a la diferen» S A entre 1»)-, niveles dv» produce i ón de NE" y FP1 previos y pu>ler?ores -t la i plantación. I .i-, célula 5 enc psuladas fueron implantadlas durante un periodo de A meses. Después de A meses ni v i y» i , la produce ion basal y la estimulada con nicotina de-1 EP l di minuyeron significativamente, mientras que Uii la producción de ME auitienio ?i »jn i f o a t i vamente, ¡ igólo 7 Células PC12 encapsuladas expuestas a condiciones restrictivas ín vivo en cerebros de primates. So cultivaron células PC 12 en un cultivo de suspensión en RPMI, suplementario cor» K'V. de suero de caballea inac ti vacio por calor, 5'/, de* -..ñero de ternero f'»tal y 100 unidades de penicilina/estre tomi ina. La «élula-» cultivada?» fueron recole tadas, c ntri ugadas y se descargó el flotante. Se disolvió qm tosan Piula d'"» al o peso molecular* (4.4 g ) eu 15 l <)>-» -»» j I uc i c a i »al i na '-»--> t ér 11 l 0 „ ¡-TV/, , a una tempera! ura de 7<>" C t to a i t ac ?e')it v?goro.»a. El pH de la solución fue ajustado a 6.2 con 45 ml de solución salina i'ecjulada con 100 mM de HFFF < pH R.O), La -»olu» ion fue filtrada estér-il a través de un filtro mi J I i por o de 0.22 µM. La solución eJa qui tosan fue mezclada con un volumen de Rßy^I y usada par-a volver- a suspender los pe»llej s celulares en una concentración de 5 , 1 o<*- e 3ula ,/rttl . I -t r»oJuc ion de célul as/quitosan (apro i adamente 1,00(1) µL ) f ( e trust onada con PAN/PVC, para formar membranas de-1 fibra hueca PAN/PVC in unoa i «>1 antes 5ÍP11, de una piel (iliárntlru intemir de 450 a 500 µM, pared de» 5? 65 µM, MWCO de 65 a 1 oo ID, permeabilidad hidráulica 53 ml /mi /m*/mmH , c efic lente de transferen ia de masa de glucosa (1 • 304 »m/?, por me»ah i 1 i »lad del tamaño de poro Bñ* dol (u»f?? ?ent'» de rw n HF5 ) , Pwtaß» fibras fueron conformadas siguiendo el roce i iento general tle»ác p tu en las Patentes Estadounidenses Nos,, 5,158,881; 5,283,387 y 5,28-1,761. Lus fibras fueron a ju-» tadas» a las dimensiones apropiadas (a roxim d m nt 1 '"m) y sellada » térmicamente después del dobl ado. 5 Re implantaron c é l \ ? l A .> ene apsu] adas en tres monos Cynomol ogus. los procedimiento» qu i rúrg i e os fueron v.?a 1 i nados siguiendo substam ía I mente los de »» rito en la Patente» WO 93/00327 otorgada a Aebisther y asoc laclen. Dos cápsulas fuer-on implantadas en pos i c i artes di f renle-*'.» t»n el niícleo caudado y tres cápsulas fueron im lántenlas c-»u luejaies difer-entes en el putamen. L,. » coordenadas esteren taxi ras norrt i na I es pai-a la i plantación en el putamen y el úclscí caudado s>.» establecieron de la manera siguiente; sitio 1 eu e?3 ¡tutamen - '.O mm anteriores >Jesde~» el c ero intra-aural, 9.0 mm latera le > ovele la -jtilura sacjiltl y 16.5 m ventrales desde la super fie le del cerebro; de acuerdo con lo descrito en la Patente WO 93/O0J27 otorgada a Aebischer y asociados,, Deis »?p->ula.» fueton implantadas en pos i»-, iones d^erent en el nú l o c aci ulo y treí '"áp-.ul s fueron implantadas en 1 cegaren cl t fer»íntes c-»n el putamen. Las c oordenadas te otípi s nomínale:» par la implanta' ion en el putamen y el núcleo cacutado se e-» tabl ec i oí »>n de".1 la ¡??a?ic-M-a siguiente; sitio 1 en el putamen "- 23.0 mm anteriores de«de e¿l c ro íntr-a -aur-al , 9.0 mm laterales desde la »utura sagital y 16.5 m ventrales desde la superfi ie del c rebro; sitie) 2 on el pu lamen - 19.(1) mm "T> anteriores desde» el coro inlru-aural, lo. O m laterales desde-» la sutura sagital y 19,5 nim ventrales desde la superficie del cerebro; sitio 2 CMI o l put arrt'- i 19.0 mm anteriores desde el c".e»r-o intra-aural, 1(5.0 mm later-ales desde la sutura sagital y 19.5 mm ventrales desde la superficie* del cerebro; sitio 3 en el putamen =• 1 „ / mm anteriores desde el cero i ntra-aura 1 , 11.5 mm laterales desde la sutura sagital y 21.0 mm ventrales desde la superficie del cerebro; sitio 1 en el núcl'»o caudado - 18.0 mm anteriores desde el cero intra- tural, ''J.O m 3alerales desde la sutura sagital y 15.0 mm ventrales» de-.de-* 1 A superficie del cerebro; sitio 2 en el núcl o caudado - 27'. O m anteriores desde el cero i ntra-aur 3 , 4.5 mm lalerales de ,de la sutura sagital y 18.0 mm ventrales dessde la superficie del cerebro. Las células encapsuladas fueron implantadas durante.» aproximadamente 6 me ->c»s y luego recuperadas. Las cápsulas se ensayaron por lo» niveles Isa >alos y evocados con 3 " previos y posteriores al implante de L-dapa (L-d), norepi nofr-i na (NE), epinefpna (EPT), dopac (dp». ), dapami na (DA), y ácida homovani 1 ico (HVA), -» tguienclo el ocedimi nto descrito en el Ejemplo 4. Los cíalos mostrados en la Tabla TI están expresados O'^ picamaleís po cápsula por 30 minutos (basal) a ptcomoles por cápsula por- 15 minuto.» (evocados con J * ) . Como lo muestran los resultados de la l al) la TI, 1?-» propiedades de» las c».-»lulas encapsuladas son si nificativamen e diferentes, después de la exposición a las condiciones restrictivas durante 6 meses.

TABLA II Leyendas 1. recha del implante 2. S 111CD . Niveles basa! s 4. Niveles evocados con potasio 5. Promedio previeD al implante 6. Determinaciones individuales previa al implante 7. Promedia posterior a] implante 8. Determ naciones individuales posteriores al implante c Previo al implante 0 Posterior al implante I «i o. i l-d « t-do?» p « ?opmc Cl. C2 - caudata « as ME ß ofapHMptMtna OA •< doparnin* Pl. P2. P3 " pwlaiTMn en — ayinaph?n* MVA «= homovanílhc •cid nd - nol dvtactßd Ejemplo 8: Células PC12 encapsuladas son implantadas en un humano. Las célula •» PH12 un iu ap^ lada*» e implantadas en un receptor, siguiendo el proce i i nto Jebinto en el Ejemplo 7.

Después de m » X AH cápi»u]a*» <?an espiantadas y ensayadas por la rela ión de l --doµa/daµaíru na . las células son esparcidas en placas de varia"--» cavidades y »c?n ul i da en una gama de condiciones de j¿ ^.n vibro. Las células son ensayadas periódicamente por la product i ón de I -dopa y dopamina. Las c ,ulas que liberan 3 a GO ] AÍ J ón de->>-»ad de L-doµa/r!oµam? na son selecc loriadas e plantada^ en o l rerebru humano, usando substancí l mente los prot ed i mi ntos quirúrgicos descritos en la Patente WQ 92/001 ?7.

