CN116209672A

CN116209672A - Sars-cov-2抑制剂

Info

Publication number: CN116209672A
Application number: CN202180049677.2A
Authority: CN
Inventors: L·曹; B·考文垂; I·戈列什尼克; L·米勒; D·贝克; L·科佐多伊; J·鲍恩; L·卡特; J·B·凯斯; M·戴蒙德; N·埃德曼; A·亨特; M·C·杰维特; C·J·小五原; Y·朴; R·拉维钱德兰; L·J·斯图尔特; D·维斯勒; B·沃杰利; A·C·沃尔斯
Original assignee: NORTHWEST UNIVERSITY; University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: NORTHWEST UNIVERSITY; University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2020-07-14
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2023-06-02
Also published as: US20230250134A1; KR20230038485A; EP4182027A1; JP2023542453A; AU2021308208A1; WO2022015418A1

Abstract

公开了SARS‑CoV‑2的多肽抑制剂，所述多肽抑制剂包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101，及其用于治疗SARS‑CoV‑2感染和限制SARS‑CoV‑2感染的发展的用途。

Description

SARS-COV-2抑制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年7月14日提交的美国临时专利申请序列号63/051,474和2020年8月19日提交的美国临时专利申请序列号63/067,593的优先权，所述美国临时专利申请序列号均全文以引用方式并入本文。

联邦资助声明

本发明是根据在由国防高级研究计划局(Defense Advanced Research ProjectsAgency)授予的批注号FA8750-17-C-0219和由国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的批注号HHSN272201700059C和R01 GM120553下的政府支持完成的。政府对本发明具有一定权利。

序列表声明：

序列表的计算机可读形式通过电子递交方式与本申请一同提交，并且通过引用以其整体并入本申请中。序列表包含在2021年5月25日创建的文件中，文件名为“20-1074-WO_SeqList_ST25”并且大小为1,112kb。

背景技术

SARS-CoV-2感染被认为往往从鼻子开始，病毒在那里复制数次，然后传播到更广泛的呼吸系统。因此，将高浓度的病毒抑制剂递送到鼻子和呼吸系统中通常可以潜在地提供预防保护和在感染早期的治疗功效，并且可能对卫生保健工作者和其他经常接触感染个体的人特别有用。

发明内容

在第一方面中，本公开提供了多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101，其中所述多肽与SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合结构域(receptorbinding domain,RBD)结合。在一个实施方案中，相对于参考多肽氨基酸序列的氨基酸取代选自表1中提供的示例性氨基酸取代。在另一个实施方案中，界面残基与参考多肽中的那些界面残基相同，或相对于参考多肽中的界面残基被保守取代。在另外的实施方案中，所述多肽包含两个或更多个拷贝的与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。在一个实施方案中，所述多肽包含式Z1-Z2-Z3，其中：

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164；

Z2包含任选的氨基酸接头；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164；

其中Z1和Z3可以是相同或不同的。

在另一个实施方案中，所述多肽包含式B1-B2-Z1-Z2-Z3-B3-B4，其中：

Z1、Z2和Z3如所定义的；

B2和B3包含任选的氨基酸接头；并且

B1和B4中的一者或两者独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164，其中B1和B4中的一者可以不存在。

在一个实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:193至SEQ ID NO:355和SEQ ID NO:454至SEQ ID NO:588；以及选自表8的右手栏中所列举的那些的属，其中属位置X1、X2、X3和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列。

在另一实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:356至SEQ ID NO:453和SEQ IDNO:595至SEQ ID NO:692；以及选自表9的中间栏中所列举的那些的属，其中属位置X1、X2、X3和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列。

在另外的实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:96，其中在存在分泌信号(MARAWIFFLLCLAGRALA；SEQ ID NO:63)的实施方案中，所述分泌信号可以用任何其他分泌信号代替。

在其他方面中，本公开提供了编码本公开的多肽的核酸；表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的所述核酸；宿主细胞，所述宿主细胞包含本公开的多肽、核酸和/或表达载体；本公开的多肽的寡聚物；组合物，所述组合物包含2个、3个、4个或更多个拷贝的根据本公开的任何实施方案的多肽，所述多肽附接至支持物，所述支持物包括但不限于多肽粒子支持物；以及药物组合物，所述药物组合物包含本公开的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物和/或组合物，以及药学上可接受的载体。

在另一方面中，本公开提供了用于治疗或限制严重急性呼吸综合征(severeacute respiratory syndrome,SARS)冠状病毒感染(包括SARS-Co-V和SARS-CoV-2)的发展的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的本公开的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物、组合物和/或药物组合物，以有效治疗或限制感染的发展。

附图说明

图1.用于方法1和方法2的SARS-CoV-2刺突受体结合结构域设计而设计的微型结合剂蛋白(Minibinder Protein)被编码在长寡核苷酸中，并被筛选以与酵母细胞表面上的经荧光标记的RBD的结合。深度测序鉴定了3个Ace2螺旋支架化设计(方法1)和150个从头界面设计(方法2)，所述设计是在进行RBD结合的FACS分选后明显富集的。设计在大肠杆菌(E.coli)中表达和纯化，并且许多被发现具有可溶性表达，在生物层干涉测量实验中结合RBD，并且可以有效地与ACE-2竞争结合RBD(图2所示的示例)。基于BLI数据(例如参见图2)，微型结合剂的RBD结合亲和力是：LCB1<1nM，LCB3<1nM。LCB2、LCB4、LCB5、LCB6、LCB7、LCB8的亲和力范围为1～20nM，不同结合剂的相对强度为LCB4>LCB2>LCB9＝LCB5>LCB6>LCB7。

图2.从头设计的微型结合物与SARS-CoV-2刺突RBD的高亲和力结合。将生物素化的刺突RBD蛋白负载到链霉亲和素生物层干涉测量(biolayer interferometry,BLI)尖端(ForteBio Octet^TM)上，并在洗涤后，将所述尖端浸入不同浓度的纯化Combo 1抗RBD微型结合剂中。在负载后，将尖端单独放入缓冲液中。(左侧和中间)响应曲线指示～Kd为300pM的亲和力。(右侧)如果将ACE-2负载到RBD尖端，然后添加Combo 1，则微型结合剂会迅速使ACE-2从BLI尖端上移开。

图3.针对SARS-CoV-2刺突RBD的从头设计的微型结合剂是热稳定的。在25℃、95℃以及在加热至95℃之后在25℃在圆二色性光谱仪中测量纯化的Combo 1微型结合剂。CD光谱的形状都非常相似，表明蛋白质在所有条件下都保持折叠。

图4.针对SARS-CoV-2刺突RBD的从头设计的微型结合剂在病毒中和测定中是有效的。SARS-CoV-2菌株2019n-CoV/USA_WA1/2020获自疾病控制和预防中心(Centers forDisease Control和Prevention)(Natalie Thornburg的礼物)。在Vero CCL81细胞(ATCC)中产生病毒原种，并通过对Vero E6细胞的病灶形成测定来进行滴定。将单克隆抗体(mAb)或微型结合剂的连续稀释液与102个病灶形成单位(focus-forming unit,FFU)的SARS-CoV-2一起于37℃孵育1h。将RBD微型结合剂(或mAb)-病毒复合物添加到96孔板中的VeroE6细胞单层中，并于37℃孵育1h。随后，将细胞用补充有2％ FBS的1％(w/v)甲基纤维素的MEM溶液覆盖。30h后通过去除覆盖物收获板，并将其在室温下用4％ PFA的PBS溶液固定20min。将板洗涤，并依次与1μg/mL的CR3022([1])抗S抗体和HRP缀合的山羊抗人IgG在补充有0.1％皂苷和0.1％ BSA的PBS中一起孵育。将SARS-CoV-2感染的细胞病灶使用TrueBlue^TM过氧化物酶底物(KPL)进行可视化，并在ImmunoSpot^TM显微分析仪(CellularTechnologies)上进行定量。使用Prism软件(GraphPad Prism^TM 8.0)处理数据。

图5(A至J).LCB1-Fc预防法防护了SARS-CoV-2感染。(A)与SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体的单独原体结合的三种LCB1v1.3微型蛋白的分子表面表示(左侧：侧视图；右侧：俯视图)。(B)通过由生物层干涉测量法监测(一种以技术重复执行的实验)的纯化的LCB1v1.3和LCB1-Fc与SARS-CoV-2 RBD的结合曲线。(C)LCB1v1.3、LCB1-Fc或对照结合剂对SARS-CoV-2WA1/2020分离株的中和曲线(EC₅₀值：分别为14.4pM、71.8pM和>10,000nM；两次实验的平均值，每次实验均一式两份执行)。(D-J)7至8周龄的雌性和雄性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内(i.n.)接种10³PFU的SARS-CoV-2的前一天通过腹腔注射接受250μg的LCB1-Fc或对照结合剂。在感染后(dpi,days post infection)4天和感染后7天时收集组织。(D)LCB1-Fc施用后的体重变化(平均值±SEM；n＝8，两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析(two-wayANOVA)：***P<0.001，****P<0.0001)。(E)通过在肺中于感染后4天或感染后7天时的噬菌斑测定所测量的传染性病毒(n＝8，两次实验：Mann-Whitney检验；***P<0.001)。(F至J)在肺、心脏、脾脏、脑或鼻洗液中于感染后4天或感染后7天时的病毒RNA水平(n＝8，两次实验：Mann-Whitney检验：ns表示不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

图6(A至C)。LCB1-Fc预防法预防了SARS-CoV-2介导的肺病。(A)呼吸力学参数：在感染后7天时测量的吸气量、阻力、弹性组织阻尼、准静态顺应性和压力容积环(n＝3-6，两次实验：使用Tukey后检验的双因素方差分析：ns表示不显著，所指示的组之间*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。(B)来自在D-1处用SARS-CoV-2处理并在感染后7天时收集的小鼠的肺切片的苏木精和伊红染色。图像示出了低(左侧)和高(右侧；从左起的加方框区)放大倍率。所有图像的比例尺为100μm。来自每组n＝3只小鼠的代表性图像。(C)来自感染后4天时的SARS-CoV-2感染小鼠的肺组织的细胞因子mRNA水平的热图。对于每种细胞因子，在归一化为Gapdh后计算相对于年龄匹配的原初对照动物的变化倍数，并绘制Log₂(变化倍数)曲线(相对于n＝3个原初对照，n＝8只小鼠/组)。

图7(A至J).抗RBD结合剂的暴露后递送减轻了SARS-CoV-2负担。(A至G)7至8周龄的雌性和雄性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内接种10³PFU的SARS-CoV-2后的一天通过腹腔注射接受250μg的LCB1-Fc或对照结合剂。在感染后4天或感染后7天时收集组织。(A)LCB1-Fc施用后的体重变化(平均值±SEM；n＝6，两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析：**P<0.01，****P<0.0001)。(B)通过在肺中于感染后4天或感染后7天时的噬菌斑测定所测量的肺中的传染性病毒(n＝6，两次实验：**P<0.01)。(C至G)在肺、心脏、脾脏、脑或鼻洗液中于感染后4天或感染后7天时的病毒RNA水平(n＝6，两次实验：Mann-Whitney检验：ns表示不显著，*P<0.05，**P<0.01)。(H)来自在D+1处进行处理并在感染后7天时用SARS-CoV-2收集的小鼠的肺切片的苏木精和伊红染色。图像示出了低(左侧)和高(右侧；从左起的加方框区)放大倍率。所有图像的比例尺为100μm。来自每组n＝3只小鼠的代表性图像。(I至J)7至8周龄的雄性K18-hACE2转基因小鼠在用10³PFU的SARS-CoV-2接种后一天或两天处接受单次50μg鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂。在肺(I)或鼻洗液(J)中于感染后7天时的病毒RNA水平(n＝6，两次实验：单因素方差分析：ns表示不显著，*P<0.05，****P<0.0001)。

图8(A至K).即使当在SARS-CoV-2暴露前5天给予，LCB1v1.3的鼻内施用也减少病毒感染。(A至D)7至8周龄的雌性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内接种10³PFU的SARS-CoV-2之前的指定时间处接受单次鼻内50μg剂量的LCB1v1.3或对照结合剂。在感染后4天或感染后7天时收集组织并确定病毒RNA水平(每组n＝5-6只动物，两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析：ns表示不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。(E至J)7至8周龄的雌性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内接种10³PFU的SARS-CoV-2的前一天接受指定鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂。(E)在LCB1v1.3或对照结合剂施用后的重量变化(平均值±SEM；n＝6，两次实验：与经对照结合剂处理的组相比，使用Sidak后检验的双因素方差分析：**P<0.01，****P<0.0001)。(F至J)在肺、心脏、脾脏、脑或鼻洗液中于感染后7天时的病毒RNA水平(n＝6，两次实验：使用Dunn后检验的Kruskal-Wallis方差分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。(K)来自在D-1处用单次鼻内50μg剂量的LCB1v1.3或对照结合剂处理并在感染后7天时用SARS-CoV-2收集的小鼠的肺切片的苏木精和伊红染色。图像示出了低(左侧)和高(右侧；从左起的加方框区)放大倍率。所有图像的比例尺为100μm。来自每组n＝3只小鼠的代表性图像。

