MXPA06008408A - Compuestos para union al factor de crecimiento unidos a un calixareno. - Google Patents

Abstract

Se describen los compuestos para union al factor de crecimiento que tienen una pluralidad de grupos aciclicos de acido isoftalico unidos a una estructura base organica no peptidica y composiciones farmaceuticas de los mismos; tambien se ensenan los metodos de administracion y el uso de los compuestos para union al factor de crecimiento o las composiciones para union al factor de crecimiento, estos compuestos novedosos para union al factor de crecimiento son utiles para el tratamiento de la angiogenesis, proliferacion celular del exceso, crecimiento tumoral, y una combinacion de los mismos asi como la inhibicion de la union del factor de crecimiento a las celulas y la fosforilacion.

Description

COMPUESTOS PARA UNION AL FACTOR DE CRECIMIENTO UNIDOS A UN CALIXARENO REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama beneficio de la solicitud provisional de los E.U.A. número de serie 60/539,613, presentada el 27 de enero de 2004, la cual se incorpora en la presente invención como referencia en su totalidad, incluyendo cualesquiera figuras, cuadros, secuencias de ácidos nucleicos, secuencias de aminoácidos, y dibujos. La presente invención se realizó con apoyo gubernamental bajo un proyecto de investigación apoyado por the National Institute of Health/National Cáncer Institute apoyo económico No. CA78038. El gobierno federal puede tener ciertos derechos en esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La capacidad de los tumores para crecer más allá de unos pocos milímetros cúbicos en volumen depende de la formación de nuevos vasos sanguíneos dentro del microambiente de los tumores (Ferrara, N. Nat Rev Cáncer, 2002, 2: 795-803; Kerbel, R. S. Carcinogenesis, 2000, 21 : 505-15; Carmeliet, P. y Jain, R. K. Nature, 2000, 407: 249-57; Yancopoulos, G. D. et al. Nature, 2000, 407: 242-8). Este proceso angiogénico se activa por varios factores de crecimiento clave que se secretan por el tumor. Los factores de crecimiento no solamente se unen a sus receptores en las células endoteliales y estimulan su proliferación iniciando la formación de nuevos vasos sanguíneos, sino que también se unen a los receptores en células accesorias tales como pericitos que mantienen la integridad de los vasos sanguíneos (Ferrara, N. Nat Rev Cáncer, 2002, 2: 795-803; Kerbel, R. S. Carcinogenesis, 2000, 21 : 505-15; Carmeliet, P. y Jain, R. K. Nature, 2000, 407: 249-57; Yancopoulos, G. D. et al. Nature, 2000, 407: 242-8; Helmlinger, G., et al. Nat Med, 1997, 3: 177-82; Holash, J. et al. Science, 1999, 284: 1994-8). Entre los factores de crecimiento más estudiados están el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Varios estudios han demostrado la participación de estos dos factores de crecimiento en el proceso angiogénico con el VEGF desempeñando un papel clave principalmente en el inicio de la formación de nuevos vasos sanguíneos y PDGF siendo partícipe en el mantenimiento de estos vasos sanguíneos (Bergers, G. et al. J Clin Invest, 2003, 111 : 1287-95; Dvorak, H. F. J Clin Oncol, 2002, 20: 4368-80; Ferrara, N. Curr Top Microbiol Immunol, 1999, 237: 1-30; Dvorak, H. F. et al. Curr Top Microbiol Immunol, 1999, 237: 97-132; Eriksson, U. y Alitalo, K. Curr Top Microbiol Immunol, 1999, 237: 41-57). Esta observación impulsó un interés en el diseño de estrategias para suprimir las funciones de VEGF y PDGF, con el objetivo final de inhibir la angiogénesis y matar a los tumores por falta de alimento. Los métodos que han sido considerados se basan en el la modificación específica de los pasos bioquímicos en el mecanismo de acción de estos factores de crecimiento. Estos incluyen la inhibición de la unión de VEGF y PDGF a sus receptores respectivos mediante el uso de anticuerpos en contra de los factores de crecimiento. Uno de estos, AVASTIN, el cual tiene como objetivo al VEGF, como recientemente se ha probado para uso clínico en pacientes con cáncer colorectal metastásico (Zhang, W. et al. Angiogenesis, 2002, 5: 35-44; Ferrara, N. Semin Oncol, 2002, 29: 10-4). Otro método ha incluido el desarrollo de inhibidores de las actividades tirosina cinasa de los receptores PDGF y VEGF, resultando en la supresión de las rutas para transducción de la señal cascada abajo activadas por estos factores de crecimiento (Kerbel, R. S. Carcinogenesis, 2000, 21 : 505-15; Jain, R. K. Semin Oncol, 2002, 29: 3-9; Morin, M. J. Oncogene, 2000, 19: 6574-83; Miao, R. Q. et al. Blood, 2002, 100: 3245-52; Laird, A. D. et al. Cáncer Res, 2000, 60: 4152-60; Wedge, S. R. et al. Cáncer Res, 2000, 60: 970-5). La mayoría de estos agentes imitan la estructura del ATP y algunos son agentes antitumorales potentes que actualmente se encuentran en ensayos clínicos. No obstante, ninguno ha sido aprobado aún por la FDA. La aprobación por la FDA del AVASTIN (bevacizumab), el cual incrementa en 5 meses la supervivencia media de pacientes con cáncer colorectal metastásico, valida adicionalmente los procesos angiogénicos señalados como una estrategia para tratar el cáncer (Ferrara, N. Semin Oncol, 2002, 29: 10-4). No obstante, se tiene que realizar mucho más para explotar completamente este método. Por ejemplo, en otros ensayos clínicos, el AVASTIN no pudo prolongar la vida de pacientes con cáncer metastásico de mama. Una explicación posible para esta actividad inconsistente es que el cáncer avanzado metastásico de mama puede evitar la terapia para angiogénesis anti-VEGF por medio de otros factores de crecimiento. De hecho el apoyo para esta sugerencia proviene de estudios preclínicos que muestran que el cáncer temprano de mama secreta principalmente VEGF mientras que el cáncer avanzado de mama secreta factores de crecimiento adicionales (Relf, M. eí al. Cáncer Res, 1997, 57: 963-9). Además, en un modelo de cáncer pancreático animal, SU5416, un inhibidor del receptor tirosina cinasa de VEGF que suprime el desarrollo de tumores pancreáticos tempranos, pero no tardíos. De manera más importante en el mismo modelo, el tratamiento con SU6668 (el cual inhibe tanto a las receptor tirosina cinasas de VEGF como del receptor de PDGF) indujo la regresión del tumor pancreático avanzado en la etapa tardía del desarrollo (Bergers, G. et ai. J Clin invest, 2003, 111 : 1287-95) sugiriendo que la falla de la terapia anti-VEGF se puede deber a su capacidad para inhibir solamente el inicio pero no el mantenimiento de los vasos sanguíneos. El apoyo adicional para esta sugerencia proviene de un estudio muy reciente en donde el AVASTIN inhibió la formación de vasos sanguíneos nuevos pero no fue efectivo para inhibir a los vasos sanguíneos ya establecidos en un modelo animal en donde las células de neuroblastoma se transplantaron dentro de los ríñones de ratón (Huang, J. et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2003, 100: 7785-90). Tomándolos juntos, el entendimiento actual del proceso de angiogénesis sugiere que la modificación específica simultánea de factores de crecimiento que inician (por ejemplo, VEGF) así como aquellos que mantienen los vasos sanguíneos (por ejemplo, PDGF) puede ser un método más efectivo para la terapia del cáncer que aquellas que se dirigen solamente a un factor de crecimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de ¡a presente invención diseñar una familia de compuestos que se une a VEGF y/o PDGF e inhibir la unión de estos factores de crecimiento a sus receptores respectivos de superficie celular. Por ejemplo, se encontró que el compuesto GFB204, era un inhibidor potente y selectivo de la estimulación por VEGF y PDGF de su fosforilación del receptor tirosina cinasa y señalización (Erk1/2, Akt y STAT3). Este agente farmacológico también inhibió de manera potente ia migración de ia céluia endotelial y ia formación de la red capilar in vitro así como en la formación de vasos sanguíneos in vivo y el crecimiento tumoral en humano en xenoinjertos de ratón desnudo. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer composiciones farmacéuticas de la familia de los compuestos anteriormente referidas y los métodos de administración de las mismas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 C muestran que GFB204 inhibe la unión de 125l- VEGF y 125I-PDGF pero no de 125l- EGF a sus receptores en los fibroblastos de ratón. Las células Flk-1/NIH 3T3, NIH 3T3 y EGFR/NIH 3T3 se incubaron con 125I-VEGF, 125I-PDGF y 125I-EGF (50,000 cpm/pozo) respectivamente, junto con concentraciones en incremento de GFB204. Las células se incubaron a 4°C por 0.5 horas, luego se lavaron tres veces con PBS y tres veces con regulador de pH para lisis antes de la determinación de las cuentas de 125l como se describe bajo el enunciado de materiales y métodos. Un exceso de VEGF, PDGF, y EGF frío se utilizó para obtener niveles de unión no específicos. Las figuras 1A-1 C muestran la unión específica (% de control) para PDGFR, Flk-1 , y EGFR, respectivamente. Las figuras 1 D y 1 E ilustran que GFB-204 se une al PDGF y al VEGF como se indica por ei factor de crecimiento triptofano cuando se añadieron cantidades en incremento de GFB204 al PDGF y al VEGF, respectivamente. La fluorescencia se monitoreó mediante la excitación a 295 nm y 228 nm, respectivamente, y emisión a 334 nm. Las figuras 2A y 2B muestran el efecto de GFB204 sobre la fosforilación de Erk1, Erk2, Akt, y STAT3 estimulada por el factor de crecimiento. GFB204 inhibe la estimulación por VEGF y PDGF de la fosforilación de Flk-1 tirosina y la fosforilación de Erk1/Erk2 (figura 2A). Las células NIH 3T3 o las células Flk-1/NIH 3T3 se trataron con concentraciones en incremento de GFB204 por 5 minutos antes de la estimulación con PDGFBB (10 ng/ml) o VEGF (50 ng/ml), respectivamente, por 10 minutos. Luego las células se usaron y se procesaron para Western blot en SDS-PAGE con un anticuerpo específico para fosfotirosina-Flk-1 o anti-fosfotirosina para fosforilación de PDGFR tirosina o fosfo-Erk1/2. GFB204 afecta sobre la fosforilación de Erk1 , Erk2, Akt y STAT3 estimulada por el factor de crecimiento (figura 2B). Las células NIH 3T3, Flk-1/NIH 3T3, IGF-1R/NIH 3T3 o EGFR/NIH 3T3 se trataron con GFB204 (10 µM) antes de la estimulación con PDGF (NIH 3T3) VEGF (Flk-1/NIH 3T3), EGF(EGFR/NIH 3T3), bFGF (NIH 3T3) o IGF-1 (IGF-1 R/NIH 3T3). Luego se cosecharon las células y se procesaron para Western blot en SDS-PAGE con anticuerpos específicos para fosfo-Erk1/2, fosfo-Akt y fosfo-STAT3. Las figuras 3A-3C muestran los efectos de GFB204 sobre la angiogénesis in vitro. GFB204 inhibe la formación de la red capilar de manera dosis-respuesta (figura 3C). Las células endoteliales de la arteria cerebral media de humano (5x104) se sembraron sobre Matrigel y las células se incubaron con VEGF en la presencia (figura 3B) o ausencia (figura 3A) de GFB204 como se describe bajo el título de materiales y métodos. Las figuras 4A-4C ilustran que GFB204 inhibe potencialmente la migración de la célula endotelial del cerebro de humano dependiente de VEGF in vitro. La migración de las células endoteliales del cerebro de humano de adulto se evaluó utilizando un ensayo modificado de cámara de Boyden como se describe en el título de materiales y métodos. Se añadió el vehículo control (figura 4A) o GFB204 (figura 4B) a medio que contenía FBS al 2% en la cámara externa, y el número de células que han migrado hacia la cámara inferior que contiene VEGF se determinó después de una incubación de 18 horas (figura 4C). La figura 5 ilustra que GFB204 inhibe el crecimiento de xenoinjertos A-549 en ratones desnudos (figura 5). Las células A-549 se implantaron dentro de los flancos de ratones desnudos y cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de aproximadamente 100 mm3, los ratones de dividieron al azar y se trataron ya sea con el vehículo (* ) o con GFB204 a 1 mg/kg (a) y 5 mg/kg (»), y los tamaños tumorales se midieron como se describe bajo el título de materiales y métodos. Los tumores se procesaron dos horas después de la última inyección i. p. para tinción con CD31 IHC como se describe bajo el título de materiales y métodos. Las figuras 6A-6B ¡Ilustran la tinción con CD31 IHC como se describe bajo el título de materiales y métodos para los tumores procesados dos horas después de la última inyección i. p. para un control (figura 6A) y GFB204 (figura 6B). La cuantificación de la densidad de microvasos sanguíneos (400X) se determinó como se describe bajo el título de materiales y métodos. SE, error estándar. Las figuras 6A y 6B cuenta de microvasos sanguíneos; figura 6A = 11.3 ± 1.9; figura 6B = 2.6 ± 0.9.

