MXPA06007634A - Composiciones antivirales que inhiben infeccion con paramixovirus. - Google Patents

Abstract

La invencion se dirige a un antiviral para administrar a un huesped mamifero (p.e., un humano) susceptible de infeccion por paramixovirus, particularmente infeccion por virus sincitial respiratorio (RSV). En ciertas modalidades, una molecula del antiviral de invencion es un polipeptido, un polipeptido quimiocina, un fragmento de polipeptido quimiocina, una molecula pequena organica o un peptido mimetico, en donde la molecula inhibe o evita la infeccion por paramixovirus de una celula de mamifero.

Description

COMPOSICIONES ANTIVIRALES QUE INHIBEN INFECCIÓN CON PARAMIXOVIRUS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona de manera general con los campos de microbiología, virología, enfermedades infecciosas e inmunología. Más particularmente la invención se relaciona con polipéptidos, fragmentos de polipéptido y moléculas orgánicas pequeñas que inhiben o evitan la infección de un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un mamífero.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus sincitial respiratorio (RSV) es un virus RNA de hebras negativa no segmentada y es la causa principal de enfermedades del tracto respiratorio bajo (LRT) en niños pequeños, pacientes con liberación subyacente de anormalidades inmunológicas, y adultos de edad (Domachowske and Rosenberg, 1999; Hall, 2001). De hecho, sesenta y cinco millones de infecciones con RSV ocurren en el mundo cada año, dando como resultado 160, 000 muertes (Robbins and Freeman, 1988). Sólo en los Estados Unidos, 100, 000 niños son hospitalizados anualmente con casos severos de neumonía y broquiolitis que resultan de infección RSV (Glezen et ai., 1986; Katz, 1985). El cuidado hospitalario y ambulatorio para niños con infecciones RSV en los Estados Unidos se estimó en 1992 que costaba más de O340 millones por año (Wertz and Sullender, 1992).

Actualmente no se encuentra disponible una vacuna licenciada para evitar la enfermedad humana. Así, infantes inmunológicamente inocentes nacidos durante las estaciones epidémicas deben confiar en los anticuerpos maternalmente derivados para evitar enfermedades LRT severas originadas por RSV. Para infantes de alto riesgo esto puede ser problemático debido al estado inmune de la madre y la vida media finita del anticuerpo maternalmente derivado. Actualmente, dos medicinas biológicas, IVIG y anticuerpo monoclonal humanizado, palivizumab (Synagis®), están aprobados para prevenir la infección en infantes de alto riesgo (Hall, 2001; Krilov, 2002). Aunque los beneficios de inmunoprofilaxis son demostrables, los costos son significativos, además de las medicinas biológicas descritas anteriormente, existe un agente farmacéutico (ribavirina) licenciado para tratar enfermedades agudas del tracto respiratorio originadas por RSV (Torrence and Powel, 2002). Sin embargo, la ribavirina es un teratógeno y posee riesgos de seguridad para el personal hospitalario, los padres, y otros familiares de los niños, y como tal los beneficios de la ribavirina son controversiales (Hall, 2001; Krilov, 2002). Así, en ausencia de una vacuna licenciada, existe normalmente la gran necesidad de farmacéuticos y/o compuestos biológicos novedosos con efectividad mejorada y un perfil de seguridad creciente para evitar la liberación LRT originada por paramixovirus tales como RSV.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona ampliamente con composiciones antivirales que inhiben o previenen la infección en un mamífero. Más particularmente, la invención se relaciona con moléculas antivirales y composiciones farmacéuticas de éstas, que inhiben o evitan la infección de un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en células de mamífero.

Así, en ciertas modalidades, la invención está dirigida a una composición antiviral que comprende un polipéptido CCL5, en donde el polipéptido CCL5 inhibe la infección de un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un sujeto mamífero. En una modalidad particular, el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio (RSV). En otra modalidad, el polipéptido CCL5 inhibe la infección RSV al bloquear la interacción entre la proteína de fusión RSV (F) y la célula epitelial del mamífero. En ciertas modalidades, el polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 sintético o un polipéptido CCL5 recombinantemente expresado. En ciertas otras modalidades, el polipéptido CCL5 es biológicamente inactivo como una quimiocina en un sujeto mamífero. En una modalidad particular, el sujeto mamífero es un humano. En otras modalidades, el sujeto mamífero es un mamífero no humano domesticado seleccionado del grupo que consiste de una vaca, un caballo, un cerdo, un perro, un gato, una cabra y una oveja.

En otra modalidad, el polipéptido CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1. En ciertas modalidades, el polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 modificado con terminal NH2. En una modalidad particular, el polipéptido CCL5 modificado con terminal NH2 se selecciona del grupo que consiste de un aminooxipentano-CCL5 (AOP-CCL5), un Met-CCL5, un Na-nonanoil-CCL5 (NNY-CLL5), un CCL5 ?1-2 truncado y un CCL5 ?1-8 truncado. En otras modalidades, una composición antiviral de la invención comprende además uno o más fragmentos de péptidos CCL5, en donde los fragmentos comprenden aproximadamente 10 a 20 aminoácidos contiguos del polipéptido CCL5 de la ID DE SEC NO.: 1. En modalidades particulares, los uno o más fragmentos de péptidos CCL5 son seleccionados del grupo que consiste de ID DE SEC NO.: 1, ID DE SEC NO.: 2, ID DE SEC NO.: 3, ID DE SEC NO.: 4, ID DE SEC NO.: 5, ID DE SEC NO.: 6, ID DE SEC NO.: 7, ID DE SEC NO.: 8, ID DE SEC NO.: 9, ID DE SEC NO.: 10, ID DE SEC NO.: 11, ID DE SEC NO.: 12, ID DE SEC NO.: 12, ID DE SEC NO.: 13, ID DE SEC NO.: 14, ID DE SEC NO.: 15, ID DE SEC NO.: 16, ID DE SEC NO.: 17, y ID DE SEC NO.: 18. En otras modalidades, un fragmento de péptido CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 2. En ciertas modalidades, el fragmento de péptido de la ID DE SEC NO.: 2 se define además como un péptido con terminal NH2 de la ID DE SEC NO.: 1. En ciertas otras modalidades, el polipéptido CCL5 se define de además como un polipéptido CCL5 humano.

En aún otras modalidades, la composición antiviral de la invención comprende un péptido mimético del terminal NH2 del polipéptido CCL5 de la ID DE SEC NO.: 1. En una modalidad particular, el péptido mimético del terminal NH2 del polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 retroinvertido que comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 19, ID DE SEC NO.: 20 o ID DE SEC NO.: 21.

En ciertas otras modalidades, la composición antiviral de la invención comprende además una molécula orgánica que se une al receptor de quimiocina CCR3. En ciertas de estas modalidades; la molécula orgánica es un agonista receptor CCR3. En una modalidad particular, la molécula orgánica comprende una o más de las siguientes estructuras químicas (») fll) (Hl).

En ciertas otras modalidades, la composición antiviral de la invención se administra a un sujeto mamífero por administración intranasal o administración parenteral. En otras modalidades, una composición antiviral de la invención, comprende además una molécula orgánica que es una antagonista CCR1 o un antagonista CCR5. En ciertas modalidades, una molécula orgánica que es un antagonista CCR1 comprende una o más de las siguientes estructuras químicas: (VI) En ciertas modalidades, una molécula orgánica que es un antagonista CCR5 comprende una o más de las siguientes estructuras químicas: (VII) (VIII) (X) (XI) En otras modalidades, la invención está dirigida a un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido que codifican polipéptidos CCL5. En aun otras modalidades, la invención está dirigida a una célula huésped transfectada, transformada o infectada con el vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido CCL5.

En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición antiviral que comprende un fragmento de péptido con terminal NH2 del polipéptido CCL5, en donde el fragmento comprende aproximadamente 10 a 20 aminoácidos contiguos del terminal NH2 de un polipéptido CCL5, en donde el fragmento inhibe la infección de un virus de la Familia paramixoviridae (paramixovirus) en un sujeto mamífero. En una modalidad particular, el paramixovirus en RSV. En otra modalidad, el polipéptido CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1. En otras modalidades, el fragmento de péptido con terminal NH2 comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la ID DE SEC NO.: 2, ID DE SEC NO.:3, ID DE SEC NO.: 4, ID DE SEC NO.: 5, ID DE SEC NO.: 6, ID DE SEC NO.: 7, ID DE SEC NO.: 8, ID DE SEC NO.: 9, ID DE SEC NO.: 10, ID DE SEC NO.: 11, ID DE SEC NO.: 12, ID DE SEC NO.: 13, ID DE SEC NO.: 14, ID DE SEC NO.: 15, ID DE SEC NO.: 16, ID DE SEC NO.: 17 y ID DE SEC NO.: 18. En ciertas modalidades, el fragmento de péptido con terminal NH2 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 2. En ciertas otras modalidades, la composición es biológicamente inactiva como una quimiocina en un sujeto mamífero. En aun otras modalidades, la composición antiviral se suministra a un sujeto mamífero mediante administración ' intranasal o administración parenteral. En aun otras modalidades, el fragmento de péptidos CCL5 con terminal NH2 inhibe la infección RSV al bloquear la interacción entre la proteína de fusión RSV (F) y una célula epitelial del mamífero. En ciertas otras modalidades, la composición antiviral comprende además uno o más polipéptidos CCL5 modificados con terminal NH2 seleccionados del grupo que consiste de un aminooxipentano-CCL5 (AOP-CCL5), un Met-CCL5, un Na-nonanoil-CCL5 (NNY-CCL5), un CCL5 truncado ?1-2 y un CCL5 truncado ?1-8. En una modalidad, una composición antiviral comprende además un péptido mimético del terminal NH2 del polipéptido CCL5 de la ID DE SEC NO.: 1. En una modalidad particular, el péptido mimético del terminal NH2 y el polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 retroinvertido que comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 19, ID DE SEC NO.: 20 o ID DE SEC NO.: 21. En otra modalidad, una composición antiviral comprende además una molécula orgánica que es un antagonista de un receptor CCR1, un receptor CCR3 o un receptor CCR5. En una modalidad particular, un antagonista de un receptor CCR1, un receptor CCR3 o un receptor CCR5 comprende una estructura como se representa mediante las fórmulas l-XII.

En ciertas otras modalidades, la invención está dirigida a un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2. En ciertas otras modalidades, la invención está dirigida a una célula huésped trasnsfectada, transformada o infectada con el vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un fragmento de péptidos CCL5 con terminal NH2.

En ciertas otras modalidades, la invención está dirigida a una molécula mimética orgánica pequeña que es diseñada mediante modelamiento molecular basado en computadora utilizando las coordenadas atómicas X, Y, Z de los primeros quince aminoácidos del terminal NH2 del CCL5 de la ID DE SEC NO.: 1, en donde las coordenadas X, Y, Z, se encuentran en el archivo del Brookhaven Protein Data Bank seleccionadazas del grupo que consiste de 1RTN, 1RTO, 1EQT, y 1B3A. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición antiviral que comprende una molécula orgánica diseñada por modelamiento molecular bajado en computadora descrito anteriormente.

En ciertas otras modalidades, la invención está dirigida a un péptido mimético del terminal NH2 del polipéptido CCL5 en donde el péptido mimético inhibe la infección mediante un virus de la Familia Paramixovíridae (paramixovirus) en un sujeto mamífero. En ciertas modalidades, el mimético es diseñado por moledamiento molecular basado en computadora utilizando las coordenadas atómicas X, Y, Z de los primeros quince aminoácidos del terminal NH2 del CCL5 de la ID DE SEC NO.: 1, en donde las coordenadas X, Y, Z están comprendidas en el archivo del Brookhaven Protein Data Bank seleccionadazas del grupo que consiste de 1RTN, 1RTO, 1EQT, y 1B3A. En una modalidad particular, el péptido mimético es un mimético de giro inverso. En ciertas modalidades, el mimético de giro inverso es un mimético de giro ß, un mimético de giro ß monocíclico, un mimético de giro ß bicíclico, un mimético de giro y o un mimético de giro y monocíclico. En ciertas otras modalidades el péptido mimético está comprendido en una composición antiviral.

En ciertas otras modalidades, la invención esta dirigida a un método para prevenir o inhibir la infección mediante un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un huésped mamífero. El método comprende administrar al huésped una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición antiviral de la invención.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada, de las modalidades preferidas de ésta, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra que el CCL5 inhibe la infección RSV en la superficie epitelial. Las monocapas de la célula Hep-2 fueron pretratadas (una hora antes de la infección) con las dosis indicadas del rCCI5 recombinante (círculos) o met-CCL5 (cuadrados) antes de la infección con RSV A2. Tres días después, las placas fueron enumeradas y presentadas como contagio porcentual (desviación estándar ± 1) con relación a los posos de control (100% de contagio) incubados con virus en medio solo y no expuestos a quimiocina.

La figura 2 muestra la expresión del CCR1, CCR3 y CCR5 sobre Hep-2 y células A549. Las monocapas de célula Hep-2 y A549 fueron suavemente removidas de los matraces de cultivo de tejido utilizando un raspador de célula. Las células fueron teñidas con CCR1 antihumano o anti-CCR3 mAb conjugado a ficoeritrina o anti-CCR5 conjugado a FITC (FL2-H, eje x, líneas sólidas). Números relativos de células (conteos) son mostrados en el eje y.

La figura 3 muestra la unión de los péptidos sintéticos traslapantes del CCL5 a las monocapas de célula Hep-2. Las monocapas de célula viable Hep-2 fueron incubadas (4°C) con concentración crecientes (0.0039-4.0 µg/ml) del péptido biotinilado denotado. Después de enjuague, las monocapas fueron fijadas en metanol y se visualizo la unión del péptido mediante ELISA a OD450-550.

Las figuras 4A y 4B muestran gráficas de hidropatía del polipéptido CCL5 versus el polipéptido CCL3. La figura 4A es una gráfica de hidropatía del CCL5 (aminoácidos 5 a 68 de la ID DE SEC NO.: 1) alineada con CCL3 (aminoácidos 5 a 69 de la ID DE SEC NO.: 22). La figura 4B es una gráfica de hidropatía del CCL5 (aminoácidos 5 a 31 de la ID DE SEC NO.: 1) alineada con CCR3 (aminoácidos 5 a 31 de la ID DE SEC NO.: 22). La escala de hidropatía sobre el eje y se generó utilizando valores de hidropatía de Kyte y Doolittle (1982), con una ventana promedio que mueve nueve aminoácidos. Los valores de hidropatía negativos sobre la escala representan un ambiente hidrofílico y los numero positivos sobre la escala representan un ambiente hidrófobo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención descrita a continuación esta dirigida a una necesidad en la técnica de moléculas antivirales para administrar a un huésped mamífero (por ejemplo un humano) susceptible de infección por paramixovirus particularmente infección virus sincitial respiratorio (RSV). Así, en ciertas modalidades está dirigida a moléculas antivirales novedosas y a composiciones farmacéuticas de estos. Como se define a continuación una "molécula antiviral" de la invención es un "polipéptido", un "polipéptido de quimiocina", una quimiocina "fragmento de polipéptido" (en lo sucesivo un "fragmento de péptido"), una molécula pequeña orgánica (o un "mimético de molécula pequeño") o un "péptido mimético" (o "péptido mimético"), en donde la molécula antiviral inhibe o previene la infección por paramixovirus de una célula de mamífero.