图9(A至H).LCB1v1.3的免疫原性和对攻击的防护(A)实验细节方案。K18-hACE2转基因小鼠(每组n＝10只至12只)每3天通过鼻内施用用50μg的LCB1v1.3或对照结合剂进行治疗。在治疗后第18天，对动物进行采血并测量抗LCB1v1.3抗体。第二天，用10³PFU的SARS-CoV-2攻击动物，并在感染后7天时收集组织。(B)通过ELISA测量的血清抗体与LCB1v1.3的结合(三次实验)。虚线表示测定的检测限。(C)在LCB1v1.3或对照结合剂施用后的重量变化(平均值±SEM；两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析：****P<0.0001)。(D至H)在肺、心脏、脾脏、脑或鼻洗液于感染后7天时的病毒RNA水平(两次实验：Mann-Whitney检验：*P<0.05，**P<0.01，****P<0.0001)。

图10(A至M).LCB1v1.3保护小鼠免受B.1.1.7变体和WA1/2020 E484K/N501Y/D614G菌株。(A)LCB1v1.3对B.1.1.7或WA1/2020 E484K/N501Y/D614G SARS-CoV-2的中和作用(EC₅₀值：分别为802pM和667pM；两次实验的平均值，每次实验一式两份地执行)。(B至G)7至8周龄的雌性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内接种10³PFU的B.1.1.7前1天用单次50μg鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂处理。(B)在LCB1v1.3或对照结合剂施用后的重量变化(平均值±SEM；n＝6，两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析：***P<0.001，****P<0.0001)。(C至G)在肺、心脏、脾脏、鼻洗液或脑中于感染后6天时的病毒RNA水平(n＝6，两次实验：Mann-Whitney检验：*P<0.05，**P<0.01)。(H至M)8周龄的雄性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内接种10³PFU的WA1/2020E484K/N501Y/D614G前1天用单次50μg鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂处理。(H)在LCB1v1.3或对照结合剂施用后的重量变化(平均值±SEM；n＝6，两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析：*P<0.05，****P<0.0001)。(I至M)在肺、心脏、脾脏、鼻洗液或脑中于感染后6天时的病毒RNA水平(n＝6，两次实验：Mann-Whitney检验：*P<0.05，**P<0.01)。

图11.SARS-CoV-2感染后的细胞因子和趋化因子诱导在用对照或LCB1-Fc结合剂处理后，在感染后4天时被SARS-CoV-2感染的小鼠的肺中的细胞因子和趋化因子RNA水平的单独曲线(每组n＝8，两次实验：Mann-Whitney检验：ns表示不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。使用数据生成图6C中的热图。

图12(A至C)。与图7相关，在SARS-CoV-2感染后1天或2天时LCB1v1.3的鼻内递送降低了病毒负荷。(A至C)7至8周龄的雄性K18-hACE2转基因小鼠在用10³PFU的SARS-CoV-2接种后一天或两天处接受单次50μg鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂。心脏(A)、脾脏(B)或脑(C)中于感染后7天时的病毒RNA水平(n＝6，两次实验：单因素方差分析：*P<0.05，**P<0.01)。

图13.与图8相关，LCB1v1.3的鼻内预防减少了重量减轻。7至8周龄的雌性K18-hACE2转基因小鼠在鼻内接种10³PFU的SARS-CoV-2前的指定时间处接受单次50μg鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂。每天记录重量变化(平均值±SEM；n＝6，两次实验：使用Sidak后检验的双因素方差分析：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。

图14(A至B).多价微型结合剂同时与融合前SARS-CoV-2刺突蛋白上的多个表位接合，从而导致极其缓慢的解离速率。(A、B)使用AlphaLISA^TM经由与100倍摩尔过量的未标记M1竞争来监测微型结合剂构建体与受体结合结构域(RBD)(A)的复合物或与hexapro刺突蛋白(S6P)(B)的复合物的解离(平均值±SEM，n＝3)。

图15(A至F).与SARS-CoV-2S糖蛋白复合的多价微型结合剂的Cryo-EM结构。(A)结合至RBD的所有三种微型结合剂的带状图表示。(B)与两种RBD复合的F31-G10的Cryo-EM图谱。(C)与三种RBD复合的F231-P24的Cryo-EM图谱。(D)与S糖蛋白结合的H2-1的设计模型。(E)与S糖蛋白复合的H2-1在两个正交取向上的Cryo-EM图谱。(F)Cryo-EM图谱，示出了H2-1和S糖蛋白界面的相互作用残基。

图16(A至F)。多价增强了微型结合剂对SARS-CoV-2变体的中和作用的广度和效力。(A)使用AlphaLISA，经由与未标记的H2-0竞争来测量在24小时后微型结合剂构建体从S6P变体的解离(平均值，n＝3)。含X的细胞指示在无竞争者条件下的信号不足以量化所结合的蛋白质的分数。(B)经由ELISA测量微型结合剂构建体与ACE2对S6P的竞争(平均值，n＝2)。(C)微型结合剂构建体对SARS-CoV-2假病毒变体的中和曲线(平均值，n＝2)(D)表格总结了多价微型结合剂构建体对SARS-CoV-2假病毒变体的中和效力。N/A指示IC₅₀值高于测试浓度范围并且IC₅₀大于50,000pM。(E)微型结合剂构建体对真SARS-CoV-2分离株的中和曲线(平均值，n＝2)。(F)表格总结了多价微型结合剂构建体对真SARS-CoV-2分离株的中和效力。

图17(A至C).顶部多价微型结合剂候选物是抗逃逸的，并且可经由暴露前鼻内施用来保护小鼠免受SARS-CoV-2感染。(A)执行噬菌斑测定以分离针对对照中和抗体(2B04)以及F231-P12和H2-1多价微型结合剂的VSV-SARS-CoV-2嵌合病毒逃逸突变体。图像代表每多价微型结合剂35个重复孔。由黑色箭头突出显示的大噬菌斑指示逃逸。(B、C)K18-hACE2转基因小鼠(n＝6/时间点)在第0天用10³个噬菌斑形成单位的SARS-CoV-2变体B.1.1.7、B1.351、B.1.1.24进行鼻内感染前24h(T-24h)通过鼻内施用投配50ug的H2-0(鼻内，2×25μl剂量/鼻孔，总计100μl)。(B)感染后的每日重量变化(平均值±SEM；n＝6，使用Sidak后检验的双因素方差分析：*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001)。(C)感染几天后(感染后6天)，将动物(n＝6/时间点)处死，并通过定量实时RT-PCR分析肺、心脏、脾脏、脑或鼻洗液中SARS-CoV-2病毒RNA的存在(n＝6：Mann-Whitney检验：ns表示不显著，*P<0.05，**P<0.01)。

具体实施方式

引用的所有参考文献均以引用方式整体并入本文。在本申请中，除非另有说明，否则所利用的技术可以在诸如以下的若干篇熟知的参考文献中找到：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等人,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press),GeneExpression Technology(Methods in Enzymology,第185卷,D.Goeddel编辑,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guide to Protein Purification”in Methodsin Enzymology(M.P.Deutshcer编辑,(1990)Academic Press,Inc.)；PCR Protocols:AGuide to Methods和Applications(Innis等人1990.Academic Press,San Diego,CA),Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique,第2版(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),Gene Transfer和Expression Protocols,第109-128页,E.J.Murray编辑,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.)以及the Ambion1998Catalog(Ambion,Austin,TX)。

除非上下文中另外明确指明，否则如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。

如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。

在本文所公开的多肽的所有实施方案中，N末端甲硫氨酸残基是任选的(即：可以存在或不存在)。

除非上下文另外明确规定，否则本公开任何方面的所有实施方案均可以组合使用。

除非上下文另外明确要求，否则在整个说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等应在包括性的意义上解释，而不是在排他性或穷举的意义上解释；也就是说，在“包括但不限于”的意义上解释。使用单数或复数的词语也分别包括复数和单数。另外，词语“本文”、“以上”和“以下”和类似含义的词语在本申请中使用时应是指整个本申请而非本申请的任何特定部分。

在第一方面中，本公开提供了多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101，其中所述多肽与SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合结构域(RBD)结合。

>LCB1-1

DKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:1)

>LCB1-2

DKEEILNKIYEIMRLLDELGNAEASMRVSDLILEFMKKGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:2)

>LCB1-3

DKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:3)

>LCB1-4

DKENILQKIYEIMKTLDQLGHAEASMQVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:4)

>LCB1-5

DKENILQKIYEIMKTLDQLGHAEASMNVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:5)

LCB1_v1.1_Cys

DKENILQKIYEIMKTLDQLGHAEASMQVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVERC(SEQ ID NO:6)

>LCB1_v1.2

DKENILQKIYEIMKTLDQLGHAEASMYVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:7)

>LCB1_v1.3

DKENILQKIYEIMKTLEQLGHAEASMQVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:8)

>LCB1_v1.4

DKENILQKIYEIMKTLEQLGHAEASMQVSDLIYEFMKQGDENLLEEAEQLLQEVER(SEQ ID NO:9)

>LCB1_v1.5(具有N-连接糖基化的LCB1_v1.3)

DKENILQKIYEIMKTLEQLGHAEASMNVSDLIYEFMKQGDERLLEEAERLLEEVER(SEQ ID NO:10)

>LCB2-1

SDDEDSVRYLLYMAELRYEQGNPEKAKKILEMAEFIAKRNNNEELERLVREVKKRL(SEQ ID NO:11)

>LCB2-2

SDDEDAVRYLLYMAELLYKQGNPEEAKKLLELAEFIAKRNNNEELERLVREVKKRL(SEQ ID NO:12)

>LCB3-1

NDDELHMLMTDLVYEALHFAKDEEIKKRVFQLFELADKAYKNNDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:13)

>LCB3-2

NDDELLMLVTDLVAEALLFAKDEEIKKRVFTLFELADKAYKNNDRDTLSKVVSELKELLERLQ(SEQID NO:14)

>LCB3_v1.2

NDDELHMQMTDLVYEALHFAKDEEIQKHVFQLFEKATKAYKNKDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:15)

>LCB3-4

NDDELHMQMTDLVYEALHFAKDEEIQKHVFQLFENATKAYKNKDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:16)

>LCB3_v1.1

NDDELHMQMTDLVYEALHFAKDEEFQKHVFQLFEKATKAYKNNDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:17)

>LCB3_v1.3

NDDELHMQMTDLVYEALHFAKDEEFQKHVFQLFEKATKAYKNKDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:19)

>LCB3_v1.4

NDDELHMQMTDLVYEALHKAKDEEFQKHVFQLFEKATKARKNKDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:20)

>LCB3_v1.5

NDDELHMQMTDLVYEALHKAKDEEMQKRVFQLFEQADKAYKTKDRQKLEKVVEELKELLERLLS(SEQID NO:21)

>LCB4-1

QREKRLKQLEMLLEYAIERNDPYLMFDVAVEMLRLAEENNDERIIERAKRILEEYE(SEQ ID NO:23)

>LCB4-2

DREERLKYLEMLLELAVERNDPYLIFDVAIELLRLAEENNDERIYERAKRILEEVE(SEQ ID NO:24)

>LCB5-1

SLEELKEQVKELKKELSPEMRRLIEEALRFLEEGNPAMAMMVLSDLVYQLGDPRVIDLYMLVTKT(SEQID NO:25)

>LCB5-2

SLEEVKEILKELKKELSPEDRRLIEEALRLLEEGNPAMASMVLSDLVFLLGDPRVIELLMLVTKT(SEQID NO:26)

>LCB6-1

DREQRLVRFLVRLASKFNLSPEQILQLFEVLEELLERGVSEEEIRKQLEEVAKELG(SEQ ID NO:27)

>LCB6-2

DREQRLVRFLVRLASKFNLSMEQILILFDVLEELLERGVSEEEIRKILEEVAKEL(SEQ ID NO:28)

>LCB7-1

DDDIRYLIYMAKLRLEQGNPEEAEKVLEMARFLAERLGMEELLKEVRELLRKIEELR(SEQ ID NO:29)

>LCB7-2

DDDVRYLIYMAKLLLEQGNPEEAEKVLESARFAAELLGNEELLKEVRELLRKIEELR(SEQ ID NO:30)

>LCB8-1

PIIELLREAKEKNDEFAISDALYLVNELLQRTGDPRLEEVLYLIWRALKEKDPRLLDRAIELFER(SEQID NO:31)

>LCB8-2

PVTELLREAKEKNDPMAISDALFLVFELAQRTGDPRLEEVLFLIWRALKEKDPRLLDRAIELFER(SEQID NO:32)

>AHB1-1

DEDLEELERLYRKAEEVAKEAKDASRRGDDERAKEQMERAMRLFDQVFELAQELQEKQTDGNRQKATHLDKAVKEAADELYQRVR(SEQ ID NO:33)

>AHB1-2

DEDLEELERLYRKAEEVAKEAEEASRRGDKERAKELLERALHLFDQVFELAQELQEKLTDEKRQKATHLDKAVHEAADELYQRVR(SEQ ID NO:34)

>AHB2-1

ELEERVMHLLDQVSELAHELLHKLTGEELQRATHFDKWANEAILELIKSDDEREIREIEEEARRILEHLEELARK(SEQ ID NO:100)