Materiales y métodos Inhibición de la fosforilación del receptor de tirosina dependiente del factor de crecimiento por GFBs. Las células NIH 3T3 expuestas a privación de nutrientes que sobre-expresan Flk-1 /KDR (Flk-1 /NIH 3T3) o las células NIH 3T3 se pretrataron con GFBs por 5 minutos antes de la estimulación con VEGF (50 ng/ml) o PDGF-BB (10 ng/ml) por 10 minutos, respectivamente. Luego las células se cosecharon y usaron, y las proteínas a partir de los ¡¡sados se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Luego las membranas se sometieron o bien a inmunoblot con anticuerpo anti-fosfo-VEGFR2 (Cell Signaling Technologies, Beverly, MA) para Flk-1 activado o bien se sometieron a anticuerpo anti-fosfo-tirosina (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) para PDGFR activado. La fosfotirosina Flk-1 y PDGFR se cuantificaron utilizando un densitómetro de imágenes Bio-Rad modeio GS-700 (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA) (Blaskovich, M. A. et al. Nat Biotechnol, 2000, 8: 1065-70).

Estimulación de la fosforilación de Erk1/2, Akt y STAT3 mediada por factor de crecimiento. Las células NIH 3T3 expuestas a privación de nutrientes (PDGF-BB, bFGF), las células NIH 3T3 que sobre-expresan EGFR (EGFR/NIH 3T3, EGF), Flk-1 (Flk-1/NIH 3T3, VEGF), y IGF-1 R NIH 3T3 (IGF-1 R/NIH 3T3, IGF-1 ) se pretrataron con la concentración indicada de GFB204 por 5 minutos antes de la estimulación por 10 minutos con PDGF-BB (10 ng/ml), EGF (100 ng/ml), bFGF (50 ng/ml), VEGF (50 ng/ml) e IGF-1 (50 ng/ml). Los usados celulares se procesaron sobre geles de SDS-PAGE, luego se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a Western blot con anti- Erk1/Erk2 fosforilado (Cell Signaling Technologies) anti-Akt fosforilado o anti- STAT3 fosforilado como se describió previamente por los inventores (Blaskovich, M. A. et al. Cáncer Res, 2003, 63: 1270-9).

