MXPA94005368A - Procedimiento para la preparacion de nuevos derivados de clavam y productos obtenidos - Google Patents

Abstract

Se describe un compuesto de fórmula (I):junto con sus sales y un procedimiento enzimático para convertirestos compuestos enácidos clavulánico. Se describe un procedimiento para la preparación del compuesto de fórmula (I) y sus sales, junto con los intermedios utilizados en el mismo.

Description

"PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE NUEVOS DERIVADOS DE CLAVAM Y PRODUCTOS OBTENIDOS" ü i __. _ \ Inventores: STEPHEN WILLIAM ELSON , STEFAN ROLAND WORONIECK y EITH HOWARD BAGGALEY, subditos británicos, todos domici liados en Brockman Park, Betchworth, Surrey RH37AJ, Inglaterra Causahabiente: BEECHAM GROUP p.l.c, compañía británica domiciliada en Beecham House, Great West Road, Brentford Middlesex TW8 9BD, Inglaterra.

EXTRACTO DE LA INVENCIÓN Se describe un compuesto de fórmula (I): junto con sus sales y un procedimiento enzimático para con vertir estos compuestos en ácidos clavulánico.

Se describe un procedimiento para la preparació del compuesto de fórmula (I) y sus sales, junto con lo intermedios utilizados en el mismo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a compuestos de B-lact ma y en especial a un nuevo derivado de clavam. Esta inve ción también se refiere a un procedimiento para la prep ción de derivados de clavan. En la menoria de la patente británica No. 1.508,97 se describe un derivado de clavas conocido COMO ácido clavulánico, que es un coapuesto producido por Strcptonvces clavuliqerus ATCC 27064 o un ñútante de gran rendiniento del nismo. El ácido clavulánico tiene la estructura (A) Mostrada ñas abajo, donde taabi n se indica la estereoquímica abso luta y un sistena de nuae ación.

Por lo tanto, el ácido clavulánico es el ácido Z-( 2R,5R) -3-( B-hidroxißtiliden) -7-oxo-4-oxa-l-asablciclo-(3.2.0)heptan-2-carboxllico. El ácido clavulánico es un potente inhibidor de los encinas B-lactaaasas y es un conpuesto de gran interés clínico debido a que protege de la degradación a los antibióticos de B-lactaaa lábiles frente a las B-lactamasas. Esta invención proporciona un coapuesto de fórmula (I) o una sal o forna protegida del nismo: En la fóraula (i), que se nuaera de la aisaa for-aa que el ácido clavulánico» la estereoquímica absoluta en las posiciones 2 y 5 es opuesta a la del ácido clavulánico, es decir, es 2S,5S. Por lo tanto, el coapuesto de fóraula (I) y sus sales y ásteres presentan un efecto Cotton negati vo en el espectro DC (Dicroisßo Circular) en la región de 230-240 na, en contraste con la inflexión positiva presenta da por el ácido clavulánico en la aisaa región. La utilidad del coapuesto de fóraula (I) y sus ta les reside en su capacidad para actuar cono interaedlos en un procediaiento de preparación de ácido clavulánico coao el que se describe a continuación. El coapuesto de fóraula (I) puede estar en foraa s ltteriónica o en foraa de sal, por ejeaplo cono sal met lice tal cono la sal sódica, una sal de adición de ácido, una sal anónica o una sal de aaonio sustituido, por ejeaplo una sal de aaina terciaria. Las sales de adición de ácidos pueden formarse en el grupo aaino terainal y pueden ser, por ejeaplo, sales con ácidos inorgánicos tales coao, por ejeaplo, clorhídrico, broahídrico, ortofosfórico, o sulfúrico o ácidos orgánicos coao, por ejemplo, aetanosulfónico, toluensulfónico, acáti- co, propiónico, láctico, cítrico, fuaárico, aálico, ßuccíni co, salicílico o acetilsalicilico. Las sales aetálicas pueden foraarse en el grupo carboxilo y pueden »t, por ejeaplo, sales de aluminio y sales de aetales alcalinos y álcalino-tórreos coao, por ejeaplo, sales de litio, sodio, potasio, calcio y aagnesio. Las sales de aaonio sustituido pueden ser, por ejeaplo, las formadas con (alquil c¿_g) sainas coao, por ejeaplo, trietilaaina, hidroxi( alquil Cj ) sainas coao 2-hidroxietilanina, blsí 2-hldroxietil) aniña o tri(2-hidro- xietll) aniña, cicloalquilaminas coao, por ejeaplo, biciclo- hexilaainas, o con procalna, dibencllpiperidina, M-bencil- B-fenetilaaina, deshidroabietilaaina, N,H*-bis-deshldroabie tilaain'a, glucaaina, N-aetilglucaaina o bases del tipo pi dinico coao, por ejeaplo, piridina, colidina o quinolina. Debe entenderse que esta invención se extiende a j& los coapuestoß de fóraula (I) donde uno o aás de los grupos funcionales presentes están en foraa protegida. Asi, el grupo carboxi puede estar protegido, el grupo ani o puede estar protegido o tanto el grupo carboxi coao el grupo aai- no pueden estar protegidos. Todas estas foraas protegidas del coapuesto de fóraula (I) y otros coapuestos descritos aqui están coaprendldas en el t?ra no "foraa protegida". Además, el téraino "foraa protegida" aplicado a los coapuest ifi aqui descritos cubre los internedios "enmascarados", que pueden convertirse en los conpuestos finales por procedi- nientoß qulaicos conocidos por su capacidad de convertir un grupo funcional en otro (donde el resto de la aolácula peraanece sustancialeante inalterado). Por ejeaplo, las foraas enaascaradas preferibles de una aaina incluyen los correspondientes análogos asido y ciano que pueden convertirse en la aaina deseada por reducción. (Se observará que el correspondiente conpuesto ciano contiene un átono nenos iJl de carbono en la cadena lateral, excluyendo el carbono del grupo ciano). Los grupos protectores del carboxilo fornadores de éster adecuados son alquilo C, g, alquenilo C- -, alquinilo C2_6» cicloalquilo Cj_7, arilo, aril-alquilo C1-6 y tri(alquil . -) sililo, opcionalnente sustituidos. En el sentido utilisado aqui, el término "arilo" incluye fenilo y naftilo, anbos opcionalnente sustituidos f con hasta 5 átonos de flúor, cloro o grupos alquilo C, g, alcoxi.C. *, haloalquilo C, g, hidroxi, aniño, carboxi, (alcoxi C, 6) carbonilo, ariloxicarbonilo, (alcoxi ^?) carboniH alquilo Cj_£) , nitro, ariloxicarboniloxi, aril- ( alquil C1-6)oxicarboniloxi, (alquil C1-6)oxicarboniloxi, (alquil Clv6)carboniloxi, ariIcarboniloxi , ari1( alquil C1-6 carboniloxi o ari1( alquil Cj_6)oxicarbonilo. El término "halógeno" se refiere a flúor, cloro,. brono y yodo. Los té ninos halógeno y haluro deben ser interpretados en consecuencia. Algunos ejemploe de los sustituyentes opcionales en los grupos protectores mencionados aqui cono opclonalaen te sustituidos incluyen hasta tres grupos (que pueden ser iguales o diferentes) seleccionados entre halógeno, hidroxl, alcoxi Clßg, alquiltio C, g, ciano, nitro, carboxi, ácido carboxilico, éßter alquílico C, ,, carbaaóílo, aniño, mono-( alquil Cj *) amino y dl< alquil C, -) ani o. Grupos protectores del carboxilo formadores de é¿ teres especialnente adecuados son los que pueden ser eliminados bajo condiciones convencionales. Estos 'grupos incluyen alquilo C, ?, tal cono netilo y etilo, bencilo, p-metoxibencilo, benzolÍmetilo, p-nitrobencilo, 4-piridilnetilo, 2,2,2-tricloroetllo, 2,2,2-tribronoetilo, t-butilo, t-amilo, alilo, difenilnetilo, trlfenilnetilo, adanantilo, 2-b«nci loxifenilo, 4-netiltiofenilo, tetrahidrofur-2-ilo, tetrahidro-piran-2-ilo, pentacloro enllo, acetonilo, p-toluensulfoni1-etilo, netoxinetilo o un grupo sililo, estannilo o conteniendo fósforo. Un grupo carboxilo puede ser regenerado a partir de cualquiera de los esteres citados por nétodos habituales apropiados al grupo éster particular, por ejenplo hidrólisis catalisada por ácidos y bases o por hidrólisis catalisada ensimáticemente o por hidrogenólisis bajo condiciones donde el resto de la molécula queda sustancialnente inalterado. Un grupo protector del carboxilo preferido en el conpuesto de fórnula (I) o en una sal o un derivado amino-protegido del nisno es el grupo bencilo. Los grupos protectores adecuados para el grupo a iño son los que pueden ser fácilnente escindidos* una discusión conpleta de la forna en que puede ser protegido un grupo aniño y de los nétodos para escindir los derivados protegidos resultantes se encuentra, por ejenplo, en "Protective Groups in Organic Synthesis", por T. w. Greene (Wiley-ínterscience, New York, 1981). Ejenplos adecuados de grupos protectores del aniño son los grupos enmascaradores descritos antes; (alquil Cj_6) carbonilo opclonalmente sustituido; arilcarbonilo; ari1( alquil C. c) carbonilo; (heterociclil)carbonilo donde 1—o el grupo heterociclilo es un anillo aronático de 5 o 6 miem bros que contiene hasta 4 heteroátomos seleccionados entre oxigeno, nitrógeno y asufre; o un grupo que produce un car-banato tal cono benciloxicarbonilo opcionalnente sustituido en el anillo fenilico con uno o dos sustituyentes seleccionados entre alquilo C1-4, alcoxi C1-4, trifluornetilo, halógeno o nitro; (alquil C, 4>oxicarbonilo, por ejenplo, t-buto xicarbonilo; o (alquil C1_4)oxicarbonilo opcionalnente sustituido en el grupo alquilo con hasta tres sustituyentes seleccionados entre alcoxi C, 4, halógeno o nitro, por ejenplo 2,2,2-trlcloroßtoxicarbonilo o 1-cloroßtoxicarboni- lo. Ejemplos preferidos de grupos N-protectores para el grupo ani o presente en el conpuesto (I) son los conocidos convencionalnente para la protección de grupos a iño en la quinica de los péptidos, cono se describe nás adelante. Un grupo protector del aniño especialnente preferido ea el conpuesto de fórnula (I) o en una sal o en un de rivado carboxi-protegido del mismo, es benclloxicarbonilo. Convenientemente, el conpuesto de fóraula (I) se encontrará en foraa aislada, libre de aaterial de ácido nucleico. El coapuesto es adecuadamente, por ejeaplo, sustan cialaente puro, nás adecuadanente con una puresa del 75 % como minino y preferiblenente con una puresa del 85 % cono ninino, por ejenplo una puresa del 90-100 %• Una forna ais lada preferida es la forna sólida, préferiblenente la forna cristalina. Sin enbargo, debe entenderse que nada de lo que antecede excluye el uso del conpuesto (I) en forna inpu ra. Cuando se deja que los conpuestos de esta invención cristalicen, o se recristalisan, en disolventes org&ni eos, el disolvente de la cristalisación puede encontrarse presente en el producto cristalino. Esta invención incluye dentro de su ámbito estos solvatos. Análogamente, los conpuestos de esta invención pueden ser cristalisados o re- cristalizados en disolventes que contienen agua. En estos casos, puede formarse agua de hidratación. Esta invención incluye dentro de su ámbito los hidratos estequionétricos asi cono los conpuestos que contienen cantidades variables de agua que pueden ser producidos por procedinientos tales cono liofluxación. Conpuestos específicos dentro de esta invención de fómula (I) o una sai o forna protegida del nisno son los siguientes: ácido Z-( 2S,5S)-3-(B-aninoetiliden)-7-oxo-4-oxa-l-asabici- clo( 3.2.0)heptan-2-carboxílico ácido Z-( 2S,5S)-3-(B-benclloxicarbonilaninoetiliden)-7-oxo- 4 4-oxa-l-azabiciclo( 3.2.0)heptan-2-carboxllico y Z-(2S,5S)-3-(B-benciloxicarbonilaninoetiliden)-7-oxo-4-oxa- l-asabiciclo( 3.2.0) eptan-2-carboxilato de bencilo. Esta invención tanbién proporciona un procedímiß to para la preparación de un conpuesto de fóraula (I) o una sal o foraa protegida del nisno, cuyo procediniento consiste en tratar un conpuesto precursor de fórmula (II) o una sal del nisao: p—ir-C.H- *H-CHj-CHj-NHj di) COjH con un sistena enzimático capas de efectuar la delación deseada y después, si es necesario o deseable, convertir el producto en una sal o en una forna protegida del nisno. Le expresión "sistena enslnático" en el sentido utilisado aqui se refiere a un ensina o a una serie de en-zinas. Esta invención proporciona adenás un conpuesto de fórmula (II) o una sal o forna protegida del nisno. Los compuestos de fórnula (II) contienen dos ato nos de carbono asinétricos, narcados con asteriscos e_» la fórnula. Por lo tanto, estos conpuestos pueden existir en cuatro fornas estereoisonéricas. Esta invención conprende todos los estereoisómeros de los conpuestos de fórnula (II) y su uso, ya estén libres de otros isóneros o mezclados con otros isóneros en cualquier proporción y, por lo tanto, incluye, por ejemplo, mezclas racénicas de enantióneros. Tanbién están incluidos dentro del ánbito de esta invención los solvatos, especialmente los hidratos, del compuesto de fórnula (II) o de sus sales. La invención tanbién se extiende a los derivados protegidos del conpuesto de fórmula (II), es decir, conpuestos donde uno o más de los grupos funcioneles esté en forma protegida. Los grupos protectores adecuados para los grupos carboxilo y a iño en los compuestos de fórnula (II) incluyen los indicados antes como adecuados para proteger los grupos carboxilo y aniño en el compuesto de fórmula (I). Un grupo protector preferido para el grupo carboxilo en los compuestos de fórnula (II) es bencilo. Los grupos protectores preferidos para el grupo aniño en los compuestos de fórnula (II) incluyen benciloxicarbonilo y asido. Los grupos protectores adecuados para el grupo hi droxi en el conpuesto de fórmula (II) incluyen los discutidos por T.w. Greene (loe. cit.). Grupos protectores ßspß-cialéente adecuados son los que forman esteres, por ejenplo » un éster alcanoilico C^ * opcionalnente sustituido tal cono el acetato; (alquil , )- y aril-carbonatos opcionalnente sustituidos; (alquil C1-6)-, aril- y aril(alquil(C, ,) éteres opcionelnente sustituidos; éteres tri(alquil C, g)silí-licos opcionalnente sustituidos; y acétales (por ejenplo los derivados tetrahidropiraniloxi algunas veces denominados "éteres THP"). Convenientemente, el compuesto de fórmula (II) se encontrará en forma aislada, libre de material ácido nuclei^ co» El conpuesto es adecuadanente, por ejenplo, sustancial^ nente puro, nás adecuadanente con una puresa del 75 % cono niniao y preferibleaente con una puresa del 85 % coao aini-ao, por ejeaplo una puresa del 90-100 • Una foraa aislada preferida es la forma sólida, especialaente la foraa crista lina. Sin eabargo, debe entenderse que nada de lo que antecede excluye el uso del conpuesto (II) en une foma impura. El conpuesto de fórnula (II) puede encontrarse en forna switteriónica. Las sales de los conpuestos de fórnula (II) pueden ser, por ejenplo, sales de adición de ácidos, sales amó nicas y sales de amonio sustituido, por ejemplo sales de aainas terciarias. La formación de la sal es posible en uno cualquiera s en los dos grupos carboxilo y en el grupo aaino terminal. Ejemplos de sales adecuadas son las neneio nadas antes para las sales del conpuesto (I). Conpuestos particulares de fórmula (II) o una sal o forma protegida de los mismos son los siguientes: ácido 5-anino-3-hidroxl-2-( 2-oxoazetidin-l-il)valérico ácido 5-benciloxicarbonilanino-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin- 1-il)valérico 5-benciloxicarbonilamino-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-1- 1)- valerato de bencilo y 5-asido-3-hldroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il)valerato de bencilo. El procedimiento de esta invención se lleva a cabo adecuadanente, por ejenplo, en un sistena libre de células, es decir, en ausencia de células vivas. Preferiblemente, el sistena ensinático empleado deriva de un nicroorganisno, en especial una especie de Streptomyces.