Las quimiocinas son citoquinas de peso molecular pequeño que juegan un papel central en la dirección del movimiento de las células hacia un sitio de daño o infección (Baggiolini, 2001). Por ejemplo, la quimiocina CCL5 (también conocida como "RANTES"; que es un acrónimo para "célula T normal regulada sobre activación, expresasada y secretada) se cree que juega un papel principal en el reclutamiento de leucocitos a áreas de daño de tejido originado por replicación (Apia and Rowland-Jones, 2001; Moser and Loetscher, 2001). Las quimiocinas están dividas en subfamilias basadas en el número y espaciamiento de motivos de cisterna conservados denominados C, CC, CXC, y CX3C. Se ha establecido previamente que la infección con RSV induce la expresión de gen y la secreción de quimiocinas en células epiteliales de vías aéreas (Harrison, 1999; Noah et al., 2002; Zhang, 2001). Además, ciertos polipéptidos de quimiocina de la familia CC han demostrado que poseen potentes propiedades antivirales contra virus de la ¡nmunodeficiencia humana tipo (VIH-1) (Lusso, 202; Lehner, 2002; Proudfoot et al., 2003). Por ejemplo, el VIH-1 entra a las células T y a los macrófagos a reunir el CCR5 como un correceptor primario. Los polipéptidos de quimiocina CCL5 (RANTES), CCL3 (MIP-1a) y CCL4 (MIP-1ß) son ligandos inhibitorios que bloquea el CCR5 como un correceptor de VIH-1 y de esta manera evitar la infección con VIH-1 - La presenta invención muestra por primera vez que el polipéptido CCL5 recombinante (rCCL5), el polipéptido CCL5 modificado con terminal N y los fragmentos de péptido CCL5 con terminal N (a) inhiben la infección de células epiteliales humanes con RSV (ejemplo 2), (b) bloquean la interacción entre las células epiteliales y la proteína de fusión (F) del RSV (ejemplo 3) y (c) inhibe la infección RSV in vivo (ejemplo 4).

Como contraste a los reportes publicados de inhibición de quimiocina de infección con VIH-1 (por ejemplo, las quimiocinas CCL3, CCL4 y CCL5) (Lusso, 2002; Lehmer, 2002; Proudfoot et al., 2003), los datos de la presente invención demuestran que la inhibición de quimiocina de la infección de RSV solo ocurre con CCL5, pero no con otros inhibidores CC tales como CCL3 (MIP-1a) o CCL4 (MIP-1ß) (ver ejemplo 2), que sugieren que el RSV puede utilizar un receptor diferente a CCR5 (es decir, como contraste al V1H-1).

Las células epiteliales humanas fueron examinadas mediante citometría de flujo para receptores (CCR1, CCR3 y CCR5) conocidos por unirse al CCL5. Los resultados demostraron que el CCR3 (pero no el CCR1 o CCR5) se expresaba sobre la superficie de las células epiteliales Hep-2 y A549 (ver, ejemplo 3 y figura 1), que sugiere que el CCL5 bloquea el o las interacciones entre RSV y CCR3 sobre la superficie de la célula epitelial. Las quimiocinas CC recombinantes adicionales conocidas por unirse al CCR3 (Baggiolini, 2001) fueron ensayadas para determinar si ellas también reducían el contagio del RSV. Antes del tratamiento de las monocapas de célula HEp-2 con cantidades crecientes de CCL11 recombinante (eotaxina), CCL8 (MCP-2) o CCL15 (MIP-1 d) no dañan el contagio por RSV (tabla 10 y tabla 12). Además, la preincubación de las monocapas de célula HEp-2 en la presencia de anticuerpos receptores de antiquimiocina poli o monoclonal dirigidos contra CCR1, CCR3 y/o CCR5 no reducen el contagio del RSV (datos no mostrados).

Se ha demostrado previamente in vitro, utilizando cepas RSV mutantes a las que les faltas la proteína SH (hidrófoba pequeña) y/o la proteína G (unión), que la proteína F (fusión) sola es suficiente para mediar la unión del RSV (Karron et al., 1997). Así, la inhibición del CCL5 se investigó adicionalmente al examinar la capacidad del rCCL5 para inhibir la infección de la sepa RSV deficiente en la proteína G y/o la proteína SH. Una serie de estudios fueron desarrollados utilizando cepas RSV genéticamente modificadas suprimidas de la proteína SH (RSV?RH) o con el ectodominio del terminal C de la proteína G truncado en el aminoácido 118 (RSV?118). Estudios indicaron que el tratamiento con 10 µg/ml de rCCI5 o Met-CCL5 redujo el contagio de los virus RSV?118 y RVS?SH con relación a las células de control cultivadas con virus en medios solos (ejemplo 3, tabla 15). Antes del tratamiento con rCCL5 (10 µg/ml) también redujeron la infección mediante cp32/D1 mutante (al que le faltan tanto las proteínas SH como G) y las cepas B1 padre. del RSV (ejemplo 3, tabla 15). Así, la infección inhibida por rCCL5 mediante las cepas RSV deficientes en proteínas G y/o SH.

Al determinar que región del CCL5 inhibe la infección por RSV, fue sintetizada una serie de 9 fragmentos de péptidos CCL5 (15-meros, que se traslapan mediante 7 aminoácidos) que representan todos sesenta y ocho aminoácidos de la ID DE SEC NO.:1 (Ejemplo 4 y tabla 2) y se ensayaron en un modelo de ratón in vivo para infección. El péptido 1 (ID DE SEC NO.: 2), que representa los primeros quince residuos de aminoácido del terminal NH2 del CCL5, fue el péptido mas inhibitorio in vivo cuando se administro simultáneamente con o antes de infección RSV (ejemplo 4, tabla 16 y tabla 17).

Tomados juntos los datos de la presente invención indican un mecanismo novedoso de inhibición CCL5, en donde el CCL5 bloquea el o la interacciones que ocurren entre la proteína F y el sobre RSV y la superficie de célula epitelial. Además, los fragmentos de péptidos CCL5, que representan la porción del terminal NH2 del CCL5, se han identificado que inhiben la infección por RSV.

Así, en ciertas modalidades, una molécula antiviral de la invención es un polipéptido CCL5, un polipéptido CCL5 modificado terminado en NH2, un fragmento de péptidos CCL5 con terminal NH2, un fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2 modificado, un péptido mimético designado para semejar una porción terminal NH2 del polipéptido CCL5 o una molécula pequeña designada para semejar una porción terminal NH2 del polipéptido CCL5, en donde la molécula antiviral inhibe o previene la infección por Paramixovirus de una célula de mamífero, particularmente una célula epitelial. Como se describe a continuación, un "paramixovirus" comprende virus de la familia paramixoviridae, incluyendo, pero no limitados, RSV, virus de Parainfluenza (PIV) tipos 1-4 virus del sarampión, virus de paperas, Metapneumovirus humano, virus Nipah, virus Hendra, virus Rinderpest y virus del moquillo canino.

A. moléculas antivirales Como se estableció supra, una molécula antiviral de la invención es un polipéptido, o un fragmento de péptido, una molécula pequeña orgánica o un péptido mimético que inhibe o evita la infección por paramixovirus de una célula de mamífero. Más particularmente, una molécula antiviral es un polipéptido, un fragmento de péptido una molécula pequeña orgánica o un péptido mimético que bloquea, inhibe o previene la o las interacciones entre la proteína F del paramixovirus y un receptor de superficie de célula epitelial, reuniendo de esta manera el paramixovirus o evitando de esta manera que el paramixovirus entre a la célula. Los polipéptidos antivirales (y los fragmentos de estos) y los péptidos miméticos antivirales/moléculas miméticas pequeñas de la invención se establecen adelante en las secciones A.1 y A.2 respectivamente. 1. CCL5 y Fragmentos de estos En ciertas modalidades, una molécula antiviral de la invención es un polipéptido CCL5, un polipéptido CCL5 químicamente modificado o un polipéptido CCL5 genéticamente modificado. En una modalidad particular, un polipéptido CCL5 se modifica en su terminal NH2. En otras modalidades una molécula antiviral de la invención es un fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2, un fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2 químicamente modificado o un fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2 genéticamente modificado el fragmento de péptido comprende una porción de terminal NH2 de un polipéptido CCL5 que inhibe la infección por paramixovirus de una célula de mamífero.

Como se define posteriormente, un polipéptido CCL5 en longitud completa tiene un peso molecular d,e aproximadamente 7.8 kDa y comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1. En ciertas modalidades, un polipéptido CCL5 de longitud completa de la ID DE SEC NO.: 1 es un polipéptido CCL5 sintético o un polipéptido CCL5 recombinantemente expresado. Un polipéptido CCL5 de longitud completa de la invención comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1, en donde el polipéptido inhibe o previene la infección por paramixovirus de una célula de mamífero. Así, un polipéptído CCL5 comprende un polipéptido que comprende (a) una secuencia de aminoácido mostrada en la ID DE SEC NO.: 1 (b) variantes alélicas de ocurrencia natural del polipéptido de la ID DE SEC NO.: 1 (c) polipéptidos aislados de los organismos diferentes del humano (por ejemplo ortólogos de polipéptidos CCL5) y (d) polipéptido CCL5 modificados con terminal NH2 de la ID DE SEC NO.: 1.

Una variante alélica de un polipéptido CCL5 de acuerdo con la presente invención comprende un polipéptido (1) que es aislado de una célula humana y (2) que contiene sustancial homología con el polipéptido CCL5 humano de la ID DE SEC NO.: 1. Las variantes alélicas de un polipéptido CCL5 son variantes de secuencias de aminoácidos de ocurrencia natural del polipéptido CCL5 que mantiene la capacidad para inhibir o prevenir la infección por paramixovirus de una célula de mamífero. Así, una variante alélica del polipéptido CCL5 se define como "variante funcional". Las variantes contienen solamente substituciones conservadoras de uno o más aminoácidos de la ID DE SEC NO.: 1, o la sustitución, supresión o inserción de residuos no críticos en reportes no críticos del polipéptido. Por ejemplo, un fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2 (ID DE SEC NO.: 2) se observo que inhibía la infección por paramixovirus de células epiteliales de mamífero (ejemplo 4). Además, los estudios estructurales y funcionales de la inhibición de CCL5 de la infección VIH-1 sugiere además que los residuos de aminoácido Phe12, Tyr14, y Ile15 del CCL5 son críticos para actividad anti-VIH-1 (Nardese et al., 2001). Así, en ciertas modalidades preferidas, una variante alélica de un polipéptido CCL5 de longitud completa comprende un polipéptido que tiene homología sustancial con un polipéptido CCL5 humano de la ID DE SEC NO.: 1, en donde el polipéptido no comprende una sustitución de supresión de aminoácidos Phe12, Tyr14 y Ile15.

La presente invención comprende además ortólogos no humanos de los polipéptidos CCL5. Los ortólogos de los polipéptidos CCL5 son polipéptidos que son aislados de organismos de mamífero, no humanos y poseen las propiedades antivirales del polipéptido CCL5. Los ortólogos del polipéptido CCL5 son fácilmente identificados por que comprenden una secuencia de aminoácido que es sustancialmente homologa con la ID DE SEC NO.: 1. programas tales como el BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al. ,1990), AACornpldent y AACompSim (Wilkens et al., 1998) están públicamente disponibles en el servidor de proteómicos ExPASy (Expert Protein Analysis Sistem) del Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y son particularmente útiles para identificar los polipéptidos homólogos en bases de datos públicas tales como el GenBank, Protein Data Bank (PDB), el SwissProt, el Protein Information Resource (PIR) y el Protein Research Foundation (PRF).

Como se estableció previamente, las quimiocinas (también conocidas como citocinas quimiotácticas) son polipéptidos con peso molecular pequeño (por ejemplo aproximadamente 8-10 kDa) que juegan un papel central para dirigir o reclutar el movimiento de células (por ejemplo monolitos) hacia un sitio de daño o infección. En ciertas modalidades, un polipéptido CCL5 (o un fragmento de este) es un polipéptido CCL5 químicamente modificado o un polipéptido CCL5 genéticamente modificado, de tal forma que el polipéptido CCL5 modificado es biológicamente inactivo como un agonista de quimiocina en un sujeto mamífero.

Por ejemplo, una modificación CCL5 es aquella que disminuye, reduce o inactiva la actividad biológica del polipéptido CCL5 como un agonista de la quimiocina, en donde el polipéptido CCL5 modificado retiene su capacidad para inhibir la infección por paramixovirus. Como se definió aquí, un "agonista de quimiocina" o la "actividad biológica de un quimiocina o agonista de quimiocina" se refiere a la capacidad de un polipéptido de quimiocina (por ejemplo CCL5) para inducir o estimular quimiotaxis, movilización de calcio, inflamación y similar.

La actividad agonista de un polipéptido de quimiocina de la invención se detecta o se mide mediante métodos tales como ensayos de movilización de calcio, ensayos de quimiotaxis, ensayos de N-Acetil-D-D-glucosamidasa y similares (Proudfoot et al., 1996; Simmons et al., 1997; Gong and Clark-Lewis, 1995; Fincham, 1988) (ejemplo, ver ejemplo 6).

En ciertas modalidades, un polipéptido CCL5 es genéticamente y/o químicamente modificado en su terminal NH2, en donde la modificación al terminal NH2 inactiva el CCL5 como una agonista de quimiocina. Varias modificaciones al terminal NH2 del CCL5 han sido descritas en la técnica a las cuales inactivan la actividad de quimiocina del CCL5. por ejemplo, cuando la metionina de iniciación (Met) del CCL5 (RANTES) es retenida, el polipéptido Met-CCL5 (Met-RANTES) resultante (1) es inactivo como un agonista de quimiocina (por ejemplo el Met-CCL5 no estimula o induce la movilización de quimiotaxis de Ca2+), (2) antagonista del efecto "quimiocina" inducido por CCL5 y CCL3 (MIP-1") en el receptor CCR5 (Proudfoot et al., 1996) y (3) inhibe la infección HIV-1 de los cultivos de macrófago humano primarios (Simmons et al., 1997). Como se define posteriormente, un polipéptido "Met-CCL5" o "Met-RANTES" comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1 y además comprende un terminal NH2 de aminoácido de metionina al residuo de serina en la posición 1 de la ID DE SEC NO.: 1.

Los polipéptidos CCL5 con terminal NH2 truncado también han sido descritos los cuales inactivan la actividad de quimiocina del CCL5. por ejemplo, Arenzana-Seisdedos et al., (1996) sintetizaron un polipéptido CCL5 truncado en el cual los primeros ocho aminoácidos fueron suprimidos (denominados RANTES (9-68)), denominados en lo sucesivo como "CCL5(?1-8)" y un polipéptido truncado en el cual los primeros dos aminoácidos fueron suprimidos (denominados RANTES(3-68)), denominados en lo sucesivo como "CCL5(?1-2)", en donde a los polipéptidos truncados les faltaban las propiedades quimiotáctica y de activación de leucocito, e inhibieron la infección de VIH-1. Como se define posteriormente, un polipéptido "CCL5(?1-8)" comprende los residuos de aminoácido 9 a 68 de la ID DE SEC NO.: 1. Como se define posteriormente, un polipéptido "CCL5(?1-2)" comprende los residuos de aminoácido 3 a 68 de la ID DE SEC NO.: 1.