Unión de 125l-factores de crecimiento a sus receptores. El ensayo de unión de 125I-VEGF, 125I-PDGF y 125I-EGF a sus receptores respectivos se llevó a cabo como se describió previamente (Blaskovich, M. A. et al. Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70. Brevemente, las células Flk-1/NIH 3T3, las células NIH 3T3 y las células EGFR/NIH 3T3 se incubaron con 125I-VEGF, 125l- PDGF y 125I-EGF (50,000 cpm/pozo), respectivamente, y concentraciones en incremento de GFB204. Las células se incubaron a 4°C por 0.5 horas, luego se ¡avaron tres veces con PBS y tres veces con Tris 25 mM, pH 8.0, Tritón-X-100 al 1 %, glicerol al 10%, y SDS al 1 % antes de la determinación de la cuentas de 125l en un contador gamma (Beckmann Inc.). Se utilizó un exceso de factores de crecimiento fríos para obtener niveles de unión no específicos.

Formación de la red capilar. 200 µl de Matrigel se colocaron dentro de cada pozo de una placa para cultivo de 24 pozos a 4°C y se dejó polimerizar mediante la incubación a 37°C como se describió previamente (Papadimitriou, E. et al. Biochem Biophys Res Commun, 2001 , 282: 306-13).

Las células endoteliales de la arteria cerebral media de humano (5x104) se sembraron sobre el Matrigel en 1 mi de EBM que contenía VEGF (20 ng/ml). Las células se incubaron en la presencia o ausencia de GFB204 a las concentraciones indicadas en la leyenda de las figuras 1A-1C. Cada muestra se fotografió utilizando una lente de objetivo 10X, y se cuantificó la longitud total de las estructuras en forma de tubo en cada fotografía utilizando el software Image Pro Plus (Media Cybemetic, Inc., MD).

Ensayo de migración de célula endotelial del cerebro de humano. La migración de las células endoteliales del cerebro de humano de adulto se evaluó utilizando un ensayo modificado de cámara de Boyden (BD BioCoat Matrigel Invasión Chamber) (Papadimitriou, E. et al. Biochem Biophys Res Commun, 2001 , 282: 306-13). Las células se sembraron a 4x104/ml sobre una membrana con tamaño de poro de 8 µm revestida con una capa delgada de matriz de membrana basal Matrigel. GFB204 se añadió al medio en la cámara externa y las células se cultivaron por 18 horas bajo condición dependiente de VEGF en la cámara inferior (VEGF 20 ng/ml). Las células no invasoras se removieron de la superficie superior con un hisopo de algodón. Luego los insertos de membrana se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con el pigmento Cristal-Violeta. El número de células que migraron hacia la superficie de los filtros, se cuantificó mediante el conteo de las células que migraron en campos microscópicos seleccionados al azar (10X). Las muestras se analizaron para diferencias significativas utilizando una prueba t de Student para muestras independientes.

Actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto en ratón desnudo. Los ratones desnudos (Charles River, Wilmington, MA) se mantuvieron de conformidad con los procedimientos y guías de the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Las células A-549 se cosecharon y se resuspendieron en PBS, luego se inyectaron s. c. dentro de ios flancos derecho e izquierdo (10x106 células por flanco) de ratonas desnudas de 8 semanas de edad como se reportó previamente (Sun, J. et al. Cáncer Res, 1999, 59: 4919-26). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los animales se dosificaron i. p. con 0.2 mi de solución una vez al día. Los animales control recibieron un vehículo mientras que los animales se inyectaron con GFB204 (1 ó 5 mg/kg/día). Los volúmenes tumorales se determinaron mediante ia medición de ia iongitud (1 ) y ei grosor (w) y calculando el volumen (V = 1w2/2) como se describió previamente (Sun, J. et al. Cáncer Res, 1999, 59: 4919-26). La importancia estadística entre los animales control y tratados se evaluó utilizando la prueba t de Student.