>AHB2-2_

ELEEQVMHVLDQVSELAHELLHKLTGEELERAAYFNWWATEMMLELIKSDDEREIREIEEEARRILEHLEELARK(SEQ ID NO:101)

如以下示例中所详述，多肽以高亲和力结合SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合结构域(RBD)。

在本文的所有实施方案中，同一性百分比要求不包括可并入多肽中的任何附加功能结构域。在一个实施方案中，1个、2个或3个氨基酸可从N和/或C末端缺失。

如以下示例中所述，已对多肽进行广泛的突变分析，从而允许确定多肽内的每个残基处可允许的取代。示例性取代如表1中所示(数字表示残基编号，并且字母表示可以存在于该残基处的单字母氨基酸)。因此，在一个实施方案中，相对于参考多肽氨基酸序列(即：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101中的一者)的氨基酸取代选自表1中提供的示例性氨基酸取代。

表1:示例性取代：

LCB1(SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--A,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

4--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

5--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

6--A,C,I,L,M,Q,T,V

7--A,C,D,E,F,G,H,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

8--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

9--C,I,L,M,N,Q,T,V

10--C,F,V,W,Y

11--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

12--A,C,D,H,I,L,M,N,S,T,V,Y

13--C,I,M,Q

14--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

15--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

16--C,F,I,L,M,T,V

17--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

18--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,W

21--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

22--A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

23--C,E,M,N,P,Q,S,T,V

24--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

25--A,C,G,M,N,Q,S,T,V

26--M,N,V

27--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

28--A,C,G,I,L,S,T,V

29--A,C,S,V,W

30--D

31--A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

32--C,F,H,I,L,M,N,P,T,V

33--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

34--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

35--A,C,D,F,H,M,Q,V,W,Y

36--A,C,D,E,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

37--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

38--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

39--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

40--D,E,G,H,N,P,Q

41--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

42--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

43--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

44--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,V,W,Y

45--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

46--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

47--A,C,G,P,S,T,V

48--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

49--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

52--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

56--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB2(SEQ ID NOS:11-12)

1--A,C,D,E,G,N,P,S,T

2--D,M,P,Q,Y

3--A,D,E,N,Q

4--C,D,E,V

5--D

6--A,C,D,E,G,N,Q,S,T,V

7--A,C,G,I,L,M,P,S,T,V

8--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

9--D,N,Y

10--I,L,T

11--C,E,G,I,L,M,W

12--F,H,Y

13--E,M,Q,R,V

14--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

15--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V

16--C,H,L,T

17--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

18--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

21--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

22--A,C,D,E,G,I,K,L,N,P,Q,R,S,T,V

23--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

24--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

25--A,C,E,G,H,I,K,N,P,Q,R,S,T,Y

26--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

27--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

28--H,K,R,T,Y

29--C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

30--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

31--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

32--F,H,I,K,L,M,P,Q,R,Y

33--A,C,G,P,S,T

34--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

35--F,H,Y

36--A,C,E,H,I,L,M,S,V

37--A,C,E,G,H,L,M,Q,R,S,T,V,W

38--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

39--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V

40--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

41--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

42--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

43--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

44--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

45--A,C,E,F,I,L,M,P,S,T,V,W,Y

46--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

47--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

48--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

49--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

52--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

56--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB3(SEQ ID NOS:13-17,19-21和137-163)

1--C,E,F,I,M,N,T,W

2--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--D,G,L,M,N,S,Y

4--A,C,E,F,H,K,Q,T

5--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

6--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

7--A,C,D,F,I,L,M,P,R,S,V,W

8--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

9--A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,Y

10--A,C,F,G,H,K,M,N,Q,R,S,T,Y

11--D,F,H,L,M,N,Q

12--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

13--A,F,I,L,M,N,Q,S,T,V

14--A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

15--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

16--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

17--A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W

18--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

21--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

22--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

23--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

24--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

25--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

26--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

27--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

28--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

29--A,C,D,E,F,G,I,L,M,N,P,S,T,V,W,Y

30--C,E,F,H,L,N,S,W,Y

31--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

32--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

33--A,C,E,F,I,K,P,Q,S,V,W,Y

34--A,D,E,F,G,H,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y

35--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

36--A,C,E,G,H,I,M,N,Q,S,T,V

37--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

38--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

39--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

40--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

41--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

42--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

43--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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46--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

47--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

48--A,C,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W

49--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

52--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

56--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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60--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

61--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

62--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

63--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

64--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB4(SEQ ID NO:23-24)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

4--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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7--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

8--A,C,H,I,M,N,Q,R,S,T,V,Y

9--A,C,D,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,Y

10--A,C,D,E,M,N,P,Q,S,T,V

11--C,D,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V

12--F,G,I,L

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14--A,C,D,E,G,L,M,N,Q,R,S,T,V

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19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

21--C,D,Q,Y

22--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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24--A,F,G,I,L,M,W

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31--C,D,E

32--A,C,E,I,L,M,Q,S,T,V,Y

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36--A,C,G,S,T,V

37--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

38--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

39--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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45--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

46--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

47--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

48--A,C,M,S,T,V

49--A,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,F,I,K,L,M,R,T,V,W,Y

52--F,I,K,L,M,V

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

56--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB5(SEQ ID NO:25-26)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

4--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

5--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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7--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

8--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

9--A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

10--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

11--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

12--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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15--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

16--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

17--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

18--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

21--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

22--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

23--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

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25--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

26--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

27--A,C,G,H,I,S,T,V

28--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

29--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

30--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

31--A,C,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

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33--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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35--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

36--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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41--C,H,I,L,M,P,R

42--A,C,E,G,H,I,L,M,P,T,V,Y

43--C,I,L,M,Q,T,V

44--A,C,D,F,G,H,I,M,S,T

45--D,Y

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47--C,E,G,I,V

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49--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

52--C,D,E,H,I,K,N,P,Q,R,S,T,Y

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

56--F,I,L,M,T,V,W

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58--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

59--A,C,F,I,L,M,T,V,Y

60--C,F,M,N,V,Y

61--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

62--A,C,F,G,I,L,M,S,T,V,W

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64--A,C,E,F,G,H,K,L,N,P,R,S,T,W,Y

65--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB6(SEQ ID NO:27-28)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--E,W

4--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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7--H,T,V

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10--A,K,L,W

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13--E,L

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17--F,N,P,S

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19--L,N,Q,V

20--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

21--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

22--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

23--C,D,P,Q,R,W

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26--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

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30--L,Q,V,W

31--I,K,L,S

32--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

33--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

34--A,F,L,T,V

35--C,D,G,H,K,L,N,T

36--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

37--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

38--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

39--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

40--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

41--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

42--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

43--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

44--F,I

45--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

46--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

47--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

48--L,Q,R,T

49--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

51--C,V,Y

52--A,E,H,K

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--C,F,H,L,P,W,Y

56--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB7(SEQ ID NO:29-30)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

4--I,T,V

5--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

6--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

7--L,P,Y

8--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

9--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

10--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

11--A

12--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

13--A,L,P

14--H,L,R,T,Y

15--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

16--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

17--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

18--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

21--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

22--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

23--A,S

24--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

25--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

26--C,G,S,V,Y

27--K,L,M,W

28--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

29--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

30--A,Y

31--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

32--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

33--A,C,F,I,K,L,V,W

34--A,H,L

35--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

36--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

37--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

38--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

39--A,C,K,L,M,N

40--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

41--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

42--A,C,D,L,V

43--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

44--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

45--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

46--Q,S,V

47--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

48--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

49--E,L

50--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

52--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

53--I

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

56--L,M,N,R

57--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

LCB8(SEQ ID NO:31-32)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--C,F,I,L,M,S,V,W,Y

3--A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

4--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

5--A,C,F,G,I,K,L,M,Q,S,T,V,W,Y

6--H,I,K,L,M

7--A,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,W,Y

8--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

9--A,C,F,G,I,L,M,S,Y

10--A,F,H,K,L,M,Q,R,S

11--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

12--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

13--A,C,D,E,F,G,H,M,N,Q,S,W,Y

14--C,D,E,H,N,Q,S

15--A,D,E,F,H,I,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

16--C,F,M,N,R,Y

17--A,C,I,L,M,Q,R,V

18--A,C,F,H,I,L,M,T,V,Y

19--I,Q,S

20--D,N

21--A,C,G,S,V

22--A,C,I,L,M,V

23--C,F,R,T,W,Y

24--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

25--C,E,S,T,V,Y

26--A,C,D,E,F,G,H,N,Q,S,T

27--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V

28--C,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,W,Y

29--A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,Y

30--A,C,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,T

31--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,Y

32--A,C,D,E,G,H,I,K,N,Q,R,S,T,W

33--A,C,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,S,W,Y

34--C,D,E,F,H,M,N,W,Y

35--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y

36--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

37--F,G,H,I,L,M,S,T,Y

38--D,E,H,Q,W,Y

39--C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

40--A,C,E,G,H,I,K,M,P,V,Y

41--C,F,H,I,K,L,M,R,S,T,V

42--E,F,I,T,W,Y

43--A,C,D,E,F,H,I,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

44--C,G,I,K,L,M,T,V,Y

45--G,S,W,Y

46--C,I,K,L,M,N,Q,R,S,T

47--A,C,E,N,Q,S,T,V

48--C,D,E,F,H,I,L,M,W

49--C,D,F,H,K,L,M,N,Q,R,T

50--A,C,D,E,N,Y

51--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

52--A,C,D,E,G,H,K,L,M,N,Q,R,S,T

53--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

54--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

55--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

56--C,I,L,M

57--A,C,D,E,G,I,N,Q,S,T

58--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

59--A,C,G,P,S

60--A,C,E,F,G,I,L,M,N,Q,S,T,V

61--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

62--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

63--A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

64--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V

65--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y

AHB1(SEQ ID NOS:33-34)

1--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

2--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

3--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

4--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

5--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

6--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

7--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

8--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

9--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

10--A,C,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

11--F,N,Y

12--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

13--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

14--A,D,G

15--A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V

16--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

17--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

18--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

19--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

20--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

21--A,C,E,G,S,V

22--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

23--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

24--A,C,D,E,F,H,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,Y

25--A,C,D,F,G,H,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

26--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

27--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

28--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,Y

29--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

30--A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

31--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

32--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

33--A,G,S

34--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

35--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

36--A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

37--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

38--A,C,E,G,H,M,P,Q

39--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

40--A,C,D,E,G,K,N,Q,R,S,T

41--A,C,D,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y

42--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

43--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y

44--E,F,H,Q,S,W,Y

45--D,N

46--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

47--C,T,V

48--F,S,W,Y

49--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

50--A,C,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y

51--A,D,G,H,N,S

52--H,K,Q,R

53--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

54--A,C,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V

55--A,C,E,G,H,K,N,Q,R,S,T

56--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

57--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

58--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

59--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

60--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

61--A,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

62--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

63--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

64--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

65--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

66--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

67--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

68--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

69--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

70--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

71--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

72--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

73--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

74--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

75--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

76--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

77--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

78--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

79--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

80--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

81--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

82--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

83--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

84--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

85--A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y

AHB2(SEQ ID NO:101-102和164)