Alternativamente, el o los ensinas pueden ser pro # ducidos por ingeniería genética. Si se emplea un sistena libre de células, el extracto libre de células se produce preferiblenente por soni ficación u otra ruptura en los microorganismos, opcionalaen te después de haber separado los residuos celulares, quedan do el sistena ensinático en solución. El sistena enzimático productor del conpuesto de fórmula (I) o de una sal del nisno, conprende adecuadanente, F por ejemplo, una enzina oxigenase. ¿ El ensiaa oxigenase es adecuadaaente, por ejeaplo, una dioxigenasa del tipo donde un átomo de la molécula de dioxigeno es transferido a cada una de un per de moléculas substrato. Las dos moléculas substrato pueden ser igua les o diferentes. El compuesto precursor de fóraula (II) puede servir cono una molécula substrato y una molécula como, por ejenplo, un 2-oxoácido, tal cono ácido 2-oxoglutári^ co, puede servir cono segunda nolécula substrato (co-subs- trato). Los ensinas para los cuales sirve el ácido 2-oxo- glutárico cono co-substrato son las dioxigenasas preferidas para uso en el procediniento de esta invención. En lo que antecede se observará que los enzinas oxigenases utilisan oxigeno molecular y, por consiguiente, para facilitat la reacción, preferiblenente debe suninistrar se oxígeno suficiente al nedio de reacción pera nantener una tensión de oxigeno disuelto adecuada. La transferencia efi • cas del oxigeno desde la fase gaseosa a la fase en solución es favorecida agitando o sacudiendo el nedio de reacción. Adenás del co-substrate y oxigeno, la nescla de reacción con el ensina oxigenasa puede contener uno o nás co-factores adicionales. Habitualnente, estos co-factores incluyen una fuente adicional de iones ferroso, especialmen te, por ejenplo, en foraa de sulfato ferroso. Una fuente preferida del ensina oxigénese es una áfc especie de Streptomyces tal cono, por ejenplo, cepas é o derivadas de S_. clavullqerus. S_. juraonHnensls. S. katusura- hananus y ¿. llpnanll. En especial, son útiles las siguientes cepas de estos nicroorgsnisnos: ¿. clavullqerus ATCC 27064, S_. jumonqlnensls ATCC 29864, ¿. katsurahananus T-272 y S. llpnanll NRRL 3584. Un ensina preferido dentro de esta invención derl va de ¿. clavuliqerus ATCC 27064 y presenta las siguientes características: a) capacidad de convertir un conpuesto de fórnula (II) o una sal del nisno, definido anteriormente, en un conpue¿ to de fórnula (I) o una sal del nisno definida anteriormente; b) una sola banda correspondiente a un peso molecular de aproxinadanente 48.000 daltons cuando se exanina por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfe 4 sódico; c) un punto isoeléctrico (pl) de 5,65 cuando se exaaina por enfoque isoeléctrico. El ensina oxigenasa puede ser preparado cultivando el microorganismo de forna convencional, especialnente bajo condiciones aerobias en un medio liquido o semiso ido adecuado. En general, se incluyen en el medio de cultivo fuentes de carbono y nitrógeno que puedan asimilar los microorganismos y sales inorgánicas nutrientes esenciales pa ra el crecimiento de los microorganismos. Dada la natura-lesa de los grupos prostéticos en los enzimas oxigenasa, el medio de cultivo debe contener una fuente de iones metálicos como, por ejemplo, hierro. La« condiciones de cultivo pueden ser une temperatura comprendida entre 10°C y 80°c y un pH comprendido entre 3 y 10. Las condiciones preferidas son de 20 a 30°C a un pH de 5 a 9, adecuadanente, por ejenplo, alrededor de pH 7, durante 0,5 a 5 días* El ensina oxigenasa puede ser aislado y utilizado en forna purificada, en forna parcialmente purificada, tal cono se obtiene en estado inpuro, como filtrado de una preparación de células desintegradas o como homogeneizado crudo de células. En el caso más adecuado, el enslne es, por ejenplo, por lo nenos parcialmente purificado para separar otros enzimas que podrían catalizar la destrucción del precursor, del enzima o del núcleo de clavan. El ensina puede ser unido a un soporte polimérico insoluble. El procediniento de esta invención se lleva a cabo en general en medios acuosos, manteniéndose la mezcla de reacción adecuadamente entre pH 4 y 9, más adecuadanente, por ejenplo, entre 6,5 y 8,5 y preferiblenente alrededor de pH 7,0-7,5. El pH es controlado adecuadanente, por ejem pie, empleando tanponea cono tampón de ácido 3-(N-norfolino) propanosulfónico a pH 7. Alternativanente, el pH puede ser controlado por adición de un ácido une base adecuados. Le tenperatura de la reecclón debe ser la adecuada para el enzima empleado y en general está conprendida entre 15 C y 60°C y es. preferiblemente alrededor de 30°C. El tiempo de reacción depende de factores tales come las concentraciones de las sustancias reaccionantes y de los co-factores, tempe ratura y pH. El precursor (II) o su sal se disuelve adecuadamente, por ejemplo, en tanpón antes de mezclarlo con el enzima. La concentración de la solución de precursor depende do la solubilidad de este último; habitualmente le concentración de la solución de precursor está comprendida entre 5 y 0,001% en peso/volumen. Una vez terminada la reacción el enigma puede ser separado de la mezcla de reacción y el compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo, puede ser aislado por métodos convencionales. La purificación inicial del compuesto de fórmula (I) o una sal del mismo im plica convenientemente una operación cromatográfica. El compuesto de formule (I) puede ser aislado en una forma en la que el grupo carboxilo y/o amino presente está protegido y, si se desea, el grupo o grupos protectores pueden ser posteriórnente separados pera generar el coapuesto (I) en foraa pura. En lugar de empleer un sistema libre de células, el procedimiento de esta invención también puede operar uti Usando un microorganismo intacto. Entonces se prepara el compuesto precursor de fórmula (II) o una s l del mismo y se pone en contacto con el microorganismo para producir el compuesto de fórmula (i) o una Sal del mismo. El microorganismo puede encontrarse en forma de cultivo en crecimiento, cultivo en reposo, micelio lavado, células inmovilizadas o protoplastos. Un compuesto de fórmula (II) puede prepararse por delación de un compuesto de fórmula general (III): OH X-CH--CH,-CO-NH-CH-CH-CH,-CH,-NH (III) 2 2 , 2 2 2 C02H donde X es un grupo saliente y los grupos funcioneles COjH, OH y NH, pueden estar protegidos. Un grupo saliente representedo por X es cualquier grupo que, bejo las condiciones de reacción, sea escindido del coapuesto de partida proaoviendo asi la reacción en un sitio especifico. El grupo X puede ser aquí hidroxilo o hidroxilo esterificado, tal coao un éster sulfúrico opcio-nalaente sustituido con halógeno; halógeno, por ejeaplo broao, cloro o yodo; o aril- o alqui1-ßulfoniloxi coao, por ejeaplo, p-toluensulfoniloxi (tosilo) o aetanosulfoniloxi (aesilo); o une sal de alquilexonio. El procedimiento anterior se lleva a cabo preferí bleaente bajo condiciones básicas, por ejemplo en presencia de hidróxido sódico o potásico, o de hidruro sódico o potásico. La reacción de dcleción puede realizarse: a) cuando X es halógeno o eril- o alqui1-sulfoniloxi, o una sal de alquiloxonio del alcohol, en presencie de un disolvente coao, por ejeaplo, dimetils lfoxide, dimetilforma- ida, hexametilfosferamida, diclorometano, acetonitrile o ecetato de etilo o mezcles de cualesquiera do estos disolventes; b) cuando X es halógeno o un éster sulfúrico del alcohol coao, por ejeaplo, el clorosul ato, por aétodos de catálisis con transferencia de fases en solución acuosa y/u orgánica, on presencia de una sal aaónica cuaternaria tal coao bisulfato o haluro de tetrabutilaaonio o haluro de bencil-triaetilaaonie; c) cuando X es hidroxilo, an presencia do un reactivo adecuado coao, por ejemplo, Ejemplos adecuados de grupos N-pretßcterßs para el grupo aaino presente en el coapueste (III) son los conocidos convencionalaente pera esta aplicación en la qulaica de péptidos. Ejemplos de estos grupos son los grupos ácido carboxilico coao, por ejemplo, acetilo, cloroacetllo, tri-fluoroacetilo, butirilo, bensoilo, fenilacetilo o piridincar-bonllo; o un grupo ácido derivado del ácido carbónico come, por ejemplo, etoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, t-butoxi-carbonilo, bifenilisopropoxicarbonilo, p-metllbenciloxicar-bonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-broaobendloxlcarbonl-lo, p-fenilasobendloxicarbonilo, p-(p-netoxlfenilaso)benciloxicarbonilo o t-aailoxicarbonilo; o un grupo ácido dßri vado de un ácido sulfónico o p-toluenßulfónico; u otros gru pos cono, por ejenplo, bencilo, tritilo, formilo, fteloilo, o-nitrofenilsulfonilo, bencilideno o nitro. Los grupos N-protectores preferidos son t-butoxicarbonilo y benciloxicar bonilo. En ciertos casos, ßl átomo de nitrógeno puede estar sustituido con dos de los grupos anteriores, per ejem-pío con bencilo y con benciloxicarbonilo. Alternativamente, ol grupo aniño presente puede estar protegido en forma do un grupo asido o un grupo ciano y puede ser generado per un nétodo adecuado, por ejemplo por reducción. La separación del grupo o grupos protectores presentes en el compuesto resultante puede efectuarse por un procedimiento apropiado que depende del tipo o tipos del grupo o grupos protectores. Algunos procedlnientos típicos son los siguientes: hidrogßnación en presencia de catalizador de paladio (por ejemplo peladlo sobre carbón, negro de peladle) para los grupos benciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, p-bronebenciloxicarbonilo, p-fenilasobencil-oxicarbenilo, p-(p* -metoxifenilaso)benciloxicarbonilo y tri tilo que protegen al grupo amino teminal; tratanientos con bromuro de hidrógeno en ácido acético glacial para los grupos benciloxicarbonilo, p-brenobenciloxicarbonilo, p-feni1-asobenciloxicarbonile y t-butoxicarbonile, que protegen al grupo aniño terminal; trataniento con sodio netálico en ano niaco liquido para los grupos benciloxicarbonilo, p-bromo-bencilexicarbonilo y tosilo que protegen el grupo aniño ter minel; tratamiento con ácido clorhídrico y/o jleido acético para los grupos tritilo, t-butoxicarbonilo, fornilo y ben-cilideno que protegen al grupo aniño teminal. Alternativa, nente, la desprotecclén puede efectuarse con un ensine hi-drolitico adecuado, por ejenplo una anidase. Un grupo asido ternlnal o ciano puede ser reducido a un grupo aniño, por ejenplo por hidrogenación en presencie de un catalizador do peladlo. Ejenplos adecuados de derivados bloqueadores del carboxile para el grupo -COjH en el conpuesto (III) son las sales y los esteres derivedos del ácido carboxílico. Prefe riblenente, el derivado puede ser fácilnente escindido en una fase posterior de la reacción* Ejenplos adecuados de ^ sales son las sales metálicas como, por ejemplo, las formadas con sodio, potasio y litio y las sales con aminas terciarias come, por ejemplo, las formadas con tri( alquil C,_6) a inaa, N-etilpiperi ine, 2,6-lutidina, pirldina, N-metil- pirrolidina o dimetilpiperasina. una sal preferida es la formada con trietilamina. Ejemplos adecuados de grupos protectores del carboxilo formadores de esteres en el compuesto (III) son aqué líos que pueden ser separados bajo condiciones convenciene- fi les, como se ha indicado antes al tratar de los grupos adecuados para proteger al grupo carboxilo en los compuestos de fórmula (I) Y (II). El grupe hidroxllo puede ser protegido de la misma forma que el grupo hidroxi en el compuesto de fórmula (II), por ejemplo en forma de un éter silllico o como un és ter, en especial un éster alcanellico C, , por ejemplo como el derivado acetato. Ék Los compuestos de fórmula general (III) donde los grupos funcionales presentes están libres o uno o más de estos grupos están en forma protegide, son nuevos y constituyen otro aspecto de esta invención. El compuesto de formule general (III) puede ser preperado copulando un compuesto de formule general (IV), o un derivado N-acilente del mismo, con un compuesto de fórmu la (V) o un derivado del isno que permita que tenga lugar la acila- ción. • OH t X-CH2-CH2-C02H H„N-CH -CH-CH--CH„-NH. C02H (IV) (V) donde X es el definido antes y cualquier grupo funcional pue de estar protegido. La naturalese de los grupos protectores y su elimi neción es la nisna discutida con respecto a la férnula gene¬ • ral (III) anterior. Naturalmente, puede ser conveniente no separar los grupos protectores de una forma protegíde del conpuesto (III) y en lugar de ello ciclarlo para dar el conpuesto (II) en forna protegide cone se ha discutido antes. Ejenplos adecuados de grupos que pemiten que tenga lugar la acilación y que están opcionelmente presentes en el grupo a-anino del conpuesto de partida de fórnula (V) son los grupos N-sililo, N-estannilo y N-fósfero, por ejemplo grupos trialquilsilile tales cono trinetilsililo, grupos tri alqullestannilo tales cono tri-n-butilestannilo, grupos de fórnula -PR* donde R* es un grupo alquile, aralquile, alce xi, haloalquilo, arilo, haloalcoxi, ariloxi, aralquiloxi o dialquilanino y Rb es igual a R* o es halógeno o donde R* y R unidos fornan un anille; grupos del fósforo adecuados cono éstos son, por ejemplo, - ÍOCgH^j, - ÍCjH^, -p-0(CH2)2- y -í-0(CH,) ,-0. i i En el procedimiento anterior puede empleerse un de rivado N-adlante reactivo del ácido (IV). Naturalmente, la elección del derivado reactivo estará influida por la natura laza química de los sustituyentes del ácido. Un ejemplo adecuado de un derivado N-acilante es un heluro de ácido, preferiblemente el cloruro o bromuro de ácido. La acilación con un haluro do ácido puede efectuarse en presencia de un agente aceptor de ácido, por ejemplo une aniña terciaria tal cono trietilanina o dlnetilanilina, una base inorgánice tal como hidróxido sódico o bicarbonato sód co o un oxirano, que se une al haluro de hidrógeno liberado en la reacción de acilación. El oxirano es preferiblemente un óxido de 1,2-alquileno , ¿, cono, por ejemplo, óxido de etileno u óxido de propileno. La reecdón de acilación empleada de un haluro de ácido puede efectuarse a una temperatura coaprendida eproxiaadaaente entre -50°C y +50°C en medies acuosos o no acuosos como, por ejemplo, acetona acuosa, tetrahidrofurano acuoso, aceteto de etilo, dimetilacetamida, diaßtilforaaaida, acetonitrilo, diclorometano, 1,2-dicloro-etano o mezclas de los mismos. Altßrnatlvaßente, la reac-ción puede llevarse a cabo en una emulsión inesteble de un disolvente no aiscible con agua, especialmente un éster o acetona alifáticos, tai coao metil isobutil cetona o acetato de butilo.