Estudio IHC. Al día de término de los experimentos antitumorales, los tumores se extrajeron y se fijaron en formalina al 10% en regulador de pH neutro por 6 horas. Después de la fijación, las muestras de tejido se procesaron en bloques de parafina. Las secciones de tejido (4 µm de grosor) se obtuvieron a partir de los bloques de parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E) utilizando técnicas histológicas estándares. Las secciones de tejido también se sometieron a ¡nmunotinción para CD31 (BD Biosciences, San Diego, CA) utilizando la técnica con el complejo de avidina biotina peroxidasa (Blaskovich, M. A. et al. Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70). El anticuerpo monoclonal de ratón se utilizó a una dilución 1 :50, después de la recuperación del antígeno por microonda (cuatro ciclos de 5 minutos cada a alta potencia en regulador de pH con citrato 0.1 M).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención pertenece a compuestos que se unen a factores de crecimiento. Más particularmente, la presente invención pertenece a los compuestos (tales como aquellos que se muestran en el cuadro 1 ) que se unen ios factores de crecimiento tales como VEGF y/o PDGF, y son capaces de inhibir la unión de uno o más de estos factores de crecimiento a sus receptores respectivos de superficie celular. La invención también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de estos compuestos y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención se refiere a métodos para la inhibición de la unión de dichos factores a las células mediante el contacto de uno o más compuestos de la invención (o composiciones que comprenden uno o más de los compuestos) con las células in vitro o in vivo. En otros aspectos, la presente invención incluye métodos para la inhibición de la fosforilación estimulada por los factores de crecimiento (por ejemplo, fosforilación de Erk1 , Erk2, Akt, y/o STAT3); métodos para la inhibición de la angiogénesis; y métodos para la inhibición del cáncer y/o crecimiento tumoral mediante el contacto de uno o más compuestos o composiciones de la presente invención con células blanco in vitro o in vivo. En una modalidad específica, la presente invención se refiere a un método útil para la inhibición de los factores de crecimiento a partir de la unión a las células, para la inhibición de la fosforilación estimulada por el factor de crecimiento, para la inhibición de la angiogénesis, para la inhibición del cáncer y crecimiento tumoral o una combinación de los mismos, en donde el método comprende poner en contacto al menos un compuesto para unión al factor de crecimiento o una sal farmacéuticamente aceptable de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento, a una célula in vitro o in vivo; en donde los compuestos para unión al factor de crecimiento comprenden una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a una estructura base orgánica no peptídica; en donde cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento, o la sal farmacéuticamente de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento puede o puede no ser portado en un vehículo farmacéuticamente aceptable, excepto por el compuesto que tiene la estructura general: I I u?nuc ?aua ?\ i co. y cada R2 es: En incluso otra modalidad específica, una composición farmacéutica de la presente invención se administra localmente o sistemáticamente a un paciente para lograr la inhibición de la angiogénesis, inhibición del crecimiento tumoral, y/o inhibición del cáncer. En una modalidad, la presente invención incluye un compuesto que se une a los factores de crecimiento que comprende una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a una estructura base orgánica no peptídica. En una modalidad adicional, la estructura base orgánica es una estructura base de calix[4]areno. Los grupos acíclicos de ácido isoftálico de los compuestos de la invención se pueden funcionalizar con un grupo ácido, un grupo hidrófobo, o ambos. En otra modalidad, el compuesto que se une al factor de crecimiento de la presente invención tiene la estructura general: en donde cada R1 se selecciona independientemente a partir de entre los siguientes grupos químicos: y cada R2 se selecciona independientemente a partir de entre los siguientes grupos químicos: En modalidades específicas, el compuesto de la presente invención se selecciona a partir del grupo que consiste de GFB201 , GFB202, GFB203, GFB204, GFB205, GFB206, GFB207, GFB208, GFB209, GFB210, GFB211 , GFB212, GFB213, GFB214, GFB215, GFB216, GFB217, GFB218, y GFB219 (como se establece en el cuadro 1 ). Los factores de crecimiento que son señalados como el objetivo o que actuaron sobre los compuestos de la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, factor de crecimiento derivado de plaquetas, a factor de crecimiento endotelial vascular, o a ambos. En otro aspecto, la presente invención provee una composición que comprende al menos un compuesto de la invención, como se describe en la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención provee un método para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad que comprende proliferación celular en exceso, angiogénesis en exceso, un tumor, o una combinación de cualquiera de los precedentes, en donde el método comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un compuesto o composición de la invención. En una modalidad específica, el tumor puede expresar cantidades elevadas de un factor de crecimiento, tales como ei factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento endotelial vascular, o ambos. También se podrían producir niveles elevados de PDGF y VEGF a partir del microambiente tumoral ocasionados por células y vasos sanguíneos endoteliales angiogénicos. En incluso otra modalidad específica, la presente invención provee un método para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad que comprende proliferación celular en exceso, angiogénesis en exceso, un tumor, o una combinación de cualquiera de los precedentes, en donde el método comprende administrar una cantidad efectiva de una composición farmacéutica, en donde la composición farmacéutica comprende al menos un compuesto para unión al factor de crecimiento o una sal farmacéuticamente aceptable de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable; o uno o más compuestos de factor de crecimiento, en donde los compuestos para unión al factor de crecimiento comprenden una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a una estructura base orgánica no peptídica excepto para el compuesto que tiene la estructura general: en donde cada R1 es: y cada R2 es: Las formulaciones (también se refieren en la presente invención como composiciones) incluyen aquellas adecuadas para administración local o sistémica, tales como administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo transdermal, bucal y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradermal) y pulmonar. Las formulaciones pueden estar presentes convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar mediante cualesquiera métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Dichos métodos incluyen el paso de poner en asociación el ingrediente activo con el vehículo el cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan mediante la asociación uniforme e íntimamente del ingrediente activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y luego, si es necesario, dándole forma al producto. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden estar presentes como unidades discretas tales como cápsula, sellos o tabletas, cada una conteniendo una cantidad predeterminada del ingrediente activo; o como una emulsión líquida de aceite-en-agua, emulsión líquida de agua-en-aceite o como un suplemento dentro de una solución acuosa, por ejemplo, un té. El ingrediente activo también se puede presentar como un bolo, electuario, o pasta. Las formulaciones adecuadas para administración tópica en ia boca incluyen tabletas que comprenden el ingrediente activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tales como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado. Las composiciones farmacéuticas para administración tópica de conformidad con la presente invención se pueden formular como un ungüento, crema, suspensión, loción, polvo, solución, pasta, gel, aspersión, aerosol o aceite. Alternativamente, una formulación puede comprender un parche o un vendaje tal como un emplasto en vendaje o adhesivo impregnado con ingredientes activos, y opcionalmente uno o más excipientes o diluyentes. Las formulaciones adecuadas para administración tópica al ojo también incluyen gotas oculares en donde el ingrediente activo está disuelto o suspendido en un vehículo adecuado, especialmente un solvente acuoso para el agente. Las formulaciones para administración rectal pueden estar presentes como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, mantequilla de cocoa o un salicilato. La formulación adecuada para administración vaginal puede estar presente como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o como formulaciones en aspersión que además del agente contienen dichos vehículos como se conocen en la técnica que son apropiados. Las formulaciones adecuadas para administración nasal, en donde el vehículo es un sólido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 mieras, el cual se administra de la manera en que se toma una aspiración, por ejemplo, mediante la inhalación rápida a través del paso nasal a partir de un contenedor del polvo que se mantiene cercano a la nariz. Las formulaciones adecuadas en donde el vehículo es un líquido para administración mediante nebulizador, incluyen soluciones acuosas u oleosas del agente.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones estériles para inyección acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, bacteriostatos y solutos los cuales vuelven a la formulación isotónica con la sangre del recipiente pretendido; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden inciuir agentes para suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas en micropartículas que se diseñan para dirigir el compuesto a los componentes de la sangre o a uno o más órganos. Las formulaciones pueden estar presentes en contenedores de dosis unitaria o de dosis múltiple o contenedores sellados de dosis múltiple, tales como por ejemplo, ampolletas y viales, y que se pueden almacenar en una condición secada mediante congelamiento (liofilizada) que requiere solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones extemporáneas para inyección se pueden preparar a partir de poivos estériles, granulos y tabletas de ia ciase previamente descrita. Las formulaciones preferidas de dosis unitaria son aquellas que contienen una dosis diaria o unidad, subdosis diaria, como se mencionó anteriormente en la presente invención, o una fracción apropiada de la misma, de un agente. Se debe entender que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para administración oral pueden incluir dichos agentes adicionalmente como edulcorantes, espesantes, y agentes saborizantes. También se pretende que los agentes, composiciones, y métodos de esta invención se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas. Se conocen varios sistemas para administración y se pueden utilizar para administrar un compuesto de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, endocitosis mediada por receptor y los similares. Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, rutas intra-arteriales, intramusculares, intravenosas, intranasales, y orales. En una modalidad específica, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar localmente al área que necesita de tratamiento; dicha administración local se puede lograr, por ejemplo, mediante infusión local durante la cirugía, mediante inyección, o por medio de un catéter. Las cantidades terapéuticas se puedan determinar empíricamente y variarán con la patología a ser tratada, el sujeto a ser tratado, y la eficiencia y toxicidad del agente. De manera similar, se puedan determinar fácilmente las formulaciones de dosis adecuadas y métodos de administración de los agentes por aquellos expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante cualesquiera de una variedad de rutas, tales como oralmente, ¡ntranasalmente, parenteralmente o mediante terapia de inhalación, y puede tomar la forma de tabletas, tabletas, granulos, cápsulas, pildoras, ampolletas, supositorios o en forma de aerosol. Estos también pueden tomar la forma de suspensiones, soluciones, y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos. Además de un compuesto de la presente invención, las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros compuestos farmacéuticamente activos o una pluralidad de compuestos de la invención. Idealmente, se debe administrar el agente para alcanzar concentraciones pico del compuesto activo en los sitios de la enfermedad. Las concentraciones pico en los sitios de la enfermedad se pueden alcanzar, por ejemplo, mediante la inyección intravenosa del agente, opcionalmente en solución salina, o se administra oralmente, por ejemplo, una tableta, cápsula o jarabe que contiene el ingrediente activo. De manera ventajosa, las composiciones se pueden administrar simultáneamente o secuencialmente con otros fármacos o agentes biológicamente activos, tales como agentes anti-cáncer. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes, agentes eliminadores de radicales libres, péptidos, factores de crecimiento, antibióticos, agentes bacteriostáticos, inmunosupresores, anticoagulantes, agentes reguladores de pH, agentes anti-inflamatorios, anti-piréticos, enlazadores de liberación dependiente de tiempo, anestésicos, esteroides y corticosteroides. Preferiblemente, la administración se llevó a cabo oralmente, parenteralmente, subcutáneamente, intravenosamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, ¡ntraarterialmente, transdermalmente o vía una membrana mucosa. Se pretende que el término "cáncer" signifique cualquier malignidad celular cuyo rasgo único es la pérdida de los controles normales lo cual resulta en el crecimiento no regulado, pérdida de diferenciación y capacidad de invadir los tejidos locales y formar metástasis. El cáncer se puede desarrollar en cualquier tejido de cualquier órgano. Más específicamente, se pretende que el cáncer incluya, sin limitación, cáncer de próstata, leucemia, cánceres dependientes de hormona, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer epidermal, cáncer hepático, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer del cerebro, y cáncer del riñon. Se pretende que los términos "tratamiento", "tratar" y los similares signifiquen la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado, por ejemplo, inhibición del crecimiento de la célula cancerosa o inducción de apoptosis de una célula cancerosa. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El "tratamiento" como se utiliza en la presente invención abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir una enfermedad o condición (por ejemplo, prevención del cáncer) de que ocurra en un individuo el cual puede estar predispuesto a la enfermedad pero aún no ha sido diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, (por ejemplo, detener su desarrollo); o (c) aliviar la enfermedad (por ejemplo, reducir los síntomas asociados con la enfermedad). Se pretende que el término "actividad anti-cáncer" signifique una actividad la cual es capaz de inhibir sustancialmente, hacer más lento, interferir, suprimir, prevenir, retrasar y/o detener un cáncer y/o una metástasis del mismo (tales como inicio, crecimiento, extensión, y/o progreso del mismo de dicho cáncer y/o metástasis). Se pretende que los términos "administrar", "administración", y "poner en contacto" signifiquen un modo de administración incluyendo, sin limitación, oral, rectal, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, transdermalmente o vía una membrana mucosa. El preferido siendo oralmente. La administración se puede llevar a cabo localmente, en un sitio(s) blanco(s), o sistémicamente. Un experto en la técnica reconoce que las formas adecuadas de formulación oral incluyen, pero no se limitan a, una tableta, una pildora, una cápsula, una tableta, un polvo, una tableta para liberación sostenida, un líquido, una suspensión líquida, un gel, un jarabe, una pasta aguada, una suspensión, y los similares. Por ejemplo, una dosis diaria se puede dividir en una, dos o más dosis en una forma adecuada para ser administrada una, dos o más veces a lo largo de un periodo de tiempo. El término "terapéuticamente efectiva" se pretende que signifique una cantidad de un compuesto de la invención adecuada para mejorar sustancialmente algún síntoma asociado con una enfermedad o una condición médica. Por ejemplo, en el tratamiento del cáncer, un compuesto el cual disminuye, previene, retrasa, suprime, o detiene cualquier síntoma de la enfermedad podría ser terapéuticamente efectivo. No se requiere una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto para curar una enfermedad pero proveerá un tratamiento para una enfermedad de tal manera que el inicio de la enfermedad se retrasa, posterga, o previene, o los síntomas de la enfermedad se mejoran, o el término de la enfermedad cambia o, por ejemplo, es menos severa o la recuperación se acelera en un individuo. Se pretende que el término "independientemente" signifique que cada de los cuatro sustituyentes R1 y cada uno de los cuatro sustituyentes R2 de los compuestos para unión al factor de crecimiento de la presente invención cada uno puede ser el mismo sustituyente o cada uno puede ser un sustituyente diferente. Cuando ios compuestos de esta invención se administran en terapias de combinación con otros agentes, éstos se pueden administrar secuencialmente o concurrentemente a un individuo. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención pueden estar comprendidas de una combinación de un compuesto de la presente invención, como se describe aquí, y otro agente terapéutico o profiláctico conocido en la técnica. Las sales de adición acida farmacéuticamente aceptables se pueden preparar a partir de ácidos inorgánicos y orgánicos. Las sales derivadas a partir de ácidos inorgánicos incluyen ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y los similares. Las sales derivadas a partir de ácidos orgánicos incluyen ácido cítrico, ácido láctico, ácido tartárico, ácidos grasos, y los similares. Las sales también se pueden formar con bases. Dichas sales incluyen sales derivadas a partir de bases inorgánicas u orgánicas, por ejemplo sales de metales alcalinos tales como sales de magnesio o sales de calcio, y sales orgánicas de amina tales como sales de morfolina, piperidina, dimetilamina o dietilamina. Como se utiliza en la presente invención, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes (tales como reguladores de pH en solución salina con pH regulado con fosfato, agua, solución salina), medio para dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y que retrasan la absorción y los similares. Ei uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en lo que respecta a cualquier medio o agente convencional que es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos suplementarios también se pueden incorporar dentro de las composiciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de conformidad con los métodos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticamente útiles. Las formulaciones se describen en numerosas fuentes las cuales se conocen bien y están fácilmente disponibles a aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (Martin EW (1995) Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19a ed.) describe las formulaciones que se pueden utilizar en conexión con la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, los términos "individuo" y "paciente" se utilizan de manera intercambiable para referirse a cualesquiera especies de vertebrados, tales como humanos y animales. Preferiblemente, el paciente es de una especie de mamífero. Las especies de mamífero las cuales se benefician a partir de los métodos descritos incluyen, y no se limitan a, simios, chimpancés, orangutanes, humanos, monos; animales domesticados (por ejemplo, mascotas) tales como perros, gatos, cuyos, hámsters, cerdos vietnamitas barrigones, conejos, y hurones; animales domesticados de granja tales como vacas, búfalos, bisoñes, caballos, burros, cerdos, ovejas, y cabras; animales exóticos típicamente encontrados en zoológicos, tales como osos, ieones, tigres, panteras, elefantes, hipopótamos, rinocerontes, jirafas, antílopes, perezosos, gacelas, zebras, núes azules, perros de la pradera, osos koala, canguros, zarigüeyas, mapaches, pandas, hienas, focas, lobos marinos, leones marinos, nutrias, marsopas, delfines, y ballenas. Los pacientes humanos o animales no humanos pueden tener un intervalo de edad a partir de neonatos a ancianos. De conformidad con otra modalidad de la presente invención, se provee un método para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar a un individuo una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de la presente invención. Preferiblemente, un cáncer a ser tratado de conformidad con una modalidad de la presente invención se selecciona a partir del grupo que consiste de cáncer de próstata, leucemia, cánceres dependientes de hormona, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer epidermal, cáncer hepático, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer del cerebro, y cáncer del riñon.