Las modificaciones químicas de los polipéptidos CCL5 también han sido descritas las cuales inactivan la actividad de quimiocina CCL5. Estas modificaciones incluyen la adición de un grupo de aminooxipentano (denominada como "AOP-RANTES" o "AOP-CCL5") al residuo de serina con terminal NH2 del CCL5 (Simmons et al., 1997) y \a adición de un grupo N"-nonanoilo (denominado como "N"-nonanoilo-RANTES", "NNY-RANTES" o "NNY-CCL5") al residuo de serina con terminal NH2 del CCL5 (Mosier et al., 1999). Como se define posteriormente un polipéptido AOP-CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1 y además comprende un grupo de aminooxipentano covalentemente unido al primer residuo de serina de la ID DE SEC NO.: 1. Como se define posteriormente, un polipéptido NNY-CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 1 y además comprende un grupo N -nonanoilo covalentemente unido al primer residuo de serina de la ID DE SEC NO.: 1. Alternativamente, el residuo Ser1 es sustituido con otro aminoácido (por ejemplo Gly1),en donde el aminoácido sustituido en la posición 1 comprende un AOP o un NNY covalentemente unido.

Así, en ciertas modalidades, las modificaciones y cambios son hechas en la secuencia primaria del polipéptido CCL5 de la invención el cual inactiva el CCL5 como un agonista de quimiocina, en donde el CCL5 modificado detiene sus propiedades anti-paramixovirus. Por ejemplo, la actividad funcional y/o biológica de un polipéptido se determina mediante interacciones complejas en el nivel de la estructura primaria, secundaria y terciaria, y como tal, ciertas sustituciones de secuencia de aminoácido pueden ser hachas en una secuencia de polipéptido (O su secuencia codificante de ADN subyacente) y se obtiene un polipéptido con propiedades similares (por ejemplo propiedades antivirales).

Para elaborar tales cambios se considera el índice hidropático de los aminoácidos (por ejemplo, ver Figura 10A y 10B). La importancia del índice de aminoácido hidropático para conferir función biológica interactiva sobre un polipéptido se entiende generalmente en la técnica (por ejemplo, Kyte and Doolittle, 1982; Eisenberg et al., 1984; Hopp and Woods, 1981). Se conoce que ciertos aminoácidos son sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar un índice o calificación hidropática similar y resultan aún en un polipéptido con actividad biológica similar. Por ejemplo, el carácter hidropático relativo del residuo de aminoácido afecta la estructura secundaria y terciaria del polipéptido resultante, lo cual a su ves define la interacción de los polipéptidos con otras moléculas tales como encimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos y similares.

Como se subraya anteriormente, la sustituciones de aminoácido están generalmente basadas en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena natural de aminoácido por ejemplo, su hidrofobicidad, hídrof ilicidad, carga, tamaño, y similares. Las sustituciones de ejemplo que toman varias de las anteriores características en consideración son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y se establecen adelante en la tabla 1.

TABLA 1 SUBSTITUCIONES DE AMINOÁCIDO En ciertas modalidades, un polipéptido CCL5 se modifica en su terminal NH2 en donde la modificación al terminal NH2 inactiva al CCL5 como un agonista de quimiocina. Así, en ciertas de estas modalidades, el polipéptido CCL5 se modifica en su terminal NH2 utilizando mutagénesis especifica del sitio (por ejemplo, CCL5?1-8, Arenzana-Seisdedos et al., 1996). Alternativamente, un polipéptido CCL5 (o fragmento de este) se modifica en su terminal NH2 mediante modificaciones químicas o sintéticas conocidas en el arte (por ejemplo AOP-CCL5, Simmons et al., 1997; NNY-CCL5, Mosier et al., 1999).

La mutagénesis especifica de sitio también es útil en la preparación de polipéptidos CCL5 de segunda generación (por ejemplo, un polipéptido antiviral (o fragmento de éste) que tiene actividad de quimiocina reducida y/o un polipéptido CCL5 (o fragmento de este) que tiene propiedades antivirales implementadas) a través de mutagénesis especifica del ADN subyacente. La mutagénesis especifica de sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótido especificas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como también un numero suficiente de nucleótidos adyacentes, para suministrar una secuencia iniciadora de tamaño suficiente y una complejidad de secuencia para formar un dúplex estable a ambos lados en que la unión de su presión esta haciendo atravesada. Típicamente, un iniciador de aproximadamente de 17 a 25 nucleótidos de longitud es el preferido, con aproximadamente 5 o 10 residuos a ambos lados de la unión de la secuencia que esta siendo alterada. La técnica de la mutagénesis especifica de sitio- conocido en el arte y típicamente emplea un vector fago que puede existir tanto en una hebra simple como en una hebra de forma doble (por ejemplo ver U.S. 5,556,747; patente U.S. 5,789,166 y patente U.S. 6,391,548, que se incorpora cada una como referencia aquí en su totalidad).

En modalidades particulares, la invención esta dirigida a fragmentos de polipéptidos CCL5. Como se utilizan aquí, los términos "fragmento de polipéptido", "fragmento de péptido" o "fragmento de proteínas" son utilizados intercambiable mente. Como se define posteriormente un fragmento de péptido CCL5 es un polipéptido CCL5 que tiene una secuencia de aminoácido que es completamente la misma como parte, pero no toda la secuencia de aminoácido CCL5 de longitud completa o madura. Así, el fragmento de polipéptido comprende, por ejemplo, al menos siete o mas (por ejemplo 8,10,12,14,16,18,20, o más) aminoácidos contiguos del polipéptido CCL5 de la ID DE SEC NO.: 1. Un fragmento de péptido CCI5 se produce o se genera por vía de métodos de expresión recombinante, química de péptido sintético o mediante clivaje químico o clivaje enzimático de un polipéptido CCL5 de longitud completa. Los fragmentos son de "permanencia libre" o comprendidos dentro de un polipéptido mayor del cual ellos forman una parte o región, más preferiblemente como una región simple, contigua. En una modalidad, un fragmento de péptido CCL5 comprende aproximadamente 10 a 20 aminoácidos contiguos (por ejemplo un 10-mero, un 11-mero, un 12-mero, un 13-mero, un 14-mero, un 15-mero, etc.) del polipéptido CCL5 de longitud completa de la ID DE SEC NO.: 1.

Como se describió en el ejemplo 4, una serie de nueve fragmentos de péptido CCL5 traslapantes (15-meros) fueron generados (ver tabla 2 adelante) y vía de ensayos de infección RSV in vitro e in vivo. Se observó en estos ensayos que el péptido numero 1 (ID DE SEC NO.: 2), que representa los primeros quince aminoácidos del terminal NH2 del CCL5 (es decir, los aminoácidos 1-15 de la ID DE SEC NO.: 1), fue el más inhibitorio de los nueve péptidos CCL5 traslapantes ensayados. También es conocido en la técnica de las quimiocinas, que los fragmentos de péptidos CCL5 del terminal NH2 inhiban la infección VIH-1 de linfocitos. Por ejemplo, Nardese et al. (2001) diseño una serie de péptidos 12-mero sintéticos que comprenden tanto el NH2-Loop como los residuos de hebra D1 que forman la senda hidrófoba sobre el CCL5 (por ejemplo, ver sección A-2 y tabla 5A adelante), -19-mero que se extiende tanto en grupo NH2-Loop como el Di-hebra y un 24-mer cíclico que expande el Cys11-Cys43. Estos péptidos fueron asignados (Ac) y amidatados (NH2) en la posición de aminoácido indicada adelante. En un ensayo de infección aguda, la potencia anti-VIH-1 del 19-mero que se extiende tanto en NH2-Loop como el grupo aromático Di-hebra (Ac-Cys 11-Tyr29- NH2; ID DE SEC NO.: 16) fue significativamente superior que aquel del dodecámero derivado de NH2-Loop Ac-Cys11-Ala 22- NH2 (ID DE SEC NO.: 13) (ID50 medio = 8.9 +/-3.8 µM versus 51.5 +/- 6.3 µM ; P < 0.0001 . Dos péptidos más cortos a los que les falta un grupo aromático Di-hebra (Cys11-lys25 y Cys11 Glu26) fueron menos efectivos (ID50 media = 48.1 +/-6.8 µM y 44.7 +/- 3.3 µM, respectivamente), confirmando la importancia de tal grupo aromático para la actividad antiviral VIH-1. Un 24-mero cíclico que extiende la región entera entre la segunda y tercera cisternas (Cys11-Cys34 cíclicas; ID DE SEC NO.: 17) inhibió VIH-1 más potentemente que en dodecamero original (ID DE SEC NO.: 13) (ID50 media = 29.8 +/-1.6 µM), aunque menos del 19-mero (ID DE SEC NO.: 16). Ningún efecto se vio con un derivado de péptido cíclico de control co-lineal derivado del ligando CXR4 SDF-1. Estos hallazgos demostraron que el grupo aromático dentro de la hebra D1 el CCL5 es crucial para la actividad anti-VIH-1, que confirma que esta región, junto con el NH2-Loop, está involucrada en la interfase del receptor CCR5.

Los fragmentos de péptido CCI5 que inhibieron la infección por RSV (Tabla 2; péptido número 1) y la infección de VIH-1 Tabla 3) fueron alineados y se muestran en la Tabla 4 adelante. También se presenta en la Tabla 4 (texto resaltado) un fragmento de péptido CCL5 de consenso (péptido No. 17) que comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 18.

Tabla 2 SECUENCIAS DE AMINOÁCIDO DE LOS PENTADECAMEROS DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS CCL5 TRASLAPANTES (15- MEROS) Tabla 3 SECUENCIAS DE AMINOÁCIDO DE LOS DODECAMEROS CCL5 ANTI-HIV (12-MEROS), UN NONADECAMERO CCL5 (19-MEROS) Y UN 24-MERO CÍCLICO Tabla 4 ALINEAMIENTO DE LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDO DE LOS FRAGMENTOS CCL5 ANTI-RSV Y ANTI-VIH-1 Y LA SECUENCIA DE AMINOÁCIDO DE CONSENSO.

Así, en ciertas modalidades, un fragmento de péptido CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la ID DE SEC NO.: 2, que representa los 15 residuos terminales NH2 de un polipéptido CCL5 en longitud completa. En otras modalidades, el péptido CCL5 de la ID DE SEC NO.: 2 se modifica en uno o más de sus residuos de aminoácido con terminal NH2. En otras modalidades, un fragmento de péptido CCL5 comprende una secuencia de aminoácido de la SEQ ID N: 18 o un fragmento modificado con terminal NH2 de éste. En ciertas otras modalidades, la secuencia primaria y secundaria del fragmento de péptidos CCL5 de la ID DE SEC NO.: 2, ID DE SEC NO.: 11, ID DE SEC NO.: 12, ID DE SEC NO.: 13, ID DE SEC NO.: 14, ID DE SEC NO.: 15, ID DE SEC NO.: 16, ID DE SEC NO.: 17 o ID DE SEC NO.: 18, se utiliza para diseñar un péptido mimético o una molécula mimética pequeña orgánica como se establece adelante en la sección A.2.

Se contempla en ciertas modalidades de la invención que el polipéptido CCL5 es clivado en fragmentos mediante clivaje clínico o enzimático. Este se logra al tratar polipéptidos CCL5 purificados con una enzima proteolítica (es decir una proteinasa) que incluye, pero no está limitada a, proteinasas de serina (por ejemplo quimiotripcina, tripsina, plasmita, elastasa, trombina, substilina) proteinasas de metal (por ejemplo carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B, leucina aminopeptidasa, termolicina, colagenasa), proteinasas de tiol (por ejemplo, papaina, bromelaina, proteinasa de estreptococo, clostripaina) y/o proteinasas de ácido (por ejemplo pepsina, gastricsina, tripsinógeno). Los fragmentis d epolipéptido también son generados utilizando medios químicos tales como tratamiento del polipéptido con bromuro de cianógeno (CNBr), ácido 2-nitro-5-tiocianobenzoico, ácido isobenzoico, BNPA-scatole, hidroxilamina o solución de ácido diluido. En otras modalidades, los fragmentos de polipétido CCL5 de la invención son recombinantemente expresados o preparados por vía de métodos de síntesis de péptido conocidos en la técnica (Barany et al., 1997; Simmons et al., 1997; Proudfoot ef al., 1996; Proudfoot et al., 1999; Patente U.S. 5,258,454) como se describió en el ejemplo 1. 2. Péptido Miméticos y Miméticos de Molécula Pequeña Orgánica.

Una aproximación común a un diseño de droga involucra el examen de interacción entre proteína-proteína asociadas con una enfermedad particular, seguida por el diseño de moléculas pequeñas que pueden mimetiza o unirse a unas de las proteínas interactuantes. A menudo la bioactividad se deriva solamente de una pequeña región localizada de una superficie de proteína creada por elementos estructurales secundarios tales como a-hélices, ß-láminas, ß-giros, ?-giros, ß-hebras, estructuras argolla y similares. Así, las moléculas miméticas orgánicas pequeñas y los péptidos miméticos son a menudo diseñados para ejercer su actividad biológica al mimetizar estos elementos estructurales localizados (es decir estructuras secundarias) de las superficies dobladas de proteína (es decir estructura terciaria).

Un "péptido mimético" o "peptidomimético" se refiere a varios tipos de clases de moléculas, en tanto que las moléculas resultantes se parecen o semejan a un elemento estructural secundario de polipéptido deseado (o terciario localizado). Por ejemplo, un péptido mimético es un oligómero que semeja una estructura secundaria de péptido a través del uso de una unión de isoésteres de unión de amina y-o modificación de la estructura de péptido nativa, que incluye extensión de cadena o incorporación de heteroátomo, ejemplos de los cuales incluyen azapéptidos, oligocarbamatos, oligoúreas, ß-péptido, ?-péptidos, oligo (fenilenoetinileno)s, sulfonopéptidos vinilogos glicinas pol i-N-sustituidas (peptoide) y similares (por ejemplo, ver Gellman, 1998; Kirshenbaum et al., 1999; Barron y Zuckermann, 1999). Los métodos para diseñar u sintetizar péptidos miméticos son bien conocidos por un experto en la técnica. En ciertas modalidades, se contempla que el péptido mimético se utiliza para solucionar sensibilidad a la proteasa, estabilizar la estructura secundaria y/o mejorar la biodisponibilidad relativa a un análogo de péptido CCL5 de ocurrencia natural. En ciertas modalidades, un péptido mimético de la invención es un mimético de giro inverso, por ejemplo, un mimético de giro D, un mimético de giro D monocílico, un mimético de giro D bicíciico, un mimético de giro (o un mimético de giro (monocíclico.

La estructura secundaria de D hebra ha sido considerada a menudo una conformación aleatoria, pero más recientemente ha sido reconocida como un elemento fundamental y discreto de una estructura de proteína reconocida por un amplio rango de receptores biomoleculares. Por ejemplo, se ha demostrado convincentemente que todas las enzimas proteolíticas se unen a sus inhibidores-sustratos en estructuras de hebra D extendidas, en las cuales la estructura de péptido o la molécula no péptido equivalente es una exposición confirmacional lineal (Tendal y Fairlie, 1999; Fairlie et al., 2000; Bode y Huber, 1992). Un de giro D es un sitio en una estructura de polipéptido en donde la cadena de polipéptido reversa su dirección. Estos giros son polares y localizados primariamente sobre la superficie de la molécula de proteína (es decir solvente expuesto) y sirve así como sitios ideales para reconocimiento de anticuerpo de unión de receptor y diseño de péptido mimético.