Otros ejemplos adecuados dß derivados N-acilentes del ácido de fórmula generel (IV) incluyen los esteres acti vos coao, por ejemplo, los esteres succininido, ftalialdo y p-hidrefenilico o el anhídrido del coapuesto (IV) o enhidri dos aixtos del coapuesto IV) con otros ácidos. Alternativaaente, un coapuesto de fóraula general (IV) puede ser copulado o un coapuesto do fámula (V) ea-pleando un agente deshidratante, adßcuadaaente, por ejeaplo, un reactivo de cerbodiiaida tal coao N,N'-diciclehexilcarbo dliaida o ( l,3-dinetilaninopropil)-3-ßtilcarbodiinida. La reacción de copulación de la carbodiimida puede llevarse a cabo en un disolvente no aiscible con agua, un disolvente aiscible con egua, un sisteaa bifásico o una aezcla de agua y un disolvente aiscible con agua, dependien do de la naturaleze del reactivo de carbodiimida y de cualquier grupo protector presente en los coapuestos (IV) y (V). Otros reactivos copulantes que se utiUsan en le síntesis do péptidos, como, por ejemplo, disulfuro de dipi-ridllo/trifenilfosfina, también son adecuados para la prepa ración de los conpuestos de fórnula general (III) a partir do los conpuestos (IV) y (V). Tanbién puede prepararse un conpuesto de fórmula general (III) por reducción de un conpuesto de fórmula gene ral (VI): X-CH2-CH2-CO-NH-CH-C-CH2-CH2-NH2 (VI) C02H donde X es el definido antes. Adecuadamente le reducción se lleve a cabo, por ejemplo, empleando un hidruro como reactivo reductor tal co mo NaBH4, Zn(BH4)2 o NaBH^CN, en un disolvento ecuoso U orgá nico adecuado. Alternativamente, el compuesto (VI) puede ser reducido con un enzima adecuado en presencia do co-fac-toras adecuados o reducido empleando células completas tales como levadura o células de hígado. Un compuesto de fórmula general (VI) puede ser preparado por copulación de un compuesto de formule general (IV) o un derivado N-ecilente del mismq con un compuesto de fdmula (VII): 0 H2N-CH-C-CH.-CH?-NH- (VII) C02H Las funciones cerboxilo y ¿-amino del cosqpuesto (VID pueden ser adecuadamente protegidas. Ejemplos adecúa dos de grupos protectores son los descritos antes para la protección de los compuestos de formule generel (IIX). Ade más, el grupo carbonilo en (VII) puede ser protegido por métodos conocidos én este campe, por ejemplo los descritos por T. . Greene (loe. cit.). Los métodos descritos antes para la copulación de un compuesto de fórmula general (IV) con un compuesto de formule (V) pueden ser utilizedos para copular un compuesto de fórmula general (IV) cea un compuesto do formule(vii) . De nuevo puede ser conveniente ne seperar ningún grupo protector presente hasta que se prepare el compuesto de fórmula general (III), o, realmente, has ta después de haber ciclado el compuesto de formule (III) en forma protegido. Puede prepararse un compuesto de formule (VII) por condensación de un compuesto de fórmula (VIII) o de fór muía generel (IX) donde R es un grupo bloqueador del carboxilo, formador de éster, con le glicina (X). 0 0 C1-C-CH2-CH2-NH2 ROC-CH2-CH2-NH2 HJN-CHJ-COJH (VIII) (IX) (X) por ejemplo en presencie de una base en un disolvente orgánico anhidro. Ejemplos adecuados de basas son las bases inorgánicas cono hidruro sódico o potásico y las bases orgánicas cono diisopropilaniduro de litio o bis( trinetilsiliDanidu-ro de litio. El grupo R formador de éster puede ser, por ejemplo, un grupo alquilo o aralquilo. Las funciones aniñe y carboxilo de los conpuestos (VIII), (IX) Y (x) pueden estar protegidos. Si durante le reección con el compuesto (IX) el grupo carboxilo de la glicina (X) está protegido con un grupo formador de éster, ese grupo es preferiblemente igual al grupo R. Los grupos protectores adecuados incluyen los des, critos antes para les compuestos de fórmula generel (III). Per ejemplo, las funciones amino de los compuestos (VIII) y (IX) pueden ser protegidas come grupo* eside o cieno que posteriormente pueden convertirse en grupos aniño. En el conpuesto (X), la función aniño puede ser protegido ceno derivado N-(difenilnetileno) o isonitrile. Un conpuesto de fórnula (V) puede ser preparado por un nétodo sinilar, por ejemplo por condensación de un compuesto do formule (XI): H2N-CH2-CH2-CHO (XI) con glicina* (fórmula X)). La función carboxilo dß la glicina (X) y las funciones aniño do la glicina (X) y del compuesto XI) pueden sor protegidas adecuadamente con grupos protectores descritos antes. Esta invención también proporciona un procedimien to pere la preparación de un compuesto de fórmula (II) o un sal o forma protegido del nisno, cuyo procediniento consist en condensar un conpuesto de fórmula (XIA): Y-CH2CH2CHO (XIA) donde Y es halógeno o amine, estando el grupo amino opcionalmente protegido, con un compuesto de fórmula (XII) o una sal del mismo. donde el grupo carboxi puede estar protegido y después, si es necesario o deseable, efectuar una o más do las siguientes etepes: •^ߣ\ i) convertir el grupo Y en un grupo amino; ii) convertir el producto en un ácido libro, sel o forma protegido del mismo. Preferiblemente, el compuesto de fórmula (XIA) responde e le fórmula (XI) definida anteriormente. La condensedón puede realizarse empleando las condiciones básicas descritos antes para la preperación del compuesto (VII). El grupo carboxilo del compuesto (XII) puede ser adecuadamente protegido y el grupo omino dol compuesto (XI) puedo ester protegido. Por ejemplo, el grupo aniño puede estar protegido como grupo azido o come grupo ciano y puede ser generado por reducción. En otro especto preferido, en luger del compuesto (XI), es posible utilizar como compuesto de partida el correspondiente cloro derivedo do fórmula (XX*): C1CH2CH2CH0 (XI') El conpuesto preparado por condensación con el compuesto (XII) puede ser convertido en un compuesto sini-lar al conpuesto (II) pero con un grupo esido teminal, por reección con une asida adecuada, por ejenplo azida sódica, en un disolvente adecuado, por ejenplo dimetilsul óxido. Entonces puede ser generado el conpuesto (II) por reducción del grupo asido temínal. En otro aspecto do la invención, se proporcione un procediniento pera la preparación de un compuesto do fÓ£ mulo (II) o una sal o forma protegida del mismo, cuyo proco dimiento consiste en reducir un compuesto de fórmula (XIII) o una sal del mismo. _ NN--CCHH--C-CH2-CH2-NH2 (XIII) C02H donde las funciones carboxilo y amino pueden ser protegidas, si so desea, por los métodos descritos entes y después, si os noceserio: i) seperar cualquier grupo protector; ii) convertir el producto en un ácido libro, sel o forma protegida del mismo. Ejemplos adecuados de agentes reductores útiles son los conplojos do hidruros netálicos cono, por ejemplo, NeBH., NaBH3CN, Zn(BH4)2, en nedios disolventes acuosos u orgánicos. Alternativamente, el conpuesto (XIII) puede ser reducido con un enzima adecuado en presencia de co-facteres adecuados o reducido empleando células completas tales como levaduras o células de higedo. Puede prepararse un compuesto de formule general (XIII) a partir de un compuesto de fórmula (VIII) o (IX) por condensación con un compuesto de fórmula (XII) empleen-do, por ejemplo, las condiciones básicas descritas antes. En otra via, puede prepararse un compuesto de fé muía (II) por delación de un compuesto de fórmula (XIV): OH t H02C-CH2CH2-NH-CH-CH-CH2-CH2-NH2 (XIV) C02H Los grupos funcionales en el compuesto (XIV) pueden ser protegidos como antes. Los grupos protectores adecuados incluyen los descritos antes para los compuestos de formule "general (III). Para la delación, el grupo carboxi^ lo dol radical propenilo y la función amina secundaria se dejan preferiblemente sin proteger. La delación del compuesto (XIV) puede realizarse empleando un agente deshidratante. Son adecuados los agentes corrientemente utilizados para la síntesis de péptidos. Por ejemplo puede utilizarse un reactivo de carbodiimida o una mezcla de trifenilfosfine y disulfuro de dipiridilo. Los reactivos de carbodiimida normalmente se utilizan en disolventes acuosos u orgánicos, do acuerdo con el reactivo particular utilizado. El reactivo de trifenilfosfina/disulfuro de dipiridilo se utilize ede cuedanente, por ejemplo, en un disolvente orgánico, habitual^ mente acetonitrilo. En lo anterior puede advertirse que puede prepara£ se un compuesto de fórmula (II) por delación de un compuesto de fórmula (XIV) o de un compuesto de formule (III) come el definido antes. Por consiguiente, este invención proporciona un procedimiento para la preparación de un compuesto de formule (II) o una sal o forma protegida del mismo: Á N-CH-CH-CH2-CH2-NH2 (II) C02H cuyo procedimiento consiste en dcler un compuesto de fórmula (XIVA) o une sel del mismo: OH t Z-CH-CH-CH2CH2NH2 (XIVA) COjH donde' Z es un grupo de formule H02CCH2CH2NH- o XCH2CH2CONH-dondo X es un grupo séllente; y donde cuelquier grupo reactivo puedo estar protegido; y después, si es necesario, efec tuer une o más do las siguientes etepes: i) separar cualquier grupo protector; ii) convertir el producto en un ácido libre, sal o forma protegida del mismo. Puede prepararse un compuesto do fórmula general (XIV) por reacción de 3-hidroxiornitina (V) con un compuesto do fórmula (XV): OH t H02C-CH-CH-CH2-CH2-NH2 CHj- H-CO^ H2 (V) (XV) Los grupos e-carboxilo y ¿-omino presentes en el compuesto (V) pueden estar protegidos, por ejemplo el grupo ¿-amine puede estar protegido con un grupo bencllexicarbonl-lo. El grupo carboxilo del compuesto (XV) puede estar en forma libro o en forma salina o en otro forme protegida. Un grupo protector edecuado serle, por ejemplo, un grupo és, ter. En estos casos, normalmente se utiliza el éster trl-cloroetilico. El grupo éster se sepere habitualmente después do la rßección empleando una mezcla de cinc/ácido acético/tetrahidrofurano. tanbién puede preperarse u? conpucste do formule IIT" por técnicas convencion les do preparación de B-lacta-mas. Por ejemplo, un compuesto do fórmula (XVI): OH i _-CH-C-NH-CH-CH- H,-CH,-NH, (XVI) puedo convertirse en un compuesto do fórmula (II) mediante un síntesis que utilize, por ejemplo, cloruro de fenilsulfe nilo seguido de hidróxido potásico on combinación con un ca talizador dß transferencia de foses. Esto procedimiento se lleve a cabo preferiblemente cono síntesis en "una vasija ".

En otro nétodo, puede hacerse reaccionar un conpuesto de fÓ muía (XVII) con un compuesto de fórmula general (V): -CH2- H2-NH2 (XVII) (V) a una temperatura inferior, por ejemplo, a -70°C, preferible, monto a -78°C, empleando prinero t-C.HgOCl y después, per ejenplo, nitrito de plata. Este procoso so realiza preferiblemente cono síntesis en una vasija. En anbos proceses, cualquier grupo fundonel no inplicado en les reacciones pue do estar protegido y, si so desea, posteriormente puede eliminarse el grupo protector. En la reacción anterior, cuendo es necesario o deseable, un grupo hidroxilo libre, cerboxilo o ani o del conpuesto do partida puede estar protegido durente las reacciones descrites con grupos protectores habituales en este camp Si se desea, los grupos protectores pueden ser eliminedos por los métodos conocidos habituales después de la preparación. Esta invención se extiende a los nuevos intermedios ya estén en forme libre o en une forma en la que uno o más grupos funcionales presentes estén en forme protegida. En lo que antecede se observa que esta invención proporciona un procedimiento pero la preparación de un compuesto de fórmula (II) o una sal o éster del mismo: C02H cuyo procedimiento consiste en treter un compuesto de fórmula (XVIII) o une sal del mismo: OH t Z1-NH-CH-CH-CH2-CH2-NH2 (XVIII) COjH donde los grupos funcionóles pueden ester protegidos y Z os H o CH2«CH-C0-, con reactives conocidos en este campe por su cepecidad do convertir el grupo z NH-, donde Z es el definido antes, en un redical B-lactama de fórmula: \ y después, si es neceserio o deseable, reelizer une o más de las siguientes etapas: i) separar cualquier grupo protector; ii) convertir el producto en un ácido libre, sel o forme protegido del mismo. Los conpuestos de fémulas (IV), (VIII), (IX), (X), (XI), (XI*), (XII), (XV), (XVI) y (XVII) son conpuestos conocidos o pueden ser preperados a partir de conpuestes conocidos por procedimientos conocidos o enálogos a los conocí :____> dos. El compuesto (II) también puede ser preparado por síntesis enzimática, por ejemplo una síntesis libre de células o por aislamiento a partir de une cepa adecuada de una especio de Streptomyces, por ejemplo S_. clavullqerus, S_. .u onjlnensls. ¿. Katsurahamanus, o S_. llpmanll. Adecuadamente, el aislamiento del compuesto (II) implica la disgregación del micelio y el aislamiento del compuesto (II) del contenido celular. Típicamente, el aislamiento del compues, to (II) en forma purificada implica procedimientos cromato- gráficos. Alternativamente, el compuesto (II) puede ser utilizado en forma impura o parcialmente purificada. Se entenderá que puede prepararse une sel de un compuesto de fórmula (II) por los métodos descritos antes donde se utiliza una sal de un compuesto do partida o un compuesto libre (II) preparado y posteriormente convertido -j& en una sal. Asimismo, si se desea, una sal del compuesto (II) preparada puede convertirse en el compuesto libre no salificado o en otra sal del compuesto (II). Las sales de los compuestos de formule (II) pueden ser producidas, por ejemplo, por tratamiento de un compuesto do fórmula (II) con el ácido o la base apropiados. Los compuestos de fórmula (II) y sus sales producidos per los procedimientos anteriores pueden ser recupera dos por métodos convencionales. ____> Los compuestos de fórmula, general (II) pueden ser preparados en pares dlastereoisoméricos de enantidmeros, si se desea, por ejemplo por cristalización fraccionada en un disolvente adecuado, v.g. metanol o acetato de etilo o une mezcla de ambos. El par de enantiómeros asi obtenido puede ser separado en estereoisómeros individuales por medios con vencioneles, por ejemplo empleando una sal ópticamente acti va como agente de resolución o por separación estereoselectiva de un grupo protector empleando un enzima adecuado, por ejemplo una esterasa tal como subtilisina. En mezclas do diastereoisomeros de fórmula (II), la relación de dlaste reoisomeros puede ser alterada por tratamiento con une base no nucleofllica, por ejemplo l,5-diazabiciclo( .3.0) non-5- eno. Compuestos ópticamente activos adecuados que pueden ser utilizados como agentes de resolución son los descritos en "Topics in Stereochemistry", Vol. 6, Wiley In-terscience, 1971, Allinger, N.L. y Eliel, W.L. , editores científicos. Alternativanente, cualquier enentiómero de un coopuesto de fórmula (II) puede ser obtenido por síntesis este-reoespeclfica empleando compuestos de pertide ópticamente u^ ros de configuración conocida. Esta invención también se extiendo a un compuesto de formule (II) o una sal del mismo para uso en la síntesis de ácido clavulánico. En otro aspecto de esta invención, se proporciona un procedimiento para la preperacidn de ácido clavulánico o una sal del mismo, cuyo procedimiento consiste en tratar un compuesto de fórmula (I) o una sal del nisno con un sistema enzimático. Tanbién este invención proporcione ácido claro lenice o una sal del mismo siempre que se haya preparado por dicho procedimiento'. Preferiblemente, el sistema enzimátice empleado deriva do un microorganismo, en especial una especie de Streetomyces. Adecuadamente, el proceso se lleva a cabo en un sisteme libre do células. Adecuadamente, la síntesis li bre do célules del ácido clavulánico consiste en tratar un compuesto do fórnula (I) o una sal del nisno con un extracto de una especio de Streptonycos. Adecuedanento, le especie de Streetpavees es una especie productora de ácido clavulánico. El extracte de une especie de Streptomyces conprejn de un sistena enzimático. El extracte libro do células es producido preferiblenente por sonificación u otro nétodo de dlsgregeclén de las células de Streptomyces y epclonalnente seperende después los residuos celulares y quedando el sis-tena enzinático en solución o suspensión. El sistena enzi-mático puede derivar de fuentes alternativas, por ejemplo, el o los enzinas pueden ser producidos adecuadanente por in genierie genética. Un sistena enzimático preferido derive de una especie productora de ácido clavulánico do Streptomyces cono, por ejenplo, cepas productores de ácido clavuláni-cß de S_. clavullgerua. S_. lumonllnenals y S. katurahananus o cepes derivedes de las mismas, por ejenplo copes nutan es. Son adecuadas en especial les siguientes cepos de estos microorganismos: S_. clavuliqerus ATCC 27064, S_. junonUnensis ATCC 29864 y S_. Katsurahamanus T-272. En lugar do emplear un sistema libre de células, el procedimiento enterler también puede operar utilizando un micreergeniamo intacto. Entonces el compuesto precursor dß fórmula (I) o una sal del mismo se pone en contacto con el microorgenis o pera producir ácido clavulánice o una sal del mismo. El microorganismo puede estar en forma de un cultivo en crecimiento, un cultivo en reposo, un micelio le vado, células inmovilizadas o protoplaßtes.