EJEMPL0 1 Identificación de GFB204, un derivado de calixareno que inhibe potencialmente la estimulación de Flk-1 por VEGF y PDGF y la fosforilación de receptor tirosina por PDGF El método iniciai para aiíerar interacciones proteína-proteína biológicamente significativas tales como aquellas que implican a los factores de crecimiento con sus receptores, consistió del diseño de moléculas que contenían cuatro asas peptídicas sintéticas unidas a una estructura base de calix[4]areno (esquema A 1 , reacción (a)) (Blaskovich, M. A. et al. Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70). Los componentes del asa peptídica se basan en un hexapéptido cíclico en el cual se reemplazan dos residuos por el dipéptido mimético 3-aminometilbenzoato modificado con un grupo 5-amino para proveer un enlace a la cavidad del calixareno. Este diseño permitió la síntesis de una librería de derivados de calixareno que tienen diferentes secuencias peptídicas en las asas y áreas de superficies grandes capaces de unirse a las superficies proteicas. Uno de los miembros de la librería, GFB111 , se une a PDGF y bloquea su unión a PDGFR a concentraciones subµM y selectivamente en relación con otros factores de crecimiento (Blaskovich, M. A.et al. Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70). Las cuatro asas peptídicas en GFB111 contenían residuos negativos e hidrófobos en la secuencia GDGY (esquema A, reacción (a)), la cual coincide bien con los aminoácidos positivos e hidrófobos en las asas i, ¡i y III del PDGF homodimérico, los cuales son críticos para la unión a PDGFR (Oefner, C.et al. Embo J, 1992, 11 : 3921-6; Andersson, M. et al. Growth Factors, 1995, 12: 159-64). GFB111 y compuestos similares se describen en Solicitud Publicada de E.U.A. No. US2003/0118589, presentada el 21 de marzo de 2001 , y Solicitud Internacional Publicada No. WO 01/70930, presentada el 21 de marzo de 2001 , las cuales se incorporan como referencias en su totalidad, incluyendo todas las figuras y cuadros. Para mejorar este diseño, se ha diseñado una librería de segunda generación en la cual en lugar de las asas peptídicas simples, los grupos acíclicos de ácido isoftálico funcionalizados con un amplio intervalo de grupos ácidos e hidrófobos (R-i y R2; esquema A, reacción (b); y cuadro 1 ) están unidos a la estructura base del calix[4]areno.