Ejemplo 9: Células PC12 encapsuladas expuestas a condiciones /- restrictivas in vivo en el cuerpo estriada de ratas. Cápsulas Las cápsulas fueron preparadas a partir de fibras huecas con una técnica *» i nvet '»» IVJ? d fa-»e, usando fibras huecas de PAN/PVC, si tju i enrfa --.ubs tanc i a 3 men te el proc dimi nto descrito en el Ejemplo 7 (diámetro interior do 43 ¿ 500 µM, pared de 50 a 65 µM, MWCO 100 ID, permeabilidad hidráulica 53 ml /mi n/ma/mmH ) . Cultivo v ene ao ul ación de la . célula,» Se cultivaron células PC1? y PCITÍA en S0 ml de cultivos rotativos de Ro rpm en un medio HL-1 libre de suero (Ventrex, Inc., Portland, Mame) a una temperatura de 37° C en una atmósfera de i e ambiente saturada ron agua y con 7Vi de CO». Las células fueron t i e? olee tanda el flotante del cultivo rotativo y < entp fugando a 800 g. La viabilidad fue evaluada por exclusión del a¿ul tryµan y resultó ser 90 + 5% antes de la encap-.ul' i n. Las célula-» =;»-> vol ieron a suspender en Hl.-l , pH 7.3, en una concentración de A ,< 10"' lulas/ml. Se l s agregó a las células PC12 y PC12A un olumen igual de una solu ión con un contenido de 27. (p/v) »ie ijtn IUJ-IU de baja viscosidad ton pH 6.7 (' <<bT0SAN <w> , cloruro de t|u? tosan, Frutan Biapoly er, Dra men, Norway), resultando en nfw c concentrar ón final de» células de 1.0 x l "* células/ml . Las cápsula--.» in ividual s tenían una long ud de 7 + 0.5 m. se fabricaron cápsula-» PCI? y PC12A cargadas n células en dos partidas separadas y -»I.Í colocaron eu una placa para el cultivo de tejido*» do 24 ? v dades que contenían 1 ml de medio Los dias del 5 al 7 posteriores a la encapsulación, laß cápsulas que flotaban libremente, -?<-' 1 tvaron o ver s con 1 ml de solución salina regulada on HP?-)'-) HFPEñ (que contenía 10 µM de ascorbato) para remover el mecho de cultivo residual. La preparación de la muestra consistió en una incubación durante 30 minutos (liberación basa!) en 250 µl t» H RS. Todas las muestras fueron protegidas lüntra la oxidar ion por medi del agregado rápido de un regulador acidificado reductor1 de c? tra o (CRAB) y se obtuvo una p eparaci n esti o de muestra en ácido cítrico 10 'i'/ mM, etabisul f i to de sodio 70 µM, y 0.1 N de ácido µ&»rcl?pco.

El al acenamiento durante un período e¡'tend i o se llevó a cabo a una tempera tura de R ° p. los standard*-? fueron preparados diluyendo soluciones pal ron >->n HPT^ y estabilizando las diluciones con CRAB en 0.1 M de ácido perc 3 ópt.a. Reducción de los niveles de dopam na en el cuerpo estriado Be an ste-»? ?r>)u l s ratas ron una inyección intramuscul r de 1.0 l/Hj »le me/cl de t etami na (33 mg/ml), xilazina (1.7 mg/ml), y acepramazxna (10 mg/ml) y se colocaran en un instrumento es ter otáx i o de f- ap f . Un total de 12 µg de 6 -^r O? (un volumen de (> µl de concentra» ion 1 µg/µl disuelto en solución salina 0.9VÍ que contenía 0.2 µg/µl de ácido asc?rbico) fue infusianado a una velocidad de-» 1.0 µl /minuto y la infusión se dejó difundir1 durani»-» 5 minutos antes >le retractar lentamente la cánula de infusión, las coordenadas e infusión fueron 4.2 mm posteriores al bregma, 1.0 mm lateral desde la linea media, y 7.4 mm ventrales líesele el dura. I i¿l antac ion de la cápsula Las cápsulas fueron implantadas 4 meses después de la lesión (2.75 meses después de la última inyección de apo orfina). l s ratas fueron an -»tes i a»1as como antes, se hizo una incisión sagital en el cuero cabe»! ludo y se perfore) un agujero para colocar la cápsula de polímero. Se efectuó el implante en las ratas, colocando la cápsula dentro de un catéter1 de teflón calibre IR, montado al ITH o e-» 'rep táx it a . Dentro ?o la cánula se ccalocó un obturador1 de Af or inoxidable, til disposi i o fue-» introducido en el cerebro, y el obturador fue mantenido en su lugar mientras se elevó l cánula exterior para colocar1 la cápsula pasivamente ent o d»»l cuerpo estriado del hospedero. La-j coordenadas e^terootí, i» .1 » pa a la implantación fueron; 0.5 m anteriores al breg a, 3.0 mm laterales desde la sutura sagital, y 7.5 mm por debajo de» la íe de la corteza. Con las ratas e no recibieron el implante se efectuaron cirugías ficticias (anestesia, lacera» ion del 1 uero >.<?bel 1 udo , perforación del cráneo y punción de la »iur a ) . Análisis bioquími o Después de termina) el «us yo del comportamiento, las r-i as sin cápsulas PC12, PC12A, y la mitad de l s ratas ron las cápsulas vacías, fueron ane tesiadas en una cámara de COa y decapitadas rápi amente. l.os ?.»»rol>ro>? fueron extraídos de los cráneos, las cápsula-» fueron muela , lo» dos uerpos estriados fueron sacados por ti 1 ->et t i n, colocados en tubos F-ppendorf, y congelados rápidamente eu nitrógeno líquido. Después de la recuperación de la f psula e] cuerpo estriado del hospedero, las c"*)sulas fueron colocadas durante aproximadamente 30 minutos en 1 ml de HBSS fosfatado. El HBS1B fosfatado fue extraído y se agregó 1 ml de HPES HB8R. Se re»a I 1 i-a mi ios análisis de ratecolammas seg?n el µroced 1 m 1 ento descrit eu el F'je plo . Una vez completado el ensayo de t alecol a 1 na , lus el 1 sµcssi 11 vos fueron colocados en para formal deludo al 47. y enviados para el análisis mor fológi t o. La Figura 8 mue-tra la I bora 1 n de dopa ina y L -dopa medida durante up período de 30 minuto» y rw e o ta a pnr* imw cápsulas in i i ale»-», asi gn-ln» lo .0 a cada cápsula un número de identificación. romo se iluslr-i en la Figura 8, los niveles de producción de l.-dop i y dopa ina a o í s después d l implante fue r jn significa ivamente diferente*», que los niveles previos al ímpl ante.