Así, en ciertas modalidades, una molécula que inhibe o evita la infección por paramixovirus en un sujeto mamífero es un péptido mimético o un a mimético de molécula pequeña orgánica (en lo sucesivo, una "molécula pequeña" o "mimético de molécula pequeña"). Un péptido mimético o una molécula mimética pequeña de la invención se diseña para parecerse o semejarse a ciertos elementos estructurales secundarios o terciarios del polipéptido CCL5 o un polipéptido CCL5 modificado de éste (por ejemplo Met-CCL5; AOP-CCL5) como se describe adelante.

La estructura de solución tridimensional del CCL5 ha sido resuelta por vía de RMN bi tridimensional (Skelton ef al., 1995). Los datos RMN obtenidos se utilizaron para generar un ensamble de 20 miembros de energía de estructuras CCL5 minimizadas de energía que fueron depositadas en el Brookhaven Protein Data Bank bajo el nombre de acceso 1RTN. Una estructura CCL5 media, calculada mediante 2000 etapas en minimización de energía in sílico que utiliza 20 estructuras CLL5 (Skeleton et al., 1995), también se depositó (nombre de acceso PDB 1RTO). Más recientemente, la AOP-CCL5 ha sido químicamente sintetizada en su alta resolución (1.6A) estructura de cristal resuelta y depositada bajo el nombre de acceso PDB 1B3A (Wilken et al., 1999, seguido cortamente de manera posterior por una estructura de cristal de alta resolución (1.6Á) de Met-CCL5, depositado bajo el. nombre de acceso PDB 1 EQT (Hoover et al., 2000).

El pliegue de polipéptido del CCL5 es similar a aquel de los otros polipéptidos CC y CXC, que forman una lámina D antiparalela de tres hebras flanqueada por una hélice " con terminal COOH. Listada en la Tabla 5A y en Tabla 5B de adelante están los elementos estructurales secundarios del CCL5 Y AOP-CCL5, determinados mediante RMN (PDB 1RTO; Skelton et al., 1995) y cristalografía de rayos X (PDB 1B3A; Wilken et al., 1999) respectivamente.

TABLA 5A ESTRUCTURA SECUNDARIA DE CCL5 TABLA 5B ESTRUCTURA SECUNDARIA AOP-CCL5 La estructura de solución RMN del dímero CCL5 (Skelton ef al., 1995) muestra una región con terminal NH2 parcialmente desordenada seguida por una hebra corta (DO) que conduce al motivo de bi-cisteína de firma, una región extendida (NH2-loop)que finaliza con un giro 310, tres D-hebras antiparalelas (D1-D3) conectadas por loops a una hélice-a con terminal COOH. La relevancia fisiológica de los dímeros de quimiocina está aún en debate, pero recientes estudios indican que la función biológica del CCL5 depende de la estructura dimérica (Nardese et al., 2001). De acuerdo con el modelo de quimiocina bi-sitio, dos distintas regiones de quimiocinas participan en la interacción con los receptores de quimiocina: el terminal NH2, que es crítico para la activación del receptor, y otro dominio responsable por el evento de corte primario, que sugirió que involucra la región NH2-loop (Clark-Lewis, 1994; Schraufstátter, 1995; Lowman et al., 1996; Pakianathan et al., 1997; Crump et al., 1997; Hemmerich et al. ,1999; Laurence et al., 2000). El NH2-loop se cree que juega un papel pivote en la fisiología de la infección de VIH-1 en razón a que ni el bloqueo de VIH-1 mediado por quimiocina ni la función coreceptora VIH-1 requiere la actividad señalizadora de los receptores de quimiocina (Nardese ef al., 2001).

El mapeo funcional del CCL5 (descrito anteriormente en la Sección A) se correlacionó con la estructura de solución RMN (Nardese et al., 2001). El análisis del potencial electroestático de superficie del dímero CCL5 indicó que los residuos NH2-argolla críticos para la actividad antiviral V1H-1 (Phe12, Tyr14 y lie 15) son desplegados sobre la superficie de la molécula, donde ellos contribuyen a la formación de un parche hidrófobo y expuesto a solvente grande (180Á2). Esta característica estructural es consistente con un papel potencial como sitio de corte de receptor. Por ejemplo, el Phe12 es estructuralmente equivalente en las quimiocinas CC MCP-1 a Tyr13, un residuo implicado en la unión y contribución de CCR2, junto con otros residuos NH2-loop, a la formación de una ranura de superficie hidrófoba. De manera similar, el residuo equivalente del MIP-1D, Phe13, es crítico para la unión del CCR5 y la dimerización de la quimiocina. Sin embargo, el parche hidrófobo sobre CCL5 también comprende un grupo de residuos aromáticos (Tyr27-Tyr29) que yacen en el centro del péptido Di-hebra que despliega actividad antiviral HIV-1 (por ejemplo, ver sección A.1 anterior). Así, el análisis estructural de Nardese ef al., sugiere que tanto los residuos NH2-loop como Di-hebra contribuyen a la formación de la interfase del receptor CCR5 putativo. De manera interesante, los residuos D1-hebra del CCL5 no se requieren para la inhibición de la infección RSV de células epiteliales mamíferas, sugiriendo la posibilidad de un mecanismo alternativo (o elementos estructurales alternativos) para la inhibición de CCL5 de la infección RSV (es decir, relativa a la infección VIH-1 ).

Los péptidos miméticos con quiralidad de amino ácido invertida (es decir, estereoisómeros de D-amino ácido, estereoisómeros de L-amino ácidos de ocurrencia natural) son inherentemente resistentes a la digestión mediada por proteasa y así representan candidatos adecuados para aplicaciones terapéuticas. Nardese et al., (2001) sintetizaron un mimético invertido de un NH2-loop/D 1-hebra 19-mer con una dirección inversa de las uniones de péptido con el fin de preservar la topoquímica de cadena lateral original. El péptido retoinvertido (Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2; ID DE SEC NO.: 19) inhibió efectivamente la fusión de célula mediada por cubierta VIH-1 con una potencia (ID50 media = 13.3 +/- 2.7 µM) comparable con aquella de la contraparte de L-amino ácido (ID DE SEC NO.: 16) y su quimiotaxis antagonizada. Por contraste, no fue visto ningún efecto con un péptido retroinvertido de control con similar composición de amino ácido y valor de hidrofobicidad. Estas actividades biológicas confirmaron la predicción de que la retroinversión dio como resultado la preservación de la orientación espacial original de las cadenas laterales de péptido.

Así, en ciertas modalidades, la invención esta dirigida a un péptido mimético de un polipéptido CCL5 desde aproximadamente el residuo de amino ácido uno al residuo de amino ácido treinta de ID DE SEC NO.:1, en donde, el péptido mimético inhibe la infección por paramixovirus en un sujeto mamífero. En una modalidad particular, un péptido mimético esta basado en residuos de amino ácidos uno hasta quince del fragmento de péptidos CCL5 con terminal NH2 de ID DE SEC NO.: 1. como se representa por ID DE SEC NO.: 2 y muestra que inhibe la infección por RSV (Ejemplo 4). En otra modalidad, un péptido mimético esta basado en los residuos de amino ácido uno hasta veintidós ID DE SEC NO.: 1. En otra modalidad, un péptido mimético esta basado en los residuos de amino ácido uno hasta veintinueve ID DE SEC NO.: 1. En otra modalidad, un péptido mimético es un péptido retroinvertido que comprende los residuos de amino ácido once hasta veintinueve ID DE SEC NO.: 1 en orden inverso como sigue: Ac-YFYEKlHARPLPRAlYAFC-NH2 (ID DE SEC NO.: 19), representada en lo sucesivo como "Ac-D- Tyr29-D-Cys11-NH2". En otra modalidad, un péptido mimético es un péptido retroinvertido que comprende los residuos de amino ácido uno hasta treinta y cuatro ID DE SEC NO.:1 en orden inverso como sigue: Ac-CKGSTYFYEKIHARPLRPAIYAFCCPTTDSSYPS-NH2 (ID DE SEC NO.:20) representada en los sucesivo como "Ac-D-Cys34-D-Ser1-NH2". En aún otra modalidad, un péptido mimético es un péptido retroinvertido que comprende los residuos de amino ácido uno hasta quince ID DE SEC NO.: 1 en orden inverso como sigue: Ac-IYAFCCPTTDSSYPS-NH2 (ID DE SEC NO.: 21), representado en los sucesivo como "Ac-D-Iso15-D-Ser1-NH2". En otra modalidad, un péptido mimético o una molécula mimética pequeña comprende los elementos estructurales secundarios y terciarios de los aminoácidos NH2-loop Phe12, Tyr14 y Ile15. Estos elementos estructurales son fácilmente determinados vía modelamiento molecular in sílico y visualización de un archivo de acceso de coordenadas moleculares Brookhaven Protein Data Bank seleccionado del grupo que consiste de 1EQT (Met-CCL5), 1B3A (AOP-CCL5) y 1 RTO (CCL5), como se describe adelante. En aún otras modalidades, las coordenadas moleculares de CCL5 (PDB 1RTN: PDB 1RTO), Met-CCL5 (PDB 1EQT) y/o AOP-CCL5 (PDB 1B3A) son utilizadas para generar (vía modelamiento molecular in silito) péptido miméticos de segunda generación ID DE SEC NO.: 1, ID DE SEC NO.: 2, ID DE SEC NO.: 18 o un fragmento con terminal NH2 de este.

Como se estableció previamente, el pliegue del polipéptido de CCL5 es similar a aquel de las otras quimiocinas CC y CXC (por ejemplo, CCL3, CCL4). Sin embargo, se demostró en la presente invención que el CCL5, pero no el CCL3 (MIP-1") o el CCL4 (MIP-1"), inhibió la infección RSV de las células epiteliales, sugiriendo que el RSV (como contraste al VIH-1) puede utilizar un receptor diferente del CCR5. Para dilucidar adicionalmente la secuencia y/o los requisitos estructurales de la inhibición mediada de CCL5 de la infección por RSV, los polipéptidos CCL5 y CCL3 se compararon mediante alineamiento de secuencia de amino ácido (Tabla 6), gráficas de hidropatía (FIG. 4A y FIG.4B) y modelamiento/visualización molecular (FIG. 11). Como se describió en el ejemplo 5, una comparación de las secuencias CCL5 y CCL3 (MIP-1") indicó que CCL5 y el CCL3 comparten 32 amino ácidos idénticos (es decir, 48% de identidad) y tenían aproximadamente 78% de similitud de secuencia de amino ácido (Tabla 6).

Tabla 6 Aligamiento BLAST de CCL5 y CCL3 CCL5 68 SSDT~tPCCFAYIARP PRAHIKEYFYTSGKCSNPAWFVTRKNRQVCANPEKKIWREYINSLEMS ++DT T CCF+Y +R +P+ I YF TS +CS P V+F+T+++RQVCA+P ++WV++Y++ E+S AADTPTACCFSYTSRQIPQNFIAAYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWQKYVSD E S 3 68 Una comparación de las gráficas de hidropatía (Kyte and Doolittle, 1982) del CCL5 de longitud completa versus el CCL3 de longitud completa (FIG. 4A y FIG. 4B) indicaron que la mas grande divergencia de secuencia hidropática entre CCL5 y CCL3 ocurre entre los terminales NH2 de estos polipéptidos (por ejemplo, ver Ejemplo 5). Las estructuras de energía minimizada de CCL5 (PBD 1RTO) y CCL3 (PBD 1B53) fueron modeladas in silico (SWISS-MODEL and Swiss-PdbViewer (Guex and Peitsch, 1997)) y las estructuras terciarias (o doblez) super impuestas con la excepción de los amino ácidos con terminal NH2, 1 a 7 (dato no mostrado) y los amino ácidos con terminal COOH, 64 A 68. Similares a las gráficas de hidropatía CCL5/CCL3 (FIG. 4A), la divergencia de la secuencia estructural más grande entre CCL5 y CCL3 ocurre en los residuos de amino ácido con terminal NH2. Sin querer estar ligado por ninguna teoría particular, se contempla que la diferencia entre la inhibición de CCL5 de la infección de VIH-1 con relación a ia inhibición de RSV, puede en parte ser modulada por los primeros quince amino ácidos del terminal NH2 del CCL5.

Así, como en ciertas modalidades, un péptico mimético o una molécula mimética pequeña de la invención mimetiza un fragmento de péptido del terminal NH2 del CCL5 que comprende una secuencia de amino ácido de ID DE SEC NO.: 2. En una modalidad particular, un péptico mimético esta basado en los ángulos di-hedricos de los primeros quince amino ácidos de los primeros quince amino ácidos de CCL5, AOP-CCL5 o Met-CCL5 como se establece en la tabla 7.

Tabla 7 LOS ÁNGULOS DIHÉDRICOS PARA LOS PRIMEROS QUINCE AMINOÁCIDOS CON TERMINAL NH2 DEL CCL5, MET-CCL5 Y AOP-CCL5 En otras modalidades de la invención, una molécula antiviral es una molécula mimética pequeña no péptido (como contraste al péptido mimético) que inhibe o previene la infección por paramixovirus de una célula de mamífero. Similar ai diseño de un péptido mimético, una molécula pequeña no péptido de la invención es diseñada para mimetizar los elementos estructurales clave o los residuos de amino ácido del polipéptido CCL5 de ID DE SEC NO.: 1. En una modalidad particular, una molécula pequeña esta basada en los residuos de amino ácido uno hasta quince del fragmento de péptido CCL5 con terminal NH2 de ID DE SEC NO.: 1 como se representó por ID DE SEC NO.:2. En otra modalidad, una molécula pequeña esta basada en los residuos de amino ácido once hasta veintidós del ID DE SEC NO.:1 representada por el ID DE SEC NO.: 13. En otra modalidad, una molécula pequeña esta basada en los residuos de amino ácido once hasta veintinueve de ID DE SEC NO.: 1 representada por el ID DE SEC NO.:16. En otra modalidad, una molécula pequeña esta basada en el péptido mimético retroinvertido Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2 del ID de SEC No.: 18.

En una modalidad preferente, una molécula pequeña de la invención se asemeja al parche hidrófobo CCL5 formado por los residuos amíno ácidos Phe12,Ala13,Tyr14 y Ile15 del NH2-LOOP. Én ciertas modalidades, la molécula mimética pequeña comprende la disposición molecular tridimensional de amino ácidos Phe12, Tyr14 y 11 e 15 encontrado en un funcional y plegado polipéptido CCL5 en donde Phe12, Tyr14 y Ile15 están espacialmente limitados de acuerdo a los ángulos dihedrales de las coordenadas moleculares de de CCL5 (PDB 1RTO), coordenadas moleculares de AOP-CCL5 (PDB 1B3A)o Met-CCL5 (PDB 1EQT). En otra modalidad, una molécula pequeña de la invención mimética del parche hidrófobo formado por los residuos amino ácidos Phe12, Ala13, Tyr14 y I le 15 de NH2-loop y los residuos Tyr27, Phe28 y Tyr29 del D 1 -planilla. Descrito en Nardese et al. (2001). En otra cierta modalidad, las coordenadas moleculares de CCL5 (PDB 1RTN; PDB 1TRO), Met-CCL5 (PDB 1EQT) y/o AOP-CCL5 (PDB 1B3A) son utilizados para generar (cálculos y modelado molecular vía in silico) una molécula pequeña que semeja el parche hidrófobo CCL5.