ESQUEMA A Para evaluar esta librería para moléculas capaces de prevenir la unión de PDGF y VEGF a sus receptores, se determinó inicialmente su capacidad para alterar la fosforilación de receptor tirosina estimulada por PDGF y VEGF como se describe bajo el título de materiales y métodos. A partir de los 19 compuestos en la librería se identificó el GFB204 (en donde Ri es un ácido carboxílico y R2 un éster bencílico) como un potente inhibidor de la fosforilación de tirosina por ambos VEGFR y PDGFR (cuadro 1 ) con los valores IC50 de 190 nM (PDGF) y 480 nM (VEGF). Todos los miembros de la librería que tienen al menos cuatro grupos carboxílicos inhibieron la señalización por PDGF a concentraciones menores de µM (IC50 < µM), aunque el único compuesto que carece de grupos ácidos (GFB217) no tiene una actividad significativa. El análisis de los datos en el cuadro 1 reveló que todos los inhibidores potentes (que tienen IC50 < 0.6 µM) contienen Ri = COOH y R2 = éster hidrófobo o amida. GFB211 , en donde R2 = bencilamida, tiene una actividad solamente ligeramente menor (IC50 =1.34 ± 0.32 µM) que GFB204, mientras que GFB209, (R2 = metil éster) es menos potente (IC50 = 2.9 ± 2.05 µM). Estos datos sugieren que la estructura de los sustituyentes hidrófobos no es crucial para la inhibición de la señalización por PDGF, siempre y cuando éstos sean más grandes que un grupo metilo. Los compuestos que tienen grupos aromáticos y alifáticos son igualmente activos y las amidas más estables tienen actividad similar a sus análogos éster. En contraste, los derivados de calixareno que contienen sustituyentes de aminoácidos (por ejemplo GFB202, GFB203, GFB205, GFB206, GFB207 y GFB208) muestran en general una actividad menor (IC50 en el intervalo 1-6 µM). Esto se puede deber ya sea a un cambio en la relación de grupos iónicos a hidrófobos en la estructura base (estos derivados tienen 8-16 ácidos carboxílicos y solamente 0-4 sustituyentes hidrófobos) o a una distancia no óptima entre éstos. Además, la presencia de grupos ácidos en el espaciador isoftálico parece ser más importante que la presencia de sustituyentes hidrófobos: GFB201 , GFB202, GFB203, y GFB206 que carecen de grupos hidrófobos en las posiciones R-i y R2 pero son más potentes que GFB217, el cual no tiene grupos carboxilato. Posiblemente, los mismos grupos de ácido isoftálico proveen un área hidrófoba que interactúa con las regiones hidrófobas del dominio para unión a los receptores de PDGF. Finalmente, es importante mencionar que los compuestos más activos en el estudio tienen exactamente un ácido carboxílico y un grupo hidrófobo en los cuatro componentes isoftálicos dentro de la estructura base consistente con los estudios previos los cuales llevan a la identificación de GFB 111 (Blaskovich, M. A. et al. Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70). Los estudios SAR también revelaron que las características necesarias en esta serie para la inhibición de la fosforilación de la Flk-1 tirosina estimulada por VEGF son mucho más severas. De hecho, aparte de GFB204 (IC50 = 0.48 ± 0.31 µM), solamente uno de otros compuestos potentes, GFB213, inhibió la fosforilación de la Flk-1 tirosina con un valor IC50 de 0.85 ± 0.44 µM (cuadro 1 ). Los factores que determinan la actividad en la inhibición hacia la señalización por VEGF son difíciles de inferir a partir de los datos en el cuadro 1. GFB204 se une a ambos PDGF y VEGF. La capacidad de GFB204 para unirse a ambos VEGF y PDGF se demostró mediante las curvas de titulación de fluorescencia. Ambos VEGF y PDGF contienen triptofanos que fluorescen a 334 nM cuando se excitan a 294 nM. Las figuras 1 D y 1E muestran que las concentraciones en incremento de GFB-204 disminuyeron la capacidad de PDGF y VEGF para fluorescer de manera concentración dependiente.

EJEMPLO 2 GFB204 inhibe la unión de VEGF y PDGF pero no de EGF a sus receptores respectivos La capacidad de GFB204 para inhibir la fosforilación del receptor tirosina estimulada por PDGF y VEGF sugiere que GFB204 ya sea altera la unión al ligando/receptor, la dimerización del receptor o la actividad del receptor tirosina cinasa. Por lo tanto, se determinó si GFB204 inhibe la interacción entre PDGF y VEGF y sus respectivos receptores pero no a otros factores de crecimiento. Para este fin, los presentes inventores evaluaron la capacidad de GFB204 para bloquear la unión a [I-125J-PDGF, [l-125]-VEGF y [l-125]-EGF a sus receptores en las células NIH 3T3 (PDGF), las células NIH 3T3 que sobre-expresan Flk-1 de humano (VEGF) y EGFR de humano (EGF) como se describe bajo el título de materiales y métodos. GFB204 inhibió efectivamente la unión de [l-125]-PDGF y [l-125]-VEGF a sus receptores con valores IC 0 de 154 +/- 1.0 nM y 469 +/- 94 nM, respectivamente (figuras 1A-1 C). En contraste, la unión de [I-125J-EGF a su receptor no se afectó por GFB204 con concentraciones tan altas como de 100 µM. Por lo tanto, GFB204 es más selectivo para PDGF y VEGF en comparación con EGF.

EJEMPLO 3 GFB204 altera la fosforilación de Erk1, Erk2. Akt y STAT3 por la estimulación de PDGF y VEGF pero no por EGF-, bFGF- o IGF-1 Para documentar adicionalmente la selectividad de GFB204 por PDGF y VEGF sobre los otros factores de crecimiento, ios presentes inventores determinaron la capacidad de GFB204 para bloquear la estimulación por el factor de crecimiento de las cinasas Erk1 , Erk2 y Akt así como el transductor de la señal y el activador de la transcripción STAT3. Para este fin, las células NIH 3T3 (PDGF y bFGF) o las células NIH 3T3 que sobre-expresan Flk-1 (VEGF), EGFR (EGF) o IGF-IR (IGF-1 ) fueron expuestas a privación de nutrientes y estimuladas con el factor de crecimiento correspondiente en la presencia o ausencia de GFB204, y las células se procesaron para inmunoblot Western anti-fosfotirosina (PDGF y VEGF) y para anti-fosfo-Erk1/2, Akt y STAT3 (PDGF, VEGF, EGF, bFGF y IGF-1) como se describe bajo el título de materiales y métodos. La figura 2A muestra que, como se describe en el cuadro 1 , el tratamiento de las células expuestas a privación de nutrientes con PDGF o VEGF resultó en una estimulación potente de la fosforilación del receptor tirosina y que el tratamiento con GFB204 inhibió esta estimulación con valores IC5o de 190 nM y 480 nM, respectivamente. De manera similar, la estimulación de Erk1 y Erk2 por PDGF y VEGF también se inhibió con valores IC50 similares. Además, ésta inhibición fue selectiva ya que GFB204 bloqueó a la fosforilación de Erk1 , Erk2, Akt y STAT3 estimulada por PDGF y VEGF pero tuvo poco efecto sobre aquella estimulada por EGF-, bFGF- y IGF-1 (figura 2B).