Ejemplo 10 Células adrenales cromoafines encapsuladas expuestas a condiciones restrictivas in vivo en el espacio subaracnoide hum na Se prepararon célul a-=» c romoa fines adrenales bovinas de ar-frerda con el procedi i nto el Ejemplo 4. Se inmo ilizaron agregados de-.» células tlrpiMlf en una matriz de al gi nato al 1.57. rßticulado con CaCla y se encaµsularon en membranas de-» fibra hueca PAN/PVC i nmunoai si a tf-s, tipo 4, de piel doble (diámetro interior1 77 JÍ , pared 70 µM , MWCH e ho a 100 t- ) , siguiendo substapc ?al ente el proc dimi nto descrito en ia P tente 0 92/19195. ,? Las células encapsul das se implantaron en el espacio subaracnoide de dos pacientes humano*», ton ránce-u1 term?na3, dolor aliviado incom letamente pur t»-»rap? nar» ótica, y sin evidencia de infección activa o tumor en el espacio me->ningeo. Se garantizó el consentimiento de lo par lentes >µ?e habían ido nformados y se recibió la aprobación del Comité de Etica de la Facultad de Medicina de la Uni ersidad de lausa a, Suiza. Para establecer1 la anestesia de la piel, se usó infiltración local ion lidocaina al 1 ,, a í como también del periostio y de otras e tructuras profundas del tejido conectivo 67 hacia abajo e in luyendo el ligamentum flavu . Se ofertu? una incisión de 3 a 5 centímetros en el plano parasagital 1 a 2 cm. a la derecha o izquierda de la línea media y se continuó hacia abajo hasta la fast la 1 u budor --»a I . U-» ndo puntos de referencia 5 tradicional s, como las » res a-e ilíacas y las protuberancias de la espina lumbar, y guiándose también par f 1 uoroscop i , se introdujo una aguja de Touhy, cal ibre 18, en el espacio subaracnoide entre I - Z y \ - A por me io de un acercamiento oblicuo paramel laño. La aguja fue» di igida desde arriba, de modo que entró en el espacio en un ángulo agudo no mayor de 30 A 35° con respe to al cordón espinal en el plano o sagital o transversal. Se introdujo un al-tmbre guia en la lur del e e? de la aguja Touhy hasta que se exten ió a 4 a 5 cm en el espac-ia subaracnoide (determinados por' medición previa). Se retiró la 15 aguja de Touhy de»l alambre-». luego se colocó un dilatadar French 7 sobre el alambre guia y se usó el alambre para dirigir1 al cliJatador a medida que f tt* empujado suavemente, pero de manera firme a través de la fasc a, el músculo µara sµ i noso y l ligamentum flavum, siguiendo la trayectoria tiel alambre hac la el espacio subaracnoide. Después de-* que la trayectoria del alambre había sido "sobre- dilatada" por el dilatad?r French 7, se ensamblaran un dilatador French 6 y una vaina de cánula y se < alocaron sobre el alambre guia. El c latador F rench 6 y la cánida se hirieron avanzar 'Ti cuidadosamente »-ÍH el espa io subarat no i e hasta que la punta de apertura de la cánula estaba poyj c i nada 7 t dentro de] espacio. 67 Una ve. asegurada la posición apropjada d(? la cánula, el alambre guia y el. di .1. d tacl» »r fremh ¿, fueron ret i ráelos suave y suc?J>(/ vamente de l luz de la cánula. La célula adrenal < romoa fina eiu aµsul arla fue provista en un contenedor1 estéril de doble envoltura, bañado en medio de-1 transporte, y completamente ensamblada incluyendo un filamento tubular de fi ación de si l icona. La porción de membrana del dispositivo fue introdu» irlo cui adosamente en la cánula. Se hizo avanza la cápsula lia >ta que la punta la membrana alcanzó un punto situado a 2 -- 10 mm entr o de la punta craneal de la cánula en «1 espacio subaracnoide. e»; posicionada la cápsula pur medio de un empujador, la cánula y wl e pujadar fueron retirados compl tamente. la s tuar ?»jn final d» la cápsula fue tal, que la porción de membrana de 5 rm de longitud del dispo iti o estaba completamente dentro i-Jel »-:»spacio subarac oide que contiene el CSF, ventral a la cauda equina. Las cápsulas fueron explantadas después de 84 dias en ente 1 y después de 55 días en el paciente 2. Se-? comparó la produt > j óu e c atoe o1 aminas — norepi ne riña ("NE") y ep i nef r un. ("FPT") -- de-»pués de la exposición a con i iones res p i t i vas ¡ v vo, con ni eles previos a la implantación (Tabla ", ) ., las catecolaminas fueron medidas de acuerdo con o] procedi iento dest r i o en el Ejemplo 4. Los datos de la tabla e-»tán e --pregados como µ i c ornóles por cápsula por 30 minutos (básale?,) o pit ornóle-» por cápsula por 15 minutos (es imulado, ton nicotina. N- ). la producción de catecol minas era i nificativamente diferente después de la f> -\ exposición a l s condi iones restrictivas que antes de la i p lantac i ún .

Tabla 3. Producción de catecola inas de cápsulas implante» Explante NE E HE E Paciente 1: Implantación durante 84 dias Basal O 84 37 8 N-S 273? 2673 6366 3886 Paciente ?: Implantación durante días Basal A tt 120 4.1 69.3 N-S 5027 5063 10.6 65 Ejemp lo 11; Células BHK-hNGF aclimatadas y reencapsuladas expuestas a *« condiciones restrictivas in vivo. Se prepararon células F.HI -hNGF encapsuladas de acuerdo con el procedimiento <|e<.,? i i t , en ej Fj»-»m lo 1, implantadas en el ventrículo lateral tie cerebro de rata y aclimatadas por exposición a conche iones restrictivas in vivo durante 14 meses. Después de 1 A mese», l » cápsulas fueran explantadas, y las células aclimatadas de dos cápsulas fueron reunidas y e: pand ida» por el pasaje en un medio FBS DMEM al 1 7*. Para este experimento se usó una linea t-lunal designada clon BHK-hNGF 23., Estas células se subd i i eron en µ, e» alicuotas y se congelaron porciones en nitrógeno x j q , do . |>A% células de control del clon BHK-hNGF 23, no aclimata as m vivo, se cultivaron m i tro en PBS MFM al 107, (l)a?u o celular del t 1 on BH1 -hNGF 23). Se ensayaron los siguientes seis grupos de t lulas y cápsulas: G upo 1 : v lulas BH1 --hNGF 23 (células aclimatadas de cápsulas e,,µ 1 ant n » n ivo); rec»nt.aµ->u 1 acias eu matriz de V?trogen >; cápsulas impl ntada':» en ventrículos laterales de cerebro de rata; Gruño 2. células BH1 -hNRF 23 (células acl imatadas) 5 r a^aspendiclas en FBS DMFM al 1 Y, para oncapsul ación (sin matriz); cápsulas implantadas en ventrículos laterales de cerebro de rata Gruño Zi células de control BHl'-hNGF 23 (del banco celular; no implantadas pre iamente); encapsul atlas en matriz de V?tragen > ; cápsulas implantadas en ventrículos laterales de cerebrcD de rata; Grupo 4; télula-. de tontiol BHf -hNGF 23 (del banco celular; nu , implantadas pre iamente); r'esuspend idas en FBS DMEM al 107* para ene psulací ón (sin matriz); cápsulas implantadas en ventrículos laterales de rebro e rata; Grupo 5; célula':, de ontiol HMI- ( el banco; no implantadas pre iamente); encapsuladas en matriz de Vi trogep <R> ; cápsulas implantadas ean ventrículos laterales de cerebro de r a; y ßr µo 6; células de cont) l W (del banca; no implantadas previamente); r'esuspend 1 das en FBS DMEM al 107, (sin matriz.) para enc-apsul c- i n ; clpsula» implantarlas en ventrículos laterales de cerebro de rata; Cápsulas Se encapsul aron células aclimatadas del clon BH1 -hNGF 23, siguiendo eseiu i al mente el µrcx c»d miento descrito en el Ejemplo i. La mayoría de la-» tápsulas f e* preparada a partir1 de fibras HF120794-6 con una longi ud fin l de» 7 mm. Varia» cápsulas de control fueron pr epar'adas a partir ele fibras 101-97-9 que eran comparables eon las fibra » XP 1 t H-.i - » en tos ejemplos del 7 al 9. Las fibras HFJ20794-6 de piel simple tienen, en p'r^med io , un espesor de pared de» R .4 µ; un diámetro interior (I.D.) de 453.2 µ; un diámetro ».» tenor (Ü.D.) de 625.1 µ; una permeabilidad hidráulica (HP) de 43.0 mm/min/m^/mmH ; y un corte del paso de moléculas hasta uu determinado peso molecular (MWCG) en base a un ensayo e difusión e de trano de 187 KD. Las fibras de piel -.imple 101-97--8 tienen, en promedio, un espesor de pared de 59 µ; cm diámetro interior de 541 µ; una insistencia a la tensión de 31 g; una permeabilidad hidráulica (HP) de 62 m /mi n/m^/mmH ; y un corte del µ so de? moléculas hasta un determi ado p».-»so molecular1 (MWCO) en base a un ensayo de difusión de dextrano de 88 ID. Encapsulac ón Las célula».-» enr.apsuJ arlas en una a iz (grupos 1, 3 y 5) se volvieron a suspender en Vi trogen <R> diluido eu la proporción de 3 si ion medio PC- l , i ou una densidad de carga de.» 1 x 10 cél ??lrtá/ml . la» cápsula--» fuei un mantenidas eu el medio PC-1 durante tm per1]' ocio de 5 a 7 dias previos a la implantación.