El sistene enzimático puede prepararse cultivando el microorganismo de forma convencionol, especialmente baje condiciones aerobias en un medio liquido o semisólido edecuado. En general, en el medie de cultive se incluyen fuentes de carbono y nitrógeno que pueda asimilar los micro organismos y las sales inorgánicas nutrientes normalmente utilizadas para promover el crecimiento do les micreßrgenis mes. Las condiciones de cultivo pueden ser uno temperatura comprendida entre 10°C y 80°C y un pH entre 3 y 10. Les condiciones preferidas son de 20°C a 30°C a un pH de 5 a 9, por ejemplo alrededor de 7, durante 0,5 a 5 días. El sisto ma ensimático puede ser aislado y utilizado en forma purifi cada, en forma parcialmente purificada, tal cono se obtiene en estado inpuro cono filtrado de una preparación de células disgregadas o cono honogeneizado crudo de células. Lo nás adecuado es purificar el sisteno ensimático por lo nenos parcialnente para elininar otros enzinas que podrían catalizar la destrucción del precursor (I), del enzina o ensinas o dal producto de reacción. El enzima o ensinas pueden ester fijados a un soporte insoluble. El procediniento se lleve a cabo en generel en me dios acuosos, nanteniendo la mezcla de reacción a un pH con prendido entre 4 y 9, más adecuadamente, por ejenplo, entre 6,5 y 8,5. El pH es adecuedanente controlado empleando ta pones convencionales conocidos en este campo. En una reali zacién, por ejemplo, se utiliza tampón de ácido 3-(N-morfo-lino) propanosulfónico (pH 7). La temperatura de la reecdón debe ser adecuada para el enzima empleedo y en general está comprendida entre 15*C y 40ßC, siendo preferiblemente alrededor do 30°C. El tiempo do reacción depende de factores teles como la concentración de las sustancias reeccienantes, la temperatura y el pH. Por ejemplo, un compuesto de formule (I) o una sal del mismo se disuelve edecuadamente en un tampón antes de mezclarlo con el sistema enzimático; la concentración dependerá de la solubilidad del compuesto de fórmula (I) o de su sal. Adecuadamente, la concentración de le solución de com puesto de fórmula (I) o de una sal del mismo, puede estar comprendida entre 5 % y 0,001 % en peso/volumen. Después de termi ede le reacción, el enzima puede ser separado de la mezcla de reacción y el ácido clavulánico o una sal del mismo puede ser aislado por métodos convencionales. La purificación inicial del ácido clavulánico o de una sal del nisno inplica convenientenente una etapa cromatográfica. En otra realización de este invención, se proporciona un procedíniento pera convertir un precursor de fórmula (II) o una sal dol mismo en ácido clavulánico o una sal del mismo, por tratamiento con un sistema enzimático como se ha descrito anteriormente. Adecuadamente la reección se lleve e cabo mediante una síntesis en ausencia de células, sin aislamiento intermedio del compuesto (I) o de sus sales. Alternativamente, la conversión del compuesto de fórmula (II) en ácido clavulánico se realiza directamente empleando un microorganismo intacto. Los siguientes ejemplos ilustran esta invención. Todos los porcentajes indicados aquí son en peso y todas laß relaciones son volumétricas. En los espectros de RMN H, los protones que se indican como "intercambiables" se intercambian con el deuterio al agitar con D-O. EJEMPLO 1 5-Azido-3-hidroxi-2-( oxoazetidin-1-il) valerato de bencilo. En atmósfera de nitrógeno seco, se agrega una solución de 3.28 g (15 mmoles) de 2-( 2-oxoazetidln-l-il) acetato de bencilo en 5 ml de tetrahidrofurano seco a 15 ml de une solución ÍM de bis( trlmetilsillDamiduro de litio en tetrehidrofurano que se ha enfriado a -70 C. La velßci dad de adición es tal que la temperatura de la solución ne pasa de -60°C y, una ves terminada la adición, la mezcla do reección se agita a -70°C durante 15 minutos. Se añade a la mezcla de reacción una solución de 18 mmoles de 3-azi-do propionaldehido en 50 ni de tetrehidrofurano mientras se mentiene la temperatura por debajo do -70 C. Después de agitar a -70°C durante 2 horas más, la mezcla se reacción se trata con una solución de 0,86 ml (15 mmoles) de ácido x¿ acético en 2 ml de agua y se deja que alcance la temperatu¬ • ra ambiente. El producto se extrae con acetato de etilo y se lava sucesivamente con agua, une solución saturada de bicar bonato sódico y agua antes de secarlo con sulfato magnésico y eveporarlo para der un aceite naranja. El aceite se cromatografía en gel de sílice (Merck Art. 9385), eluyende con acetato do etilo/hexano 2:1 para dar 2,72 g ( 36 %) de 5-asi- do-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il)valerato de bondlo como aceite amarillo pálido. La cromatografía en capa fina de este material en plece de gel de silice (Merck Art. 5719), eluyendo con una mezcla de diclorometano/acetato de etilo/etanol 60:10:1, indica que so trata de una mezcla do diestereoisómeros en la relación 1:2, R.0,44 y 0,40 respectivamente; visualización con vapores de yodo. x,máx(KBr> 3l07' 2100 v 1733 c -1» f J H(CDC13, 250 MHZ) 1,76 (lH, m) , 1,96 (1H, m) , 3.02 (2H, ), 3,32 (2H, m) , 3,49 (2H, m) , 4,03 (lH, d, J - 3.3 Hs), 4,28 (1H, m), 4,51 (lH, d, J - 5 Hz, intercambiable), 5,23 (2H, s), y 7,34 (5H, ß). EJEMPLO 2 Epimerización do 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxoazeti- din-l-il)valerato de bencilo. A una solución de 4,1 g (12,8 mmoles) de 5-azldo-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il)valßrate de bencilo, preparado como en el Ejemplo 1, en 400 ml de dlclorometano se agregan 1,86 g (14,9 mmoles) de l,5-diasabiciclo( 4.3.0) on-5-eno y la mezcla se agita a la temperatura ambiente duren-te 1 hora. Se separa el disolvente o presión reducida y la mitad del eceite residuel se cromatografía en une columna (45 x 4,5 cm) de gel de sílice (Merck Art. 9385) empleando une mésela de diclorometano, acétete de etilo y etanol 60:10:1 para dar 1,1 g del diasterßoisomero más rápido de 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il) valerato de bencilo en forma de aceite, que cristaliza al dejarlo en reposo, y 58 mg dß una mezcle de los diastereoisómeros más rápido y más lento en la relación 30:70 respectivamente, en forme de eceite. por cromatografía de la otra mitad de la mezcla de reacción bajo las mismas condiciones, se obtienen otras cantidades similares del diastereoisómero más rápido y de la mezcla de los dos diastereoisémeros. Una muestra del diastereoisómero más rápido se recristaliza en hexano para dar agujas blancas, p.f. 63-64°. >> (KBr) 3400, 3101, 1725, 1263, 752, 699 cm"1 mas ¿H(CDC13, 400 MHs) 1,7 (lH, ) , 1,84 ( lH , m) , 3.03 (2H, m), 3,35 (lH, m) , 3,43 ( lH , m) , 3,51 (2H, m) , 4,04 (lH, d, J - 3 Hs), 4,32 (2H, m) , 5,23 y 5,26 (2H, ABq, J - 12 Hz) y 7,37 (5H, s).

Análisis para Cl5HlflN40 : Encentrado : C, 56,63; H, 5,64; N, 17,50 % Calculado : C, 56,59; H, 5,70; N, 17,60 % El diastereoisomero lento dol 5-asido-3-hidroxi-2-(2- oxoazetidin-1-il) valerato de bßncile se obtiene en forma de aceite por cromatografía, utilizando el mismo sistema, de muestras que contienen una proporción do ese diastereoisómero. 5H(CHC13, 250 MHz) 1,78 (lH, m) , 1,97 (1H, a), 2,99 (2H, t, J - 4,5 Hs) , 3,33 (2H, m) , 3,5 ( 2H , m) , 4,04 (1H, d, J - 4,5 Hz), 4,27 ( lH , m) , 4,52 (lH, d, J . 5 Hz), 5,22 (2H, m) y 7,36 ( 5H , s). El diastereoisómero lento puede ser isomerizado a una mezcla de diastereoisómero más rápido y diastereoisóme ro más lento en la relación 3:1 respectivanante por tratamiento con 1,5-diezabiciclo (4.3.0) non-5-eno como se ha descrito antes. Los dos diastereoisómeros se ensayan fácilmente utilizando un sistema HPLC constituido por una columna de silice Spherisorb, eluyendo con una mezcla de acetonitrilo, ácido acético y diclorometano en las proporciones 8:0,1:91,9 y detectando con lus UV a 254 nm. EJEMPLO 3 Resolución del diastereoisómero rápido del 5-ezido 3-hidroxi-2-(2- oxoazetidiirl-il)valerato de bendle Se disuelven 300 mg (0,94 mmoles) de 5-azido-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valerato de bencilo en 5,5 ml de acetona y 25 ml de tampón de fosfato 0,1M y se agita a 37°C. se agregan 50 mg de Subtilisina Carlsberg (obtenida de Sigma Chemical Co. Ltd.) y la mezcla de reacción se mantiene a pH 7,6 con una solución de hidróxido sódico lN empleando un Metrohm pH Stat. Cuando ya no so está utilisendo más solución de hidróxido sódico, al cabo de unos 5 ho-r*» Y media, el pH de la solución se ajusta a 9,5 y la solo ción se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica se lava con agua y se seca con sulfato magnésico para dar 142 mg del éster no hidrolizado. La fracción acuosa se acidula a pH 3,0 empleando ácido clorhídrico diluido y se extrae con acetato de etilo para dar, después de secar con sulfato magnésico, 83 mg de ácido 5-azido-3-hidroxi-2-( 2-exoazeti-din-l-il)valérico como aceite inestable. Un» muestra del éster no hidrolizado se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (Merck Art. 9385) eapleendo acetato de etilo/hexano/etanol 40:60:2 como eluyente para dar el 5-azido-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-lDvalerato de benciló enantioméricamente puro. (a)20 + 31,8° (c - 2,0, CHClj) Espectro de RMN H idéntico al del compuesto de partida.

X - EJEMPLO 4 *y 5-Azide-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valerato de etilo Una solución de 3,45 g (13,8 mmoles) de 5-cloro- 3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il)valerato de etilo y 1,10 g (17 mmoles) de azida sódica en 20 ml de dimetilsulfóxido seco se agita entre 55° y 65°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluye con diclorometano y la capa orgánica se lava tres veces con agua antes de secarla con sulfato magnésico y evaporarla. El residuo se cromatografía en gel de sílice (Merck Art. 9385) , eluyendo con acetato de etilo/ hexano 2:1, para dar 2,59 g (rendimiento 73 %) de 5-azido- 3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valerato de etilo como acei te. amarillo pálido, por destilación bulbo a bulbo a 0,2 mm Hg entre 185 y 195°C se purifica el producto a un aceite in coloro. *max KBr) 3405* 2l02 ? 1733 cm"1 ÓH(CHC13, 250 MHS) 1,31 ( 3H , t, J - 7 Hz) , 1,81 (1H, m), 1,87 (1H, m) , 3,03 ( 2H , t, J - 3 Hz), 3.40 ( 2H , m) , 3,53 (2H, m), 4,00 ( lH , d, J - 3,5 Hz) , 4,25 ( 3H , m) , y 4,53 ( 1H , d , J - 4, 5 Hz, intercambiable) . Análisis para c ?oH 16N3°4; Encontrado : C , 46,93; H , 6,46; N , 21,83 % Calculado : C , 46 ,87 ; H , 6 ,29 ; N , 21 ,86 % EJEMPLO 5 Acido 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il) valérico Una solución de 0,77 g (3 mmoles) de 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il)valerate de etilo en 13 ml de tetrahidrofurano y 13 ni de agua se trata con una solución de 0,445 g (3,2 nnoles) de carbonato potásico en 2,5 ni de agua, de tel manera que el pH de la nescle de reacción no pasa de 11,5. Después de evaporar el disolvente, el produc to se oxtrae con etanol, se filtre y se cronetogrefla en gel de sílice (Merck Art. 9385) eluyendo con etanol para dar 396 ng dO un sólido blanco. Se disuelven 200 mg de este mat rial en agua y se pasan por una columna de resina cambiadora de ion IR 120 (H) pera dar 92 mg de ácido 5-azido-3-hidroxi-2-( -oxoazetidin-1-il)valérico en formo dß eceite que lentamente produce un sólido blanco. El compuesto se utilise sin purificarlo más. <fH((CD3)2S0 + 020) 1,69 (2H, m) , 2,89 (2H, t, J - 3 Hß?, 3,40 (4H, m), 3,89 (lH, m) , y 4,10 (lH, d, J - 6,6. Hs). EJEMPLO 6 5-Cloro-3-hidroxi-2-(2-oxoezetidin-l-il)valerate de etilo . En etmósfere de nitrógeno seco, se agrega una solu don de 8,45 g (54 mmoles) de 2-( 2-oxoezetldin-l-il) acetato 3> ¿fe. de etilo en 20 ml de tetrahidrofurano seco a 55 ml do una =»- solución ÍM de bis( trimetilsiliDamiduro de litio en tetrahidrofurano que se ha enfriado a -70*C. La velocidad de adición es tal que la temperatura de la solución no asciende por encima de -60°C y después de termineda la reacción, la mezcle se agita a -70°C durante 15 minutos. Se añade a la mezcla de reacción una solución do 65 mmoles de 3-cloro- propieneldehido en 90 ml de éter mientras se mantiene la temperatura por debajo do -60°C. Después de agitar a -70ßC durante 2 horas más, la mezcla de reacción se trata con una solución de 3,5 ml de ácido acético en 3 ml de agua y se de ja que alcance la temperatura ambiente. El producto se extrae con acétete de etilo y se lava sucesivamente con agua, solución saturada de bicarbóna to sódico y agua antes de secar con sulfate magnésico y eva porar para dar un aceite. El eceite se cromatografía en gel de sílice (Merck Art. 9385) eluyendo con acetato de etilo/ hexano 2:1 y produce 3,90 g (rendimiento 29 %) de 5-cloro- 3-hidrexi-2-( 2-oxoazetidin-l-ll)valerato de etilo en forma do aceite, con una recuperación del 5 % de 2-2( 2-exoazeti- din-l-il)acetato do etilo. El producto puede ser purificado más por destilación bulbo a bulbo a 0,3 mm Hg entre 170 y 180°C. * max(KBr 3383 y 1734 c""1 > £H(CDC13, 60 MHz) 1,31 (3H, t, J - 6 Hz) , 2,09 (2H, m), 3,03 (2H, m) , 3,39 (2H, m) , 3,70 (2H, m) y 4,25 (5H, m, un protón intercambiable). Análisis para C10H16C1N04 Encontrado : C, 48,5; H, 6,8; N, 5,7 % Calculado : C, 48,1; H, 6,5; N, 5,6 % EJEMPLO 7 Hidrocloruro do N -benciloxicarbonil-3-hidroxier- nitineto de bencilo A una solución agitada de 3,6 g (11 mnoles) do N- ( difenilmetilen) glicinato de bencilo en 15 ml de tetrahidro furano seco, en atmósfera de nitrógeno seco, enfriado a -70°C se egrege gota a gota a lo largo de 20 minutos 11 ml de una solución iMdß bis( trimetilsiliDamiduro de litio én THP, de manera que la temperatura de la mezcla de reección no asciende por encima de -60°C. La mezcla de reacción se agita a -60°C durante 20 minutos y después se agrega geta a gota una solución de 3 g (14,5 mnoles) de N-bendloxicarbo- nil-3-eminopropionaldehido en 15 ml de tetrahidrofurano seco, do nuevo manteniendo le temperatura por debajo dß -60 C. Después la mezcla de reacción se agita durante 7 minutos más a -70°C. La mezcla de reacción se deja calenter a -20°C y después se vierte en une mezcle bien agitada de 100.ml de éter y 100 ml de tampón de fosfato a pH 7,0. Se separa la capa etérea y la fase acuosa se extrae dos veces con 50 ml cada vez de éter. Los extractos orgánicos reunidos se lavan con agua, se secan con sulfato magnésico y se evaporan para dar 7,2 g de un aceite. El espectro de RMN H de este raate- 2 5 rial indica que se trata de N -dlfenilmetilen-N -benciloxi-carbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo sustancialmente pu ro. El conpuesto se disuelve en 25 ni de éter, se egregan ni de HCl 2N y la mezcla de reacción se agita fuertemente a la temperatura ambiente durante 2 horas. Se filtra la mez cía de reección para dar 2,4 g de una mezcla de diastereoisó meros de hidrocloruro de N -benciloxicarbonil-3-hidroxi-orni tinato de bencilo como sólido amarillo pálido. Por recrista, lización de una muestra de 300 mg de este material en etanol se obtienen 110 mg del diaestereoisomero menos soluble, p.f. 195-197°. »m|?(KBr) 3300, 1708, 1691, 1272 cm"1 <5'H((CD3)2 SO) 1,69, (2H, m) , 3,1 (2H, m) , 3,98 ( lH , m), 4,11 (1H, d, J - 2,5 Ha), 5,0 ( 2H , s) , 5,18 ( lH , d, J - 12,5 Hs), 5,28 (1H, d, J - 12,5 Hz) , 5,77 (lH, d, J - 5 Hz) , 7,36 (10H, a), 8,53 ( 3H , s ancho). Análisis para c20H25ClN2°5: Encontrado : C, 58,67; H, 5,96; N, 6,67; Cl, 8,76 Calculado : C, 58,74; H, 6,16; N, 6,85; Cl, 8,76 Por evaporación del etenol del filtrado y trituración del residuo con acetato de etilo se obtiene una nueve cantidad (100 mg) del dieestereoisomero menos soluble despué do filtrar. Por evaporación del filtrado se obtiene el diaestereoisomero más soluble de hidrocloruro de N -bencil-oxicarbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo en forma de gomo, ¿H((CD3)2SO) 1,67, (H, m), 3,14 (2H, m) , 4,10 (2H, m) , 4,99 (2H, s), 5,20 ( lH , d, J . 12,5 Hs) , 5.30 (lH, d, J « 12,5 Hs), 5,80 (lH, d, J - 5 Hs) , 7,38 (10H, m) , y 8,44 ( 3H , s ancho) , contaminado con una pequeña cantidad del diaste-reoisónero nenos soluble. Se recupera otra cantidad adicional de los diastereoisómeros mezclados a partir de la solución acida que queda después de la hidrólisis del N2-difenilmetilen-N5-bencil-oxicarbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo. La solución acida se separa de la fase etérea, se ajusta e pH 6,0 y se separo el agua por evaporación. Se agrega etanol a la goma residual y se evapora para dar 1,5 g de una goma. Por trituración de la goma con acetone, filtración del sólido y evo poración del filtrado acetónico, se obtienen 500 mg de una mésela do diastereoisómeros de hidrocloruro de N -benciloxi-carbonil-3-hidroxi-ornltlnato de bencilo en la que predomine el diastereoisómero más soluble. La separación de los diaß-terßoisómeros se realisa por trituración con aceteto de etilo. El rendimiento total de hidrocloruro de N -benciloxi-carbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo es 2,9 g (65 %) .