1--C,G,A,V,F,Y,W,S,Q,D,E,R,K

2--C,P,G,V,I,M,L,F,Y,W,S,N,Q,D,E,R,H

3--C,G,A,V,I,F,S,T,D,E,K

4--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

5--C,P,G,A,V,M,L,Y,W,S,N,Q,D,E,R,K,H

6--G,A,V,I,F,S,T,D,H

7--C,P,G,V,I,M,L,F,W,S,T,N,Q,E,R,K,H

8--C,P,G,A,V,M,L,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

9--C,P,G,A,V,I,M,L,F,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

10--C,P,G,A,V,I,L,Y,W,S,T,N,E,R,K

11--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,H

12--C,P,G,A,V,I,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

13--C,G,A,V,M,L,F,W,S,T,N,E,H

14--C,P,G,A,V,I,Y,S,T,N,D,E,R,H

15--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K

16--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

17--C,P,G,A,V,L,Y,W,S,T,Q,D,E,R

18--C,P,A,V,I,M,F,Y,N,Q,R,K,H

19--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

20--C,P,G,A,V,M,L,Y,W,N,Q,E,R,K,H

21--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,N,Q,E,R,K,H

22--C,P,G,A,V,M,L,F,Y,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

23--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,E,R,K

24--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,Q,E,R,H

25--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,R,H

26--C,G,A,V,L,Y,S,N,D,R,K,H

27--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

28--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

29--C,P,G,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,R,K,H

30--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

31--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,Q,D,E,R,K,H

32--P,G,A,V,I,L,W,S,T,D,R,H

33--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,E,R,K,H

34--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

35--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

36--C,P,G,A,V,I,L,F,Y,S,T,N,Q,D,E,R,H

37--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

38--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,Q,E,R,K

39--C,P,G,A,V,I,W,S,Q,E,R,H

40--C,P,G,A,V,I,L,Y,W,S,T,N,D,E,R,K,H

41--C,P,G,A,V,I,M,L,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

42--C,P,G,A,V,M,L,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

43--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

44--C,P,G,A,V,I,M,L,F,W,S,T,Q,D,E,R,H

45--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

46--C,P,G,A,V,I,M,L,F,S,T,Q,E,R,K

47--C,G,A,V,I,M,L,F,W,S,T,N,Q,D,E,R,H

48--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,N,Q,E,R,K

49--C,P,G,A,V,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

50--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

51--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

52--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

53--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,D,E,R,K,H

54--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

55--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

56--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

57--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

58--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,E,R,K,H

59--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

60--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,Q,D,E,R,K

61--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,N,Q,D,E,R,K,H

62--C,G,A,V,L,S,T,N,D,E,K,H

63--C,P,G,A,V,I,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

64--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,H

65--C,G,A,V,I,M,L,F,Y,S,T,N,R,K,H

66--C,P,G,A,V,I,M,L,W,T,Q,E,R

67--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

68--C,P,G,A,V,I,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,H

69--P,G,V,I,M,L,Y,W,S,T,Q,R,K

70--C,P,G,A,V,I,M,L,F,Y,W,S,T,N,Q,D,E,R,K,H

71--C,G,A,V,L,F,W,S,Q,D,E,R,K

72--C,V,I,L,S

73--P,G,A,V,S,T,E

74--C,A,L,F,Y,S,T,R,H

75--C,P,G,V,I,L,F,W,S,N,D,E,R,K

表2中列出了用于各种设计类型的距RBD靶标8A以内的界面残基的残基编号。在另一个实施方案中，表2中列出的界面残基处的氨基酸残基与参考序列的该残基处相同，或者可以通过保守氨基酸取代进行取代。此类保守氨基酸取代涉及用具有相似生理化学特性的残基取代残基，例如，将一个脂肪族残基取代成另一个(诸如将Ile、Val、Leu或Ala取代成另一个)，或将一个极性残基取代成另一个(诸如在Lys与Arg之间；Glu与Asp之间；或Gln与Asn之间)。其他此类保守取代(例如，具有相似疏水性特征的整个区域的取代)是已知的。氨基酸可以根据其侧链特性的相似性进行分组(A.L.Lehninger,Biochemistry,第二版,第73-75页,Worth Publishers,New York(1975))：(1)非极性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；(2)不带电荷的极性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)；(4)碱性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者，天然存在的残基可以基于常见的侧链性质被分成组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代将需要将这些类别中的一个类别的成员交换为另一个类别。特定的保守取代包括例如：Ala变为Gly或变为Ser；Arg变为Lys；Asn变为Gln或变为His；Asp变为Glu；Cys变为Ser；Gln变为Asn；Glu变为Asp；Gly变为Ala或变为Pro；His变为Asn或变为Gln；Ile变为Leu或变为Val；Leu变为Ile或变为Val；Lys变为Arg、变为Gln或变为Glu；Met变为Leu、变为Tyr或变为Ile；Phe变为Met、变为Leu或变为Tyr；Ser变为Thr；Thr变为Ser；Trp变为Tyr；Tyr变为Trp；和/或Phe变为Val、变为Ile或变为Leu。

表2：界面残基

‘LCB1’：[3,6,7,10,13,17,20,22,23,25,26,29,32,33,36]，

‘LCB2’：[1,2,5,6,9,12,13,16,20,32,35,39]，

‘LCB3’：[1,3,4,6,7,10,11,13,14,15,18,27,30,33,34,37]，

‘LCB4’：[8,11,12,15,23,24,26,27,28,30,31,34,56]，

‘LCB5’：[35,37,38,40,41,44,47,48,53,56,60,63]，

‘LCB6’：[3,4,7,8,11,12,14,15,21,24,25,28,31,32,35]，

‘LCB7’：[2,3,6,7,9,10,13,17,29,32,33,36]，

‘LCB8’：[14,15,16,19,22,23,26,29,30,38,41,42,45]，

‘AHB1’：[34,38,41,45,48,49,52,63,64,67,68,70,71,74,78,81,82,85]，

‘AHB2’：[4,7,11,14,15,18,21,26,29,30,33,34,36,37,40,43,44,47,48]。

在一个实施方案中，表2中列出的界面残基处的氨基酸残基与参考序列的该残基处相同。

在另一实施方案中，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34和SEQID NO:100至SEQ ID NO:101。

在一个实施方案中，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136(参见表3)。

表3：LCB1示例性变体

/>

多肽可在保留结合活性的同时包含大量突变，如以下实施例中所详述。在一个实施方案中，所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在选自由2、4、5、14、15、17、18、27、28、32、37、38、39、41、42、49、52和55组成的组中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个残基处的氨基酸取代。在另一实施方案中，取代选自表4中在给定行中单独地(即：表中列出的任何单个突变)或组合地列出的取代。

表4：示例性LCB1取代

/>

在另一实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163(参见表5)。

表5：LCB3示例性变体

/>

多肽可在保留结合活性的同时包含大量突变，如以下实施例中所详述。在一个实施方案中，所述多肽包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸序列在选自由2、6、8、9、13、14、19、22、25、26、28、29、34、35、37、40、43、45、49和62组成的组的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或全部20个残基处的氨基酸取代。在另一实施方案中，取代选自表6中在给定行中单独地或组合地列出的取代。

表6：示例性LCB3取代

在另外的实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:100至SEQ ID NO:101以及SEQ ID NO:164(参见表7)。

表7：AHB2示例性变体

AHB2v2 ELEEQVMHVLDQVSELAHELLHKLTGEELERAAYFNWWATEMMLELIKSDDEREIREIEEEAARILEHLEELART(SEQ ID NO:164)

在一个实施方案中，所述多肽包含相对于SEQ ID NO:101的氨基酸序列在选自由63和75组成的组的一个或两个残基处的氨基酸取代。在另外的实施方案中，所述取代包括R63A和/或K75T。

在本文公开的所有实施方案中，多肽可包含一个或多个被认为适合预期用途的附加官能团或残基。在一个实施方案中，所述多肽可进一步包含一个或多个在N末端和/或C末端处添加的半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，所述多肽可进一步包含N连接的糖基化位点(即：NX(S/T)，其中X是任何氨基酸)。

在另外的实施方案中，所述多肽包含两个或更多个(即：2个、3个、4个、5个或更多个)拷贝的与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。在这个实施方案中，2个或更多个结合剂被连接。在一个实施方案中，所述两个或更多个拷贝的多肽都是相同的；在另一实施方案中，所述两个或更多个拷贝的多肽不完全相同。在这些实施方案中的任一实施方案中，所述两个或更多个拷贝的多肽可以由氨基酸接头序列分开，但是此类接头不是必需的。氨基酸接头可以具有适合预期目的的任何长度和氨基酸组成。在一个实施方案中，氨基酸接头的长度独立地介于2-100个氨基酸或3-100个氨基酸之间。

在另一实施方案中，氨基酸接头序列包含富含Gly-Ser的(至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的Gly-Ser残基)氨基酸接头。在另一实施方案中，所述富含Gly-Ser的接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GG以及SEQ IDNO:35至SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:165至SEQ ID NO:171。

GSGS(SEQ ID NO:35)

GGSGGS(SEQ ID NO:36)

SGGSGGSGGSG(SEQ ID NO:37)

GGSGGSGSGGSG(SEQ ID NO:38)

GGSGSSGGSGSGSG(SEQ ID NO:39)

GGSGSGGSGSGSGGS(SEQ ID NO:40)

SGGSGSGSGGSGSGS(SEQ ID NO:41)

GGGSGGGSSGGSGGSSGGGSGGGS(SEQ ID NO:42)

GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG(SEQ ID NO:43)

GGGSGGGSGGSGGSGGGSGGGSGSGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:44)

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)

SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)

GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:165)

GGSGGGGSGGGGSGG(SEQ ID NO:166)

GGSGGGGSGG(SEQ ID NO:167)

GGGGSGGGG(SEQ ID NO:168)

GGGSGGG(SEQ ID NO:169)

GGSGG(SEQ ID NO:170)

GGSGSSG(SEQ ID NO:171)

在另一实施方案中，所述氨基酸接头序列可包含富含Pro(至少15％、20％、25％或更多的Pro残基)的氨基酸接头。非限制性和示例性实施方案可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:172至SEQ ID NO:176。

AGSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSASG(SEQ ID NO:97)

GSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSGGSGNSSGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTPSPSAS(SEQID NO:98)

GGASPAAPAPASPAAPAPSAPAGG(SEQ ID NO:172)

GGASPAAPAPASPAGG(SEQ ID NO:173)

GGASPAAPAPGG(SEQ ID NO:174)

GGASPAAPAGG(SEQ ID NO:175)

GGSSGPSTPPTPSPSTPPTPSPSPGGSSG(SEQ ID NO:176)

在另外的非限制性实施方案中，所述氨基酸接头可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:177至SEQ ID NO:178。

GGSSAGSPTSTGTSSATPSGSGTGG(SEQ ID NO:177)

GGSSGEAAAKEAAAKEAAAKGSSGG(SEQ ID NO:178)

GGSSGQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGGGSSG(SEQ ID NO:99)

在一个实施方案中，所述多肽包含式Z1-Z2-Z3，其中：

Z2包含任选的氨基酸接头；并且

其中Z1和Z3可以是相同或不同的。在一个实施方案中，Z1和Z3是相同的；在另一个实施方案中，Z1和Z3是不同的。在Z1和Z3不同的实施方案中，Z1和Z3各自可以是给定起始单体的变体(例如：Z1包含SEQ ID NO:1(LCB1)的氨基酸序列，并且Z3包含SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136的氨基酸序列。可以使用本文所公开的单体的任何此类组合。还应理解的是，多肽可包含2个、3个、4个、5个或更多个本文所公开的任何实施方案的单体。在存在3个或更多个单体的实施方案中，所有3个单体都可以是相同的；2个单体可以是相同的并且一个单体可以不同，或者所有3个单体都可以不同。

在一个采用LCB1及其变体的实施方案中，Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136。

在另一采用LCB3及其变体的实施方案中，

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQID NO:137至SEQ ID NO:163；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQID NO:137至SEQ ID NO:163。

在另一采用AHB及其变体的实施方案中，

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。

在一个实施方案中，Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQID NO:102至SEQ ID NO:136；并且

Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。

在另一实施方案中，Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQID NO:102至SEQ ID NO:136；并且

Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:164。

在另一实施方案中，Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163；并且

在作为本文所公开的其他实施方案中的任何实施方案的另一实施方案中，所述多肽包含至少3个单体(即：3个、4个、5个或更多个)。在一个此类实施方案中，所述多肽包含式B1-B2-Z1-Z2-Z3-B3-B4，其中：

Z1、Z2和Z3如上所定义；

B2和B3包含任选的氨基酸接头；并且

B1和B4中的一者或两者独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164，其中B1和B4中的一者可以不存在。在一个实施方案中，B1和B4中的一者不存在。在另一实施方案中，B1和B4都存在。在一个实施方案中，B1和B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164。在这个实施方案中，B1和B4可以是相同的或可以是不同的。在一个实施方案中，当存在时的B1和当存在时的B4与Z1和Z3中的一者或两者相同。在另一实施方案中，当存在时的B1和当存在时的B4与Z1和Z3中的任一者都不相同。

在一个实施方案中，当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:164。

在另一实施方案中，当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136。

在另外的实施方案中，当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。

在又一实施方案中，当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。

在B1和B4两者都存在的各种实施方案中，

·B1和B4中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136，并且另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163；

·B1和B4中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136，并且另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164；或者

·B1和B4中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163，并且另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。

在各种非限制性实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:193至SEQ ID NO:355和SEQ ID NO:454至SEQ ID NO:588；以及选自表8的右手栏中所列举的那些的属，其中属位置X1、X2、X3和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列。在所有实施方案中，多肽中可存在或不存在任何N末端甲硫氨酸残基。在一个实施方案中，多肽中不存在任何N末端甲硫氨酸残基。

>LCB1-6GS-LCB1

>LCB1-12GS-LCB1

>LCB1-24GS-LCB1

>LCB1-36GS-LCB1

>LCB1_v1.1-GSLCB1_v1.1(1GS1)

>LCB1_v1.1-PRO-LCB1_v1.1(1PRO1)

>LCB3_v1.2-GS3-LCB3_v1.2(3GS3)

>LCB3_v1.2-PRO-LCB3_v1.2(3PRO3)

>LCB1_v1.1-GS-LCB3_v1.2(1GS3)

>LCB3_v1.2-GS-LCB1_v1.1(3GS1)

>LCB3_v1.2-10GS-LCB1_v1.1(LCB3-GS10-LCB1)

/>

>LCB1_v1.1-PRO-LCB3_v1.2(1PRO3)

>LCB3_v1.2-PRO-LCB1_v1.1(3PRO1)

>36175(5_LCB1_接头14)

表8.菊链设计

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表8A

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在一些实施方案中，多肽包含与选自表8的中间栏中列举的那些的属的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，X1、X2、X3(当在属中叙述时)和X4(当在属中叙述时)可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列。例如，表8中中间栏的第一行序列的属是X1-(SEQ ID NO:4)-X2-(SEQ ID NO:4)。在这个实施方案中，X2可以存在或不存在，并且当存在时，可以(例如)包含任何合适长度的氨基酸接头和认为合适的氨基酸组成。X1可以存在或不存在，并且当存在时可以包含任何氨基酸残基或认为合适的残基，包括但不限于前导序列、可检测标签、纯化标签等。