Como se expresó anteriormente, ciertos datos de la invención indican que CCR3 es un coreceptor para la entrada de RSV en células epiteliales de mamífero. Así como, en otra modalidad, la invención esta dirigida a una molécula antiviral de la invención administrada en combinación con una molécula antagonista pequeña del receptor CCR3, una antagonista de péptido del receptor CCR3, un mimético del receptor CCR3 o una combinación de estos. En ciertas modalidades, una antagonista CCR3 es una molécula que comprende uno o más de las siguientes estructuras químicas: (I) (") (lll) En otras modalidades, la molécula antiviral de la invención es administrada en combinación con una antagonista de molécula pequeña del receptor CCR1. En ciertas modalidades, el antagonista CCR1 es una molécula que comprende una o más de las siguientes estructuras químicas: (IV) (V) (VI) En aún otras modalidades, la molécula antiviral de la invención administrada en combinación con una antagonista de molécula pequeña del receptor CCR5. En ciertas modalidades, una antagonista CCR5 es una molécula que comprende uno o más de las siguientes estructuras químicas: (Vil) (VIII) (IX) (X) (XI) B. QUIMIOCINAS QUE CODIFICAN POLINUCLEOTIDOS, VECTORES Y CÉLULAS HUÉSPED DE EXPRESIÓN RECOMBINANTE En ciertas modalidades, un polipéptido de quimiocina (por ejemplo, CCL5, CCL3), un polipéptido de quimiocina truncado (por ejemplo, CCL5)1-8), un fragmento de quimiocina (por ejemplo, CCL5 del ID DE SEC NO.:2) y similar es recombinantemente expresado. En modalidad preferida, un polinucleótido que codifica un polipéptido de quimiocina esta comprendido de un vector de plásmido y expresado en una célula huésped procariótica. Una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido CCL5 de longitud completa de la invención se establece como ID DE SEC NO.: 23.

Cuando los polinucleótidos de quimiocina son utilizados para producción recombinante de los polipéptidos de quimiocina, los fragmentos de estos o truncamientos de estos, el polinucleótido incluye la secuencia codificante para el polipéptido, o la secuencia codificante para el polipéptido en marco de lectura con otras secuencias codificantes, tales como aquellas que codifican una secuencia líder o secretoria, una secuencia pre-, una pro-, una prepro- secuencia de proteína u otras porciones de péptido de fusión. Por ejemplo, una secuencia marcadora la cual facilita la purificación del polipéptido fusionado puede estar ligada a la secuencia codificante (ver Gentz et al., 1989, incorpora- aquí en su totalidad como referencia). Así, se contempla en la presente invención la preparación de polipéptidos de fusión que codifican polinucleótidos que permiten la purificación His-tag de los productos de expresión. El polinucleótido también puede contener las secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, no traducidas, señales de división y poliadenilación.

Como se utiliza aquí, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico que ha sido ligado. Un vector de la invención incluye vectores conocidos en el arte como los plásmidos, los vectores virales y similares. La expresión de las proteínas en procariotes es más a menudo llevada a cabo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o no fusión. Los vectores de fusión agregan un número de amino ácidos a la proteína que se codifica allí, al término de amino o carboxi de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión típicamente sirven para tres propósitos: 1) incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) Ayudar a la purificación de la proteína recombinante al actuar como un ligando en purificación de afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión, un sitio de clivage proteo Utico es introducido en la unión de la porción de fusión de la proteína recombinante para posibilitar la separación de la proteína recombinante de la porción de fusión subsecuente a la purificación de la proteína de fusión. Tales encimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el factor Xa, la trombina y la entero quinaza.

Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988), pMAL (New England Biolabs, Beverly; MA) Y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusiona la proteína de unión glutationa S-transferasa (GST), maltosa E o la proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante objeto.

Ejemplos de vectores de expresión E.coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amann et al., 1988) y pET lid (Studier et al., 1990).

En ciertas modalidades, un vector de expresión recombinante se introduce en una "célula huésped" en donde se expresa el polipéptido de quimiocina. Una "célula huésped trabajada por ingeniería genética" y "una célula huésped recombinante" son utilizadas intercambiablemente aquí. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica. Por ejemplo, un polipéptido de quimiocina se expresa en células bacteriales, tales como, E. coli, Moraxella catarrhalis, células de insecto (tales como células Sf9 o Sf21), levadura (tal como S. cerevisiae) o células de mamífero (tal como células de ovario de hámster Chino (CHO), NIH3T3, PER.C6, NSO o células COS). Otras células huésped adecuadas son conocidas por aquellos expertos en la técnica El vector de ADN es introducido en las células procarióticas o eucarióticas por vía de transformación convencional infección u otras técnicas de transfección. Como se utiliza aquí, los términos "transformación", "infección", y "transfección" están destinados a referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, que incluye co-precipitación fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, infección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar, infectar o transfectar células huésped se pueden encontrar en Sambrook, ef al..("Molecular Cloning: A Laboratory Manual" segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Col Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariótica en cultivo, también se utiliza para producir (es decir, expresar) grandes cantidades de un polipéptido de quimiocina deseado. De acuerdo con esto, la invención suministra además métodos para producir polipéptidos de quimiocina utilizando las células huésped de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la cual un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido ha sido introducido) en un medio adecuado hasta que es producido el polipéptido de quimiocina.

En otra modalidad, el método comprende además aislar el polipéptido de quimiocina del medio o de la célula huésped.

Un vector de expresión de la presente invención se utilizó tanto como unos medios para preparar cantidades de ADN que codifica un polipéptido de quimiocina mismo, y como medios para preparar los polipéptidos codificados. Se contempla que donde los polipéptidos de quimiocina de la invención son hechos mediante medios recombinantes, uno puede emplear vectores de expresión procarióticos o eucarióticos como sistemas de lanzadera.

C. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS ANTIVIRALES En ciertas modalidades preferidas, la presente invención suministra composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula antiviral de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las moléculas antivirales son incorporadas en las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto mamífero, (por ejemplo, un humano). Tales composiciones típicamente comprenden la composición "activa" (es decir, la molécula antiviral) y un "portador farmacéuticamente aceptable". Como se utiliza en lo sucesivo la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacteriales y antifungosos, agentes de retrazo isotónico y de absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas son bien conocidas en el arte. Excepto hasta ahora como cualquier medio o agentes convencionales es incompatible con el compuesto activo, tales medios se pueden utilizar en las composiciones de la invención. Los compuestos activos suplementarios se pueden incorporar en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta pretendida de administración. Ejemplos de rutas de administración incluyen parenteral (por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal), en mucosa (por ejemplo, oral, rectal, intranasal, bucal, vaginal, respiratoria) y transdérmica (tópica). Las soluciones y suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea, pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacteriales tales como bencil alcohol o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilenodiaminotetraacético; amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajustar la tonicidad tal como cloruro de sodio o dextrosa. El ph se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido hidroclórico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede estar incluida en ampollas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiple de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde agua soluble) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática, Cremofor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la proporción que la operación fácil de la jeringa exista. Debe ser estable bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y se debe preservar contra la acción de contaminación de los microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador es un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de estos. La fluidez adecuada es mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos se logra mediante varios agentes antibacteriales y antifungosos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y similar. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tal como, manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se realiza al incluir en la composición un agente que retraza la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles son preparadas al incorporar el compreso activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización de filtrado. De manera general, las dispersiones son preparadas al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros agentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secados por vacío y secado por congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución filtrada previamente estéril de esta.

Otras composiciones generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Ellos pueden estar incluidos en cápsulas de gelatina o comprimidos en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se incorpora con excipientes y se utiliza en la forma de tabletas, pildoras o cápsulas. Las composiciones orales también se preparan utilizando un vehículo de fluido para uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo de fluido se aplica oralmente y se rocía y expectora o traga. Agentes de de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las tabletas, pastillas, cápsulas, pildoras y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un ligador tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como esterato de magnesio o Sterote; un glidante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente endulzante tal como sucrosa o sacarina; o un agente saborizante tal como hierbabuena, metil salicilato, o saborizante de naranja.

Para administración por inhalación los compuestos se administran en la forma de un rociado de aerosol de un contenedor presurizado o dispensador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. La administración sistémica también puede ser por medio de la mucosa o por medio transdérmico. Para la administración transdérmica o por mucosa, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a ser permeada. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración por la mucosa, detergentes, sales de bilis, y derivados de ácido fusídico. La administración por la mucosa se acompaña a través del uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles, o cremas como se conoce generalmente en la técnica.

Los compuestos también se preparan en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao o otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En una modalidad, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsuladas.

Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de vinil etileno, polianhídridos ácido pol ig I i col ico , colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en técnica. Los materiales también se obtienen comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se utilizan suspensiones liposomales (que incluyen liposomas marcadas para células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales.) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se preparan de acuerdo con los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente U.S. 4,522,811 que se incorpora aquí como referencia.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitaria para el sujeto a ser tratado; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéuticamente requerido. La especificación para las formas de dosis unitarias de la invención se dictan por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular a ser alcanzado, y las limitaciones inherentes en técnica de compuestos tales como un compuesto activo'para el tratamiento de individuos.

Un vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende que designa un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica que no origina efectos colaterales y que hace posible, por ejemplo, facilitar la administración del compuesto activo para incrementar su vida y/o su eficacia en el cuerpo, para incrementar su solubilidad en la solución o alternativamente mejorar su preservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables también son conocidos y serán adaptados por las personas versadas en la técnica de acuerdo con la naturaleza y forma de la administración del compuesto activo escogido.

Una composición de la presente invención se administra típicamente en forma parenteral en formulaciones de dosis unitaria que contienen vehículos fisiológicamente aceptables, adyuvante y vehículos fisiológicamente no tóxicos bien conocidos según se desee. En término parenteral como se utiliza aquí incluye inyección intravenosa, subcutánea, ¡ntradérmica, intramuscular, intraarteial, o técnicas de infusión.

Las preparaciones inyectables por ejemplo suspensiones oleaginosas o acuosas estériles inyectables, se formulan de acuerdo con la técnica conocida utilizando agentes humectantes o dispersantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación estéril inyectable también puede ser una solución estéril inyectable o suspensión en un diluyente no tóxico parenteralmente aceptable o solvente, por ejemplo, como una solución en 1 ,3-butanediol.

Entre los vehículos aceptables y solventes que se pueden emplear está el agua, solución de Ringer, y solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, se emplean convencionalmente aceites estériles fijos empleados como un solvente o un medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo suave se puede emplear incluyendo mono-o di-glicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos grasos tales como ácido óleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

Portadores preferidos incluyen solución salina neutral amortiguada con fosfato, lactato, tris, y similares. Cuando se administra por vectores virales, el vector se purifica suficientemente para dar este esencialmente libre de contaminantes indeseados, tales como partículas de adenovirus defectuosas que interfieren o endotóxicas u otros pirógenos, de tal forma que este no origine ninguna reacción adversa en la recepción individual de la construcción del vector. Unos medios preferidos para purificar los vectores incluyen el uso de gradientes de densidad flotante, tal como centrifugación de gradiente de cloruro de cesio.

Un vehículo también puede ser una liposoma. Los medios para utilizar liposomas como vehículos de administración son bien conocidos en la técnica.

Todas las patentes y publicaciones citadas aquí se incorporan como referencia.

D. Ejemplos.

Los siguientes ejemplos se llevan a cabo utilizando técnicas estándar, que son bien conocidas y de rutina por aquellos expertos en la técnica, excepto donde se escriba de otra forma en detalle. Los siguientes ejemplos se presentan para propósito ilustrativo, y no se deben construir en ninguna forma como limitantes del alcance de esta invención.

Ejemplo 1 Materiales y Métodos Reactivos y quimioquinas. A menos que se indique lo contrario, todas las quimioquinas humanas recombinantes (r) y anticuerpos de receptor de quimioquina anti-humano se compran de R &D Systems Inc. (Minneapolis, MN). El factor derivado de célula estromal (SDF) -1 a (CXCL12) y CCL5 humano recombinante se obtienen respectivamente de Biosource Internacional (Camarillo, CA) y Wyeth (Andover, MA). Ambos anticuerpos monoclonal y policlonal contra receptores de quimiocina CC (CCR) se utilizan en los estudios. Los anticuerpos monoclonales (mAb) se dirigen contra CCR3 humano (catalog No. MAB155) o CCR5 (catalog No. MAB182). Los anticuerpos policlonales purificados de afinidad elevados contra la secuencia de péptidos de CCR1 (catalog No. sc-7934), CCR3 (catalog No. sc-7897), CCR4 (catalog No. sc-6126) o CCR5 (catalog No. sc-8283) se compran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). El anticuerpo policlonal anti-humano CX3CR1 (catalogo No.TP502AF) se compra de Torrey Pines Biolabs (Houston, TX). Una serie de nueve péptidos sintéticos traslapantes (Tabla 1) de CCL5 (Schali et al. 1988) se compra de Sigma-Genosys (The Woodlands, TX) o se sintetiza utilizando químicas de péptido estándar. Los péptidos se marcan con biotina utilizando químicos EZ-LINK™ NHS (N- Hidroxisuccinimidobotina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pierce; Rockford, IL). Por experimentos in vitro e in vivo, los péptidos gliofilizados se disuelven respectivamente en medio esencial mínimo Dulbecco (DMEM, Gibco BRL; Grand Island, NY) complementado con 5% (V/V) FBS (Hyclone; Logan, UT), 2mM L-glutamina y 2% de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL); o reconstituido en PBS y utilizado en las concentraciones indicadas. Los péptidos tuvieron una pureza mayor del 90%. El inhibidor, anti-fusión, RFI-641 (Raznikov et.al. 2001) se diluye en PBS y se administra in vivo en 25µg/dosis.

Depósitos de virus. Cepas RSV A2 y B1 tipo silvestre (Wright ef al., 1973) y cepas cpts248/404 RSV mutantes (Ackerlind ef al., 1988), rA2cpts248/404?SH (Crowe eí al., 1994) y cp32/D1, deficiente en genes SH y G (nucleótidos 4064-5462) (Karron et al., 1997), se propagan como se describió anteriormente (Hancock ef al., 1996) en células HEp-2 (ATCC CCL 23) cultivadas en medio completo (DMEM complementado con 2mM L-glutamina, 2% penicilina/estreptomicina y 10% (V/V) FBS, 37°C, 5% CO2). Se aisla el cp32/D1 mutante de la cepa B1 utilizando las metodologías descritas anteriormente para el cp52 (Crowe et al., 1996; Karron eí al., 1997). Un RSV, recombinante (rA2cp?G118) truncado genéticamente en el aminoácido 117 de la proteína G. también se utiliza en esta investigación. Todos lo virus de deposito se preparan a partir de lisatos de células clarificados por centrifugación a baja velocidad (200 g) 15 minutos a 4°C.

Inhibición de el contagio del virus in vitro. Se hacen crecer monocapas de células HEp-2 en placas de cultivo de tejidos de 96 posos (Falcon, Becton Dickson and Co.; Franklin Lakes, NJ) con medio completo. Las monocapas se pretratan durante 1 hora a 4°C o 37°C en posos por triplicado con cantidades indicadas de quimioquina recombinante o anticuerpo de receptor anti-quimioquina. Después de la remoción de la quimioquina o anticuerpo, se infecta monocapas 1 hora a la misma temperatura con la cepa RSV mutante o de tipo silvestre denotada y luego cubierto con 2% Sephadex (Amersham Biosciences; Piscataway, NJ). También se evalúa la actividad antiviral 1 hora antes de que las células se infecten o sigan la exposición simultanea de las monocapas al virus en una mezcla 1:1 con la dosis indicada de quimioquinas o péptidos CCL5. Las propiedades inhibidoras de los anticuerpos de receptor anti-quimiocina se ensayan solos o en combinación en dosis que varían de 5 a 100 µg/ml de medio de cultivo.