EJEMPLO 8 N2-B-Carboxietil)-N5-benciloxicarbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo Uno solución do 1,0 g (2,4 mmoles) de hidrocloruro do N -benclloxicarbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo que contiene aproximadamente 90 % del diastereoisómero me-nos soluble y aproximadamente 10 % del diestereoisómero más soluble, en 15 ml de agua, se agita con 150 ml do acetato de etilo y se ajusta a pH 7,75 con una solución dilolda do hidróxido sódico. Se separa la capo acuosa y so oxtroo tres veces con 100 ml cada ves de acetato de etilo. Las ca pas orgánicas reunidas se secan con sulfato magnésico y se eveporan para dar 0,57 g de N -benciloxicarbonil-3-hidroxl-ornitinato de bencilo cono aceite pardalnento cristalino. Se disuelven 430 ng (1,15 mmoles) de este material en 15 al de acetonitrilo destilado conteniendo 0,788 al (11,5 maoles) de ácido acrllico y se agita a la teaperotura aabiente duran te 3 días. El precipitado blanco resultante se separa por filtración y se lava con algunos mililitros de acetonitrilo pora dor 390 mg (76 %) do N2-(B-carboxietil)-N5-bendloxi-carbonll-3-hidroxi-ornitinato de bencllo, p.f. 153,5-154,5°C (acetonitrilo). M . (KBr) 3336, 1740, 1691, 1633, 1533, 750 y *H((CD3)2S0, 250 MHS) 1,45 (lH, m) , 1,73 (lH, m) , 2,31 (2H, t, J . 6,6 Hs), 2,56 (lH, a), 2,74 (lH, m) , 3,06 (3H, m), 3,37 (2H, s ancho), 3,63 ( 1H , m) , 5,00 (2H, s) , 5,12 (2H, s), 7,19 ( 1H , t, J - 5,3 Hz) y 7,35 (10H, m). Análisis para C23H28N2°7 Encontrado : C, 61,86; H, 6,18; N, 6,21 % MH* (B.A.R. p.i., tioglicßrol) , 445 Calculado : C, 62,15; H, 6,35; N, 6,30 % M, 444.

EJEMPLO 9 5-Benciloxicarbonilamino-3-hidroxi-2-( 2-oxoaseti-din-l-il)valerato de bencilo e Se calienta a reflujo una solución de 227 mg (0,51 mmoles) de N2-(B-carboxietil)-N5-benciloxicarbonil-3-hidroxi-ornitinato de bencilo en 50 ml de acetonitrilo destilado con 135 mg (0,61 mmoles) de disulfuro de 2,2*-dipiri-dilo recristalizado y 160 mg (0,61 mmoles) de trifenilfosfina, durante 8 hores, El ecetonitrilo se separa a vacío y el residuo so cromatografia en gel de silice (Merck Art. 9385) repetidas veces, empleando los siguientes disolventes como eluyentßs: éter/etanol 49:1, acetato de etilo/alcohol iso-propilico 19:1 y hexano/acetona/alcohol isopropilico 8:8:1, para dar 217 mg (64 %) del diaestßreoisomero lento del compuesto del titulo en formo do aceite, que cristaliza lentamente, p.f. 66-68° (acetato do etilo/hexano). R# 0,22 en cromatografía en capa fina, placas de ^ 9*1 de sílice (Merck. Art. 5719) eluyendo con diclorometa- "" no/acetato de etilo/etanol 60:10:1. O _.„(KBr) 1725, 742 y 698 cm"1 ÍH(CDC13, 250 MHZ) 1,85 ( 2H , m) , 2,98 ( 2H , t, J - 4,2 HZ), 3,40 (4H, m) , 4,09 ( lH , d, J - 3,3 Hz) , 4,17 ( lH , m), 4,69 (lH, d, J » 4,1 Hz) (intercambia con D20) , 5,10 (2H, s), 5,22 (3H, m) y 7,36 (10H, ) . Análisis para C23H26N2°7 Encontrado: C, 64,81; H, 6,12; N, 6,55 % MH+ (B.A.R. p.i., tioglicerol).427 Calculado : C, 64,77; H, 6,15; N, 6,57 % M, 426. EJEMPLO 10 Epimerización de 5-benciloxicarbonilamino-3-hi- droxi-2-(2-oxoazetidin-l-il) valerato de bencilo Se tratan 0,7 mg (1,6 µ moles) del diaßtereoisó- raero lento del compuesto del titulo, preparado como se des- f cribe en el Ejemplo 9, con 0,25 µl (2,0 µmoles) de 1,5-dia- sabidclo(4.3.0)non5-eno en 350 µl de diclorometano como en ol Ejemplo 2. El análisis e la mezcla de reacción el cabo de 90 minutos por cromatografía de líquidos a alta presión (columna: silice Spherisorb 5uM, eluyendo con acetato de ßtilo/hexßno/ácido acético 50:49*85:0,15; flujo, 1,5 ml/minuto; detección, UV a 254 nm) indica la conversión en une mésela de diastereoisómero más rápido (tiempo de retención 9,7 minutos) y el diastereoisómero más lento (tiempo de retención 11,1 minutos) en la relación 71:29 respectivamente. El diastereoisónero más rápido puede separarse de una mezcla de ambos diastereoisómeros por cromatografía en gel de sílice (Merck Art. 9385) eluyendo con dicloromotano/acetato de etilo/etanol 60:10:1. por cromatografía en capa fina, placas de sílice (Merck Art. 5719) , el diastereoisómero más rápido tiene una Rf de 0,25; el diastereoisómero lento tiene una R« de 0,22 en el mismo sistema disolvente. El diástereoisómefo más rápido presenta las siguientes propiedades espectrales: >)ma?(KBr) 1725, 1527, 752 y 698 cm"1 ¿H(CDC13, 260 MHz) 1,70 (2H, m) , 3,01 ( 2H , t, J -4 Hz) , 3,37 (4H, m) , 4,34 ( lH , d, J - 3 Hs) , 4,28 (lH, m) , 4,49 (lH, d, 8,4 Hz) , 5,10 ( 3H , m) , 5,21 ( 2H , m) y 7,35 (10H, m). EJEMPLO 11 5-ßenciloxicarboni 1amino-3-oxo-2-( 2-oxoezetidin-1-il)valerato de bencilo So disuelven 1.25 g (5,7 mmoles) de 2-(2-oxoaze-tidin-1-il) acetato de bencilo en 40 ml de tetrahidrofurano seco y se enfria a -60°C en atmósfera de nitrógeno seco. Se agregan gota a gota a lo largo de 10 minutos 6,27 ml de una solución 1,0M de bis( trimetilsiliDamiduro de litio en hexano y la mezcla se agita a -60°C durante 15 minutos más.

Se añaden en 15 minutos 2,41 g ( 10 mmoles) de cloruro do B-benciloxicarbonilamlnopropionilo en 10 ml de tetrahidrofurano seco y le mezcla se agita a -60 C durante dos horas y media más. Se añaden a la mezcla do reacción 0,5 ml de ácido acético y 400 ml de acetato de etilo y después so lava con 50 ml do agua, 50 ml de salmuera y 50 ml de solución satura da do bicarbonato sódico y se seca con sulfato magnésico. Se evapora el disolvent a temperatura baje a vacio y el producto crudo se purifica por cromatografía en columna empleando gel de sílice (Merck Art. 9385) y eluyendo con acetato de etilo para dar 0,415 g (17,1 %) de 5-benciloxicar-bonilamino-3-oxo-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valerato de bencllo en formo do goma. ^,m_-a__x„<KBr> 3382t 1760, 1719, 1522 y 1247 cm"1 ¿(CDC13, 250 MHz) 2,58 ( lH , t, J - 7 Hs), 2,9 ( 2H , m), 3,1 (1H, m), 3,4 (3H, m) , 4,0 ( lH , m) , 5,07 ( 2H , s) , 5,20 (2H, s) y 7,35 (10H, m) .

EJEMPLO 12 5-Benclloxicarbonilamino-3-hidroxi-2-(2-oxoaseti-din-l-il) valerato de bencilo Se tratan 6,9 mg (16 Rimóles) de 5-benciloxicarbonil amino-3-oxo-2-(2-oxoasetidin-l-il)valerato de bencilo en 1,5 ml de tetrahidrofurano con 2,2 mg (58 µmoles) de borohidruro sódico. Al cabo de una hora la mezcla de reacción k se analisa por cromatografía liquida a alta presión emplean do condiciones similares a las descritas en el Ejemplo 10. Lo mésela de reacción contiene el diastereoisómero rápido del compuesto del titulo y el diastereoisómero lento del compuesto del titulo en la relación 55:45 respectivamente, junto con compuesto de pertida que no ho reaccionado. EJEMPLO 13 Preparación de ácido 5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxo- asetidin-1-i1) valérico Se hidrogenan a la presión atmosférica 1,6 g (5 m los) de 5-azido-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin- -il)valerato de bencilo como mezcla de diastereoisómeros preparada en el Ejemplo 1, en 45 ml de etanol y 7 ml de agua con 900 mg de catalizador de peladlo al 5 % sobre carbón. Cuando no se ha absorbido más hidrógeno, se filtra la mésela de reacción y el filtrado se evapora para dar una goma. Por trituración con éter se obtiene un sólido que se separa por filtración y se seca a va o para dar una espuma friable. La espu •o so tritura con metanol pera dar un sólido blanco y una so lución do color amarillo pálido. El sólido se sopera por filtración y se seca para dar 29'4 mg del diastereoisómero menos soluble del compuesto del titulo cono polvo blanco, p.f. 152-153,5°C. jnax(KBr) 3422» 1709» 1637» 157ß» 1376» 1333' 1248 1228 y 1151 ce"1 & ¿H(D2°> 2S0 HHx » 1»93 (2H» m) * 3»03 (2H* t, J - 4 Hz) , 3,21 (2H, m), 3,55 (2H, m) , y 4,21 (2H, m) ; ¿(D20, 100 MHZ), 31,06, 36,23, 37,99, 41,03, 62,49, 69,54, 172,40 y 174,74. Análisis para CQH^N^.1/2H20: Encontrado : C, 45,85; H, 6,77; N, 12,94 % Calculado : C, 45,49; H, 7,16; N, 13,26 % La solución mßtenólica amarilla pálida se evapora para dar 574,2 mg de una mezcla del diasterßoisonoro nonos soluble descrito antes y el diastereoisonoro más soluble en forma de polvo. Experimento de correlación de resonancia magnética nuclear carbono-protón 20 WcííH)! 30,9, 1,90; 31,5, 1,84; 36,2, 2,95;.37,8, 3,15; 41,0, 3,44; 41,0, 3,56; 62,39, 4,18; 62,89, 4,13; 69,47, 4,16 y 69,47, 4,26. EJEMPLO 14 Preparación de ácido 5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxo- azetidin-1-il)valérico _¿_ P So hidrogenan 0,76 g (23,9 mmoles) del diastereoisómero rápido do 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il)- valerato do bencilo sobre catalizador de peladlo al 5 % sobre carbón en 20 ml de etanol y 5 ml de agua durante 1 hora. El catalizador so sopera por filtración y el filtrado se eva pora. La goma residual se tritura con éter para dar, después de filtrar, 456 mg (97 %) del compuesto del titulo como sólido amarillo pálido. Le impureza de color amarillo se separa por trituración con acetato de etilo. El compuesto del título (400 g) se purifica por cromatografía en columna de gel de sílice (Merck Art. 9385) empleando agua/etanol 15:85 como eluyente pera dar 290 mg del compuesto del titulo cono sólido blanco que contiene 1/7 equivalentes molares de etanol. ¿H(D20, 400 MHs) 1,16 (t, CH-jCH^H) , 1,84 ( 2H , m) , 3,00 (2H, t, J - 3,9 Hz), 3,15 ( 2H , ) , 3,50 (1H, m) , 3,58 (1H, m), 3,63 (q, CH3CH¿OH), 4,07 ( lH , d, J - 5,4 Hs) » 4,19 ( lH , m) . ¿^O), 100 MHZ), 31,66, 36,12, 37,61, 40,99, 63,19, 69,54, 174,79 y 174,97. Por recristalización de una muestra en metanol acuoso se Obtienen prismas blancos, p.f. 130-135°. l)max(KBr) 3349» 1723' 1653» 16U» 1390» 91ß y Análisis para CgH^HjO^HjO: Encontrado : C, 43,93; H, 7,40; N, 12,49 % Calculado : C, 43,63; H, 7,32; N, 12,72 % EJEMPLO 15 Acido 5-anino-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valérico a partir de 5-azido-3-hidroxi-2-( 2-oxoasetidin-l-11)valerato de bencilo enantioméricamente puro Se hidrogenan 140 mg de 5-azido-3-hidroxi-2-( 2-oxoasetidin-1-il) valerato de bencilo enantioméricamente puro, (a)20 * 31,8° (c - 2,0, CHClj) , obtenido por tratamiento dol diastereoisómero rápido con subtilisine Cerlsberg como se ha descrito en el Ejemplo 3, en 7 ml de etanol y 2 ml de agua con 75 mg de catalizador de peladlo al 5 % sobre carbón. Después de filtrar, la solución se evapora para dar un aceito que se disuelve en metanol, se filtra y el filtredo se evapora para dar 61 mg de ácido 5-amino—3-hidro __o xi-2-(2-oxoasetidin-l-il)valérico como sólido blanco (a)j: + 7,00 (c « 0,5 %, H20). El espectro de RMN H corresponde al del compuesto preparado en el Ejemplo 14.