在另一个示例中，表8中中间栏最后一行的序列的属是X1-(SEQ ID NO:155)-X2-(SEQ ID NO:164)-X3-(SEQ ID NO:135)-X4。在这个实施方案中，X2和X3可以存在或不存在，并且当存在时，可以(例如)包含任何合适长度的氨基酸接头和认为合适的氨基酸组成。X1和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以包含任何氨基酸残基或认为合适的残基，包括但不限于前导序列、可检测标签、纯化标签、分泌信号等。

在一些实施方案中，存在于单体结构域之间的任选结构域是存在的，并且可包含氨基酸接头。在这个实施方案下，(a)在上述第一示例中，X2将存在并且包含任何合适长度和氨基酸组成的氨基酸接头，并且X1可存在或不存在；并且(b)在上述第二示例中，X2和X3中的一者或两者将存在并且包含任何合适长度和氨基酸组成的氨基酸接头，并且X1和X4可以独立地存在或不存在。

在本文所公开的多肽的任何实施方案或实施方案组合中，多肽可进一步包含一个或多个附加的功能肽结构域。任何此类附加的功能肽结构域都可以适当地用于预期目的。在各种非限制性实施方案中，附加的功能肽结构域可包括例如靶向结构域、可检测结构域、支架结构域、分泌信号、Fc结构域，或另外的治疗肽结构域。在一个实施方案中，所述附加功能结构域包含Fc结构域，所述Fc结构域包括但不限于包含氨基酸序列的Fc结构域，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。

Fc结构域：

在另一个实施方案中，所添加的功能结构域可包括寡聚化结构域。可以适当地使用任何寡聚化结构域来产生适合预期目的的寡聚物。在一个非限制性实施方案中，寡聚化结构域可包括同源三聚化结构域。示例性寡聚化结构域可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:179至SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:589至SEQ ID NO:594。

在一个实施方案中，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:356至SEQ ID NO:453和SEQ IDNO:595至SEQ ID NO:692；以及选自表9的右手栏中所列举的那些的属，其中属位置X1、X2、X3和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列。在所有实施方案中，多肽中可存在或不存在任何N末端甲硫氨酸残基。在一个实施方案中，多肽中不存在任何N末端甲硫氨酸残基。

表9.同源三聚体设计

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表9A

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在一些实施方案中，多肽包含与选自表9的中间栏中列举的那些的属的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，X1、X2、X3(当在属中叙述时)和X4(当在属中叙述时)可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列，如上文针对表8中列出的实施例所述。在一些实施方案中，存在于单体结构域之间的任选结构域是存在的，并且可包含氨基酸接头，如上文针对表8中列出的实施例所述。

在另一个实施方案中，多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:693至SEQ ID NO:701，其中任何N末端甲硫氨酸残基可以不存在或存在，并且其中括号中的残基可以存在或不存在(优选地不存在)并且在确定同一性百分比时不被考虑。在一个实施方案中，N末端甲硫氨酸残基不存在并且任选的残基不存在。

表9B

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本文所述的任何实施方案或实施方案组合的多肽可进一步连接至稳定化结构域以促进在施用于受试者后增加停留时间。任何合适的稳定化结构域都可以用于预期目的。示例性稳定化结构域包括但不限于聚乙二醇(PEG)、白蛋白、羟乙基淀粉(HES)、由氨基酸Pro、Ala和/或Ser构成的构象无序多肽序列(‘PAS化’)，和/或由氨基酸Lys和Ala构成的有或没有Glu的粘蛋白扩散性多肽。此类粘蛋白扩散性多肽的非限制性实施方案包括但不限于：

粘蛋白结构域：AKAKAKAKAKAKAKAKAKAKGG(SEQ ID NO:61)；GGAKAKAKAKAKAKAKAKAKAK(SEQ ID NO:62)

这些实施方案的示例性多肽可以例如包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:65至SEQ ID NO:96，其中在存在分泌信号(MARAWIFFLLCLAGRALA；SEQ ID NO:63)的实施方案中，所述分泌信号可以用任何其他分泌信号代替。

>粘蛋白_LCB1_v1.1_Cys_

>粘蛋白_LCB1_v1.3

>LCB1_v1.3_粘蛋白

Fc融合体(粗体＝分泌信号，下划线＝LCB，黄色是GS接头，绿色是Fc)

>LCB1-Fc1(BM40-LCB1-GS4-Fc-Opt-WT)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-1)

>LCB1-Fc2(BM40-LCB1-GS15-Fc-Opt-WT)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-1)

>LCB1-Fc3(BM40-Fc-Opt-GS15-2-LCB1-WT)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-1)

>LCB1-Fc4(BM40-LCB1-GS15-Fc-Opt-GS15-2-LCB1-WT)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-1)

>LCB1-Fc5(BM40-LCB1-GS4-Fc-Opt-Q38)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-3)

>LCB1-Fc6(BM40-LCB1-GS15-Fc-Opt-Q38)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-3)

>LCB1-Fc7(BM40-Fc-Opt-GS15-2-LCB1-Q38)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-3)

>LCB1-Fc8(BM40-LCB1-Q38-GS15-Fc-Opt-GS15-2-LCB1-Q38)(LCB1序列＝第一暂时性的LCB1-3)

>LCB1-6M-Fc9(BM40-LCB1-6M-4N,14K,15T,18Q,27Q,38Q-GS15-Fc-Opt)(LCB1序列＝这种暂时性的LCB1_v1.1)

>LCB1-6M-Ngly-Fc10(BM40-LCB1-6M-Ngly-4N,14K,15T,18Q,27N,38Q-GS15-Fc-Opt)(LCB1序列＝原始暂时性的LCB1-5＝LCB1_v1.1＝具有N连接糖基化的LCB1-4)

>LCB3-6M-Fc11(BM40-LCB3-6M-8Q,26Q,28H,35K,37T,43K-GS15-Fc-Opt)(LCB序列与第一暂时性的LCB3-3相同)

>LCB3-6M-NGly-Fc12(BM40-LCB3-6M-Ngly-8Q,26Q,28H,35N,37T,43K-GS15-Fc-Opt)(LCB序列与作为具有N连接糖基化的LCB3-3的第一暂时性的LCB3-4相同)

>LCB1-6M-GPGcP-Fc13(BM40-LCB1-6M-4N,14K,15T,18Q,27Q,38Q-GPGcP-Fc-Opt)(LCB序列与第一暂时性的LCB3-3相同)

/>

>LCB3-6M-GPGcP-Fc14(BM40-LCB3-6M-8Q,26Q,28H,35K,37T,43K-GPGcP-Fc-Opt)(LCB序列与第一暂时性的LCB3-3相同)

>LCB1-6M-GS30-Fc15(BM40-LCB1-6M-4N,14K,15T,18Q,27Q,38Q-GS30-Fc-Opt)LCB1-4

>LCB3-6M-GS30-Fc16(BM40-LCB3-6M-8Q,26Q,28H,35K,37T,43K-GS30-Fc-Opt)(LCB序列与第一暂时性的LCB3-3相同)

>LCB1-v1.3-Fc17(BM40-LCB1-v1.3-4N,14K,15T,17E,18Q,27Q,38Q-GS15-Fc-Opt)

>LCB1-v1.3-Ngly-Fc18(BM40-LCB1-v1.3 Ngly-4N,14K,15T,17E,18Q,27N,38Q-GS15-Fc-Opt)(>LCB1_v1.5(＝具有N连接糖基化的LCB1_v1.3)

>LCB1-v1.3-GPGcP-Fc19(BM40-LCB1-v1.3-Fc19-4N,14K,15T,17E,18Q,27Q,38Q-GPGcP-Fc-Opt)

>LCB1-v1.3-GS30-Fc20(BM40-LCB1-v1.3-4N,14K,15T,17E,18Q,27Q,38Q-GS30-Fc-Opt)

/>

/>

本公开进一步提供了本文的任何实施方案或实施方案组合的多肽的寡聚物。在一个实施方案中，寡聚物是本文所公开的包含寡聚化结构域的多肽寡聚物。在一个实施方案中，寡聚物包括三聚体，包括但不限于同源三聚体。

在另一个实施方案中，本公开提供了组合物，所述组合物包含2个、3个、4个或更多个拷贝的本文的任何实施方案或实施方案组合的多肽，所述多肽附接至支持物，包括但不限于多肽粒子支持物，诸如纳米粒子或病毒样粒子。

如本文所公开，多肽结合SARS-CoV-2刺突糖蛋白，并且因此可用作(例如)用于治疗SARS-CoV-2感染的治疗剂。在一个实施方案中，多肽以如在所附实施例中所述测量的至少10nM的亲和力结合SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

在另一方面中，本公开提供了编码本公开的多肽的核酸。所述核酸序列可以包含RNA(诸如mRNA)或DNA。此类核酸序列可以包含用于促进编码的蛋白的表达和/或纯化的附加序列，包括但不限于polyA序列、修饰的Kozak序列，以及编码表位标签、输出信号和分泌信号、核定位信号和质膜定位信号的序列。基于本文的教导，对于本领域技术人员而言清楚的是，何种核酸序列将编码本发明的蛋白质。

在另一方面中，本公开提供了表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至合适的控制序列的本公开的任何实施方案或实施方案组合的核酸。“表达载体”包括将核酸编码区域或基因可操作地连接至能够实现基因产物表达的任何控制序列的载体。可操作地连接至本公开的核酸序列的“控制序列”是能够影响核酸分子的表达的核酸序列。控制序列不必与核酸序列邻接，只要所述控制序列起作用以引导所述核酸序列的表达即可。因此，例如，在启动子序列与核酸序列之间可以存在中间的未翻译但被转录的序列，并且仍然可以认为所述启动子序列“可操作地连接”到所述编码序列。其他此类控制序列包括但不限于聚腺苷酸化信号、终止信号和核糖体结合位点。此类表达载体可以是本领域已知的任何类型，包括但不限于质粒和基于病毒的表达载体。用于驱动所公开的核酸序列在哺乳动物系统中表达的控制序列可以是组成型的(由多种启动子中的任一种启动子驱动，所述启动子包括但不限于CMV、SV40、RSV、肌动蛋白、EF)或诱导型的(由许多诱导型启动子中的任一种诱导型启动子驱动，所述诱导型启动子包括但不限于四环素、蜕皮激素、类固醇响应性)。

在一个方面中，本公开提供了细胞，所述细胞包含本公开的任何实施方案或实施方案组合的多肽、组合物、核酸和/或表达载体，其中所述细胞可以是原核生物或真核生物，诸如哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述细胞可以用本公开的核酸或表达载体瞬时或稳定地转染。表达载体至原核和真核细胞中的这种转染可以通过本领域已知的任何技术来完成。产生根据本发明的多肽的方法是本发明的另外部分。所述方法包括以下步骤：(a)在有利于多肽表达的条件下培养根据本发明的这一方面的宿主，以及(b)任选地，回收表达的多肽。在其他实施方案中，多肽可以经由任何其他合适的技术产生，所述其他合适的技术包括但不限于使用无细胞蛋白质合成(或体外转录和翻译)。

在另一方面中，本公开提供了药物组合物/疫苗，所述药物组合物/疫苗包含

(a)本文的任何实施方案或实施方案组合的多肽、核酸、表达载体和/或宿主细胞；以及

(b)药学上可接受的载体。

所述组合物可进一步包含(a)冻干保护剂；(b)表面活性剂；(c)增量剂；(d)张力调节剂；(e)稳定剂；(f)防腐剂和/或(g)缓冲剂。在一些实施方案中，药物组合物中的缓冲液是Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液。所述组合物还可包含冻干保护剂，例如蔗糖、山梨糖醇或海藻糖。在某些实施方案中，所述组合物包含防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索铵、氯己定、苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫柳汞、苯甲酸以及它们的各种混合物。在其他实施方案中，所述组合物包含增量剂，如甘氨酸。在又其他实施方案中，所述组合物包含表面活性剂，例如聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65、聚山梨醇酯-80、聚山梨醇酯-85、泊洛沙姆-188、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨糖醇三月桂酸酯、脱水山梨糖醇三硬脂酸酯、脱水山梨糖醇三油酸酯，或它们的组合。所述组合物还可包含张力调节剂，例如使配制品与人血基本等渗或等渗的化合物。示例性张力调节剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、蛋氨酸、甘露糖醇、右旋糖、肌醇、氯化钠、精氨酸和精氨酸盐酸盐。在其他实施方案中，所述组合物另外包含稳定剂，例如以冻干或液体形式基本上防止或减少纳米结构的化学和/或物理不稳定性的分子。示例性稳定剂包括蔗糖、山梨糖醇、甘氨酸、肌醇、氯化钠、蛋氨酸、精氨酸和精氨酸盐酸盐。

多肽、核酸、表达载体和/或宿主细胞可以是组合物中的唯一活性剂，或者组合物可以进一步包含一种或多种其他适合预期用途的试剂。

在另外的方面中，本公开提供了一种用于治疗严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒感染(包括SARS-Co-V和SARS-CoV-2)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物、组合物和/或药物组合物，以有效治疗所述感染。在一个实施方案中，SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2。