Inhibición de contagio del virus in vivo. Ratones BALB/c hembras (8-10 semanas de edad, Charles River Laboratories; Wilmington, ME) se le administra péptido (125 µg a 500 µg/dosis) 1 hora antes o 1 hora después del reto, o simultáneamente en una mezcla 1:1 con una cepa A2 de RSV (~2x106 pfu). Todas las administraciones fueron intranasales (0.05 mi) y se ejecutaron bajo anestesia inyectada (60 mg cetamina/kg y 2.5mg de xilazina/kg (The Butler Co.; Dublin OH). Cuatro días después de remueven los pulmones se homogenizan, se clarifica por centrifugación a baja velocidad, se congela y almacena a-70°C hasta que las placas de ensayo se ejecutan utilizando monocapas de células HEp-2 (Hancock ef al. 1996). Todos los animales se alojan en una instalación acreditada por la the American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care.

Ensayo de placa. Se visualizan placas de virus como se describió previamente (Hancock eí al. 1996) utilizando proteína anti-F (L4) mAb (Paradiso ef al., 1991; Walsh and Hruska, 1983). De aquí en adelante, las células de enjuagan con agente de bloqueo botto (PBS, 5% leche en polvo) e incuban con IgG antiratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc.; Gaithersburg, MD). Se detecta la unión de anticuerpo utilizando 0.05% de 4-cloro-1-naftol que contiene 0.1% H2O2 en PBS. Después de enumeración de placas, el porcentaje medio de contagio (± 1 desviación estándar de posos por triplicado) se calcula con relación a las monocapas expuestas al virus en medio de cultivo solo sin quimioquina o anti-cuerpo de receptor de anti-quimiocina.

Interacción de péptidos CCL5 con células HEp-2. Se utiliza un ELISA para evaluar la unión relativa de los péptidos sintéticos a la monocapas de células HEp-2. En resumen, se cultivan placas de 96 posos (Falcon) con 3x104 células HEp-2 por poso en 0.2ml de medio de completo. Después de incubación durante la noche (37° C, 5% CO2), las monocapas se enfrían en hielo durante aproximadamente 15 minutos. Los péptidos biotinilados se agregan a los posos triplicados en dosis ascendentes de 0.49 µg a 500 µg por mi DMEM (complementado con 1% FBS, 2% penicilina/estreptomicina, y 2mM L-glutamine) y se encuba a 4°C durante 1 hora. Las monocapas se fijan luego (20 minutos a TA) con 80% metanol (JT Baker; Phillipsburg, NJ).

Después de lavar con PBS, las monocapas se incuban (30 minutos a TA) con 0.3% (V/V) H202 (Sigma; St. Louis MO), se lava de nuevo y se sondea (30 minutos a 4°C) con CCL5 mAb anti-humano biotinilado (R&D systems). Después, se encuban las monocapas (1 hora a TA) con streptavidin-HRP (Zymed; San Francisco, CA). Los posos se desarrollan con solución de sustrato de una etapa TMB (DAKO; Carpintería, CA). Se determina una densidad óptica (450 nm, referencia en 550 nm) con un lector de microplaca Molecular Devices Versamax (Sunnyvale, CA).

Citometría de flujo. Para comprobar la expresión CCR, Se removieron gentilmente las células A549 y HEp-2 de placas de 6 posos (Falcon) utilizando un raspador e incubadas (30 minutos a 4°C) con mAb botinilado contra CCR1 (catálogo No. FAB182F), CCR3 (catalogo No. FAB145P), o CCR5 (catalogo No. FAB155P), seguido en adelante por streptavidin-ficoeritrina. Las células se analizan utilizando técnicas citométricas de flujo estándar (FACSort, Becton Dickinson; Mountain View, CA). Todos los reactivos se compran de R&D systems.

Detección de CCL5. Se utiliza un ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems) para detectar CCL5 secretado en supernadantes d cultivo de células HEp-2 y células epiteliales A549 24 horas después de inyección RSV. La densidad óptica se determina (450 nm, referencia en 550 nm) con un lector de microplaca Molecular Devices Versamax. Para determinación del numero de copias de CCL5 mRNA y los genomas RSV luego de infección, se desarrollan ensayos de reacción de cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) El ARN celular total se aisla de las monocapas celulares utilizando un kit RNeasy mini (Qiagen; Valencia, CA) y QiaShredders (Qiagen). Las concentraciones de ARN se miden en un lector de placa de fluorescencia CytoFluor® 4000 (Applied Biosystems) después de adición de Reactivo de Cuantificación ARN RiboGreen (Molecular Probes; Eugene, OR. Un microgramo del ARN celular total se transcribe de forma inversa utilizando un kit de reactivos de transcriptasa inversa TaqMan® (Applied Biosystems) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El cADN resultante se ensaya para la presencia de genomas RSV utilizando un conjunto de sonda-iniciador de ADN complementario para una región del gen L desde el RSV A2. Adicionalmente, el reactivo de ensayo pre-desarrollado TaqMan® RANTES humano (PDAR) (Applied Biosystems; Foster City, California) que contiene el primer conjunto de sonda-iniciador se utiliza para detectar CCL5 cDNA de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El PCR, detección de fluorescencia, y los análisis de datos se desarrollan en un detector de secuencia ABI Prism 7700 (Perkin-Elmer; Pittsburgh, PA).

Análisis Estadístico. Se determinan diferencias significativas (p<0.05) después de transformación log por comparación múltiple HSD Tukey-Kramer o ensayo de t de Student utilizando software estadístico JMP® (SAS Institute Inc.; Cary, NC). Los datos se expresan ± 1 desviación estándar. Todos los datos se confirman en estudios separados con resultados similares.

Ejemplo 2 CCL5 inhibe la infección de células epiteliales con RSV En este ejemplo, se demostró in vitro que las células epiteliales humanas por vía aérea producen polipéptidos CCL5 en respuesta a la infección con RSV. La tabla 8 y la tabla 9 muestran resultados representativos de los experimentos que se examinan respectivamente los efectos de la infección RSV en incrementos cuantitativos en el número de copias de mARN y la secreción de CCL5 de monocapas de células A549 y HEp-2. En las monocapas de A549, el número de copias CCL5 mARN se incremento dos días (7 veces) y tres días (20 veces) después de infección (tabla 8). Los datos adicionales indican que la replicación RSV progreso, en numero de transcripciones CCL5 se incremento dramáticamente con relación al numero de copias de genoma RSV (tabla 8). La proporción de numero de copias de genoma CCL5 mARN a RSV se incremento dieciséis veces entre el día uno y tres del cultivo. La proteína CCL5 se detecta en supernadantes de cultivo tan temprano como 24 horas después de infección (tabla 9). Así, en respuesta a la infección RSV, las monocapas secretadas incrementaron las cantidades de polipéptidos CCL5.

Tabla 8 Infección de líneas de células epiteliales de pulmón humano con RSV induce la expresión de CCL5a a. células A549 se infectan (MOI =0.09) con RSV A2 (RSV) o se cultivan en medio solo (Control) y los números de copia CCL5 mARN y los números de copia de genoma RSV de hebra negativa se determinan en ARN celular total por PCR 1 en tiempo real cuantitativo a 3 días en adelante. b. Denota en número de copias CCL5 mARN por ng total a ARN. c. Denota la proporción de números de copias CCL5 mARN para los números de copia de genoma RSV.

Tabla 9 Líneas celulares epiteliales humanas infectadas con cantidades incrementadas de RSV secretado de CCL5 dentro de medio de cultivo3. a. Las células A549 y HEp-2 se infectan (MOI= 0.09) con RSV A2 (RSV) o cultivadas en medio solo (control). Se recolectan los supernadantes de cultivo 1-3 días después y se analizan para CCL5 secretado por ELISA. b. Los números representan medio de cultivo CCL5 por mi. c. ND denota no determinado.

El potencial de CCL5 para inhibir la infección de células epiteliales con RSV se investiga adicionalmente. La tabla 10 y la tabla 11 describen experimentos separados en donde la exposición anterior (una hora) de monocapas de células HEp-2 con cantidades ascendentes de rCCL5 humano disminuye la infección. En las dosis más grandes ensayadas el contagio (10µg rCCL5/ml) se reduce a aproximadamente 30% (tabla 10) y 20% (tabla 11) relacionada con las monocapas de control de cultivo en medio solo. El efecto inhibidor equivale a una concentración inhibidora media (IC50) de 726nm. La inhibición es dependiente de la dosis, como 1µg Y 5Mg fueron menos inhibidores que 10µg rCCL5/ml de medio de cultivo. Antes de ia exposición (1 hora) de células HEp-2 a concentraciones similares de MIP-1a/CCL3 recombinante, MIP-1ß/CCL4, MCP-2/CCL8, o eotaxin/CCL11 (Tabla 10 y Tabla 11), o MIP-15/CCL15 recombinante o SDF-1a/CXCL12 (Tabla 12) no deteriora el contagio. Los datos adicionales indican que la inhibición del tratamiento requerido de contagio de las monocapas celulares con rCCL5 (10µg/ml) antes de (tabla 12), o en le mismo tiempo se agrega el virus a las monocapas (tabla 13). El rCCL5 no reduce el contagio in vitro cuando se administra una hora después de absorción del virus (tabla12) o después de desnaturalización con calor (tabla 13). Antes del tratamiento de las monocapas A549 con rCCL5 también inhibe la infección con RSV (datos no mostrados).

Tabla 10 CCL5 inhibe la infección de células epiteliales con RSVa Porcentaje de contagio Dosis µg) CCL5 ~CCL"3 CCLS CCT1 s~ " "i~ 2s:2"± e:7 ~?B6.T±2'.Í~ ?4.4fio.5 ~ s~44± .< Y5."0±772 " 97'.2±8".7~" 100.0*0.0 93.?Í12. 73.6±20:6 " 95.8+11.0 S879±6;4 ""] ?"44±"4."S a. Se exponen monocapas de células HEp-2 a 1,5, o 10µg/ml de CCL5 (RANTES), CCL3 (MIP- 1a), CCL8 (MCP-2) O CCL11 (eotaxina) durante una hora. Luego, las monocapas se enjuagan tres veces con medio y se infectan durante 1 hora con la cepa A2 de RSV. Después de 3 días de incubación, se enumeran las placas para determinar el grade de contagio viral. Los datos se presentan, como el porcentaje medio de contagio (± 1 la desviación estándar) con relación a los posos de control (100% de contagio) incubado con virus en medio solo y no expuesto a quimiocina.

Tabla 11 CCL5 inhibe la infección de células epiteliales humanas con RSVa Porcentaje de contagió Dos¡¡ CCL5 CCL3 CCL4 {µg) 10 16.0+S.O" 9170 ±5.0 98.0. ±5.0 ~42.0±3.0 98.0±1.0 99.o±s;o 101.0±4.0 103.0±3.0 104.0±4.0 a. se exponen monocapas HEp-2 a 1,5 o 10 µg/ml de CCL5 (RANTES), CCL3 (MIP-1a) o CCL4 (MIP- 1 ß) durante una hora. Luego, se enjuagan las monocapas tres veces con medio y se infectan durante 1h con ia cepa A2 de RSV. Luego de tres días de incubación las placas se enumeran para determinar el grado de contagio viral. Los datos se presentan, como el porcentaje medio de contagio (± 1 la desviación estándar) en relación con los posos de control. (100% de contagio) incubado con virus en medio solo y no expuesto a quimiocina.

Tabla 12 Inhibición de la infección con RSV es dependiente de la administración antes de CCL5a Porcentaje de~ contagio Tratamiento CCL5 CCL3 CCL15 CXCLT2" PRE 22 + 11 91 + 10 97±3 f 88+7 i " - - -, - - OST"" " " 1ff1±12 f04±7 " $$±4~ f 104~±4 a. se tratan monocapas de células HEp-2 con 10µg/ml CCL5, CCL3, CCL15 (MIP-15) o CXCL12 (SDF- 1) una hora antes de infección (PRE) o una hora después de remoción (POST) de RSV A2. Se enumeran las placas de 3 días después y se presentan como porcentaje medio de contagio (± 1 la desviación estándar) en relación con los posos de control. (100% de contagio) incubado con virus en medio solo y no expuesto a quimiocina.

TABLA 13 INHIBICIÓN DE INFECCIÓN ES DEPENDIENTE DE LA ADMINISTRACIÓN ANTERIOR O SIMULTANEA DE CCL5 CON RSV Y SENSIBLE A LA DESNATURALIZACIÓN POR CALOR3 Porcentaje de contaqio ~CCL~5 (iil) PRE S'ÍM " ," "C?"LOR™ _ _10 .... 17 33 - - -- - -7S -- 8S-__ __ _.^4 ._ " 83" a. CCL5 (10 µg/ml) o volumen igual de PBS se administra 1 hora antes de infección (PRE) o simultáneamente (SIM) mezclado con RSV para monocapas de células HEp-2. Los grupos adicionales incluyen CCL5 desnaturalizado por calor (HEAT). Las placas se enumeran tres días después.

EJEMPLO 3 EL CCL5 BLOQUEA LA INTERACCIÓN ENTRE LA CÉLULA EPITELIAL Y LA PROTEÍNA DE FUSIÓN (F) DEL RSV Para comprobar si la inhibición de la infección ocurre directamente al bloquear las interacciones del virus con los ligandos de superficie celular, o en segundo lugar al exterior en la trayectoria de señalización luego de las interacciones del receptor- ligando, se desarrollan experimentos con RCCL5 que retienen la metionina (met)-CCL5 de N-terminal (Proudfoot et al., 1996). EL Met-CCL5 retiene la metionina inicial y luego une el receptor que no es biológicamente activo (Simmons et al., 2000). En dosis mayores ensayadas (20 µg met-CCL5/ml) el contagio fue de aproximadamente 25% de células de control (figura 1).

Las propiedades de inhibición del met-CCL5 también fueron dependientes de la dosis. Antes de tratamiento con 1.25 µg el met-CCL5/ml resultó en aproximadamente 80% de contagio, mientras que las dosis de 0.313 o 0.156 µg de met-CCL5/ml no fueron inhibidoras. La inhibición de la replicación también se ensayo cuando la infección y la administración del rCCL5 se desarrollaron secuencialmente a 4°C para impedir la agregación de CCR, que es importante para el exterior en señalización (Blanpain et al., 2002). El contagio luego de pretratamiento (1 hora) a 4°C con 20 µg rCCL5/ml fue de aproximadamente 14% de control y similar (16%) a aquel observado cuando las monocapas se tratan secuencialmente con rCCL5 y se infectan a 37°C (Tabla 14). Así, los datos sugieren que el rCCL5 puede inhibir la replicación bajo condiciones (4°C) que podrían limitar una cascada de señalización intracelular.

TABLA 14 PRETRATAMIENTO DE LÍNEAS DE CÉLULAS EPITELIALES HUMANAS CON CCL5 A 4°C O A 37°C INHIBE LA INFECCIÓN CON RSVa "" " "P orce rita [é~d"e" Tarítagip CCL5 fn'g)' " " A?S ~ " ' ~"37.!"C~ " 20 ' 14" "" ' 16 -10_. _ 23' " ' "~ 4' 5 " 37 "• " 41 a. Se pretratan monocapas celulares HEp-2 durante 1 hora a 4°C o a 37°C con dosis indicadas de CCL5 recombinante. Las placas se enumeran 3 días después de infección con RSV A2 y se presentan como porcentaje de contagio relacionado con los pozos de control (100% de contagio) incubado con virus en medio sólo y no expuesto a quimiocina.