Las células de los grupos 2, 4 y 6, encapilladas sin matriz, se volvieron a suspender en TBS DMFM al 107, y fueron colocadas en tub< _ sobre un tambor rotativo durante el período de conservación pre io a l impl ntación, Implantación d las cápsulas Se selec ionaron al A .? \' cápsulas que contienen célula BHK-hNGF previamente aclimatadas ?n ivo y las cápsulas de control. Las cápsula-» fueron implantadas en el ventrículo lateral de ratas. ('orno controles -sirvieron muestras paralelas de células BH1 -hNGF no a» l?mata»l-ts. ß-3.1 is.i s bioquí ico Se ensayaron cápsulas de los grupos del 1 al 6 por- la liberación de NGF d>-» acuerdo » on el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La J ibera» j ón de NGF de las cápsulas que contienen células aclimatadas y t lilla» sin aclimatar, fue medida antes de la implantación y después de la implantación durante un período de un mes. La Figiua 11 mu* »tra la prod?ci i ón de NGF de cápsulas , loa grupos del l al 4. No se muestran los víalo» de 'Í células de control que no producen NGF. Después de los ensayos de produc ión e NGF, la . cápsulas fueron fijadas en 47, de parafar aldehida y pro?e->?das para h =»l ol ogí a , d s-»ecc i ón y análisis morfoló ico.

Ejemplo 32i Células PC12 encapsuladas expuestas a condiciones in o en ratas con lesiones unilaterales en Xa substancia nigra.

Cul c ó 1 i I '"ie i u 1 í i „ i i ,p j, t u < , » ? 'i) i ?? i 111 I i -» \-7 I ' » i »ji 11 end» > '-»ub'' ia i.i Ifflt'uli' ?»l µi i» i i» ), > am i n i ( >'- pHIVi » » » | . l i v m<-»?\ » lu, i» ,» para la neur ona-, d»»p- m i n»-'», »j i > > >»n I i »ub >tam id ni'j? t. Pa l a «orne { ?»la-> a un, ] n o u < un ó-OHDA e, l „nb >l anr i -i nii ra e-,<t T n .1 I ,? n i ii1 t I » » i i i . » »m, j -t id » » , 1 ^ » >n f f »? metí ¡ > I »le Pa T'l i nson a-»> >c i ¡da » on ni ele- <> ¡ j» , i» !» »p mp ua . I i » H ta > f on ane , t> >.» i -í» la » »ju i » -n I ) I µ ?tn » I i i » -n l < \o ->» r i I o en el F. je p ¡o Q . p» > > i • I el i M I ( 11 i ni ¡ i i ' i i ,e, 11 o e . !, • » r e» 11 A l ( o 11»--» I oµ f . S l » aµ I i ».? o 11 i ni i ?< < n i ' ' ?? > i d» m» ol i I do l o µ»j d>» A-ONDA IU olum n .Jo '| il ) 7' ', | t? i : ? > I I os en una ..oluc ion » i 1 i n i il „ 9\ |U»» nnl ioiio ., . "' )llj µ1 d» ?> ido ,? ,\ lirlnrn' , y s perm i 1 ó » µ n» se d i f ni ni i » i ,< ilut an' » '"i n i ,tn ',» j % ,n?t»; , > lo \ » * t i r -i i l n a men l e la .:ánnl,t »lo mlmi?p, ! ., , . ooi » leñada » l ? nfn-,? n f r ii ?j.'7 m pouleí ?o, o > il br t»(jma, 2.7 m laterales desde la 1 ínoa med i =? , y 7 < . ni , I » - I . Un > i n 1 », barí a »l»» i m i » n'iii I plan tac ion de » áµ..?»i ¡ , I i > > 't| " 1 i í i » » » »n niµ I <•< n t »> I-, . i la »? a 1 m> »n I o » le "' a ^ -.eman i » »)»-> ,|in>'» , |» .¡n ' , , ? , |, |, ,an ol I »» , i t,n ida-, uní 1 a tepal mente. i t ,- > i i , fu»», ? ?u»»- I »» , i ni .» I --i -, » áp>»ul a.-> i p lantada--»,, u » ind > lo µ r»,» e» i j ,n i on I o •> y l a-, » oor denud (IIÍSSÍ ?»1 tu»» í'^'i e I F i »m? > I \ V , i ll? J I :» I :» 1) 1 O t > m , u., I o - U I ,µ0 r, •.µui-'n d" l -t i n | 1 i - » i» i . » i > ' . f I.-»I OU ipe- I e i ,,»! » , una i. í tr a de CO,,» y > I »t .»µ i ' -m i » r µ i » I -unen I o , l o l rebr1») » fueron r'emov i »"|? )'.» de Lo » » i > n» »» » y 1 i > »:?µ .n I a » »»,.! i' ¡d.?>» el l ido 3 :- 1 on tdo ¿- 1 I ,?» le \ mi ule . on I o I ^ » I» » I i i'i dir . I- I i util µo e , l i i -ujo y I > i H'U" 1 »»» » t* » i i til ,» >n fin'i iin .a» uln µ» ir vi i -»e» » i ?n µ i ra »»1 i n l i > i - I» » > i ano na , t o I » )» n»l» )1 > >'. »;n l,ub»)-, e r¡-)µon»l»!i i . )u»j? ' ? ?|» l o l itbu . r áp idamente r-»n ui l r» jeno I í?|u?do. i . 'p >? I i » . "- i » I i» ,?.|a- »n 1 ?i? I de Hl <;<- fr,7( alado ur uil » (¡ i o mi iil n -ni » ' • o i i ,u l > , l-ie e l ( > jo ej Hh'-'?'; fu^fai ado y -><. a.jt » <jo 1 ml d>-» l?F-PFci Hf'r-ic!, l oo a ná 3 i -» i , d> » c a 'i til-niHin »e i > 1 i ' t r n I» » > ?»»? i t » » tn el µ vo< e i m i on o de;,t-t' to en el Fje µio 4. l¡n,í . » - i » »mf » I I arlos j > mál ? -»? -> r a terril a na la » i }p-»ul t > »> • > o3 o? -> i > >n >»?t µ ir a form-» I d»-l?i du al A * µa a el na I i » i m» >\ í o I o»j o o , l a I i 'jen < µ < > ? | »'* e i > i ¡ i 11 i,- r m ion µr ornen i e d i) ? p >ula--> prev i o, a I s implantar ?»'?n { 'Tr " '• , ¿ »l»» 4µ n ¡ ¡. , (.» plantad t-> de I o •> i uei'|)o e-» l i i i» lo » ' >- < ,n u I i » » ' I » I» »µ imi i » i ^ y no I e > i on ido > fe onl i ol ' , ' » I i ' , I '• ,, " i', -,(, µo , I o? i »->? »»-> ,-j la i mµ 1 an tac i'in . I" I µ i n>» I »'? i. uo , I i , , » ' ¡ , » an I i h»le i e i a 11.-a.. de t a teco! am i na µr o.lu ol<¡ µo, » »¡u ! > IV | * »»? aµ-»u 1 <.?da » < amb?a v on el t le µo. I , » .µ »ul » µ nl t l.t- d>» i bo -, la»1 í, el lesionado y el »je c oni r ol , mus l r.» ,'» »n >» ? u o : velo» ?d-»d»-'s »ie producc ión >i»--» l --d»?µ-t ,|e ,µu?-'»'» de 1 -i <> I i ma l >» ion MI V I durant»» do » j l r e-3 smnnii'i La Figura 9 <panel. B) muestra la relación de l-dopa/dopamina liberadas de las cápsulas del panel A arriba es?:.. ritas. El panel. B muestra que después de una aclimatación in y i vo. en un ambientes de bajo nivel en dopamina, las células encapsuladas produjeron una relación L--dop /dopamina menor que las células aclimatadas en un ambiente de control. Las relaciones L-dopa/dopamina llegaron a ser relativamente estables después de 14 dias in vivo. Las cápsulas explantadas de ambos lados, el lesionado y til control, mostraron relaciones de producción de L-dopa/dopamina mayores, después de haber sido a «matadas in vivo, en comparación con los niveles de producción previa al implante.