在另一方面中，本公开提供了一种用于限制严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒感染(包括SARS-Co-V和SARS-CoV-2)的发展的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物、组合物和/或药物组合物，以有效治疗所述感染。在一个实施方案中，SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2。

多肽、核酸、表达载体、宿主细胞和/或药物组合物可以经由主治医务人员认为合适的任何合适的施用途径来施用。在一个实施方案中，所述多肽、所述核酸、所述表达载体、所述宿主细胞、所述寡聚物、所述组合物和/或所述药物组合物是鼻内施用的。在另一个实施方案中，所述多肽、所述核酸、所述表达载体、所述宿主细胞、所述寡聚物、所述组合物和/或所述药物组合物是全身施用的。

当所述方法包括治疗SARS冠状病毒感染时，将一种或多种多肽、核酸、表达载体、宿主细胞和/或药物组合物施用于已经被诊断为患有SARS冠状病毒感染的受试者。如本文所用，“治疗(treat/treating)”意指完成以下中的一项或多项：(a)减轻受试者的感染症状的严重程度；(b)限制受试者的症状增加；(c)提高生存率；(d)缩短症状的持续时间；(e)限制或预防症状的发展；以及(f)减少住院治疗的需要和/或缩短用于治疗感染的住院治疗的时长。

当所述方法包括限制SARS冠状病毒感染的发展时，将一种或多种多肽、核酸、表达载体、宿主细胞和/或药物组合物预防性地施用于未知是否患有SARS冠状病毒感染，但是可能有这种感染的风险的受试者。如本文所用，“限制”意指限制在可能是任何受试者的有此类感染的风险的受试者中SARS冠状病毒感染的发展。

受试者可以是任何受试者，诸如人类受试者

SARS-CoV-2感染的示例性症状包括但不限于发烧、疲劳、咳嗽、呼吸急促、胸闷和/或疼痛、嗅觉丧失或减弱、味觉丧失或减弱以及呼吸系统问题，包括但不限于肺炎、支气管炎、严重急性呼吸综合征(SARS)以及上下呼吸道感染。

如本文所用，“有效量”是指有效治疗和/或限制SARS-CoV-2感染的组合物的量。本文的任何实施方案的多肽、组合物、核酸或组合物通常配制为药物组合物，诸如上文公开的那些，并且可以经由任何合适的途径施用，包括口服、肠胃外、通过吸入喷雾、经直肠，或者以含有常规药学上可接受的载剂、佐剂和媒介物的剂量单位制剂局部施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、动脉内、肌内、胸骨内、腱内、脊柱内、颅内、胸内、输注技术或腹膜内。多肽组合物也可以通过微球、脂质体、免疫刺激复合物(ISCOM)或其他微粒递送系统或引入合适组织(诸如血液)中的持续释放配制品来施用。可以调整剂量方案以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。合适的剂量范围可以是例如0.1μg/kg-100mg/kg体重的多肽或其纳米粒子。组合物可以在单次推注中递送，或者可以如由主治医务人员所确定多于一次(例如，2次、3次、4次、5次或更多次)进行施用。

本公开还提供了用于设计结合SARS-Cov-2的受体结合位点(RBD)的多肽的方法，其中所述方法包括如在以下实施例中所述的步骤。此类方法可包括多肽设计(如实施例中的任何实施方案或实施方案组合中所述)、无细胞合成和使用任何合适的技术评估SARS-Cov-2 RBD结合的步骤。

实施例

概述

需要针对SARS-CoV-2的有效治疗剂。我们试图使用计算蛋白质设计来生成针对SARS-Cov-2的受体结合位点(RBD)的高亲和力结合剂，所述结合剂阻断与细胞进入所需的Ace2受体的相互作用。我们使用以下两种策略生成了形状与RBD上的Ace2结合位点互补的小蛋白质支架：第一，围绕造成与RBD的大部分相互作用的Ace2中的螺旋构建支架，以及第二，使长度少于65个残基的多样化从头设计的支架抵靠这个区域停靠。在这两种情况下，然后对RBD界面处的支架残基进行高亲和力结合优化，并且对蛋白质剩余部分中的支架残基进行针对折叠到靶标结构和稳定性的优化。预计与病毒结合最强的50,000种设计被编码在大型寡核苷酸阵列中，并用荧光激活细胞分选，使用酵母表面展示筛选与RBD的结合；分选之前和之后对群体的深度测序鉴定出了数百种结合靶标的设计。通过高分辨率序列图谱确认最高亲和力(通过分选最富集的)结合剂的结合模式，并且通过组合1-4种有益的取代进一步增加亲和力。所述优化设计中具有在RBD上的Ace2界面周围的不同结合位点和完全不同序列的八种优化设计被发现在大肠杆菌(E coli)中高水平表达，并以100pM至10nM的Kd结合RBD。这些设计以范围为10nM至20pM的IC₅₀阻断活病毒感染vero-6细胞。因此，所述多肽可用于例如鼻内和全身SARS-CoV-2治疗两者，并且更广泛地说，我们的结果证明了计算蛋白质设计用于快速生成针对流行病威胁的潜在治疗候选物的能力。

SARS-CoV-2感染被认为往往从鼻子开始，病毒在那里复制数次，然后传播到更广泛的呼吸系统。因此，将高浓度的病毒抑制剂递送到鼻子和呼吸系统中通常可以潜在地提供预防保护和在感染早期的治疗功效，并且可能对卫生保健工作者和其他经常接触感染个体的人特别有用。许多单克隆抗体正在开发作为全身性SARS-CoV-2治疗剂，但是这些化合物对于鼻内递送不理想，因为抗体很大且往往不是极其稳定的分子，并且结合位点密度低(每150Kd抗体两个)；Fc结构域提供很少的额外益处。更理想的是这样的蛋白质抑制剂，所述蛋白质抑制剂对单克隆病毒具有非常高的亲和力，但是具有较高的稳定性和小得多的大小以最大化抑制结构域的密度并使得能够通过雾化直接递送到呼吸系统中。

我们打算从头设计与Ace2结合竞争的针对RBD的高亲和力结合剂。我们探索了以下两种策略：第一，我们尝试将造成与RBD的大部分相互作用的Ace2中的α螺旋在造成与RBD的附加相互作用的所设计小蛋白质中支架化，以获得更高的亲和力；并且第二，我们试图完全从头开始设计结合剂，所述结合剂不包含任何已知的与RBD的结合相互作用。第二种方法的优点是设计的可能性范围要大得多，并且因此可以识别出可能具有更高亲和力的结合模式。对于第一种方法，我们使用Rosetta^TM blue print builder生成掺入Ace2螺旋的小蛋白质，并且对于第二种方法，使用大型微型蛋白质库进行RIF对接和设计。设计与Ace2结合位点周围的RBD表面的不同区域的相互作用(图1)。方法1和方法2的设计被编码在长寡核苷酸中，并筛选与酵母细胞表面上的荧光标记的RBD的结合。深度测序鉴定了3个Ace2螺旋支架化设计(方法1)和150个从头界面设计(方法2)，所述设计是在进行RBD结合的FACS分选后明显富集的。设计在大肠杆菌中表达和纯化，并且许多被发现具有可溶性表达，在生物层干涉测量实验中结合RBD，并且可以有效地与ACE-2竞争结合RBD(图2所示的示例)。基于BLI数据(例如参见图2)，微型结合剂的RBD结合亲和力是：LCB1<1nM，LCB3<1nM。LCB2、LCB4、LCB5、LCB6、LCB7、LCB8的亲和力范围为1～20nM，不同结合剂的相对强度为LCB4>LCB2>LCB9＝LCB5>LCB6>LCB7。

为了确定所述设计是否通过所设计的界面结合RBD，构建了位点饱和文库，在所述位点饱和文库中每个设计中的每个残基一次被20种氨基酸中的每种氨基酸取代，并进行RBD结合的FACS分选。深度测序显示结合界面残基和蛋白质核心残基在许多设计中是保守的，此类位点饱和文库(SSM)是针对所述设计构建的(SSM用于定义表1中允许的氨基酸变化位置)。对于大多数设计，少数取代在FACS分选中富集，表明它们增加了对RBD的结合亲和力。对于方法1设计和方法2的8个设计的最高亲和力，构建掺入这些取代的组合文库，并再次筛选与FACS的结合；由于结合亲和力非常高，所以分选中使用的浓度低至20pM。每个文库都集中在少量密切相关的序列上，并且对于每个设计，将优化变体中的一个优化变体在大肠杆菌中表达并纯化。

通过生物层干涉测量法研究所述8种具有不同的RBD结合模式的优化设计的结合(图1)。对于一些的设计，Kd的范围为1-20nM，并且对于其余设计，Kd低于1nM，太强以至于无法使用此技术进行可靠测量(参见图2)。设计的圆二色光谱与设计模型一致，并且设计在室温下经过数天后仍保持完全结合活性(图3)。

我们研究了所述设计阻断活病毒感染人类细胞的能力。在不同量的设计结合剂存在下将100FFU的SARS-CoV-2添加到2.5-3×10^4个vero细胞中。详细信息在图4的图例中提供。我们观察到所有设计均以范围为1nM至0.02nM的IC₅₀有效抑制感染。

表10中提供了关于具体设计的详细信息。

表10

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所设计的结合剂作为潜在的治疗剂相较于抗体具有几个优点。它们一起跨越了一系列结合模式，并且在组合时病毒逃逸将不太可能。在高温下延长时间后活性的保留表明它们不需要冷链。所述设计比完整的抗体分子小20倍，因此在同等质量下具有多20倍的潜在中和位点，从而增加了局部施用药物的潜在功效。对于简单得多的微型蛋白来说，商品成本和大规模生产非常高产量的能力应该更低，与抗体不同，所述微型蛋白不需要在哺乳动物细胞中表达即可正确折叠。小尺寸和高稳定性应该使它们适于通过雾化直接递送到呼吸系统中。免疫原性是任何外来分子的潜在问题，但是对于先前表征的从头设计的小蛋白质，很少或没有观察到免疫应答，这可能是因为高溶解度和稳定性以及小尺寸一起使得不太可能在树突细胞上呈递。

参考文献

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靶向受体结合结构域的超强效微型蛋白防护SARS-CoV-2感染和疾病

尽管引入了公共卫生措施和基于刺突蛋白的疫苗来缓解COVID-19大流行，但是SARS-CoV-2感染和死亡人数仍在继续上升。在此，我们研究了一种前导结合剂LCB1的经修饰版本在表达人类ACE2的转基因小鼠中防护SARS-CoV-2介导的肺部疾病的能力。LCB1-Fc的全身施用减小了病毒负荷，减少了免疫细胞浸润和炎症，并完全预防了肺部疾病和病理学。单次鼻内剂量的LCB1v1.3减少了肺部的SARS-CoV-2感染，即使在病毒接种前五天或接种后两天给予也如此。重要的是，LCB1v1.3体内防护了历史菌株(WA1/2020)、新兴B.1.1.7菌株和编码关键E484K和N501Y刺突蛋白取代的菌株。这些数据支持使用LCB1v1.3来预防或治疗SARS-CoV-2感染。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)是2019年冠状病毒病(COVID-19)大流行的病因，已导致全球疾病、痛苦和经济困难。尽管实施了公共卫生措施，但是SARS-CoV-2传播主要通过人际传播持续存在(Day，2020；Li等人，2020；Standl等人，2020)。SARS-CoV-2诱发的临床表现范围从无症状感染到重症肺炎、多器官衰竭和死亡。尽管人们对决定疾病严重程度的潜在机制知之甚少，但是免疫功能低下者、老年人和患有特定合并症(例如，心血管疾病、糖尿病或肥胖病的病史)的人出现不良结局的风险增加(Zhou等人，2020)。

在此，通过在表达人类ACE2(hACE2)的转基因小鼠中使用严格的SARS-CoV-2疾病发病机制模型(Golden等人，2020；Winkler等人，2020a)，我们评估了示例性微型蛋白结合剂LCB1的体内功效。对于我们的体内实验中，我们评估了两个版本的LCB1：(a)Fc修饰的二价形式LCB1-hIgG-Fc9(LCB1-Fc)，其应延长体内半衰期并参与免疫系统的效应臂；(b)缺少Fc结构域的进一步优化的LCB1单体形式LCB1v1.3。在SARS-CoV-2暴露之前或之后的一天腹腔内施用LCB1-Fc赋予了实质性保护，包括没有重量减轻、将病毒负荷减少到接近检测限，以及抑制肺部炎症和病理。在SARS-CoV-2接种之前五天或之后两天LCB1v1.3的鼻内递送赋予了保护。剂量实验表明，LCB1v1.3在药理学可及的浓度下保持功效，并且是弱免疫原性的。最重要的是，LCB1v1.3保护动物免受当前新兴的B.1.1.7英国变体和编码在所关注的南非(B.1.351)和巴西(B.1.1.248)变体两者中存在的关键刺突取代E484K和N501Y的SARS-CoV-2菌株的影响。总体而言，这些研究确立了LCB1-Fc和LCB1v1.3作为预防或减轻SARS-CoV-2疾病的可能治疗。