Se reportó recientemente que las células epiteliales bronquiales activadas expresan CCR3 (Stella et al., 2001). En razón a que el CCL5 también es un ligando para el CCR1 y el CCR5 (Pakianathan et al., 1997) se examinan las células epiteliales por citometría de flujo para los receptores conocidos por unir el CCL5. Los resultados descritos en la figura 2 confirman que el CCR3 se expresa sobre la superficie de las células epiteliales HEp-2 y A549. EL CCR1 y CCR5 no se detecta. Así, los datos indican que el CCL5 bloquea las interacciones entre el RSV y el CCR3 en la superficie celular epitelial. Las quimiocinas recombinantes adicionales conocidas por unir el CCR3 (Baggilioni, 2001) se ensayan para determinar si ellas también reducen el contagio. El pretratamiento de las monocapas de células HEp-2 con cantidades ascendentes de eotaxin/CCL11, recombinante, MCP-2/CCL8, o M1P-15/CCL15 no afecta el contagio RSV (Tabla 10 y Tabla 12). En razón a que el CXCR4 también se expresa funcionalmente sobre las células epiteliales bronquiales activas recombinantes (Eddleston et al., 2002) SDF-1 a/CXCL12 también se ensaya, pero no daña la infección (Tabla 12). La preincubación de monocapas de células HEp-2 o la infección en la presencia de anticuerpos o receptores antiquimiocina poli o monoclonales no reduce el contagio RSV (datos no mostrados).

Los mecanismos de inhibición se investigan adicionalmente al examinar la capacidad del rCCL5 para inhibir la infección por las cepas RSV deficientes en uno, o dos de las 3 giicoproteínas (proteínas F G y SH) ubicadas en la cubierta del virus. Una serie de estudios se desarrollan utilizando cepas modificadas genéticamente eliminadas de la proteina SH (rA2cpts248/404dSH), o con el ectodominio de terminal C de la proteína G truncada en el aminoácido 118 (rA2cpGd118). La Tabla 15 demuestra que el pretratamiento con 10 µg/ml de rCCL5 o met-CCL5 reduce el contagio de virus rA2cpGd118 y rA2cpts248/404dSH relacionadas con las células de control cultivadas con el virus en medio solo. Antes de tratamiento con rCCL5 (10 µg/ml) también se reduce la infección por cp32/D1 mutante (les falta ambas proteínas SH y G) y las cepas B1 parientes de RSV (Tabla 8). Así, el rCCL5 inhibe la infección por virus deficiente en las proteínas g y/o SH. Tomadas juntas, los datos indican que las interacciones rCCL5 bloqueadas que ocurren entre la proteína F en la cubierta y la superficie celular epitelial.

TABLA 15 EL CCL5 INHIBE LAS CEPAS RSV MUTANTES QUE LES FALTA LAS GLICOPROTEÍNAS DE CUBIERTA SH Y/O G DE LAS CÉLULAS HEp-2 DE INFECCIÓN3 Porcentaje de Contagio Experimento 1 Experimento 2 — Cepa met-ccld CCL5 met- CCL5 CCL5 I 248/4045SH 34 " "32 13 NDb ' _ 2$_. ~" 248/404 -"26 25" " "" ND " cp32/D1 " ND " ND 41 " ND - " rA2cp5lÍ8~ 26" ¡ 41 ND ND" ~~ """ c" .-KSV— S"4" 6"4 ND N"D"" . -B1--- "ND ND 24 — ~ ND " A "" 33 " " 31 " " 28 " " ND a. Se tratan monocapas de célula HEp-2 1h con 10 µg/ml de CCL5 recombinante o met-CCL5. Después de la remoción del CCL5, se infectan las monocapas con las cepas RSV indicadas. El Experimento 1 y el Experimento 2 denotan los resultados de dos estudios separados. Las placas se visualizan después de 3 (A2) o 5 días (rA2cpd118, 248/404, 248/404dSH, B1, y cp32/D1) incubación. Los datos se presentan como porcentaje de contagio relacionado con los pozos de control (100% de contagio) incubados con virus en medio sólo y no expuestos a quimiocina. b. ND denota no hecho.

EJEMPLO 4 LA INFECCIÓN DE RSV SE INHIBE IN VIVO POR UN PÉPTIDO SINTÉTICO N-TERMINAL DE CCL5 El CCL5 puede inhibir la infección al bloquear las interacciones entre la proteína F en la cubierta y el receptor de quimiocina (por ejemplo CCR3) o glicosaminoglican cargado negativamente(GAG) en la superficie celular epitelial. La proteína F tiene un motivo de unión heparina (HBD) compuesto de aminoácidos cargados positivamente que son importantes para la infección de células epiteliales por vía aérea (Feldman et al., 2000). La región de hélice- a C-terminal de CCL5 mostró jugar un papel en la inhibición de la infección HIV-1 (Burns et al., 1998).

Los residuos de aminoácido que interactúan con' el receptor cognato o GAG se ubican respectivamente en el N-terminal (Pakianathan et al., 1997) y el C-terminal (Proudfoot et al. 2001) regiones de CCL5. Para examinar esta posibilidades, una serie de péptidos (15-mers, se traslapan por 7 aminoácidos) que representan todos los 68 aminoácidos de CCL5 que se sintetizaron (Tabla 2). Como una selección inicial, los péptidos se biotinilaron y evaluaron para unión a las células epiteliales humanas. La figura 3 describe un experimento representativo en donde las concentraciones que se incrementan de péptidos biotinilados se incuban con células HEp-2 viables a 4°C. Los datos resultantes indican que el rCCL5 y el péptido 1 (ID ID de SEC No.: NO:2), que representan los 15 residuos N-terminal del CCL5 se unen fácilmente a la monocapa celular epitelial. Un péptido sintético (péptido 19) que contiene el HBD consensus de la proteína G RSV (Feldman et al., 1999) también se une a la monocapa. Los péptidos 7-9, que representan el HBD del CCL5, no se unen fácilmente a la monocapa. Así los datos indican que esa inhibición de contagio ocurre debido a que la región N-terminal del CCL5 (péptido 1; ID de SEC No.:2) bloquea las interacciones entre la proteína F y la cubierta y la superficie de célula epitelial.

Para ensayar hipótesis adicionales, los mismos péptidos de CCL5 se ensayan en el modelo de ratón BALB/c para la inhibición de la infección por la cepa A2 de RSV. Los resultados descritos en la Tabla 16 y 17 son representativos de 5 experimentos. Los resultados demuestran que el péptido 1 (500 µg/dosis, 10 mg/ml) fue inhibidor in vivo cuando se administra simultáneamente con el virus (Tabla 16 y Tabla 17) o 1 hora dada antes de la infección (Tabla 17). Los pulmones de ratones na?ve BALB/c cuatro días después de la infección contiene aproximadamente 5 log10 PFU por gramo de tejido. En comparación, los títulos RSV en los pulmones de ratones co-administrados con péptido 1 fue 1,000 (Tabla 16 y Tabla 17) a 100 veces (Tabla 16) menos. Cuando el péptido 1 se administra 1 hora antes de la infección, la carga de virus se disminuye más de 50 veces, y significativamente menos que aquella observada en ratones na'íve (Tabla 17). La reducción promedio en carga de virus asociada con la administración de 300 µg o más del péptido 1 en cinco experimentos fue de 2.4 log10- Las propiedades inhibidoras del péptido 1 fueron dependientes de la dosis. La coadministración de 300-500 µg de péptido 1 reduce significativamente la carga de virus. Esto no se observa con dosis de 250 µg o 125 µg (Tabla 16). Similar a los estudios in viíro con el rCCL5 (Tabla 12), el péptido 1 no inhibe la infección cuando se administra 1 hora después de infección (Tabla 17).

Los datos sugieren que los péptidos que representan el HBD C-terminal (péptido 7-9) de CCL5 (500 µg/dosis, 10 mg/ml) fue menos inhibidor. Los datos presentados en la Tabla 16 demuestran que la co-administración de los péptidos 8 o 9 con RSV reduce el contagio (aproximadamente 10 veces). La reducción promedio en carga de virus asociada con los péptidos 7-9 para todos los experimentos en 500 µg/dosis fue respectivamente 1.1, 1.0, y 1.4 log10. El promedio de reducción en la carga de virus asociada con los péptidos 2, 4 y 6 para todos los experimentos en 500 µg/dosis fue respectivamente 0.9, 1.2 y 0.5 log 10 (datos no mostrados). El péptido 19, que representa los aminoácidos 184-198 y el HBD de la proteína G RSV, y el compuesto farmacéutico RFI-641 (Razinkov et al., 2001) fueron inhibidores contra la infección RSV. Así, entre los péptidos de CCL5, el péptido 1 une las células epiteliales viables in vifro y fue más inhibidor in vivo. La inhibición por todos lo péptidos in vifro ocurre solo en valores IC50 de 391 a 525 µM (Datos no mostrados).

TABLA 16 ACTIVIDAD ANTI VIRAL DE PÉPTIDOS SINTÉTICOS DE CCL5 IN VIVO3 Tejido de Pulmón R$V/Gram"~(/b5fÍÉJ) a. Se administro simultáneamente a ratones BALB/c RSV A2 (-1X106 PFU) mezclado en volumen igual con las cantidades indicadas (µ/dosis) de péptidos sintéticos. Cuatro días después, se determina la media geométrica de los títulos de virus infecciosos (± 1 la desviación estándar) en los pulmones. El limite de detección del ensayo fue aproximadamente 1.5 Iog10. Hubo 5 ratones por grupo. b. Se administra RSV a ratones de control mezclado con cantidades indicadas de péptidos # 19 (que representa el dominio de unión de heparina de la proteína G RSV), RFI-641, o PBS.

TABLA 17 PÉPTIDO 1 DE CCL5 ES INHIBIDO IN VIVO CUANDO SE DA ANTES PERO NO DESPUÉS DE LA INFECCIÓN CON RSV Péptido Tratamiento3 Tejido" de Pulmón fug) RSV/Tram (logm) #1 (500) "" ; S ¡"m lta ríe o " "" 1.9 ± ?72" "~" : £1 (500} 7 Pre " 3.5 ±"'?7'6 "' '~i t'(ßo"oy P st S".3"±~d".2 " "#7" fííO'P ""Simultan """ ' '"' "" "373 ±" 07? PBS Simultáne ~ 5.4 ± 071 a. Se administran 500 µg a ratones BALB/c del péptido CCL5 indicado 1 hora antes (pre) o una horas después (post) infección, o se mezcla en volúmenes iguales y se administra simultáneamente (simultaneo) con ratones de control RSV A2 se administra una dosis equivalente (-1X106 PFU) de RSV mezclado en volumen igual con péptidos #7 o PBS. Cuatro días después, se determina la media geométrica de los títulos de virus infecciosos (± 1 desviación estándar). El limite de detección del ensayo fue de aproximadamente 1.5 Iog10. Hubo 5 ratones por grupo.

EJEMPLO 5 COMPARACIÓN DE SECUENCIAS DE POLIPÉPTIDOS CCL5 Y CCL3 Como se detalla en el Ejemplo 2, la quimiocina CCL5, pero no ia CCL3 (MIP- 1 a) o CCL4 (MIP- 1ß) inhibe la infección RSV de las células epiteliales. Esto indica que el RSV utiliza un receptor diferente al CCR5. Así, para elucidar adicionalmente la secuencia y/o los requerimientos estructurales del CCL5 media la inhibición de la infección RSV, los polipéptidos CCL5 y CCL3 se comparan por alineación de secuencias de aminoácido (Tabla 6) gráficas de hidropatía (figura 4A y figura 4B) y modelamiento molecular/ visualización (datos no mostrados).

Las secuencias de aminoácidos de CCL5 (ID de SECUENCIA NO: 1) y CCL3 (ID de Secuencia NO: 21) se compararon primero por vía de las "secuencias BLAST 2" espaciadas alineadas por algoritmo (BLSTP versión 2.2.6., Default Matriz BLOSUM62), que es una herramienta interactiva que utiliza el motor BLAST para comparación de secuencia proteína-proteína en forma de pares (o ADN- ADN) y genera una alineación espaciada al utilizar programación dinámica para extender el par central de residuos alineados (Tatusova y Madden, 1999). La secuencia de aminoácidos CCL5 se presenta sobre la alineación BLASTP (residuos en cajas) la secuencia de amicoácidos CCL3 se presenta por debajo de la alineación (Tabla 6). La alineación BLAST de CCL5 (residuos de aminoácido 4-68) y CCL3 (residuos de aminoácido 3-69) indican que estos polipéptidos comparten 32 aminoácidos idénticos (es decir, 48% de identidad de secuencia) y tienen cerca de 78% de similitud de secuencia de aminoácidos. La alineación incluye un espacio de aminoácido entre el Tyr7 y el Tyr8 de CCL5 (ID de SEC NO: 1), la omisión de los res primeros aminoácidos NH2-terminal de CCL5 (Ser1-Tyr3 de ID de SEC NO:21), la omisión de los primeros dos aminoácidos NH2-terminal de CCL3 (Ser1-Leuo2 de ID de SEC NO: 21) y la omisión del aminoácido COOH-terminal de CCL3 (Ala69 de ID de SEC NO:21).

Una comparación de las gráficas de hidropatía (Kyte y Doolittle, 1982) de longitud completa CCL5 versus CCL3 de longitud completa (figura 4A y figura 4B) indican que la divergencia de secuencia hidropática más grande entre el CCL5 y el CCL3 ocurre dentro del terminal NH2 de estos polipéptidos. Por ejemplo, los primeros cuatro aminoácidos del NH2-terminai de CCL5 (Ser1 -Pro2-Tyr3-Ser4) son hidrofílicos mientras que los primeros cuatro aminoácidos del NH2-terminal de CCL3 (Ser1-Leu2-Ala3-Ala4) son predominantemente hidrófobos (datos no mostrados). La calificación para la hidropatía para los primeros cuatro aminoácidos de CCL5 y CCL3 no se puede calcular con un tamaño de ventana deslizante de 9, y como tal, estos aminoácidos se omiten de las gráficas de hidropatía mostradas en la figura 4a y figura 4B. El NH2-terminal del CCL5 permanece hidrofílico hasta aproximadamente ocho aminoácidos (Serd), que es luego seguido por aminoácido hidrófobos Pro9-Cys10-Cys11-Phe12-Ala13-Tyr14-lso15-Ala16 de estructura NH2-argolla. De forma interesante, el NH2-terminal del CCL3, hasta aproximadamente treinta aminoácidos, tiene una relación inversa con (o espejos) el perfil de hidropatía de CCL5. En contraste, de aproximadamente 31 aminoácidos al final del COOH-terminal, los perfiles de hidropatía de estos dos polipéptidos son cercanamente idénticos (figura 4A).