Ejemp lo 15 : Comparación de los valores de producción de catecola ina antes y después del implante de células PC12 encapsuladas, aclimatadas en cerebro de primate. v Los valores de producción de catecolamina de un número de estudios, en los cuales células PC12 fueron encapsuladas en fibras "equivalentes a XP11" y aclimatadas en cerebros de primates, de acuerdo con la descrito en el Ejemplo 7, fueron 'comparados con los valores de producción de» catecolamina de las mismas cápsulas, antes de la implantación. Las células PC12 encapsuladas fueron ensayadas para velocidades de producción basal de L-dopa y dopamina antes de la implantación. Los datos indicados en la tabla 4 representan la producción de catecolamina previa al implante. Después, la cápsulas fueron implantadas en 7 X cerebros de primate-s para una aclimatación ?n vlva explantadas 1, 2.5, 3, 4, 5, y 6 meses después de la implanta ión y ensayadas por ?as velocidades de producción ba-sal de L-dopa y dapamina (Fi ura 10) . La comparación »!*» los datos resumidos en la Figura 10 y la Tabla 4, muestran que la producción previa al implante y la producción del explante difieren marcadamente. Los datos previos al implante en la línea 1 de la Tabla 4, corresponden a los puntos de los datos tiel espiante PA VA el intervalo de un mes en la Figura 10. Asimismo, los datos de las otras líneas en la T« í>2a 4, corresponden a los otros datos mensuales representados por puntos en la Figura 10. Tabla 4 Valores Previos al Implante Producción de c colamina de cápsulas PC12 implantadas en primates. Comparación c n fibra;» PCI? "equivalentes a XP-11" exp antadas V*'"1 ores previos al L--dopa basa! Dopa ina basal Itrfplante carrespon-dientes a tiempo pm/15 in/ml pm/15 min/ml in vivo Prom. (determ. Indiv.) Prom. (determ. Indiv.) 1 <n =• 6) 2.0? (0.08) .95 (4.1) 2.5 <n » 6) 0.78 (0.16) nd 3 ín "- 6) 0.79 (0.25) nd 4 (n «• 2) 30.6 ( 7 . 7,7., ) 2.39 (0,82) (n 6) 2.06 (O.ol) 4.26 (1.62) (n = 15) 3.09 (1.84) 21.3 (21.7) Ejemplo 14 Producción de una linea celular BHK que segrega hCNTE (BHK-CNTF). El gen humano CNTF (hC TF) fue insertado en un vector- de expresión a base de dih ídrafolatoreductaßa (DHFR) designado pNUT que contenia la secuencia f)UC 18 entera incluyendo el poliligante. La transcri ción del ADNr que codifica la forma mutante del DHFR es impulsada por' el promotor SV40. El extremo 3' es fusionado con el extremo 3' del gen del virus de la hepa i i B (HBV Z ' ) \ )A V? isocjur ir una µol i adeni 1 ación eficiente y maduración de las eñ le»s. El gen hCNTF fue obtenido por1 la amplificación PCR del ADN humano. Los iniciadores sados contenían el sitio EcoRI en la posición del cod?n de iniciación natural hCNTF. El gen hCNTF fue fusionado en su extremo 5' a una secuencia de 150 bp de un gen de inmunoglobulina de ratón (Ig). El sitio EcoRI fue usado of0 un modo tal, que la parte dt» la terminal arrimo de la proteína ho TF corresponde a los primeros 18 aminoácidos del gen Ig. Un fragmento Aval de 325 bp del gen de la hormona del crecimiento humano (hBH) que contiene la .lecuenpa de pol ladel i nación y otras ' secuencias importantes para la madura* i n del extremo ARNm 3' fue clonado a la extremidad 3' del ijen hCNTF. Brevemente, este fragmento fue introducido eu el sitio Spel de un poli ligante Bluescppt, creando un sitio Ba Hl y Notl en los extremos 5' y 3', m«pßctiv«(n«ntf. El «4 tío BamHl fun Ufftda é l «itio SQIII formado en el extremo 3' de hCMTF.

Esta construí pión ^U6J insertada en la posición *6 del promotor del ratón M1--I y el fragmento entero de 305O bp MT/ ?o/hCNTF)h6H Kpnl-NotT fue i n«ertado en el sitio pnl-Natl d^ vector pNUT. Finalmente, el gen HSV-T fue t-lanado en el sitio Notl del vector, separándolo de este modo, del gen DHFR por el plás iclo ptlC-1 entero. F-~»ta construcci n final eí» llamada RP3223E2. El ADN del vector RP3224E2 fue amplificado eu una cepa standard E. col . ü-íBloi) y purificado con un equipo Qiagen- Plas id 0-outron). El ADN fue transfectado, usando un p de transfección standard con calcio/fosfato, y selecc i onado con concentraci nes crecientes de metotrexato. Las células son selec c loriadas continuamente Í-JU mototr exato mientras que son mantenida*» en el medio tle cultivo de tejido PC-t. El medio PC-1 es un medio definido que contiene proteínas recomlp fiantes de fuentes humanas. Después de la selección con reactivos (25 a 200 µM de (y**-,o re to> , las células (BH -CNTF) fueron mantenidas dur'ante va-rias meses in vivo, sin selección con reactivos, y no mostraron pérdida de expresión de CNRF alguna, según lo evaluado por' el análisis Northern blot, los ensayos biológicos y la prueba de ' ELISA. El nivel de producción del CNTF fue de aproximadamente 1.0 ng/103 rél ul as/hora , según lo determinado por los ensayos biológicos y la prueba de ELISA.