EJEMPLO 16 v 2-l2-Oxo-(2-13C)azetidin-l-il)-(l,2-13C2) acetato de bencilo a) Sal tosilato de 1,2-13C2) glicinato de bencilo So calientan a reflujo 1,1 g (14,3 mnoles) de (1,2- C2)-glicina, 99,5 átomos por ciento de C en cada posición, en 7 ml (67,6 mmoles) de alcohol bencílico y 20 ml de tolueno con 3,1 g (16,3 mmoles) de ácido p-toluensulfónico empleando un aparato Dean-Stark durante 3,5 horas. So enfrie lo mezcla de reacción y se vierte en 150 ml de éter agitado. El sólido cristalino resultsnte se separa por filtración, se lava con 15 ml de éter y se seca para dar 4,51 g (93 % ) dß la sal tosilato de ( l,2-15C2)glicina-to de bencilo, p.f. 130-132°C (lit. compuesto sin mercar 132-134w) . max(KBr) 1707» 1223» 11B1 y 687 c""1 5H((CD3)2S0, 250 MHS) 2,30 ( 3H , s) , 3,90 (2H, dd, J . 144,8 y 6,5 Hz) , 5,25 (2H, d, J - 3,5 Hs) , 7,30 (4H, dd, J - 9,2 y 8,0 Hz), 7,40 (5H, m) y 8,25 (3H, s ancho). ¿c((CD3)2SO, 100 MHZ) 39,7 (d, J - 62,1 Hz) , 167,5 (d, J - 62,1 Hz). Se juzga que el material contiene 99,5 átomos por 13 ciento de C en las posiciones 1 y 2 en ol radical de glicina mediente el espectro de RMN C ; b) N-(3-bromo-( l-13C)propionil. -(1,2-13C2)glicinato de bencilo Se egitan fuertemente a 4°C 3,23 g (9,52 mmoles) de la sal tosilato *•de (1,2-13C.) glicinato de bencilo preparada como antes, en una mezcla de 15 ml de agua y 15 ml de tetrahidrofurano mientras se agrego gota a gota, a lo largo de 10 minutos, una solución de 1,64 g (9,51 mmoles, 91 átomos por ciento de C) de cloruro de 3-bromo-( 1- C) -propionilo, preparado por métodos comunes, en 5 ml de tetrahidrofurano. El pH de la mezcla de reacción se mentiene entre 5,5 y 6,5 con una solución diluida de hidróxido sódico durante le adición y durante 45 minutos más. La mezcla de reac cidn se diluye con 150 ml de aceteto de etilo, se separa la fase orgánica y se lava con salmuera saturada y se seca con sulfato magnésico, or evaporación de la solución seca se obtiene un sólido blanco que después de triturar con 30 ml dß hexano produce 2,7 g (94 %) de N-( 3-bromo-( l-13C)propio- nil)-(l,2-13C2)-glicinato de bencilo, p.f. 62,5-64,0°. )ma?(KBr) 3309, 1694, 1611, 1537, 755 y 701 cm"1 ¿H((CDCl3), 250 MHz) 2,83 (2H, m) , 3,63 ( 2H , ) , 4,13 (2H, dddd, J . 141,5, 7,9, 5,4 y 2,8 Hz) , 5.20 (2H, d, J - 3,2 Hz), 6,10 (1H, s ancho), y 7,36 (5H, s). ¿C(CDC13, 100 MHz) 41,5 (d, J - 61,6 Ha), 169,6 (dd, J - 61,8 y 2 Hz) y 169,7 (d, J - 2 Hs). Análisis para C^ C3H14N03B s Encontrado: C, 48,26; H, 4,65; N, 4,62 % M+, 302,0254 f Calculado: C, 48,53; H, 4,65; N, 4,62 %; M, 302,0259; c) 2-(2-Oxo-(2-13C)azetidin-l-il)(i;2 13C2)ace-tato de bencilo Se secan a vacío a 100°C durante 2 horas 1,05 g (18,7 mmoles) de hidróxido potásico en polvo y 0,78 g (2,4 mmoles) de bromuro de tetrabutilamonio, se enfria y se suspendo en 300 ml de una mezcla 19:1 de diclorometano y acetonitrilo. La mezcla se agita fuertemente y se sonifica a 30-40° y se agregan a lo largo de 5 horas 2,5 g (8,2 mpoles) de N-(3-bromo-(l-13C)?ropionil)-(l,2-13C2)glicinato de bencilo en 300 ml de diclorometano/acetonitrilo 19:1. Se agita la mezcla de reacción y se sonifica durante 15 minutos más, el material' insoluble se separa por filtración y el filtrado so evapora a sequedad. El aceite resultante se ex trae dos veces con 80 ml cada vez de éter y las capas etéreas reunidas se evaporan, or cromatografía del residuo en gel de sílice (Merck Art. 9385) con aceteto de etilo/hexano 1:1 se obtienen 0,84 g (33 %) del N-( 3-bromo-( 1-13C) -propionil)-( 1,2- C2) glicinato de bencilo de partida y 0,36 g (20 %) de 2-( 2-oxo-( 2-13C)azetidin-l-il)-( 1,2-13C2) acetato de bencilo en forma de aceite. >>,m.a___x<?Br> 1700» 742 y 700 c«~l ¿H(CDC13, 250 MHz) 3,04 ( 2H , dt, J - 6 y 4,1 Hz) , 3,43, (2H, m), 3,75 ( lH , m) , 4,31 (1H, m) , 5,18 (2H, d, J « 3,1 Hz) y 7,37 (5H, m) $C(CDC13, 100 MHz), 43,12 (dd, J - 62,1 y 0,9 Hz) , 167,84 ( ) y 168,1 (dd, J - 62,3 y 1,2 Hz). Encontrado: M* 222,0996, ? CJHJJNOJ requiere M, 222,0996. EJEMPLO 17 5-Asido-3-hldroxi-2-(2-oxo-(2-13C)azßtidln-l-lD-(1,2- C2)valerato de bencilo Se prepara el compuesto del titulo por reacción de 2-<2-oxo-(2-13C)azetidin-l-il)-(l,2-13C2)acetato de bencilo con 3-ezidopropionaldehido como se ha descrito en el Ejem pío 1, epimerización del producto resultante con 1,5-diaza-bidclo(4.3.0)non-5-eno como se ha descrito en el Ejemplo 2 y separación del diastereoisómero rápido por cromatografía. y separación del diastereoisómero rápido por cromatografía. La mezcla de diastereoisómeros rápido y lento recuperada de la columna cromatográfica se isomeriza para dar una cantidad adicional del diastereoisómero rápido puro del compuesto del titulo. Si rendimiento total del diastereoisómero rápido del compuesto del titulo es 36 %. ^-m»a„x<KBr 21°2, 1696, 1668, 761 y* 704 c "1 <$H(CDC13, 400 MHz) 1,71 ( lH , m) , 1,83,(1H, m) , 3,03 (2H, m), 3,34 ( lH , m) , 3,43 ( lH , m) , 3,51 ( 2H , m) , 3,87 (1/2H, m), 4,22 (1/2H, m) , 4,26 (lH, m) , 4,34 (lH, ) , 5,23 (2H, m) y 7,36 ( 5H , m) , ¿C(CDC13, 100 MHz) 63,4 (d, J . 61,3 Hz) , 168,1. (d, J m 61,2 Hz) y 169,3. Encontrado: M* 322 , 1506. C12 C H N O requiere M , 322 , 1508. EJEMPLO 18 Acido 5-amino-3-hidroxl-2-( 2-oxo-( 2-13C) azßtidin-l-il-(l,2-13C2)valérico El diastereoisómero rápido de 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxo(2-13C)azetidin-l-il)-(l,2-13C2)valeratd de bencilo se reduce con hidrógeno en presencia de paladio a} 5 % sobre carbón como en el Ejemplo 14, para dar el compuesto del ti tu lo como polvo higroscópico. \> „(KBr) 3424, 1678, 1544 y 1355 cm"1 M H(D20) » 250 Mz) , 1,85 ( 2H , m) , 3,0 ( 2H , m) , 3,15 (2H, ra), 3,55 ( 2H , m) , 3,80 (1/2H, m) , 4,19 ( lH , m) , y 4,34 (1/2H, m) $ c (D20, 100 MHz), 63,20 (d, J - 54 Hz) , 172,6 y 174,97 (d, J - 53 Hz). Encontrßdo: MH+ (B.A.R. p.i. tioglicerol) 206. C513C3H14N204 requiere: M 205. El grado de enriquecimiento en C, a juzgar por el espectro de RMN C es de 99,5 % en las posiciones 1 y 2 Sf del radical ácido valérico y un grado comparable en le posición 2 del radical azetidin-1-ilo. EJEMPLO 19 Preparación de medios de cultivo de Streptomyces clavuliger?s y Streptomyces llpmanll Los organismos utilizados para los experimentos descritos en los ejemplos fueron un reaislado de Streptomyces clavullqerus ATCC 27064, Streptomyces lipreanll NRRL 3584, 9 __í_? Streptomyces jumonjinensls ATCC 29864 y Streptomyces katsu- rahamanua T-272. Los cultivos pueden ser crecidos en medios sólidos o líquidos. Medio sólido El agar descrito a continuación es adecuado. Almidón hidrolizado (dextrina, Corn Products, Trafford Park, Manchester) 10 g KH2PO4 1 g MgS04.7H20 1 g NaCl 1 g CaC03 4 g (NH4)2S04 1 g Solución de elementos traza4, 1 ml Agar (Oxoid n° 3) 20 g Llevar ha 1 1 con agua desionizada. + Solución de elementos traza preparada como sigue: MnS04.H20 0,1 g ZnS04.7H20 0,1 g Llevar a 100 ml con agua desionizada. Medios líquidos Medios líquidos de cultivo adecuados son: Medio de siembra A Harina de soja (Ark'asoy 50, British Arkady Co. , Arkady Soya Mills, Oíd Trafford, Manchestßr) 20 g Almidón hidrollzado (dextrina,Corn Products) 10 g Trioleato de glicerilo ( Estol 1434 , Price' s Chemical Ltd. , Bebington, Wirral Merseyside) 5 ,0 g Llevar hasta 1 1 con agua corriente y ajustar a pH 7 ,0 con solución de NaOH.

Medio de siembra B Extracto de malta (oxoid Ltd., Basingstoke) , Han s 10 g Peptona bacteriológica (Oxoid Ltd) 10 g Glicerol 20 g Llevar hasta 1 1 con agua corriente y ajustar a pH 7,0. Medio de producción A Harina de soja (Arkasoy.50, British Arkady Co.) 25 g Almidón hidrolizado (dextrina, Corn Products) 50 - g KH2P04 0,7 g Glicerol 5,0 g Solución de elementos traza* 10 ml Llevar a l l con agua corriente y ajustar a pH 7.0 «Solución de elementtoa traza preparada como sigue: CaCl2.6H20 14,9 g MgCl2.6H20 10,0 g NaCl 10,0 g ZnCl2 0,5 g CaCl2 . 0,39 g MnS04.H20 0,38 g Llevar hasta 1 1 con agua destilada.

Medio de producción B • Almidón hidrolizado (dextrina, Corn Products) 20 g Harina de soja (Arkasoy 50, British Arkady Co.) 10 g Solubles de destilería (Scotaferm, Thos. Borth ick (Glasgow) Ltd., 60 Wellington Street, Glasgow) 0,1 g FeS04.7H20 0,1 g Llevar hasta 1 1 con agua desionizada y ajustar a pH 7,0. Medio de siembra y producción C F.

• Trioleato de gliceri lo ( E stol 1424 , Price' s Chemicals Ltd) 10 g Harina de soj a (Arkasoy 50 , Briti sh Arkady Co. ) 15 g KH2P04 1 ,0 g L levar hasta 1 1 con agua desionizada y ajustar a pH 7,0. Medio de siembra y producción D Harina de soja (Arkasoy 50, British Arkady Co.) 22,5 g KH2P04 1 , 0 g Trioleato de glicerilo (Estol 1424, Price's Chemical Ltd.) 15 ,0 g Almidón hidrolizado (dextrina, Corn Products) 8 ,0 g Llevar hasta 1 1 con agua desionizada y ajustar a pH 7,0.

EJEMPLO 20 Producción de células de ¿. clavuliqerus para disgregación Un matraz de siembra (50 ml de medio de siembra A en un matraz cónico de 250 ml) se inoculó con un aro de esporas de un cultivo en medio sólido de S. clavuliqerus y se agitó a 240 rpm durante 48 horas a 26°C. Después se transfirieron asépticamente partes alícuotas ( 1 ml) a matraces de producción (30 ml de medio de producción A en matraces cónicos de 250 ml) que se agitaron a 240 rpm durante 48 horas a 26°C. Después el contenido de los matraces se centrifugó a 15.000 x g durante 10 minutos a 4°C. El liquido sobrenadante se desechó y el sedimento micelial se resuspendió en agua fria (4°C) hasta su volumen original y después se centrifugó de nuevo a 15.000 x g d rante 10 minutos a 4 C. Se desechó el liquido sobrenadante y el sedimento micelial se utilizó para preparar el enzima como se describe en los ejemplos que siguen.

EJEMPLO 21 Preparación de homogeneizado crudo de células de S_. clavuliqerus por ultrasonificaclón El sedimento micelial, preparado como en el ejemplo 20, se resuspendió en Tampón de Tris(hidroximetil) amino-metano ("Tris") 50 nM, pH 7,0, a una concentración de 1,0 g de peso húmedo por 2,0 ml de tampón. Esta suspensión se dividió en partes alícuotas de 20 ml y el micelio se disgregó por ultrasonificación a 25 kHz (MSE Soniprep, Fisons pie, Crawley, Sussex, Reino Unido) empleando ráfagas de 4 x 10 segundos con intervalos de 10 segundos mientras se enfriaba en un baño de hielo/agua. EJEMPLO 22 Preparación de homogeneizado crudo de células de S_. clavullgerus por disgregación en X-Press En el cilindro de una máquina X-Press (AB Biox, Jarealla, Suecia) , que se había enfriado a -35°C, se introdujeron 6 g de peso húmedo de sedimento micelilar preparado como en el Ejemplo 20. Las células se disgregaron forzándolas dos veces a través del orificio de la X-Press por aplicación de una presión de 12 toneladas aproximadamente. Las células desintegradas se resuspendieron después en 12 ml de tampón Tris 50 M, pH 7,0.

EJEMPLO 23 Preparación de homo?eneizado crudo de células de S_. clavullqerus por molienda con alúmina En un mortero que se habla enfriado a 4 C se intro jeron 4 g (peso húmedo) de sedimento micelila, preparado como en el Ejemplo 20, y se molió con 1 g de alúmina. Las células disgregadas se resuspendieron en 8 ml de tampón Tris 50 mM pH 7,0.

EJEMPLO 24 Preparación de un extracto clarificado libre de células de ¿. clavuliqerus El homogeneizado crudo de células preperado como en los Ejemplos 21, 22, 23 o 24 se centrifugó a 38.000 x g durante 12,5 minutos a 4 C con objeto de seperar los residuos celulares sólidos. El liquido sobrenadante clarifica do se decantó y utilizó como extracto libre do células. EJEMPLO 25 Ensayo de la actividad dioxigenasa La actividad dioxigenasa se determinó rutinariamente en mezclas de reacción de 1 ml conteniendo 5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-10il) valerato 5 tm más sulfato ferroso 1 mM, o -cetoglutarato 5 mM y. la muestra de enzima en cuestión; Todos los reactivos se prepararon en tampdn de ácido 3-( N-morfolino) propanosulfónico (MOPS) 50 mM, pH 7,0. Las mezclas de reección se incubaron durante 10 minutos a 28 C con agitación y aireación. Las reacciones se interrumpieron por adición de un volumen igual de metanol enfriado con hielo y se centrifugaron durante 2 minutos a 16.000 x g. Se mezclaron partes alícuotas de 200 ¿il délos sobrenadantes con partes alícuotas de 100 ul del reactivo de imidazol (206 g de imidazol disuelto en 1 1 de agua y ajustado a pH 6,8 con ácido clorhídrico) y se dejó a la temperatura >_á* ambiente durante 30 minutos antes de inyectar en una columna de HPLC. Las condiciones de HPLC fueron las siguientes: Columna : µ Bondapak C.g (Millipore Waters, Harrow, Middlesex, Reino unido) Pase móvil : Tampón de fosfato sódico 0,1M pH 3,2 + 6 % de metanol Velocidad de flujo : 2 ml/minuto Longitud de onda de detección . : 313 nm. La reacción se siguió para determinar la producción del aducto de imidazol del compuesto I que tiene un tiempo de retención de 2,1 minutos. También puede utilizarse el sistema anterior HPLC de derivatización precolu na con imidazol para detectar ácido clavulánico (tiempo de retención a 5 minutos).