Las estructuras de energía minimizada de CCL5 (PBD 1RTO; Skelton et al., 1995) y CCL3 (PBD 1BB53; Czaplewski et al., 1999) se modelan utilizando el paquete de software disponible al público (es decir, accesible por vía del servidor de la red amplia mundial ExPASy) SWISS- MODEL y Swiss-PdbViewer (Guex y Peitsch, 1997). Las dos estructuras de proteínas terciarias (o veces) superimpuestas con la excepción de los aminoácidos NH2 -terminal 1 a 7 y aminoácidos COOH-terminal 64 a 68 (datos no mostrados). Un análisis mejor ajustado (SWISS-MODEL "ajuste mágico") de una traza de estructura de carbono (dibujado como diagrama de ribbon) del polipéptido CCL5 de longitud completa (aminoácidos Ser1 a Ser68 de la ID de SEC NO:1) y polipéptidos CCL3 de longitud completa (aminoácidos Ser1 a Ala69 de la ID de SEC NO: 22). Similar a los dibujos de hidropatía, la divergencia de secuencia estructural más grande entre el CCL5 y el CCL3 ocurre en los residuos de aminoácido NH2-terminal.

Finalmente, la porción NH2-terminal de la proteína CCL5 que comprende el fragmento de péptido 1 (es decir, aminoácidos 1 a 15), que ha demostrado ser el más inhibidor contra la infección RSV, se analizó estructuralmente (datos nos mostrados). Los ángulos diedros (Phi y Psi) de CCL5, Met-CCL5 y AOP-CCL5 se calculan in silico, (SWISS-MODEL y Swiss-PdbViewer) utilizando coordenadas moleculares del Brookhaven Protein Data Bank depositado como los nombre PDB 1RTO, 1EQT y 1B3A, respectivamente. Los resultados de estos cálculos se muestran en la Tabla 7.

EJEMPLO 6 ENSAYOS AGONISTAS DE QUIMIOCINA Ensayos de Quimiotaxis. Se llevó acabo la Quimiotaxis de célula THP-1 (migración celular) de acuerdo con el método de Gong y Clark-Lewis (1995) según se modifica por Proudfoot et al. (1996). En resumen, 5.6 X 105 células en 200 µl de medio (RPMI 1640 que contiene 0.01 M HEPES, 10% de suero de ternero fetal inactivado con calor, 2 mM de L-glutamina, y 0.005% de gentamicina) se colocan en las cámaras superiores de microcámaras Boyden de 96 pozos (NeuroProbe; Cabin John, MD) ajustado con 5-µm filtros. Posteriormente, 370 µl del medio descrito anteriormente (menos el suero de becerro fetal), que contiene el ligando y las diluciones apropiadas de Met-CCL5, se colocan encamaras inferiores en la microcámara Boyden de 96 pozos.

Después de sesenta minutos de incubación a 37°C bajo s% de CO2, la células se remueven de los pozos superiores, y 200 µl de salina amortiguada con fosfato que contiene 20 µM de EDTA se agrega para que separe las células unidas al filtro. Después de treinta minutos de incubación a 4°C, la placa se centrífuga a 1800 X g durante 10 minutos, y los supernadantes se remueven de las paredes inferiores. El numero de células que migran se mide por el ensayo de proliferación celular no radioactivo Cell Titer 96™ (Promega), que monitorea la conversión del azul de tetrazolio en su producto formazan.

La quimiotaxis de monocitos y neutrófilos se mide como se describe por Fincham et ai. (1988). En resumen, 50 mi de sangre fresca se recolecta en solución de 15 mi que contiene 0.1 M de EDTA, 3% Dextrano y 3% de glucosa para evitar la agregación. Esta mezcla se le permite sedimentarse durante una hora a 37°C. El PMNs y los linfocitos se preparan al colocar 14 mi de plasma en 7 mi de Ficoll y centrifugar durante 20 minutos a 296 g X y 15°C con la centrífuga sin freno. Los linfocitos se localizan en la interfaz del Ficoll y el plasma, mientras que el PMNs forma una pastilla. Los eritrocitos contaminantes se remueven del PMN (principalmente neutrófilos) Por lísis hipotónica, y los leucocitos residuales se lavan y resuspenden en una concentración de 106 leucocitos/ml en medio RPMI 1640 Aproximadamente 40-50 X106 monocitos/ml se purifican de la fracción del linfocito al agregar 106 células sanguíneas rojas de oveja/ml y rosetamiento durante sesenta minutos a 4°C, seguido por centrifugación adicional de gradiente Ficoll. Los monocitos se lavan en amortiguador PBS (140 mMNaCI, 3 mM KCI, 8 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.4) y resuspendido en medio RPMI 1640.

Una microcamara Boyden de 96 pozos se utiliza para ensayar mocitos y quimiotaxis de neutrófilo. Dilusiones seriales de la molécula antiviral de ensayo (por ejemplo, un fragmento de péptido CCL5 NH2- erm¡nai modificado) se hace en medio RPMI 1640 con 2 mM L-glutamina, 25 mM HEPES, y 10% de suero de becerro fetal inactivo por calor).

Veinticinco µl atrayente de agrega a la cámara inferior de los pozos de ensayo y se cubren con una membrana de policarbonato libre de polivinilpirrolidona con tamaño de poro de 3 µm para neutrófilos y 5 µm para monocitos. Una solución de 50 µl que contienen 106 células/ml se agrega luego a la parte superior de los pozos. Las placas de ensato se incuban a 37°C durante veinte minutos para neutrófilos y treinta minutos para monocitos. La superficie superior de las membranas se lava luego con amortiguador PBS, y las células en el lado inferior de la membrana se fijan en metanol. Las membranas se tiñen con una mezcla de tintes de Field A y B (Bender and Hobein) y secadas al aire. Las células bajo la superficie de las membranas fueron luego contadas utilizando un microscopio Axiophot Zeiss y el software analizador de imágenes VIDAS (KONTRON Electronics, Zurcí, Suiza).

Ensayo de Movilización de Calcio. La movilización de calcio intracelular neutrófilo se mide con CCL5 sintético o recombínate y moléculas antivirales de ensayo sobre un rango de concentración de 10-10M. Las células se incuban en amortiguador Ringer Krebs (1.36 mM NaCI, 1.8 mM KCI, 1.2 mM KH2PO4, 1.2.mM MgSO4, 5 mM NaHCO3, 1.2 mM CaCI2, 0.21 mM EGTA, 5.5 mM D-glucosa, 20 mM HEPES) durante treinta minutos a 37°C con 2 µm de tinte Fura-2.

El tinte Fura-2 se excita a 340 nm y la emisión de fluorescencia se monitorea a 500 nm utilizando fluorómetro. Se calcula el Ca2+ intracelular utilizando la ecuación [Ca] = Kd (F-Fmin)/(Fma?-F), en donde Kd es la constante de disociación para la unión Ca2+ para el tinte y F esta en unidades fluorescentes arbitrarias. Un exceso de 10 mM de EGTA se agrega al quelato y el Ca2+ y calcula el Fm¡n. El pH se ajusta a 8.5 al agregar 20 mM de Tris y las células se lisan con 50 µm de digitonina. Fmax se calcula del valor de fluorescencia después de exponer las células usadas a un exceso de 1 mM Ca2+.

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Claims (49)

REIVINDICACIONES

1. Una composición antiviral que comprende un polipéptido CCL5, en donde el polipéptido CCL5 inhibe la infección mediante un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un sujeto mamífero.

2. La composición de la reivindicación 1. en donde el paramixovirus es un virus sincitial respiratorio (RSV).

3. La composición de la reivindicación 2, en donde el polipéptido CCL5 inhibe la infección RSV al bloquear ia interacción entre una proteína de fusión (F) RSV y una célula epitelial de mamífero.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 sintético o un polipéptido CCL5 expresado recombinantemente.

5. La composición de la reivindicación 4, en donde el polipéptido CCL5 es biológicamente inactivo como una quimiocina en un sujeto mamífero.

6. La composición de la reivindicación 1, en donde el sujeto mamífero es un humano.

7. La composición de la reivindicación 1, en donde el sujeto es un mamífero no humano domesticado seleccionado del grupo que consiste de una vaca, un caballo, un cerdo, un perro, un gato, una cabra y una oveja.

8. la composición de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CCL5 comprende una secuencia de aminoácidos de la ID de SEC No:1.

9. La composición de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 modificado en el NH2-terminal

10. La composición de la reivindicación 9, en donde el polipéptido CCL5 modificado en el NH2-terminal se selecciona del grupo que consiste de un aminooxipentano-CCL5 (AOP-CCL5), un Met-CCL5, un Na- nonaoil-CCL5 (NNY-CCL5), un ?1-2 truncado CCL5 y un ?1-8 truncado CCL5.

11. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente uno o más fragmentos de péptido CCL5, en donde los fragmentos comprenden aproximadamente 10 a 20 aminoácidos contiguos del polipéptido CCL5 de la ID de SEC No:1.

12. La composición de la reivindicación 11, en donde uno o más de los fragmento de péptido CCL5 se seleccionan del grupo que consiste de la ID de SEC No:2, ID de SEC No:3, ID de SEC No:4, ID de SEC No:5, ID de SEC No:6, ID de SEC No:7, ID de SEC No:8, ID de SEC No:9, ID de SEC No:10, ID de SEC No:11, ID de SEC No:12, ID de SEC No:13, ID de SEC No:14, ID de SEC No:15, ID de SEC No:16, ID de SEC No:17 y ID de SEC No:18.

13. La composición de la- reivindicación 12, en donde el fragmento de péptido CCL5 comprende una frecuencia de aminoácido de la ID de SEC No:2.

14. La composición de la reivindicación 13, en donde el fragmento de péptido de la ID de SEC No:2 se define adicionalmente como un péptido de NH2-terminal de la ID de SEC No:1.

15. La composición de la reivindicación 1, en donde el polipéptido CCL5 se define adicionalmente como un polipéptido CCL5 humano.

16. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un péptido mimético del NH2-terminal del polipéptido CCL5 de la ID de SEC No:1.

17. La composición de la reivindicación 16, en donde el péptido mimético de NH2-terminal del polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 retroinvertido que comprende una secuencia de aminoácido de ID de SEC No:19, ID de SEC No:20 o ID de SEC No:21.

18. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una molécula orgánica que se une a un receptor d.e quimiocina CCR3.

19. La composición de la reivindicación 18, en donde la molécula orgánica es un antagonista del receptor CCR3.

20. La composición de la reivindicación 19, en donde la molécula orgánica comprende uno o mas estructuras químicas de la formula I, II o lll.

21. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición se administra a un sujeto mamífero mediante administración intranasal o administración parenteral.

22. La composición de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una molécula orgánica que es un antagonista CCR1 o un antagonista CCR5.

23. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido CCL5 de la reivindicación 1.

24. Una célula huésped transfectada, transformada o infectada con el vector de la reivindicación 23.

25. Una composición antiviral que comprende un fragmento de péptido NH2-terminal de un polipéptido CCL5, en donde el fragmento comprende aproximadamente 10 a 20 aminoácidos contiguos del NH2-terminal de un polipéptido CCL5, en donde el fragmento inhibe la infección por un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un sujeto mamífero.

26. La composición de la reivindicación 25, en donde el paramixovirus es RSV.

27. La composición de la reivindicación 25, en donde el polipéptido CCL5 comprende un secuencia de aminoácido de la ID de SEC No:1.

28. La composición de la reivindicación 27, en donde el fragmento de péptido NH2-terminal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la ID de SEC No:2, ID de SEC No:3, ID de SEC No:4, ID de SEC No:5, ID de SEC No:6, ID de SEC No:7, ID de SEC No:8, ID de SEC No:9, ID de SEC No:10, ID de SEC No:11, ID de SEC No:12, ID de SEC No:13, ID de SEC No:14, ID de SEC No:15, ID de SEC No:16, ID de SEC No:17 y ID de SEC No:18.

29. La composición de la reivindicación 28, en donde el fragmento de péptido NH2-terminal comprende una secuencia de amino acido de la ID de SEC No:2

30. La composición de la reivindicación 25, en donde la composición es biológicamente inactiva como una quimiocina en un sujeto mamífero.

31. La composición de la reivindicación 25, en donde la composición se administra a un sujeto mamífero mediante administración intranasal o administración parenteral.

32. La composición de la reivindicación 25, en donde el fragmento de péptido CCL5 NH2-terminal inhibe la infección RSV al bloquear la interacción entre una proteína de fusión (F) RSV y una célula epitelial de mamífero.

33. La composición de ia reivindicación 25, que comprende adicionalmente uno o más polipéptidos CCL5 modificados NH2-terminal seleccionado del grupo que consiste de un aminooxipentano-CCL5 (AOP-CCL5), un Met-CCL5, un Na- nonaoil-CCL5 (NNY-CCL5), un ?1-2 truncado CCL5 y un ?1-8 truncado CCL5.

34. La composición de la reivindicación 25, que comprende adicionalmente un péptido mimético del NH2-terminal del polipéptido CCL5 de la ID de SEC No:1.

35: La composición de la reivindicación 34, en donde el péptido mimético del NH2-terminal del polipéptido CCL5 es un polipéptido CCL5 retroinvertido que comprende una secuencia de aminoácido de la ID de SEC No: 19, ID de SEC No:20 o ID de SEC No:21.

36. La composición de la reivindicación 25, que comprende adicionalmente una molécula orgánica que es un antagonista del receptor CCR1, un receptor CCR3 o un receptor CCR5.

37. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el fragmento péptido CCL5 NH2-terminal de la reivindicación 25.

38. Una- célula huésped transfectada, transformada o infectada con el vector de la reivindicación 37.

39. Una molécula mimética pequeña orgánica que se diseña por computador basado en modelamiento molecular utilizando las coordenadas atómicas X, Y, Z de los primeros quince aminoácidos CCL5 NH2-terminal de la ID de SEC No:1, en donde las coordenadas X, Y, Z se encuentran en un archivo de Banco de Datos de Proteínas Brookhaven seleccionado del grupo que consiste de 1RTN, 1RTO, 1EQT y 1B3A.

40. Una composición antiviral que comprende una molécula orgánica de la reivindicación 39.

41. Un péptido mimético del terminal NH2 de un polipéptido CCL5 en donde el péptido mimético inhibe la infección por un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un sujeto mamífero.

42. El péptido mimético de la reivindicación 41, en donde el mimético se diseña por computador basado en el modelamiento molecular que utiliza las coordenadas atómicas X, Y, Z de los primeros quince aminoácidos del CCL5 NH2-terminal de la ID de SEC No:1, en donde las coordenadas X, Y, Z están comprendidas en un archivo del Banco de Datos de Proteínas Brookhaven seleccionado del grupo que consiste de 1RTN, 1RTO, 1EQT y 1B3A.

43. El péptido mimético de la reivindicación 41, en donde el mimético es mimético reverso.

44. El péptido mimético de la reivindicación 43, en donde el mimético de giro inverso es un mimético de ß-giro, un mimético ß-giro monocíclico, un memito ß-giro bicíclico, un mimético ?-giro o un mimético ?-giro monocíclico.

45. Una composición antiviral que comprende el péptido mimético de la reivindicación 41.

46. Un método para prevenir o inhibir la infección por un virus de la Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un huésped mamífero, el método comprende administrar al huésped una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 1.

47. Un método para evitar o inhibir la infección por paramixovirus en un huésped mamífero, el método comprende administrar al huésped una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 25.

48. Un método para evitar o inhibir la infección por paramixovirus en un huésped mamífero, el método comprende administrar al huésped una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 39.

49. Un método para evitar o inhibir la infección por un virus de las Familia Paramixoviridae (paramixovirus) en un huésped mamífero, el método comprende administrar al huésped una cantidad farmacéuticamente efectiva de la composición de la reivindicación 41.