Ejem lo 15 Células BHK-CNTF aclimatadas en el espacio lumbar subaracnoide humano y rei plantadas en un humano para el tratamiento de la esclerosis lateral amiatrófica. Encaosulaci?n de Células Las células frH\- del Ejemplo 1 4 que segregan CNTF (BH1'- VNTF) fueron eut ap-.»ul ad i-» »iytt?endo esen ial ente el procedimiento descri o eu el t empl? 1, ton la excepción de que se usa un filamento de fijación más largo con una longitud apropiada para la implanta! ón en el espa io sub ra noide lumbar hUjino. Los dispositivos fueron cargados a una densidad de 2 x 10* células transf ctadas/µl de solución de colágeno (Zyder ). Se midió el CNTF liberado de cada cápsula sumergiendo la cápsula en 2 ml de medio PCI frost.o dur'ante 3 minutos. Luego se? realizó la determinación de CNTF sobre el medio rec lectada , usando el sistema ELISA R?D, Se eligieron las cápsulas para suministrar una dosis intr-atecal de CNTF de 1 µ/dia. Cada paciente humanes un dispositivo. Aclimat ción JJQ V}vq dfi gl . s PH?'-CNTF encapsuladas en el espacio subaracnoide lumbar. Las i.t-Mulas BW. - 1 enc psuladas fueron implantadas ' durante 1 mes en el espacio subaracnoide lumbar de un sujetes humano. Se aclimataron in vivo cápsulas adicionales durante un período de hasta meses. Al expl n arlas después de un mes, se ensayó la velocidad de liberación por cápsula de CNI F , de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 12. Una ves realizados los ensayos de CNTF, las cápsulas fueron fijadas en para formal cleh ido a3 4"* \IAVA el análisis mo fol oc ?ro _ ( <- r( i t,a BH -CNTF aclimatada--» 111 i o fueron ivnuivi iií» de las cápsulas reunidas y cultivadas inmediatamente en un medio PC1 bajo condi iones restrictiva» d»» bajo oxígeno y glucosa, sel c ionadas para asemejarse lo is µo»?l)le al ambiente tiel e-~»pa ?o subaracnoi de del -sujeto. fió e controles paralelos, e? cultivaron células BH1 -CNTF bajo cendit iones ambiente. Las células aclimatadas '¿er n cari» i er J .*ad ¡ _-, y pueden ser aclimatadas además a otras condiciones restri tivas. En un conjunto de experi entos, las células BH --CNTF a í j 5 ma tadas m , y i vo „ itillivadas uv v 11 ro bajo condiciones ambiente o re tri i a», -»>-» vol ver i eron a ent.apsular (siguiendo esencialmente el mismo µr t>> etl 3 mi eu to u:»atla para la primera encapsul aci ón) y se» implantar n Í- \\ uu -»ujt-»to hospedero. Fn otro conunlo e expe imentos, la-, célula*» aclimatadas implantada, eu el ho.»µodt.»? o humano, serán aclimatadas en primer lugar a t ndic iones restrictivas i n v 1 ro en un r^i-e or prim te uo humano. I o» sujetos serán µac ¡ente-.» diacjnost i ca o.» con ALS según la mani estado por un<* combinación dc-í defi iencia^ de las neuronas motoras suµei i ore.-» e inferiores en niveles múltiples, los estudios plft trpf I JDIIHJÜ ti » confirmatorio*» demuestran ta denervación activa y crónica en tres limbos o dos limbos y la musculatura bulbar; la ausencia de implicación neuroló ic fuera del sustema motor voluntaiio; falta de» evidenc a de enfermedades primarias. que podrían i .m?i on déf?< it neurológico, particularmente, 1A spond i 1 o-» i s cervital e discrasia del plasma celular-. El pat tente es rel tivamente fuerte, es decir, puede caminar- sin a i stent i i y e»l i en eJ ini» iu tiel transcurro de ¡su en ermedad. Fl paciente tiene una » apa ?dad vital forjada de '>75Y. de lo normal en el ti mpo de entr-ada. s los µat teut s .»ou moni t or eadu'- < ada dia durante la primera semana, una >?, a 1 i semana desde la segunda hasta la cuarta semana y después, una vez al mes, por, ínter alia, efectos late- -ales tales como fiebre, estomatitis, tos y la reac 11 vac i ón de herpes. Los .-»? yu i n te-, en ..ayos »on realizados» mensualmente 0 para hacer una evaluación de 1 < efic ia: Examen Cuantitativo N » G?1 c'jgi co de Tuft (T NF); t oorcíi nac i ?n bulbarj función respirato ia -- taµarida»! vil il f H ra»la, flujo i nsp i ra tor i o. Se to a un-i muestra »an».juinea ,eman i I durante las primeras fuatro semanas, y luego ße to a una muestra mensual para la detección 5 del CNTF en el µl-t->ma, anti uerpos potenciales al CNTF, prateina C-reac tiva, f ibp nógeno . Procedimi nto qui rúrqi CCJ Fl procedimiento quirúrgico para 1.a implanta ión de» las célula F-iHI CNTF ene apsu lada --» , es el siguiente»: Después de 0 establecer el acc.es>) IV y adm?n?->trar an ibióticos pr filácticos (ce fa o 3 i na sódira, 1 gramo IV), el paciente es colocado sobre 1 A mesa de operar n'in, generalmente yA sea en posición decubitus lateral o genu-po» toral, t»,n la espina lumbar flßüionada anteriormente. El » ampo operatorio es preparado estéril y r> cubierto, dejando expuesta la línea media de la región lumbar dorßal dwwriw los nívwltta G-í a l -t, y permitiendo 1» toma dß» imágenes intraoperat i vas de 1 espina lumbar- con f luoro8c opia .

Se usa infiltración \ tn ? - , ,¡p i?,uH <iina al X .0% par'a establecer' la anestesia de la piel, asi i orno también, del periostio y otras est » uc turas de tejido ' oner tivo profundo ha»- ta abajo e incluyendo el li a ntum flavum. Se efectúa un i nt ?-»??n tle I» a 5 cm en la piel en el plano parasagital de 1 e? 2 t , hacia la derecha o izquierda de la linea media y se continúa hac la abajo havta la far»c i. lumboclorsal usando el ectrocau ten .:ac i t'>n fiara hemoslañi s . Uñando marcas de referencia tradi ional s de los huesos incluyendo las crestas iliacas y las pr tubera cia-; tle la mpina lumbar-, asi como ambién una >guía fluoroscúµu i, =>e introtluce una aguja Touhy, calibre IR, en el espacio -lUbarac no i de entre 1-3 y L -4 a través» dt» un acercami nto ub 1 u uu µaramo laño, la aguja es dirigida desde arriba, do modo ue entra al espacio en un ángulo ayudo no mayor1 de 30 a 35° c n respe to al cordón espinal en el plano sagital o transversal. L-» posición apropiada de la punta de la aguja es confirmada por1 1 A extrae i ón dw varios mililitros de 1Jñu?do cerebro esµiuai fCSF) p-tr-i pre-imp 1 antac ion de» crßtecola m , encefalina, g lutosa, CNTF humano, y niveles de proteina y conteos telulares. El e e de l-t =?yu a Touhy se vuelve a examinar para confirmar que la apertura eu la punta, esté orientada hacia arriba (la dirección de» la apertura es marcada por la muesca de indexación par-a el obturador sobre el e e de la aguja), y el alambre guia es introdu irlo l?? la abaju eu la lu,; de la aguja hasta extenderse de 4 a 5 cm en el e.»spac IO subaracnoide (determinados por medidas previa?»). Durante el paso del alambre, debe tenerse cuidado »le que pn e ? ta una resi stenc i a al avance del alambre fuera >!>-> la uju a y que til paciente no se queje de síneo as neurogénicos •> igni f ica 11 vos , lo que podría indicar una diret ión equivocada e | alambre guia, con la posible amenaza de 5 lesionar una P Í S de nervio »> el cordón e ->µ i na l . Después de» que el alambre-» guia parece haber sido colocado apropiadamente en el espacio subaracnoide, la aguja Tauhy es apartada y removida del alambre». Después, por medio de f luorosc api a , se confirma la posición ti»-» I alambre-» en la linea Í O media del canal espinal, anterior a la pus?>-?ón esperada >ie la cci da equina, y nin torc e uras o turvaturas inexplicables. tina vez removida la aejuja Touhy, el alambre guia debe poder1 moverse libremente hacia adentro y hacia afuera del espacio, con una resistencia solamente muy ligera, ocasionada por la superficie rugosa del alambro que corre a través del ligamentum flavum denso y f i b roso . Posteriormente, se coloca el di latador Fren h 7 sobre ejr~- alambre guía, y dicho alambro es usado para dirigir el CTTlatalor a medida qu* es mpujado de u manera suave, pero 710 firme a través de la f-tscia, el músculo paraesp i noso, y el 1 ígamentu flavum, si uiendti la trayectoria del alambre hacia al espacio subarac noi e . Fl avance del »hlatador French 7 es dete->n?da, y el dilatadar e» removido del alambre, apenas se-» detecte? una pérdida de resistencia después de pasar el 1 ígamentum ?5 flavum. Be3 sigue este procedimiento , con el objeto de evitar en un grado si nificativo, el avante y la manipular ion de este d?3atador, relativamente rígido, dentro dt- 1 espacio s b raenoi de.