EJEMPLO 26 Producción de una muestra del enzima dioxigenasa parcialmente purificado a partir de _S. clavullgerus Se resuspendieron 125 g (peso húmedo) de sedimento micelial, producido coreo en el Ejemplo 20, en 250 ml de una solución acuosa de ácido etilendiaminotetraacético 1 pM a pH 7,0 y se ultrasonificaron como se ha descrito en el Ejemplo 21. La suspensión celular disgregada se centrifugó a 21.000 x g durante 15 minutos y se decantó el liquido sobrenadante. Se agregó sulfato de estreptomicina al sobre- nadante para dar una concentración final de 1 % en peso/vol men. El liquido sobrenadante se dejó sobre hielo durante 3 minutos y se centrifugó a 24.000 x g durante 20 minutos. Después se decantó el liquido sobrenadante y se llevó al 50 de la saturación por adición de sulfato amónico sólido. La suspensión se dejó sobre hielo durante 1 hora y se centrifugó de nuevo. El liquido sobrenadante se llevó al 80 % de la saturación con sulfato amónico sólido, se dejó sobre hielo durante 1 hora y se centrifugó a 24.000 x g durante 60 minu tos. El sedimento se resuspendid en 20 ml de tampón Tris 50 mM, pH 7,0, y se dializó durante la noche frente o 3 1 del mismo tampón. Después del material dializado se liofili zó. Como extracto liofilizado, el enzima dioxigenasa es estable durante varios meses a -20°C. La actividad especifica del enzima era 0,0173 unidades/mg de protelna. Una unidad es la cantidad de enzima que produce 1 mmol de compuesto I a pertir del compuesto II por minuto a 28°C y a pH 7,0. La actividad dioxigenasa se determinó empleando el método descrito en el ejemplo 25. EJEMPLO 27 Preparación de una muestra sustancialmente purificada del enzima dioxigenasa a partir de S_. clavullgerus En una columna (30 x 2,4 cm) de DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Suecia) , se introdujeron 250 mg del enzima liofilizado y parcialmente purificado, preparado como se describe en el Ejemplo 26, se lavó con 100 ml de tampón Tris 50 mM, pH 7,0, y se eluyó con un gradiente de 50 a 500 DM de tampón Tris, pH 7,0. Las fracciones dioxigenasa positivas se reunieron y llevaron al 80% de la saturación con sulfato amónico sólido. La suspensión se mantuvo sobre hielo durante 1 hora y se centrifugó a 24.000 x g durante 60 minutos. El precipitado se resuspendió en 1 ml de tampón Tris 50 mM, pH 7,0, más 0,5 ml de solución de saca rosa al 30 % (preparada en el mismo tampón) y se introdujo en une columna (63,5 x 3,5 cm) de Sephadex G75 superfina (Pharmacia) que se eluyó con tampón Tris 50 mM. Las fracciones dioxigenasa positivas se reunieron, se llevaron al 80% de la saturación con sulfato amónico sólido y el precipitado resultante se separó por centrifugación y se conservó a -20°C. En esta fase, el enzima dioxigenasa producía una so}a bínda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 48.000 dalton cuando se examinó por electrofore sis en gel dß poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. Se determinó el punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico y dio un valor de pl - 5,65. La actividad dioxigenasa se midió empleando el é-todo descrito en el Ejemplo 25. EJEMPLO 28 Aislamiento de ácido 5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxo-azetidin-1-il) valérico (compuesto II) a partir de Streptomyces clavullqerua Una vasija de fermentación de 300 1, provisto de un propulsor de discos de 21,6 cm (8,5), conteniendo 150 1 de medio de producción A (descrito en el Ejemplo 19) se ino culo con 1,5 1 de un cultivo de Streptomyces clavullqerus que había sido crecido durante 48 horas en medio de siembra A (descrito en el Ejemplo 19). La vasija se agitó a 570 rpm y se roció con 150 1 de aire estéril por minuto. La formación de espuma se controló mediante la presencia en el medio de 0,02 % del antiespumante Pluronic L81 (Blagden-Campbell Chemical Co. , croydon, Reino Unido). La vasija se mantuvo a 26°C durante 48 horas. Después el cultivo se enfrió a 5°C y las células se separaron por centrifugación continua. La pasta celular se resuspendió en 75 1 de agua a 1-5 C y las células se disgregaron pasándolas por una ho-mogeneizadora Manton-Gaulin (Modelo 15M-TBA, APV, Crawley, Sussex, Reino Unido) a una presión de 2,07-3,45 MPa (3000-5000 psi). El residuo celular se separó por centrifugación continua y el liquido sobrenadante se ultrafiltró empleando un mecanismo de ultrafiltración Alfa Laval UFS-5 conteniendo 10 a de membrana de polisulfona PM120 con un limite nominal de exclusión de pesos moleculares de 10.000 dalton. La fracción de bajo peso molecular se concentró por osmosis inversa a un volumen de 6 1 que se liofilizó para dar 474 g de sólidos (Lote 1) conteniendo el compuesto II (el compuesto I se analizó por conversión en el compuesto I utilizando una preparación .dioxigenasa y después midiendo la cantidad de compuesto I formada empleando el método HPLC de derivatización con imidazol en precolumna descrito en el Ejemplo 25. Como la conversión del compuesto II en compuesto I no era siempre cuantitativa, el ensayo se utilizó como guia cualitativa para seleccionar las fracciones que contenían el com puesto II). Se realizaron une segunda fermentación y aisla miento de forma idéntica para dar 544 g dß sólidos liofili-zados (Lote 2) conteniendo el compuesto II. Une parte de los sólidos llofilizadoß (166 g del Lote 1 más 334 g del Lote 2) se purificó en cinco partes alícuotas de 100 g, como sigue. Cada parte alícuota de 100 g se disolvió en 140 ml de agua, después se agregaron 140 ml de etanol y la suspensión se centrifugó a 10.000 g duran te 15 minutos. Se despreció el precipitado y el liquido so brenadante, conteniendo el compuesto II, se cromatografió en una columna de silice 60, malla n 230-400 (E. Merck, Darmßtadt, Alemania Occidental) de 18 x 19,5 cm, preparada en alcohol metilado industrial (AMI) y elulda con 85 % de AMI/15 % de agua a 45 ml/minuto. Las fracciones que contenían el compuesto II de las cinco operaciones se reunieron y se evaporaron en un evaporador rotatorio a sequedad para dar 66,5 g de ßólidos. Este peso se redujo a 25 g reproce-cesando el material de una columna de sílice 60 de tamaño similar como antes. Después la muestra se cromatografió do veces en una columna de Diaion HP20 SS (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japón), 8 x 50 cm, preparada en agu y eluida con agua a 7 ml/minuto. Se reunieron las fracciones que contenían el compuesto II, se evaporaron en un evaporador rotatorio a sequedad (10,0 g) , se redlsolvieron en 34 ml de agua y se introdujeron en una columna de Biogel P2 (Bio-Rad Laboratories, Watford, Hertfordshire, Reino Unido), 8 x 57,5 cm, preparada con agua. El compuesto se eluyó con ¡ agua a 5 ml/minuto. Se reunieron las fracciones que contenían el compuesto II se evaporaron en un evaporador rotatorio, para dar 5,25 g de sólidos. Estos se disolvieron en 6 ml de agua, después se agregaron 6 ml de etanol y la solución se introdujo en una columna de 5 x 21. cm de sílice 60 Merck (malla 230-400), preparada con 85 % de etanol/15 % de aqua a 2 ml/minuto. Después las fracciones positivas se re- ciclaron a través de una columna similar antes de la purifi-a_? cadón adicional de la muestra (2,15 g) por cromatografía en columna de Biogel P2, 2,7 x 117 cm, preparada en agua y eluida con agua a 0,8 ml/minuto. Se reunieron las fraccione del eluato que contenían el compuesto II y se evaporaron en un evaporador rotatorio hasta sequedad para dar 580 mg de una muestra de pureza 60-70 % a juzgar por la espectroscopia de RMN.

Una pequeña parte de esta muestra se purificó hasta homogeneidad por cromatografía de líquidos a alta presión empleando un sistema de fase inversa (columna Millipore Waters u-Bondapak CN, 3,9 mm x 30 cm, eluída con agua a 0,7 ml/minuto. La muestra (21,85 mg) se disolvió en agua a razón de 10 mg/ml y se inyectó en la columna en alícuotas de 15 µl. El pico principal (detección UV a 205 nm) se recogió como una fracción discreta, se concentró, después se recromatografió como antes y a continuación se evaporó en un evaporador rotatorio para dar 7,3 mg del compuesto II como sólido vitreo incoloro. ^ m-a.x KBr) 3400, 2900, 1720 y 1600 en"1, ¿H(D20, 250 MHz) 1,89 ( 2H , m) , 3,02 ( 2H , t ), 3,18 (2H, dt), 3,52 (1H, ra) , 3,60 ( lH , m) , 4,08 ( lH , d) , y 4,22 (1H, m). Encontrado: MH* ( B.A. R. p. i. ) 203, 1028. ( C8H 14N2°4) H* rß lul ßrß 203 , 1032. EJEMPLO 29 Conversión de ácido 5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxoaze-tidin-1-il) valérico (compuesto II) en ácido Z-( 2S,5S)-3-(B-a inoetiliden)-7-oxo-4-oxa-l-azablciclo( 3.2.0) heptan-2-car-boxilico (compuesto I) por extractos libres de células de la especie Streptonyces Se preparó un extracto libre de células deS.lipman NRRL 3584 como se ha descrito para'S. clavullqerus en el Ejemplo 21. Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 500 ul del extracto, 200 ul de tampón de ácido 3-( N-morfolino)propanosulfónico, 50 mM, pH 7,0, 100 ul de ßt»-cetoglu-tarato 10 M (preparado en el mismo tampón), 100 ul de PeS04 10 mM (preparado en agua) y 100 ul de una solución de 10 mg/ml de compuesto II (preparada como en el Ejemplo 13 pero sin separación de los diaestereoisomeros) . La mezcla de reacción se incubó durante 60 minutos a 28°C con airea-ción y agitación. Al Cabo de 60 minutos, el ensayo por HPLC de derivatización con iroidazol en precolumna (descrito en el ejemplo 25) indicó que se habla producido la delación del compuesto II en compuesto I. También se prepararon extractos de enzimas libres de células a partir de S_. * jumonjinensis ATCC 29864 y S_. katsurahamanus T-272 como se ha descrito para C. clavuliqerus en el ejemplo 21. Cada extracto se incubó con i -cetoglutarato 1 mM y sulfato ferroso 1 mM a 28 C en tampón MOPS 50 mM. Las mezclas de reacción se examinaron por HPLC, hallándose que el compuesto II endógeno en los extractos se habla convertido en el compuesto I a lo largo de un periodo de 1 hora. EJEMPLO 30 Conversión de ácido 5-amino-3-hidroxi-2-( 2-oxoaze-tidin-1-il) valérico (compuesto II) en ácido Z-( 2S,5S)-3-(B- ? aminoetilidtn)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo( 3.2.0)heptan-2-car- boxllico (compuesto I) mediante una preparación de ioxige- nasa parcialmente purificada a partir de Streptomyces cla- vullqerus Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 15 mg/ml de una preparación de dioxigenasa liofilizada (preparada como se describe en el ejemplo 26) , sulfato ferroso 1 mM,«(.-cetoglutarato 5 nM, compuesto II 5 mM (un diastereoisómero, preparado como en el Ejemplo 14) y ácido 3-(N-mor-f> folino)propanosulfónico 50 mM, a pH 7,0. La mezcla de reacción se agitó continuamente (para garantizar la transferencia adecuada de oxigeno atmosférico) a 28°C. Al cabo de 60 minutos se examinó la mezcla de reacción por el método de derivatización con imidazol en precolumna descrito en el ejemplo 25 y se halló que el 42 % del compuesto II (es decir, el 84 % del enantiómero con la estereoquímica natural) se habla convertido en el compuesto I.

# EJEMPLO 31 Conversión enzimática a gran escala de ácido 5- amino-3-hidroxi-2-( 2-oxoazetidin-l-il) valérico (cpmpuesto II) en ácido Z-( 2S,5S)-3-(B-aminoetiliden)-7-oxo-4-oxa-l- azabidclo ( 3.2.0)heptan-3-carboxllico (compuesto (I) y subsiguiente aislamiento por derivatización En el siguiente experimento, el hecho de que el compuesto II y el enzima dioxigenasa aparecen ambos en Streptomyces clavuliqerus se aprovechó disgregando las célu las de S_. clavuliqerus y permitiendo que el enzima endógeno convirtiera el compuesto II endógeno para dar el compuesto I. Los métodos de producción de las células desintegradas fueron esencialmente iguales a los descritos en el Ejemplo 28. Se centrifugeron 150 1 de un cultivo de 48 horas de Streptomyces clavuliqerus y el micelio se resuspendió en agua hasta 90 1 a 5°C. Después las células se disgregaron empleando una homogeneizadora Manton-Goulin que operaba a 2,07-3,45 MPa (3000-5000 psi). Se agregaron a-cetoglutara-to y sulfato ferroso a la suspensión de células desintegradas para dar una concentración final de 1 m la concentración del compuesto II en la mezcla era 16 ug/ml. La mezcla se agitó y roció con aire durante 30 minutos a pH 7,0 a 25 C. Después el residuo celular se separó por centrifugación y el liquido sobrenadante, que contenia el compuesto 1 , se sometió a ultrafiltración. El filtrado se concentró a 6,2 1 (conteniendo aproximadamente 600 mg de compuesto I) por osmosis inversa* Después el compuesto I se convirtió en el N -benciloxicarbonil (CBZ) derivado como sigue. Se agregaron al concentrado 6,2 \ de acetona, seguido de la adición de 600 ml de cloroformiato de bencilo al 50 % en acetona, a lo largo de 10 minutos, menteniendo el pH a 7,5-8,0 (5°C). La mezcla de reacción se mantuvo a ph 7,5 durante 30 minutos más y después se devolvió a pH 7,0. Se separó la acetona por evaporación en evaporador giratorio para dar 4,75 1 de concentrado. La solución se extrajo con 1/2 volúmenes y 1/4 vo lúmenes de acetato de etilo a pH 2,0, 5 C. Los extractos se reunieron y retroextrajeron en agua a pH 7,0, empleando la mitad y la cuarta parte del volumen de acetato de etilo. Los retroextractos reunidos se llevaron a 5 1 con agua y se adsorbieron en una columna cambiadora dß anión IRA (ciclo de acetato, 22 x 5 cm, velocidad do flujo 25 ml/minuto) y se desorbieron con NaCl lM. El producto se dosalifi-có por el procedimiento de extracción con acetato de etilo descrito antes. Por retroextracción acuosa seguida se liofilización se obtuvo el CBZ derivado crudo de I. una parte de este producto se convirtió en el éster bencílico como sigue. Se disolvieron 100 g de derivado liofilizado en 120 ml de dimetilformamida y se agregaron 60 ml de bromuro do bencllo. La mezcla de reacción se agitó durante 7 horas a lo temperatura ambiente y se dejó durante la noche a 5 C. Después so agregó 1 1 de acetato de etilo (5°C) y el precipitado resultante se separó por centrifugación. El líquido sobrenadante se evaporó en un evaporador giratorio hasta 300 ml y se lavó primero con 200 ml y después con 100 ml de NaCl 4M a pH 7,0. Mediante nueva evaporación en el evaporad rotatorio se obtuvieron 100 ml de un jarabe que se lavó con 200 ml de ciciohexano. El jarabe se introdujo en una colum na de sílice (Merck Silica Art. 7734), 9,5 x 17 cm, y se eluyó. con un gradiente de éter de petróleo/acetato de etilo de 6:1 a 1:1. El producto se identificó por TLC en silice, éter de petróleo/acetato de etilo 2:1, Rf 0,4, detectado como mancha roja empleando el reactivo pulverizador de trifeni1-tetrazolio descrito en el Ejemplo 33. Las fracciones positivas se reunieron y se evaporaron en un evaporador giratorio, dando 3,9 g de aceite. Este se introdujo en una columna de silice (Silica "S", malla 230-400, Reidel-de-Haen AG, seelze, Alemania Occidental) , 5 x 14 cm, velocidad de flujo 8 ml/minuto, y se eluyó con un gradiente de 2 a 5 % de etanol en clorofo-formo. Las frac ones positivas se evaporaron en un evaporador giratorio para dar 590 mg de una goma (pureza 20 % aproximadamente). Este producto se introdujo en una columna do Sephadex LH20 (Pharmacia, uppsala, Suecia) , 18 x 3 ca, velocidad de flujo 2 ml/minuto, eluyendo con cloroformo/ ciciohexano 1:1 para dar 230 mg (pureza aproximadamente 30%) que después se purificó en una columna de sílice (Silica "S", malla 230-400, 19 x 3,5 cm, velocidad de flujo 3 ml/ minuto), eluida con acetato de etilo al 5 % en cloroformo. El producto resultante era una muestra sustancialmente pura del éster N -CBZ bencílico del compuesto I (63 mg) . ?>m¿?(KBr) 3300, 1800, 1730 y 1690 c "1 ¿H(CDC13, 90 MHz) 2,98 ( lH , d, J . 16 Hz) , 3,42 (1H, dd, J - 16 y 3 Hz) , 3,81 ( 2H , t, J - 7 Hz) , 4,68 ( 2H , m), 5,0 (1H, s), 5,07 ( 2H , s) , 5,14 (2H, s) , 5,61 ( lH , d, J - 3Hz), 7,30 (10H, s). Ó*c(CdCl3, 63 MHz), 36,66 (C-6) , 46,33 (C-10), 60,47 (C-2), 66,71 (Ar-CH2) , 67,77 (Ar-CH2) , 87,93 (C-5) , 97,51 (C-9), 128,12 (aril-C), 128,40 (arll-C), 136,51 (aril C), 152,51 (C-3), 156,14 (CHjNHCO) , 166,87 (C-8) , 174,42 (C-7), MH+ (B.A.R.) 423,1561; (C23H24N2°6)H" re<?uißrß 423,1556. El éster N -CBZ bencílico del compuesto I produjo un efecto Cotton negativo con un mínimo a 243 nm en el espectro CD. Se desprotegieron 50 mg de este material como sigue. La muestra se disolvió en 15 ml de acetato de etilo/ etanol 70:30 y se agregó a 50 mg de catalizador de paladio al 10 % sobre carbón. La mezcla se hidrogenó a una presión de 1 atmósfera durante 15 minutos. El examen por TLC indicó que la desprotección era incompleta (Silica Merck Art. 5719), etanol/agua 90:10, Rf 0,2). Se separó el catalizador por filtración y se conservó, repitiéndose la hidrogena ción con catalizador limpio. Una vez terminada la reacción, g^ se agregd el primer lote de catalizador a la mezcla de reacción y la suspensión se evaporó en un evaporador rotatorio a sequedad. Se agregaron 20 m\ de agua para disolver el producto y el catalizador se separd por centrifugación. El producto acuoso se concentró a 1,5 ml. Este se cargó en una columna de Diaion HP20 SS (1,5 x 20 cm, velocidad de flujo 1,5 ml/minuto) y se eluyd con agua. Las fracciones positivas se identificaron por TLC y después se reunieron y liofi- lizaron para dar 5,7 mg del compuesto I. #~ V (DßX(KBr) 3430, 1780 y 1840 cm"1 ¿H(D20, 250 MHZ), 3,15 ( lH , d, J - 17 Hz) , 3,57 (lH, dd, J - 17 y 2,6 Hz) , 3,67 ( 2H , t, J - 7,5 Hz) , 4,84 (lH, dt, J » 7,5 y 1 Hz), 5,01 ( lH , d , J =» 1 Hz) , 5,77 ( lH , d, J - 2,6 Hz). EJEMPLO 32 Conversión enzimatica de ácido 3-hidroxi-5-araino- 2-(2-oxo(2-13C)azetidln-l-il)(l,2-13C2) valérico ((13C3)-* compuesto II) en ácido ( 2,7,8-13C3)-Z-( 25,5S)-3-(B-aminoet_i lidßn)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo( 3.2.0)heptan-2-carboxílico (( C3)-compueekto I) Se agregan 116,4 mg de ( C3)-compuesto II (preparado como en el Ejemplo 18) a una mezcla de reacción constituida por 1,74 g del enzima dioxigenasa liofilizado (prepa, rado como en el Ejemplo 26) disueltos en 97,5 ml de tampdn de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfdnico, pH 7,0, al que se agregaron 2,33 ml de solución de sulfato ferroso M y 11,64 ml de solución de a-cetoglutarato 50 mM. La mezcla de reac, ción se incubó a 28°C en un matraz cónico de 500 ml con agi tación continua para garantizar la transferencia adecuada de oxigeno atmosférico. Al cabo de 70 minutos, el ensayo HPLC de derivatización con imidazol en precolumna (descrito en el ejemplo 26) indicó que se hablan producido 55,2 mg de compuesto I (conversión del 95 % del enantidmero biológicamente activo). El ( C3)-compuesto I se separó del enantió mero Inactivo de ( C) -compuesto II por el método siguiente. El volumen de la mezcla de reacción se redujo a 17 ml por evaporación en un evaporador giratorio y se des-proteind por cromatografía en columna de Biogel P2 (Bio-Rad Laboratories) como sigue. La muestra se cargd en une colum na de Biogel P2 (5,2 x 13,5 cm, preparada en agua) y se elu yó a 4°C con agua a 1 ml/minuto. Se reunieron las fracciones que contenían el compuesto I, se evaporaron en un evapo rador rotatorio a sequedad, se disolvieron en 5 ml de agua y se cromatografiaron a 4°C en una columna de silice 60 Merck (3 x 16 cm, preparada en 85 % de etanol/15 % de agua) y se eluyó con el mismo disolvente a 0,6 ml/minuto. Se reu nieron las fracciones que contenían el compuesto I pero no el compuesto II y se evaporaron a sequedad. El análisis por RMN C de la muestra indicó que esencialmente la única espe 13 13 cié presente marcada con ( C3) era el ( C3) -compuesto i.