结果

LCB1v1.3预防限制了病毒负担和临床疾病。我们对LCB1进行修饰以生成两种用于体内测试的版本：(a)我们将极性突变引入LCB1中以增加表达产量和溶解度，而不改变RBD结合(LCB1v1.3)，并且(b)我们通过LCB1融合到人IgG1 Fc结构域(LCB1-Fc)来修饰LCB1以增强生物利用度。LCB1v1.3和LCB1-Fc热切地结合到S三聚体中的单个RBD(图5A)，其中解离常数(K_D)分别小于625pM和156pM(图5B)。LCB1v1.3和LCB1-Fc还有效地中和了真SARS-CoV-2分离株(2019n-CoV/USA_WA1/2020[WA1/2020])(EC₅₀分别为14.4pM和71.8pM；图5C)。

为了确定这些微型蛋白针对SARS-CoV-2的保护潜力，我们利用了表达K18人hACE2的转基因小鼠，所述小鼠在鼻内接种SARS-CoV-2后会发展出严重的肺部感染和疾病(Golden等人，2020；Winkler等人，2020a)。在预防研究中，与给予使用类似计算方法设计的对照蛋白(甲型流感病毒血凝素微型结合剂)的动物相比，在鼻内(i.n.)接种10³PFU的SARS-CoV-2 WA1/2020的前一天通过腹膜内注射(i.p.)施用的单次250μg(10mg/kg)剂量的LCB1-FcWA1/2020防止了重量减轻(图5D)。在LCB1-Fc预防后，在感染后4天或7天(dayspost-infection,dpi)，在肺部未检测到传染性病毒，而在施用对照蛋白的动物中观察到了高水平(图5E，顶部和底部)。同样，在感染后4天或7天，经LCB1-Fc治疗的动物的肺、心脏、脾脏和脑中的病毒RNA水平处于或接近测定的检测限(图5F至图5I)。LCB1-Fc治疗对在感染后4天获得的鼻洗液样本中的病毒RNA水平没有影响(图5J)，结果类似于最近仓鼠中的中和人抗体的研究(Zhou等人，2021)。然而，病毒RNA水平在感染后7天时降低，表明LCB1-Fc治疗加速了病毒清除或阻止了病毒在上呼吸道中的传播。

弥漫性肺泡损伤、炎症和肺炎是COVID-19肺部疾病的表现，最终导致呼吸衰竭并需要机械通气(Johnson等人，2020；Kordzadeh-Kermani等人，2020)。我们评估了LCB1-Fc预防在K18-hACE2小鼠感染SARS-CoV-2后看到的肺功能受损的能力(Winkler等人，2020a)。在感染后7天时，用LCB1-Fc治疗的动物的肺生物力学机械通气测试显示与未经实验处理的动物没有差异(图6A)，而接受对照结合剂蛋白的小鼠表现出吸气量和肺顺应性下降以及肺阻力、弹性和组织阻尼增加，所有这些都与受损的肺功能一致。这些生物物理特性导致对照结合剂与经LCB1-Fc治疗的或未经实验处理的动物之间存在不同的压力容积环。我们还评定了LCB1-Fc治疗对SARS-CoV-2诱导的肺部病理学的影响。在感染后7天收集的感染SARS-CoV-2的动物的肺部切片显示出广泛的炎症，所述炎症的特征是在经对照蛋白治疗但未经LCB1-Fc治疗或未经实验处理的小鼠中的细胞浸润和气腔实变(图6B)。在感染后4天时，在经LCB1-Fc治疗但未经对照结合剂治疗的动物的肺部中不存在炎性细胞因子和趋化因子RNA特征，表明LCB1-Fc治疗预防肺部中的病毒感染和炎症(图6C和图11)。

暴露后抗RBD结合剂疗法减少了病毒负荷。为了评估其在暴露后环境中的功效，我们在感染后1天通过腹腔注射施用LCB1-Fc。在感染后4天和感染后7天，使用LCB1-Fc的疗法防止了重量减轻(图7A)并且降低了所有测试组织中的病毒负荷(图7B至图7G)。在任一时间点收集的经LCB1-Fc处理的动物的肺部均未回收到传染性病毒。肺部切片确认了使用LCB1-Fc的疗法改善了病理结局(图7H)。在感染后7天，在经LCB1-Fc治疗但未经对照结合剂治疗的动物的肺部切片中不存在免疫细胞浸润。

接下来，我们测试了LCB1v1.3作为鼻内递送的暴露后疗法的功效。鼻内递送可使得能够进行SARS-CoV-2生物药物的自施用。事实上，针对流感病毒的微型蛋白抑制剂已显示出作为鼻喷雾剂的功效(Chevalier等人，2017)。对于这些研究，我们使用LCB1v1.3，因为对于给定的质量剂量，其可结合增加数量的RBD分子，从而导致增加的中和活性(图5C)。尽管在感染后7天时在经对照结合剂治疗的动物的肺部和其他外周组织中检测到高水平的SARS-CoV-2 RNA，但在接种SARS-CoV-2之后D+1或D+2处通过鼻内施用接受LCB1v1.3的动物中感染减少(图7I和图12)。与经对照结合剂治疗的动物相比，接受LCB1v1.3的动物的鼻洗液中的病毒RNA水平在治疗后D+1时而非D+2时降低(图7J)。

当在感染前长达5天施用时，LCB1v1.3的鼻内递送赋予了针对SARS-CoV-2的保护。接下来，我们评估了经由鼻内预防性施用的LCB1v1.3的耐久性。在用10³PFU的SARS-CoV-2接种前5天、3天、1天或6小时，K18-hACE2转基因小鼠接受单次50μg鼻内剂量的LCB1v1.3或对照结合剂。在感染后4天或感染后7天时，通过RT-qPCR确定组织中的病毒负荷。如所预期的，在更接近SARS-CoV-2暴露时间时施用LCB1v1.3的保护效果更好，反映为如病毒载量和重量减轻的更多的减少(图8A至图8D和图S3)。然而，即使是在接种前五天接受LCB1v1.3并在感染后7天收集的小鼠，与经对照结合剂治疗的动物相比肺部中的病毒RNA水平也有所降低。无论收集时间点如何，在接种SARS-CoV-2前三天接受LCB1v1.3的动物中肺病毒RNA水平均降低。

我们测试了一系列鼻内剂量的LCB1v1.3的功效(图8E至图8J)。用低至2μg(0.1mg/kg)的LCB1v1.3进行治疗防止了SARS-CoV-2诱发的重量减轻。相对于经对照结合剂治疗的动物，在感染后7天，剂量在2μg与10μg(0.1mg/kg至0.5mg/kg)之间的LCB1v1.3降低了肺部、心脏和脾脏中的病毒RNA水平。此外，接受50μg剂量的LCB1v1.3的动物表现出极小的肺部炎症(如果有的话)(图8K)。总的来说，这些结果表明，即使是低剂量的LCB1v1.3，在暴露前经由鼻内途径施用时，也可以在严格的K18-hACE转基因小鼠发病机制模型中限制SARS-CoV-2感染和疾病。

LCB1v1.3是弱免疫原性的，并在重复给药后保持保护活性。我们每三天用50μg的对照结合剂或LCB1v1.3治疗K18-hACE2转基因小鼠，总共18天(图9A)。此次，我们收集血清并评估了抗LCB1v1.3抗体的存在。10只小鼠中只有1只小鼠产生了针对LCB1v1.3的IgG抗体(图9B)。为了确定重复给药是否影响LCB1v1.3介导的保护，我们用10³PFU的SARS-CoV-2对同期群进行攻击。同样，在接受LCB1v1.3的所有动物中均观察到了针对重量减轻(图9C)和肺部及其他器官中的病毒感染的实质性保护(图9D至图9H)。

LCB1v1.3保护免受新兴的SARS-CoV-2变体的影响。我们评估了LCB1v1.3针对包含69-70和144-145处的缺失和N501Y、A570D、D614G和P681H处的取代的B.1.1.7分离株的活性，以及针对包含在B.1.351和B.1.248变异株的残基E484K、N501Y和D614G处存在的关键取代的重组WA1/2020菌株的活性(Xie等人，2021a)。尽管LCB1v1.3对B.1.1.7和E484K/N501Y/D614G菌株的中和活性比对WA1/2020菌株的活性低约45倍至50倍，但是EC₅₀值仍然分别为约800pM和667pM(图10A)。为了确定LCB1v1.3是否可以在体内保护免受具有相关刺突蛋白取代的SARS-CoV-2毒株的影响，我们在接种10³PFU的B.1.1.7或E484K/N501/D614G SARS-CoV-2前一天，用单次鼻内50μg剂量的LCB1v1.3或对照结合剂治疗K18-hACE2转基因小鼠。值得注意的是，在感染后6天时收集的所有组织中，在用任一变异株攻击前进行LCB1v1.3治疗保护免受重量减轻(图10B和图10H)和病毒感染(图10C至图10G和图10I至图10M)。因此，LCB1v1.3对流行的和新兴的SARS-CoV-2毒株均有效。

讨论

在这里，通过使用SARS-CoV-2发病机制的严格K18-hACE2小鼠模型，我们表明LCB1-Fc当在病毒接种之前或之后一天施用时预防了SARS-CoV-2感染和疾病。用LCB1-Fc处理的小鼠的肺生物力学在所有测试参数方面与未经实验处理的动物的肺生物力学相似。

我们还评估了LCB1v1.3的功效，LCB1v1.3是没有Fc结构域的经优化的LCB1单体形式。在SARS-CoV-2感染前长达五天或感染后两天施用单次鼻内剂量的LCB1v1.3减少了病毒负荷。我们的鼻内递送是独特的。据报道，SARS-CoV-2的鼻内疗法仅在仓鼠疾病模型中使用I型干扰素进行(Hoagland等人，2021)，并且功效有限。K18-hACE2小鼠模型概括了严重COVID-19的几个方面，包括肺部炎症和肺功能下降(Golden等人，2020；Winkler等人，2020a)。由于K18-hACE2小鼠极易受到感染，因此治疗的治疗窗口有限(Winkler等人，2020b)，并且对于我们的微型蛋白，可能只能抑制病毒感染。重要的是，我们的数据表明，感染之前和之后的LCB1v1.3结合剂治疗限制了免疫细胞浸润和肺部炎症，这防止了组织损伤和呼吸功能受损。作为鼻腔预防性原理验证研究的一部分，我们观察到LCB1v1.3的免疫原性很小，表明重复给药可为可能的。

尽管一些基于抗体的疗法显示出对抗SARS-CoV-2的希望，并且有一些已被授予EUA状态，但是病毒进化可能会危及这些干涉措施，正如英国(B.1.1.7)、南非(B.1.351)、巴西(B.1.248)和其他地方出现的新兴变体所证明的。事实上，我们和其他人已经观察到许多单克隆和多克隆抗体显示出对这些变异株中的几种变异株降低的中和活性(Chen等人，2021；Wang等人，2021a；Wang等人，2021b；Wibmer等人，2021；Xie等人，2021b)。相比之下，LCB1v1.3显示出对历史(WA1/2020)和新兴(B.1.1.7和E484K/N501Y/D614G)SARS-CoV-2毒株的功效。基于与SARS-CoV-2 RBD复合的母体LCB1结合剂的cryo-EM结构(Cao等人，2020)，预计只有N501Y突变会影响结合。虽然我们观察到LCB1v1.3对新兴变体的中和活性有所降低，但是EC₅₀值仍低于800pM，表明保留了相当大的效力。

与其他潜在的基于SARS-CoV-2抗体的治疗相比，微型蛋白有几个益处：(a)由于它们的尺寸较小，所以它们可以结合单个三聚体刺突的每个原体，从而在给定剂量下产生更大的效力；(b)它们可以成本有效地制造；并且(c)它们可以使用接头蛋白混合以生成限制抗性的多聚化构建体。

实验模型和受试者细节

细胞和病毒.将Vero E6(CRL-1586，美国典型培养物保藏中心(ATCC))、VeroCCL81(ATCC)、Vero-furin(Mukherjee等人，2016)和Vero-hACE2-TMPRSS2(A.Creanga和B.Graham,NIH的礼物)于37℃在补充有10％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES pH 7.3、1mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸和100U/ml的青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)中培养。此外，在5μg/mL嘌呤霉素存在下培养Vero-hACE2-TMPRSS2细胞。SARS-CoV-2的WA1/202(2019n-CoV/USA_WA1/2020)分离株是从美国疾病控制中心(CDC)获得的。B.1.1.7和WA1/2020E484K/N501Y/D614G病毒之前已有描述(Chen等人，2021；Xie等人，2021a)。通过接种Vero CCL81或Vero-hACE2-TMPRSS2细胞来繁殖传染性原种。收集上清液，等分并于-80℃贮存。所有与传染性SARS-CoV-2相关的工作都是在华盛顿大学医学院(WashingtonUniversity School of Medicine)的机构生物安全委员会(Institutional BiosafetyCommittee)批准的BSL3和A-BSL3设施中使用正压空气呼吸器和防护设备执行的。

小鼠实验.动物研究是根据美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)的实验动物护理和使用指南(Guide for the Care和Use of LaboratoryAnimals)中的建议进行的。这些方案得到了华盛顿大学医学院的机构动物护理和使用委员会的批准(保障编号A3381-01)。病毒接种是在用盐酸氯胺酮和甲苄噻嗪诱导和维持的麻醉下执行的，并且所有的努力都是为了最小化动物的痛苦。