Una v j que la trayoc. or i a del alambre ha sido "sobredi 1 atada" µoi el dilatador Fr >»n» h 7, -.o ensamblan el di I ¡tactor Freix.h y la v i ina do. I -.1 ». anula •><? c oloc -in sobre» >íl alambre de-» guia. Cl di latador' Freneh 6 y la cánula ~¡e» hacen rt avanzar ui adosamente »_»n el esµac IO .»ubara? uoi e ha »ta que la punta de» la apertui a di 3 t » nula e-»tá µu:>ic i tinada rm dentro del espacio. Igual qu»-* con el > ¡ i l a taclor French 7, también el di latador Frent.h A y 1 i cánula ensambl dos son dirigidos por el alambre dentro do la lu»1 d»?l » I a tador. l.a posición dentro del l'i esµa»- ir) mubarac.no i » I».» ,, -, del »»t minada por la me í» i?')i? µrevia de'l d ?«pc?<»? 11 vo, y la me ie ion es conf i ada »!*.» manera aµro;, imada por1 f 1 uoroscoµ i a . D bo I u rs »jrin < melado cat\ la maní pul C I ÓU de-» 1 OÍ» th latadores y 1 i . í uh dentro del e-,?,u ?o subarac noide, para evitar1 una tlirecr ion equivof ada e ocasionaría un posible daño 5 ueuru ló ico. Una vf.1 a »e»jin ada 1 a posic i n aµi opiada dw la cánula, el alambre» guia y >-» I d i 1 a i -j.»lei f i-ench A, son removi o-, de manera - 've y en ~>ecuem ¡ A d » la luz de* la c ánula. Seg?n la pos H I un del pac ientr» .»ol)r'e la e »a do opera» ion, en este punto, de-.» b.» 1- podt»r nu r ji» >-»l flu jo »l»»l í;fl! a ti " é , »l>» la c nula que puede ser- muy rápido, Jo que pu»»»l>" requer J I »»l tapado la cánula o una l caci n muy rápida del implante para preveni r una pérdida e¡ír es s WA de» I C F . la... célula .» I'l-H- CM 1 F" <t¡.1 imat-ida .» oiu-apsul ada » µuc-»dc» ->er .Z propor ionadas» en un ntenedor e~»tér?l »ie envoltura doble, bañadt) e»n medio »1e I r-ansµort , y < >?mp 1 e tamente ensamblado inc luyendo, un fi Idi 'nln I u| u I a r d»» f i j it i n »le »? l ic:on<t» Antes de l a implantac ?ó»» i rav^"-» de la cánula y en el esµat 10 subarac noide, la < \p »ula µu» »je ,» I r .> U:J f er I da a la b iudeja dc-»l equipo de i nser't. i »')n, en donde es c olo> a>!-j. c»n una µo -»|f ion que per i í-* mantener' 1 i » íµ->ula en el medio transporte durante su h examen yene»ral de cLiflo » o >lefe» te.) •» ayor'es, I a poi c u'xi d»»l f i l mento J f i jat ion de 1 A ?- ípsula es montada sobre el t-»mµujador ei>» acero i nox i abl , i nsertando la par-te de diámetro pequeño del alambre tiel e pujaclor sobre la parte »ie la me» hr-an ? del d i >p? »? í ? vo, e i ntroduc iendo el filamento c n? ladosameul e on la » anula» Se hace .- -ut.-ai 3 -•> á sul hasta que ia µunta e» la membrana alcanza un puntes que se encuentra de» I i 10 m »l ul r»> de I ¡, punta crane»al de 1 A cánula en el espacio subura>"n>>? » le . f" t-, » olo»- a> i óp es ksg rada µor la medición previa de l a r ánula y del c onjunto de cápsul a - f i 1 am nto- 1'"» empujado?", y i'»»-'»j(u que"» la µarte de la ?r?e-»mbrana de la cápsula está protegida por- la cánula dur- inte todo «1 t i mpo que es avanzada hac- 1 a su µo.»?> ion. ""-^ tina vc-».: que la c ápsula ha -s?»l») po ic i onada dentr-o de la cánula, on el ohjc l o d m-?ni»»n»»r l i » ipsula en pos ion (sin , <- avance CJ -»ac dc>) c»u e! e »µa» io subar at-iioi > l , -se tu»a c»l empujador, mientras que? 1 -i c ínula es rol J i acla eomµ 1 e l amen te por enc ima de Ja c psula y del empujado? . Dcµués, el empujado?" es reti rado de la cápsula, desl i g ando -»u µ n te de al -t bre hac la afuera del filamento de si l ir ona . Al u-,ar os I »-> m^l >uí».j, la µosi c ? »')n f ina l tle .b la cápsula, es tal , que la p rte-* do ¡a membrana del disposi ivo queda c ulo» acia c omµ lo t-utiei i tt » dent r o del 10 subarac nui de uy cont iene-» el CSF, ventt o l a la < »u»i-? equi na , l a cápsul a puede .-.er ni anclada en su extremo caudal por medio de un filamento de fi jación dfct r:t¡ i , f p , ,¡,, apre . mad ¡mc»n -» 1 a ? rm de longi ud que crirre dentro del >:*-»µ-?< 10 ->uba? a». no de, anl as de que e-».l filamento salga a través de la dm-ß y el l igameptum flavum. El filamento l" continúa e¡; te»rn-u??eul e , ,»Jo este nivel a través dei músculo parae.»p i noso y emo?yo »¡».> t»i>- la fa-»< i -i I umbtídor-aa 1 , dt».?andu disponible generalmente cié 1 & 12 cm de f ilamento I i tir-1 p<?r- i asegurar el disposi t ivo. l as pérdida-, »JeJ C^ -ion mi n i i arlas pesr1 la inyección o de pegamento a base de fibrina p ?ssel <w> ) en la trayec oria ca ada por el filamento en el músculo µar-aesµinoso, y cerrando f irmemente la aper ura p 'ji?erfic lal de la trayec ton a ron una sutui'a de t < µo ijiunl". De-»µn»?.,, el e remo libre ci | f ilamento c»s <? n» la o » on una sutura uo absorbente» y cubierto ? c mpletamente ron up i v»c ubr i tento fie dos capas de la ie»! y t j i do •subcu neo . Pos te?" i iirmi'ii t~» , el µac iente (-»-•» t ransf er i do a un AVOA de r"**' uperac ion neur'oqu i rúrg ? > a y mantenido recostado en un estr-ieto descanso en rama, «Jurante» 7? huras e-.µut5»---» de la operación. También, se-» cesut inúa con la admini >trat oin profi l ti a de an 11) i CJ 11 CCJS , durante hor as, d » >pu»*», fiel proe ed i i en to d » ímpl anta i ?n.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1 „ Un método µai a 1 ¡ impl ntac i n d » célula-, eu un hospedero, el cual c omprendes ct (a) la c»nt aµ »n1 aci n d>» l as células en una cápsula bi oeamµat i bl e , (b) 1 i expos 11 ion de la-» células -t una o más cundí c iones restrictivas durante n período de-» ti mpo suficiente para e tablecer una µ?uµ?e»la»t f »»tula? d s ad i, en respuesta a la o onitu ¡ó\\ o conche lene.» res t r i c 11 va =» , y (f.) la implantac ión tic» 1 a*» células encapsulada-» f-»n un sitio de implantac ión e,, un ho ->pef loro , siendo sub ->t-? no i a lmente conservada ) A µroµieu-?l rol ni t» , »le >pu»'» -> de» la í pl ir at ion. 2„ Fl método lal y omo >e des» r ihe en la Reivindn ación 1? l, earac ter i .'ado idom?s porque 1 t? célula-:» e»ncapsul acias son expuesta.-» a la eondic n'in »» t on» ' I OI.O , re .l it i vas» i n i I, ro . 3. El m tenJo ta l y i nino >e des» i ibe en la RCÍI v i i n 11 c. a», i óu í " c ra terizado además poi que» la » H UIA Í encapsulada-» son e¡ pue-»tas i la c nche i »'?p o > ondic ion»-* » i estríe ti va» m viv , por medio »1e la i plai.laf ion en un si l io i planlac i ón en un recep tes?" . 4. El método tal y co o ~»e desc r i be en la Reí v i ncl ir ac ion 1 , e a r - t»-»r i .