Todavía pudo detectarse una pequeña cantidad de ( C3)-com-puesto II pero la cantidad del enantidmero activo de ( 13C3) compuesto II presente solamente ascenderla al 0,5 % de la especie marcada total. El análisis de este producto por el método de derivatización con imidazol en precolumna HPLC indicó que contenia 18,5 mg de compuesto I. Se utilizó el siguiente método HPLC para detectar la presencia de compuesto II en fracciones de la columna: Columna : C.g µ Bondapak (Millipore Waters) Disolvente : Tampdn de fosfato sódico 0,1 pH 3,0 Velocidad de flujo : 1,5. ml/ninuto Longitud de onda de detección : 205 nm Bajo estas condiciones, el compuesto II presenta un tiempo de retención de 2,55 minutos. EJEMPLO 33 Conversión dß ácido ( 2,7,8-13C3)-Z-( 2S,5S)-3-(B-aminoetiliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo ( 3.2.0)heptan-2-carboxilico (( 13C3) -compuesto I) en ácido (2,7,8-13C3)cla-vulánico por células en crecimiento de Streptomyces clavull gerus Un matraz cónico de 250 ml conteniendo 30 ml de 19) se inoculó con un aro de é ___& £ medio D (Ejemplo esporas de S_. clavuliqerus. El matraz se agitó a 26°C durante 65 horas y después se transfirieron partes alícuotas de 1 ml a tres matraces más, conteniendo cada uno de ellos 30 ml de medio D. Al cabo de 31 horas de agitación a 26°C, el titulo de ácido clavulánico habla llegado a 129 ug/ml y se agregó a cada ma- traz 6,2 mg de ( 13C3)-compuesto I. Al cabo de 16,5 horas más de crecimiento, los cultivos se recogieron por centrifugación y el liquido sobrenadante se liofilizó. El titulo de ácido clavulánico del liquido sobrenadante era 354 ug/ml, me dido por el método de derivatización con imidazol en precolu na descrito en el ejemplo 25. Los sólidos liofilizados se suspendieron en 15 ml de dimetilformamida conteniendo 0,8 ml de bromuro de bencilo y se dejaron a la temperatura ambiente (unOs 20°C) durante 6,5 horas. El clavulanato de bencilo resultante se extrajo en acetato de etilo y se evaporó en un evaporador rotatorio para dar un aceite pardo. Este se introdujo en una columna do sílice (Silica "S" malla 230-400, Riedel-de Haen) (1,5 ca x 8,5 cm) preparada en ciciohexano/acetato de etilo 6:1 y eluida con un gradiente de ciclohexano/acetato de etilo 6:1 a 1:1. Las fracciones se examinaron para determinar la presencia de clavulanato de bencilo por TLC en silice (Merck Art. 5719) revelada en acetato de etilo/ciclohexano 2:1 y visualizada (mancha roja a RÍ? 0,6) con reactivo pulverizable de cloruro de trlfeniltetrazol ( 4 % de cloruro dß trifenil- tetrazolio en metanol diluido con un volumen igual de una solución acuosa de hidróxido sódico lM). Se reunieron las fracciones que contenían el clavulanato de bencilo y se eva poraron en un evaporador giratorio para dar una goma. Esta se introdujo en una columna de Sephadex LH20 (Pharmacia) (1,5 x 10 cm) preparada en ciclohexano/cloroformo 1:1 y eluida con el mismo disolvente. Se reunieron las fracciones que contenían clavulanato de bencilo y se evaporaron pa. }1 ra dar 14,2 mg de una goma incolora que se examinó por RMN C (100 MHz) y se calcularon los enriquecimientos atómicos porcentuales de ( C) con referencia a un espectro de abundancia natural. Se detectaron enriquecimientos signifi cativos en los carbonos 2, 7 y 8 solamente y la incorporación de cada marcador ( C) en el ácido clavulánico era igual a 4,3 % aproximadamente. Se detectaron acoplamientos spin-spin 13C-13C de largo alcance debido al enriquecimien- 'flft . to concomitante de carbonos 7, 2 y 8 indicando que los enla ces entre los carbonos 7, 2 y 8 habían permanecido intactos durante la incorporación. El análisis de RMN H se realizó sobre el clavulanato de bencilo marcado para asegurarse de que el marcador estaba en el ácido ciavulánico en lugar de ser debido a la contaminación por ( C.)-compuesto I o por un derivado del mismo. El espectro de RMN H a 400 MHz no mostró señales > que pudieran ser atribuidas a la presencia de una especie de 10-aminodesoxiclavulanato. Con objeto de corroborar por duplicado este punto, la muestra de clavulanato de ( c3)~ bencilo se convirtió en el éter 10-metilico por el método siguiente: Se disolvieron 8,5 mg (29 mmoles) de clavulana- to de (2,7,8 13C3) -bencilo en 3,5 ml de diclorometano y se trataron con 30 mg (250 mmoles) de sulfato magnésico (secado a 170°C durante 24 horas) y 23 mg (100 mmoles) de óxido de plata(I) (secados a 170°C durante 3,5 horas). La suspen | sidn resultante se agitó durante 3 días con 0,2 ml (3,2 mmoles) de yoduro de metilo a la temperatura ambiente y en la oscuridad. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y se cromatografió en gel de sílice (Merck Art. 9385) en acetato de etilo/hexano 1:2 para dar 4,2 mg (47 %) de 10-0-metil- clavulanato de bencilo *n forme de aceite. >)ma?(KBr) 1804, 1751, 1695, 743 y 699 cm"1 ¿H(CDC13, 250 MHz) 3,08 ( lH , dd, J - 16,7 y 0,5 Hs), 3,28 (3H, s), 3,49 (lH, dd, J - 2,8 y 16,8 Hz) , 4,00 (2H), m), 4,82 ( H , dt, J - 7,1 y 1,3 Hz) , 5,10 ( lH , d, 0,9 Hz), 5,20 (2H, s) , 5,70 ( lH , dd, J - 2,7 y 0,5 Hz) , y 7,37 (5H, m). C(CDC13, 100 MHz) 46,39, 57,74, 60,60 (dd, J - 67,4 y 2,0 Hz) , 60,61, 66,36, 67,85, 87,89, 97,66, 128,67, 134,70, 153,11, 166,91 (dd, J - 67,5 y 3,5 Hz) , 166,87 y 174,25 (ra). Encontrado M* + NH4, 321, ClgH17N05 + NH4* requi re 321. Se halló que unas muestras del éter metílico de 13 C3 clavulanato de bencilo y del éter metílico de clavulanato de bencilo no marcado tenían el mismo tiempo de retención (19,5 minutos) cuando se examinaron por cromatografía de gases. (Columna: capilar BPI de 25 m; gas portador*, heli ____ ^ programa de temperaturas: 2 minutos a 120°C y después aumen to de 8°C/minuto hasta 280 C). Los picos que eluian al tie po de retención del éter metílico de clavulanato de bencilo se examinaron por espectrometría de masas. Se acumularon los datos de exploraciones repetidas y se promediaron por ordenador. La comparación de los espectros de masas para las muestras marcada y no marcada mostró que el material ma cado contenia un 4 % de la especie triple marcada con ( C). 9 Asi, se confirmó que el (2,7,8- C3)-compuesto I se había convertido en ácido (2,7,8- C3)-clavulánico mediante las células en crecimiento de ¿. clavuliqerus. EJEMPLO 34 Conversión de ácido Z-( 2S,5S)-3-(B-aminoetiliden)- 7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo( 3.2.0)heptan-2-carboxllico (compues to I) en ácido clavulánico por extrecto parcialmente purifi-cado de enzima de S_. clavuliqerus. Se preparó un extracto clarificado libre de células de ¿. clavuliqerus como en los Ejemplos 21 y 24. Se agregó un 1 % en peso/volumen de sulfato de estreptomicina a 0°C y se dejó durante 1 hora. La suspensión se centrifugó a 35.000 x g durante 30 minutos a 4°C y el liquido sobre nadante se conservó. Se agregó sulfato amónico para dar una concentración del 80 % de la saturación y la suspensión se dejó durante 18 horas a 4°C. Se centrifugó la suspensión a 35.000 x g durante 1 hora a 4°C. Se desechó ei liquido sobrenadante y el sedimento se resuspendid en taapón "Tris" 50 onM, pH 7,0. La solución se dlalizd (membrana Visking, tamaño 1, Medicell International) durante dos periodos de 1 hora en el tampón anterior y después se liofilizó para dar el extracto de enzima parcialmente purificado en forma de polvo. Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 40 mg/ml del extracto enzimático anterior, compuesto I 1 mM, piruvato sódico 1 mM, 5-fosfato de piridoxal 1 mM, dinucled-tido-fosfato dß B-nicotinamida (forma reducida, 1 mM) , todos ellos disueltos en ácido 3-( N-morfolino) propanosulfónico 50 8M, pH, 7,0. La mezcla de reacción se incubó a 28 C durante 1 hora. Durante este periodo, el titulo de ácido clavulánico ascendió desde menos de 0,lj?g/ml hasta 0,6 /ig/ml. Se

Claims (8)

repitió la reacción anterior sustituyendo el glioxilato sódico o el a-cetobuti ato por piruvato sódico. En ambas oca siones, el título-4e ácido clavulánico ascendió desde menos de 0,1 ug/ml hasta 0,8 ug/ml. Los títulos de ácido clavulá nico se midieron utilizando el método HPLC de derivatización con imidazol en precolurana descrito en el Ejemplo 25. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama co o propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) o una sal o forma protegida del mismo: OH 1 1--CCHH--CCHH--CH2CH2-NH2 (II) C02H cuyo procedimiento se caracteriza en que consiste en hacer reaccionar un compuesto de fórmula (XIA): Y- H2CH2CHO (XIA) donde Y es halógeno o amino, estando el grupo amino opcionalmente protegido, con un compuesto de fórmula (XII) o una sal del mismo: N-CH2-C02H (??i) donde el grupo carboxi puede estar protegido y después, si es necesario, efectuar una o más de las siguientes etapas: i) convertir el grupo Y en un grupo amino, ii) convertir el producto en un ácido libre, sal o forma protegida del mismo.

2. un procedimiento según la reivindicación 1, p¿ ra la preparación de los siguientes compuestos: ácido 5-amino-3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il) valérico, ácido 5-benciloxicarbonilamino-3-hidtoxi-2-( 2- oxoazetidin-1-il)valérico, 5-benclloxicarbonilamino-3-hidroxi-2-(2-oxoazeti- din-l-il) valerato de bencilo y 5-azido-3-hidroxi-2-(2-oxoazetidin-l-il)valerato de bencilo.

3. Un procedimiento para la preparación do un compuesto de fórmula (II) o una sal o forma protegida del mismo.

OH -CH--??HH-- H2- H2- H2 (II) C02H cuyo procedimiento caracterizado porque consiste en reducir un compuesto de fórmula (XIII) o una sal del mismo: donde las funciones carboxilo y amino pueden estar protegidas, y después, si es necesario, efectuar una o más de las siguientes etapas: i) separar cualquier grupo protector, ii) convertir el producto en un ácido libre, sol o forma protegida del mismo. 4. un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) o una sal o forma protegida del mismo: cuyo procedimiento caracterizado porque consiste en ciclar un compuesto de fórmula (XIVA) o una sal del mismo: OH t ,Z-CH-CH-CH2CH2NH2 (XIVA) C02H donde Z es un grupo de fórmula HOgCCHgCHgNH- o XCHjCHjCONH-donde X es un grupo saliente y donde cualquier grupo reac i vo puede estar protegido y después, si es necesario, efec-tuar una o más de las siguientes etapas: i) separar cualquier grupo protector, ii) convertir el producto en un ácido libre, sal o forma protegida del mismo.

5. un procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (II) o una sol del mismo: cuyo procedimiento se caracteriza en que consiste en tratar un compuesto de fórmula (XVIII) o una sal del mismo: OH Z1-NHCH-CH-CH2-CH2-NH2 (XVIII) C02H donde los grupos funcionales pueden estar protegidos o enmascarados y Z es U o CH--CH-C0-, con reactivos conocidos por ser capaces de convertir el grupo Z NH- donde Z es el definido antes en un radical de B-lactama de fórmula: y después, si es necesario o se desea, efectuar una o más de las siguientes etapas: i) separar cualquier grupo protector, ii) convertir el producto en un ácido libre, sal o forma protegida del mismo.

6. Un procedimiento para la preparación de ácid clav?lánico o una sal del mismo; dicho procedimiento se caracteriza en que consiste en tratar una amina de fórmula (I o una sal de la ism » con un sistema enzimático capaz de convertir la amina en ácido clav?lánico o una sal del mismo, y después opcionalmente, si es necesario, convertir el producto en un ácido libre o sal.

7. Compuesto caracterizado porque tiene la fórmu (II) o una sal, o bien una forma protegida del mismo. OB ?— -CH-CH-CB2- B2- H2 5 co2e

8. Compuesto de conformidad con la reivindicaci 7 , caracterizado porque se selecciona de los siguientes co puestos: ácido 5-amino-3-hidroxi-2- (2-oxoazet idin-1 - i 1 ) val rico; el ácido 5-benci loxicarboni 1 amido-3-hidroxi-2- (2-ox azetidin-1 -i 1 ) valérico; el 5-benci loxicarboni lamino-3-hidrox 2-(2-oxoazetidin-1-i 1 ) valerato de bencilo y el 5-azido-3-h droxi -2-(2-oxoazetidin-1 -i 1 ) valerato de bencilo. En testimonio de lo cual firmo la presente esta Ciudad de México, D.F., el 22 de enero de 1987. Apoderado. GG*gc .