EJEMPLO 4 GFB204 inhibe la anqioqénesis in vitro e in vivo y suprime el crecimiento de tumores de humano en ratones desnudos La capacidad de GFB204 para inhibir potencialmente y selectivamente la unión del receptor a PDGF y VEGF/ligando y la señalización subsecuente impulsó a los presentes inventores para determinar si este agente podría inhibir la angiogénesis, in vitro e in vivo y subsecuentemente inhibir el crecimiento tumoral. Primero, se determinó si GFB204 podría inhibir la angiogénesis in vitro mediante la evaluación de su capacidad para suprimir la formación de la red capilar endotelial del cerebro de humano inducida por VEGF como se describe bajo el título de materiales y métodos. GFB204 fue altamente eficiente inhibiendo la formación de la red capilar inducida por VEGF con un valor IC50 de 700 nM (figura 3C). A continuación se determinó la capacidad de GFB204 para inhibir la migración de la célula endotelial del cerebro de humano como se describe bajo el título de materiales y métodos. GFB204 inhibió la migración de la célula endotelial inducida por VEGF a través de poros de matrigel hacia la cámara inferior con un valor IC50 de 600 nM (figura 3B). La capacidad de GFB204 para inhibir la unión de VEGF y PDGF a sus receptores y la señalización subsecuente acoplada con su capacidad para inhibir la migración de la célula endotelial inducida por VEGF y la formación de la red capilar sugiere que GFB204 puede inhibir la angiogénesis y ia tumorigénesis en animales completos. Por lo tanto, a continuación se evaluó si GFB204 era capaz de suprimir el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo al implantar células A-549 de cáncer de pulmón de humano s. o en ratones desnudos. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100 mm3, los ratones se trataron ya sea con el vehículo o con GFB204 y 3 semanas después los tumores fueron removidos y procesados para ¡nmunotinción con CD31 para determinar los efectos anti-angiogénicos de GFB204 como se describe bajo el título de materiales y métodos. Los tumores a partir de animales control crecieron a un tamaño promedio de 749 ± 111 mm3 (figura 5). En contraste, los tumores a partir de animales tratados con GFB204 crecieron a un tamaño promedio de solamente 650 ± 114 mm3 (GFB204; 1 mg/kg), y 284 ± 108 mm3 (GFB204; 5 mg/kg), respectivamente. Por lo tanto, el tratamiento con GFB204 resultó en una inhibición del crecimiento tumoral estadísticamente significativa (p < 0.05), a 5 mg/kg (73%), pero no a 1 mg/kg (15%). Las secciones tumorales a partir de animales tratados con GFB204 muestran una inhibición significativa de la tinción con CD31 (figuras 4A-4C). La cuantificación de microvasos sanguíneos a una amplificación de campo (400X) indicó que los tumores a partir de ratones tratados con el vehículo contenían 11.3 ± 1.9 microvasos sanguíneos mientras que aquellos a partir de ratones tratados con GFB204 (5 mg/Kg) tuvieron solamente 2.6 ± 0.9 microvasos sanguíneos. Tomándolos juntos, los resultados demuestran claramente que GFB204 inhibe el crecimiento tumoral de los xenoinjertos A-549 y la angiogénesis in vivo. El estricto requerimiento y la dependencia severa del crecimiento tumoral sobre la angiogénesis ha impulsado a muchos investigadores al diseño de estrategias para terapia de cáncer mediante ia alteración de ia angiogénesis que resulta en la privación de nutrientes a las células cancerosas y esencialmente la muerte tumoral por privación de nutrientes (Zhang, W. et al. Angiogenesis, 2002, 5: 35-44; Ferrara, N. Semin Oncol, 2002, 29: 10-4; Jain, R. K. Semin Oncol, 2002, 29: 3-9; Morin, M. J. Oncogene, 2000, 19: 6574- 83; Miao, R. Q. et al. Blood, 2002, 100: 3245-52; Laird, A. D. et al. Cáncer Res, 2000, 60: 4152-60; Wedge, S. R. et al. Cáncer Res, 2000, 60: 970-5; Relf, M. et al. Cáncer Res, 1997, 57: 963-9; Huang, J. et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2003, 100: 7785-90; Blaskovich, M. A. et al. Nat Biotechnol, 2000, 18: 1065-70). Aunque el objetivo de la angiogénesis como un método para la terapia de cáncer se sugirió hace décadas, ha sido solamente muy recientemente que el primer fármaco diseñado para modificar un paso en el complejo proceso de la angiogénesis se ha aprobado por la FDA (Ferrara, N. Semen Oncol, 2002, 29: 10-4). De hecho, AVASTATIN, un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado ha mostrado actividad en contra del cáncer metastático de colon. Aunque es clave para proveer pruebas acerca del concepto mediante la modificación de la angiogénesis en humanos, este método no se ha explotado completamente. Una mejoría que se ha perseguido después es el diseño de estrategias que simultáneamente se dirigen a diferentes pasos en el proceso angiogénico (Bergers, G. et al. J. Clin. Invest, 2003, 111 : 1287-95; Relf, M. et al. Cáncer Res, 1997, 57: 963-9; Huang, J. et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2003, 100: 7785-90). Los presentes inventores han desarrollado un agente farmacológico sintético que inhibe la función de ambos VEGF y PDGF, factores de crecimiento que se ha mostrado que median el inicio y mantenimiento de nuevos vasos sanguíneos, respectivamente (Bergers, G. et al. J Clin Invest, 2003, 111 : 1287-95; Dvorak, H.F. J Clin Oncol, 2002, 20: 4368-80; Ferrara, N. Curr Top Microbiol Immunol, 1999, 237: 1-30; Dvorak, H.F. et al. Curr Top Microbiol Immunol, 1999, 237: 07-132; Eriksson, U. y Alitalo, K. Curr Top Microbiol Immunol, 1999, 237: 41-57). Este es el primer reporte de un agente que inhibe la unión de ambos VEGF y PDGF a sus receptores y subsecuentemente suprime la fosforilación de tirosina y las rutas de señalización corriente abajo (Erk, Akt y STAT3). GFB204 también bloqueó potencialmente la capacidad de las células endoteliales para migrar (IC50 = 600 nM) así como su capacidad para formar capilares in vitro (IC50 = 700 nM). In vivo, el tratamiento de ratones que contienen tumores de humano s.c. lleva a la inhibición de la formación de vasos sanguíneos alrededor de la masa tumoral así como la inhibición del crecimiento tumoral. Aunque GFB204 potencialmente inhibió tanto la unión de VEGF como de PDGF a sus receptores (200-500 nM), éste no fue un desorganizador no específico de todos los ligandos/receptores para unión puesto que la unión de EGF a su receptor no se afectó a dosis tan altas como de 100 µM. El apoyo adicional para la selectividad se proveyó mediante la demostración de que GFB204 inhibió la activación de Erk1 , Erk2, Akt y STAT3 por PDGF y VEGFpero no por EGF, bFGF o IGF-1. La identificación de los derivados de calix[4]areno capaces de bloquear la unión de ambos VEGF y PDGF a sus receptores es un método completamente novedoso para dirigirse a la señalización por el receptor tirosina cinasa. Aunque el anticuerpo anti-VEGF AVASTIN también bloquea la unión de VEGF a su receptor (Zhang, W. et al. Angiogenesis, 2002, 5: 35-44; Ferrara, N. Semin Oncol, 2002, 29: 10-4), aparentemente no existen otros agentes que bloquean la inhibición de ambos PDGF y VEGF a sus receptores. Además, la ventaja de GFB204 sobre AVASTIN es que GFB204 es una molécula mucho más pequeña que se puede sintetizar fácilmente a un bajo costo, a diferencia de los métodos laboriosos y costosos implicados en la generación de anticuerpos para propósitos terapéuticos. Aunque antes de este reporte no existían inhibidores duales de la unión de VEGF y PDGF a sus receptores, se han elaborado los inhibidores duales de receptor tirosina cinasas por VEGF y PDGF y algunos se encuentran en ensayos clínicos (Kerbel, R. S. Carcinogenesis, 2000, 21 : 505-15; Jain, R. K. Semin Oncol, 2002, 29: 3-9; Morin, M. J. Oncogene, 2000, 19: 6574-83; Miao, R. Q. et al. Blood, 2002, 100: 3245-52; Laird, A. D. et al.