* do ad>»m i . µ»)t »¡»?»» \ t . » »'» I u I i » »»¡n epocjénic as al hospe Jero y 1 A cápsula :, ?nmun») ? , lanl»?. h 5. El método ¡,a] y r om >e ele--.»i r ibo en la Reivindic a ión 1 , c racteri zado <n!»»m?s porque po?" l menos una de* las candi f iones r-estr u l i va •> ».» , ¡un om c»nl ración de ejluc o »a en el rango de de-»df» aµ? o/ i ad imeu te» AO mg/dec i 3 i t?-o blat aµi'oi' i madamentt» 70 mg/dec i I i t \ » i . A. El mót»)do i l y » orno ¿e de--,» r i be en 1 u Re?v?n»i?t ación 1 , e aríu.leí i , a»Jo idemí:-» µ»)rquo por lo eno •» una de la.=> r» cond ie ? ne.» re-»tr'if t i va.» e > un » » onc ent i a» i ón de o* igeno en un rango de de -.d aprox i adamente» 4<) inmHg Insta apro¡' i madamente 6b mmHg . 7. El método I i l y c o o af de.». ?b»-» en la Rei vindic c ión I , c as'acte i zado ademá µorrjue µ»n- lo menos una de las lo corií/11 c i ones restrict ivas >-*:-» una concentr a», i ón de dapamina, la VOAI ts» •> menoi t|ue 1 i, om entr a» ion f 1-5 tol?g i c a de dopamina en el liquido t erebro esp i na. I o en la µai enf i ma c erebr l . 8. El método -t I y cro o se >l«s< pbe c-»n la Rei vi ndic ación 3, c arac eri zado ad»»má ? poi ue la~> célula » son _>el e ei onadas dc-»l \7 ijrupo e oír.» is tente» " , lnl t -, nlr enale» » t i u ua f i ne-.» , c élulas df» riñon de hámster1 bel)»'», < >.'» I u I a > PH1?. 9. El métciiJo tal y como se describe en la Reivindic ación R t ?.ar-a' ter i :*ado adem-is porque» la » e-éJula.» »on c élulas PH12 y son implantada5» en un o< oµtm µoi un µe»? iodo de» 6 me »es o mayo?". "'O 10. El método tal y co o se »le-,» r i be en la Reí vi mli» ac ión 8, cara eri zado ad»-*má-» p»?rque 1 A:-, c élulas son células adrenale a c omoa f i nc>:» y ,n?? i µ I tutada;» »»n u ? t ec t µl ..,! µor uu µ»» iodo »Je> 4 meses o mayor, II. El me-'» t o» 1o t il y co o "»>-> » lesc r i he en la Fí i v i uth < ae ion '""'• R, rnrar tei'i 2adp ?d» »mís µor que | c élu la »ou células PP1? y son i mp 3 <? litadas eu un r e» »«µl o? fior- uu pe» ¡o»lf) de» " -.emana > o ma^or . 12, El método tal y c o o ,»' de--»».? i be en la Re i v i n» 11 c a», i ón 1, cara terizado ad»»mí » porque la--» célul 4» producen una molécula bioló icamente ae tí . -a »el»»» t i »nada ¡. par t i i el gr-upo c p???» i -.> I ente de neuro tran-.»m i soi e » , analgé - o » ?<*» toi e de c rec i mi en to. 13. El métode) t l y como se »lesc pbe en la Reivindic a ión 12, cara' tensad idem?s µorque la molé' ul i biológicamente ac ti va e-»s µor1 1 CJ menos una » 11 co! am i i ?a . 14. El método t il y co o -»e tlest c i b en la F m v i n»l? t apún 1, t ar'ac teri zatlo adein?s porque la psula es implantada on un hospcck»!1») en un si l to d»» Lmµlan n i n -»elee.t lonadcr) a µar'ti? del 1 (¡ g?"upo c on-> i stcpte» e» I ¡quicio » erebi o e-spi al y µarene i ma 15. El m>'»te.)do l l y como se d sc ) i be en la Reí v indica'., i n 1, t arac ter i z.a»ío arlem > µort|ue ] h»> »µede»r D ».-»s un humano. 16. Célula2» que exhiben una propiedad celular- deseada en l'"» respuesta a una conche i n restrii tiva, ->?endo producidas dichas células por mecho de.' <a) la encap->u I ac ion de las l lula en una cápaula tyM**"c omp a t J b 1 e ; y (b) 1A implan! ac i óu de-» 1 t e »'»lul is ene ap-»ul adas eu un -sitio de» implan tai ton >»n un ? e» ? µto? µr imd,»», hiendo las c-»'»lulas ¡tenoejéni c as al rec»íptor, |)or un período mínimo >.ie-» 6 meses par í establecer la pro ieda»! t lular deseada en respuesta a la-»» condi i nes ?-e-»:»t? u L U » en» oíd v-w\ s , eu el si tio de implantae ion. 17. I as > é I u I a -» tal y » cuno -»e dése?" i ben »-»n 1 i Reivindicación 1¿, t ar ac te?1) zadas además ponte las t.élulas son sel ccionadas a part i r tle I g?uµo c on »? .tente de» células adre»nales c romos» f i nes qu>> no -on de µ, nuil,»--», l éluJ.i-, e riñ n dt» hámstei bebé, y células PC 12. 10. Las células il y co o se» describen eu la Reivindicaci n 17, c m AV tor i za 13 > Me a =5 porque las » élulas no son células adi'ßnales e r-omoa-f i nes de primate» 19. I i'» <»*»l? |a , i -t 1 f » uno se desc r- i ben en la Reivindica? i ón 17, ' ira» ter i -olas a m,')'- µorque las célul vs i on c lula:-, PC12. 20. las células tal y cromo e desc iben en las Reí v i nc t ae i one--.» 19 ai i» te i 'ada-< además porcino la Ití prop ídad celular »1»> »>»<?»la I e. -imbie» de» la pro» lucí i n d c * «¿col ami na de? las c élulas. 21. las célula » tal y come» -.,'-> describen en J -i Reivindic ac i ón 2o, c ra» 1>»? i Z'>d i - ad-»m?s µorque la µroµietlad c lular- deseada es ».»! aumente» de la µrodur »-?ón de catecolamina de lc? las célul s. 22. Las célul -ts tal y < orno e describen en la Reivindica', i óu 16, < ii clpí ?z«>da a»i»*?i?ás iior'que la c apsula es i vlantarla en uu -. i t i o de i plantac i n .,e I ecc i onaclo a partir del grupo consi ten e» »t>> l iquidr) > er-ebro espinal o parenc ima '-»(" oi oh al . 2 . la f lult tal y como -,e describen en la Reivindirac i C'J? 16, . ar ac ten zada » además porque el hospedero es un humano» 24., Un método de» i pl ntac ión do ? >'» lulas en un hospedero '3 xenogépico, el cual comprendes A) el i itl ttvo dt» la» c élulas bajo dos o más conci ?on*>.» resli u I iv^ss !, , ib) la enc psnla» i n de-» J células en una rápsula b iocompa i ble y la e\po i c ion adic ional de las células c-»ne ípsul das a urp o más » onde iones res l r i e 11 vas detr nte un periodo do tiempo .~»uf?» ic»ute µar-sear!a en re »µue »la a la condic ion ?-ev> t?-? c 11 va ; y <t ) la iniµ laid a» n de las c élulas eucapsul acias en un -li i de implanta» i ón »»n t»l hosµe> lt»r"o , hiendo i onser vad i ubstane la 1 mente la µr-oµ i c.-»dacl celular, después de la i mp 1 antac i con» r? i EXTRACTO DEL INVENTO La presente inven», i ón µroµore i ona métodos de implanta», ic'in do < é I u 1 , , < n» i,, ?ul i l-? > »n un hospede?1'), 1o:> » ti 3 le-»' > '» comprenden la ?»- o-,?» mn de» I a -> » e'»lula'-» a couf c i nes restrictivas dur-tide un µerludo d» > tiempo suficiente para es tab 1 ec c-»r mu proµ 1 ed-?d f »-lul ir d»» »»-»nJ-? en r*espuesta a la » condic iones restric ti vas y I t imµlantac i n de las células encaµsuladas »-»u uu hospedero, -»?»'inlp c nservada substant talmente lo la propiedad relul'ir de-, pu s de» 1 i i lantación. También se pr J|!ÜGCJ onan célula > µrothu ida » µor la >»'-µosie ion a condu 1 one-> r-estr 1 c t ivas . lc? s*-y>