Cáncer Res, 2000, 60: 4152-60; Wedge, S. R. et al. Cáncer Res, 2000, 60: 970-5). Existen diferencias distintivas entre estos imitadores de ATP y GFB204. Aunque el blanco para GFB204 en la interacción de ligando/receptor que se presenta extracelularmente en la superficie externa de la célula, los imitadores de ATP se dirigen hacia los dominios de tirosina cinasa de los receptores que son intraceiulares. Por lo tanto, a diferencia de GFB204, los inhibidores de cinasa deben entrar a las células para alcanzar su blanco. /Además, la mayoría de los inhibidores de tirosina cinasa se dirigen al sitio de unión al ATP, las variaciones de los cuales son ubicuas en las células. Por lo tanto, el éxito del tratamiento de los pacientes con GFB204 puede ser muy diferente a partir de aquella con respecto a los pacientes tratados con un imitador de ATP que se dirige a ambas receptor tirosina cinasas por PDGF y VEGF. Están en camino de preparación los estudios preclínicos avanzados para una aplicación IND para la evaluación en fase 1 de GFB204 en humanos. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales, y publicaciones referidas a o citadas en la presente invención se incorporan como referencias en su totalidad, incluyendo todas las figuras y cuadros, hasta el grado en que no sen inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta especificación. Se debe entender que los ejemplos y modalidades descritos en la presente invención son solamente para propósitos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de las mismas serán sugeridos a las personas expertas en la técnica y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud.

Claims (32)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto para unión al factor de crecimiento que comprende una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a una estructura base orgánica no peptídica.

2.- El compuesto para unión al factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque cada uno de los grupos acíclicos de ácido isoftálico están funcionalizados con un grupo ácido o con un grupo hidrófobo.

3.- El compuesto para unión al factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la estructura base orgánica no peptídica es un calixareno.

4.- El compuesto para unión ai factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la estructura base orgánica no peptídica es un calix[4]areno.

5.- El compuesto para unión al factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la pluralidad de grupos de ácido isoftálico se unen a la estructura base orgánica no peptídica de conformidad con la estructura (I): (i) en donde cada Rl se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de: en donde cada R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de: , y

6.- El compuesto para unión al factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de GFB201 , GFB202, GFB203, GFB204, GFB205, GFB206, GFB207, GFB208, GFB209, GFB210, GFB211, GFB212, GFB213, GFB214, GFB215, GFB216, GFB217, GFB218, y GFB219.

7.- Los compuestos para unión al factor de crecimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto se dirige a los factores de crecimiento derivados de plaquetas, factor de crecimiento endotelial vascular, o una mezcla de cualesquiera de los precedentes.

8.- Una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos para unión al factor de crecimiento o una sal farmacéuticamente aceptable de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable; en donde los compuestos para unión al factor de crecimiento comprenden una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a una estructura base orgánica no peptídica.

9.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque cada uno de los grupos acíclicos de ácido ¡softálico están funcionalizados con un grupo ácido o con un grupo hidrófobo.

10.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la estructura base orgánica no peptídica es un calixareno.

11.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la estructura base orgánica no peptídica es un calix[4]areno.

12.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la pluralidad de grupos de ácido isoftálico se unen a la estructura base orgánica no pepíídica de conformidad con la estructura (I): (I) en donde cada R1 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de: en donde cada R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de:

13.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste de GFB201 , GFB202, GFB203, GFB204, GFB205, GFB206, GFB207, GFB208, GFB209, GFB210, GFB211 , GFB212, GFB213, GFB214, GFB215, GFB216, GFB217, GFB218, y GFB219.

14.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento se dirige a los factores de crecimiento derivados de plaquetas, factor de crecimiento endotelial vascular, o una mezcla de cualesquiera de los precedentes.

15.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque comprende adicionalmente un agente biológicamente activo.

16.- El uso de una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto para unión al factor de crecimiento o una sal farmacéuticamente aceptable de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable; o uno o más compuestos factores de crecimiento, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un paciente que tiene una enfermedad que comprende proliferación celular en exceso, angiogénesis en exceso, un tumor, o una combinación de cualquiera de los precedentes, en donde los compuestos para unión ai factor de crecimiento comprenden una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a una estructura base orgánica no peptídica.

17.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde cada uno de los grupos acíclicos de ácido isoftálico están funcionalizados con un grupo ácido o con un grupo hidrófobo.

18.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde la estructura base orgánica no peptídica es un calixareno.

19.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, uso que se reclama en la estructura base orgánica no peptídica es un calix[4]areno.

20.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde la pluralidad de grupos de ácido isoftálico se unen a la estructura base orgánica no peptídica de conformidad con la estructura (I): (1) en donde cada R1 se selecciona a partir del grupo que consiste de: en donde cada R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de:

21.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento se selecciona a partir del grupo que consiste de GFB201 , GFB202, GFB203, GFB204, GFB205, GFB206, GFB207, GFB208, GFB209, GFB210, GFB211 , GFB212, GFB213, GFB214, GFB215, GFB216, GFB217, GFB218, y GFB219.

22.- Ei uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento se dirige a los factores de crecimiento derivados de plaquetas, factor de crecimiento endotelial vascular, o una mezcla de cualesquiera de los precedentes.

23.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde un agente activo biológicamente es administrable de forma simultánea o secuencial al paciente.

24.- Un método útil para la inhibición de los factores de crecimiento a partir de la unión a las células, para la inhibición de la fosforilación estimulada por el factor de crecimiento, para la inhibición de la angiogénesis, para la inhibición del cáncer y crecimiento tumoral o una combinación de los mismos, en donde el método comprende poner en contacto al menos un compuesto para unión al factor de crecimiento o una sal farmacéuticamente aceptable de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento, a una célula in Vitro, en donde los compuestos para unión al factor de crecimiento comprenden una pluralidad de grupos acíclicos de ácido isoftálico unidos a un estructura base orgánica no peptídica; en donde cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento, o la sal farmacéuticamente de cualesquiera de los compuestos para unión al factor de crecimiento puede o puede no ser portado en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque cada uno de los grupos acíclicos de ácido isoftálico están funcionalizados con un grupo ácido o con un grupo hidrófobo.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la estructura base orgánica no peptídica es un calixareno.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la estructura base orgánica no peptídica es un calix[4]areno.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la pluralidad de grupos de ácido isoftálico se unen a la estructura base orgánica no peptídica de conformidad con la estructura (I): (I) en donde cada R1 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de: en donde cada R2 se selecciona independientemente a partir del grupo que consiste de:

29.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento se seleccionan a partir del grupo que consiste de GFB201 , GFB202, GFB203, GFB204, GFB205, GFB206, GFB207, GFB208, GFB209, GFB210, GFB211 , GFB212, GFB213, GFB214, GFB215, GFB216, GFB217.GFB218, y GFB219.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque cada uno de los compuestos para unión al factor de crecimiento se dirige a ios factores de crecimiento derivados de plaquetas, factor de crecimiento endotelial vascular, o una mezcla de cualesquiera de los precedentes.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende adicionalmente el suministro de manera simultánea o secuencial de un agente biológicamente activo a la célula in vitro.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque se inhibe la fosforilación de Erk1 , Erk2, Akt, o STAT3.