杂合K18-hACE c57BL/6J小鼠(品系：2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J)获自TheJackson Laboratory。将动物分组笼养并饲喂标准饲料饮食。通过鼻内施用向不同年龄和两种性别的小鼠施用10³PFU的SARS-CoV-2。

方法细节

微型蛋白生产.LCB1-Fc由GenScript合成并克隆到pCMVR质粒中，具有卡那霉素抗性。将质粒转化到大肠杆菌的NEB 5-α菌株(New England Biolabs)中，以回收用于瞬时转染到Expi293F哺乳动物细胞中的DNA。将Expi293F细胞使用Expi293F表达培养基(LifeTechnologies)于33℃、70％湿度和8％ CO₂下以150rpm的转速悬浮生长。使用PEI-MAX(Polyscience)转染培养物，使细胞生长至3×10⁶个细胞/mL的密度并培养3天。将上清液通过以下方式澄清：离心(在4000x g下5min)，添加PDADMAC溶液至0.0375％的终浓度(SigmaAldrich，编号409014)，并且进行第二次自旋(在4000x g下5min)。在AKTA Avant150 FPLC(Cytiva)上使用MabSelect PrismA^TM 2.6×5cm柱(Cytiva)纯化澄清的上清液。将结合的抗体用五倍柱体积的20mM NaPO₄和150mM NaCl pH 7.2洗涤，然后用五倍柱体积的20mM NaPO₄和1M NaCl pH 7.4洗涤，并且用五倍柱体积的pH 3.0的100mM甘氨酸洗脱。将洗脱液用2MTris碱中和至终浓度为50mM。使用SDS-PAGE来评定蛋白质纯度。使蛋白质穿过0.22μm过滤器，并于4℃贮存直至使用。

将相对于原始LCB1具有极性突变(4N、14K、15T、17E、18Q、27Q、38Q)的LCB1v1.3克隆到pet29b载体中。使LCB1v1.3在Lemo21(DE3)(NEB)中在极好的肉汤培养基中表达，并在2L带挡板的摇瓶中生长。使细菌于37℃繁殖至OD600为约0.8，然后用1mM IPTG诱导。将表达温度降低至18℃，并且将细胞振荡约16h。将细胞收获并使用热处理裂解，并于80℃在搅拌下孵育10min。通过在24,000x g下离心30min来使裂解液澄清，并施加至2.6×10cm NiSepharose^TM 6FF柱(Cytiva)以在AKTA Avant150 FPLC系统(Cytiva)上通过IMAC纯化。在含50mM Tris pH 8.0和500mM NaCl的缓冲液中，通过30mM至500mM咪唑的线性梯度来洗脱蛋白质。合并峰级分，在10kDa MWCO离心过滤器(Millipore)中浓缩，无菌过滤(0.22μm)，并使用50mM磷酸盐pH 7.4、150mM NaCl缓冲液施加至Superdex^TM 200Increase 10/300或HiLoadS200 pg GL SEC柱(Cytiva)。在尺寸排阻层析后，对细菌源性组分进行测试以确认低水平的内毒素。

生物层干涉测量.使用Octet^TM RED96(ForteBio)收集生物层干涉测量数据，并使用仪器的集成软件进行处理。简而言之，将生物素化的RBD(Acro Biosystems)以在结合缓冲液(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％表面活性剂P20和0.5％脱脂奶粉)中20nM负载到链霉亲和素包被的生物传感器(SA ForteBio)上达360s。将分析物蛋白(LCB1v1.3或LCB1-Fc)从浓缩原液稀释到结合缓冲液中。在单独的结合缓冲液中进行基线测量后，通过将生物传感器浸入含有指定浓度的靶蛋白的孔中3,600s(缔合步骤)，然后将所述传感器浸回基线/缓冲液(解离)中7,200s来监测结合动力学。

噬菌斑测定.将Vero-furin细胞(Mukherjee等人，2016)以2.5×10⁵个细胞/孔的密度接种在平底12孔组织培养板中。第二天，去除培养基并用200μL的待滴定材料在DMEM+2％ FBS中稀释的10倍系列稀释液置换，并于37℃在定期摇动下进行板孵育。一小时后，加入1mL的甲基纤维素覆盖层。将板于37℃孵育72h，然后用4％多聚甲醛(终浓度)的PBS溶液固定20min。将固定的细胞单层用0.05％(w/v)结晶紫在20％甲醇中的溶液染色，并用经蒸馏的去离子水洗涤两次。

病毒负荷的测量.将组织称重，并在MagNA Lyser^TM仪器(Roche Life Science)中在1,000μL的补充有2％热灭活FBS的DMEM培养基中用氧化锆珠粒均质化。通过以10,000rpm离心5min澄清组织匀浆，并于-80℃贮存。在Kingfisher Flex提取机器人(ThermoScientific)上使用MagMax mirVana^TM总RNA分离试剂盒(Thermo Scientific)提取RNA。将RNA使用TaqMan^TM RNA至CT 1步试剂盒(ThermoFisher)进行逆转录和扩增。逆转录于48℃进行15min，然后于95℃进行2min。扩增经如下的50个循环完成：95℃进行15秒和60℃进行1min。样本中SARS-CoV-2N基因RNA的拷贝是使用先前发表的测定确定的(Case等人，2020；Hassan等人，2020)。简而言之，TaqMan^TM测定旨在靶向N基因的高度保守区域(正向引物：ATGCTGCAATCGTGCTACAA(SEQ ID NO:190)；反向引物：GACTGCCGCCTCTGCTC(SEQ ID NO:191)；探针：/56-FAM/TCAAGGAAC/ZEN/AACATTGCCAA/3IABkFQ/)(SEQ ID NO:192)。这个区域被包含在RNA标准品中，以允许每次反应低至10个拷贝的拷贝数测定。反应混合物含有终浓度分别为500nM和100nM的引物和探针。

细胞因子和趋化因子mRNA测量.如上所述从肺匀浆中分离出RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Thermo Scientific)并按照制造商的方案添加RNA酶抑制剂，以从经DNA酶处理的RNA合成cDNA。使用TaqMan^TM快速通用PCR反应混合物(Thermo Scientific)和针对IFN-g(IDT：Mm.PT.58.41769240)、IL-6(Mm.PT.58.10005566)、IL-1b(Mm.PT.58.41616450)、Tnfa(Mm.PT.58.12575861)、CXCL10(Mm.PT.58.43575827)、CCL2(Mm.PT.58.42151692)、CCL5(Mm.PT.58.43548565)、CXCL11(Mm.PT.58.10773148.g)、Ifnb(Mm.PT.58.30132453.g)、CXCL1(Mm.PT.58.42076891)的商业引物/探针组测定细胞因子和趋化因子表达，并将结果归一化为GAPDH(Mm.PT.39a.1)水平。使用2^-ΔΔCt方法将经治疗的小鼠与未经实验处理的对照进行比较，以确定变化倍数。

肺部病理学.在收获和固定组织之前对动物实施安乐死。首先在左肺的左主支气管处结扎并进行收集以用于病毒RNA分析。使用3mL注射器和插入气管中的导管，用约1.2mL的10％中性缓冲福尔马林使右肺膨大。将组织包埋在石蜡中，并将切片用苏木精和曙红染色。使用Hamamatsu NanoZoomer^TM载玻片扫描系统扫描载玻片，并使用NDP查看软件(版本1.2.46)查看图像。

呼吸力学.用氯胺酮/甲苄噻嗪(分别为100mg/kg和10mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠。通过解剖颈部区域分离气管，并使用18号钝金属套管(典型阻力为0.18cmH₂O.s/mL)插管，将所述套管用尼龙缝合线固定在适当位置。然后经由所述套管将小鼠连接到flexiVent^TM计算机控制的活塞式呼吸机(SCIREQ Inc.)，将所述套管连接到FX适配器Y型管。开始机械通气，并经由腹膜内途径给予小鼠附加的100mg/kg的氯胺酮和0.1mg/小鼠的麻痹性泮库溴铵以防止对抗呼吸机呼吸和在测量期间呼吸。使用针对小鼠的默认设置为小鼠通气，所述默认设置包括3cm H₂O的呼气末正压、10mL/kg的潮气量(Vt)、150次/分钟(bpm)的呼吸频率，和为0.21的吸入氧气(FiO₂)分数(即，室内空气)。如前所述(McGovern等人，2013)，使用最新版本的flexiVent^TM操作软件(flexiWare v8.1.3)，使用强制振荡技术评定呼吸力学。还执行了压力容积环和吸气量测量。

中和测定.将结合剂蛋白的连续稀释液与10²个病灶形成单位(FFU)的SARS-CoV-2一起于37℃孵育1h。将结合剂-病毒复合物添加到96孔板中的Vero E6(WA1/2020)或Vero-hACE2-TMPRSS2(B.1.1.7和WA1/2020 E484K/N501Y/D614G)细胞单层中，并于37℃孵育1h。随后，将细胞用补充有2％ FBS的1％(w/v)甲基纤维素的MEM溶液覆盖。24-30h后通过去除覆盖物收获板，并将其在室温下用4％ PFA的PBS溶液固定20min。将板洗涤，并依次与SARS2-2、SARS2-11、SARS2-16、SARS2-31、SARS2-38、SARS2-57、和SARS2-71抗刺突蛋白抗体的寡克隆池(Zhou等人，2021)和HRP缀合的山羊抗小鼠IgG在补充有0.1％皂苷和0.1％牛血清白蛋白的PBS中一起孵育。将SARS-CoV-2感染的细胞病灶使用TrueBlue^TM过氧化物酶底物(KPL)进行可视化，并在ImmunoSpot^TM显微分析仪(Cellular Technologies)上进行定量。使用Prism^TM软件(GraphPad Prism^TM 8.0)处理数据。

ELISA.C末端生物素化的LCB1.1v3以在每孔100μL总体积中2.5μg/mL固定化在链霉亲和素包被的板(RayBiotech编号7C-SCP-1)上，并于4℃孵育过夜。将板用洗涤缓冲液(TBS+0.1％(w/v)BSA+0.05％(v/v)Tween20)洗涤，并用200μL/孔的封闭缓冲液(TBS+2％(w/v)BSA+0.05％(v/v)Tween20)在室温下封闭1h。将板用200μL/孔的洗涤缓冲液冲洗，并将100μL的在封闭缓冲液中1:100稀释的血清样本添加到相应孔中。对于阳性对照，将Fc-RBD在100μL封闭缓冲液中从240ng/mL开始按1:5连续稀释。将所有样本在室温下孵育1h。使用200μL/孔的洗涤缓冲液洗涤板。对于血清样本，将HRP缀合的马抗小鼠IgG抗体(VectorLaboratories编号PI-2000-1)在封闭缓冲液中按1:200稀释，并以每孔100μL在室温下孵育30min。对于阳性对照，将HRP缀合的的小鼠抗人IgG抗体(Invitrogen编号05-4220)在封闭缓冲液中按1:500稀释，并以每孔100μL在室温下孵育30min。将板用洗涤缓冲液冲洗，并将100μL的TMB(SeraCare)添加到每个孔中2min。通过加入100μL的1N HCl来猝灭反应。在Synergy Neo2^TM酶标仪(BioTek Instruments)上于450nm处测定光密度。

定量和统计分析

使用Prism^TM版本8(GraphPad)，当P值<0.05时分配统计显著性。每个图例中都指出了测试、动物数量、中值和统计比较组。通过双因素方差分析(ANOVA)确定重量变化的分析。将功能参数或免疫参数的变化与经对照结合剂处理的动物进行比较，并通过使用多重比较检验的单因素方差分析进行分析。通过Mann-Whitney检验确定两组间病毒负荷的统计分析。

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多价设计

SARS-CoV-2的逃逸变体正威胁着COVID-19大流行的大大延长。在此，我们开发了多价微型结合剂作为潜在的预防和治疗剂来解决这个问题。我们设计了包含三个拷贝的微型结合剂的多价微型结合剂(自装配同源三聚体)，或包含靶向不同位点的三个连接的不同微型结合剂的多价微型结合剂(多结构域融合体)，所述多价微型结合剂与刺突三聚体在几何上匹配，并使用快速无细胞表达和评估工作流程优化其组成。优化的设计已大大降低了SARS-CoV-2-S-糖蛋白的解离速率，其复合物半衰期大于两周。结构的Cryo-EM显示同源三聚体和融合微型结合剂构建体都可以接合单个刺突蛋白上的所有三个RBD。除了所关注的B.1.1.7、B.1.351、B.1.1.28变体之外，上面的三聚侯选物和融合候选物还能以在低pM范围内的IC₅₀中和野生型SARS-CoV-2病毒。此外，上面的同源三聚体候选物在表达人ACE2的转基因小鼠中提供了针对相同变异株的预防性保护。我们的方法强调了计算蛋白质设计与快速实验原型设计相结合以设计有效的多价抑制剂的效用，所述多价抑制剂可以广泛地中和广泛流行的所关注变体。

我们试图开发我们计算设计的微型蛋白的多价版本，所述多价版本阻断SARS-CoV-2受体结合结构域(RBD)与其宿主受体ACE2的相互作用。原则上，所设计的微型结合剂的小尺寸使得能够在单个刺突蛋白三聚体内同时接合多个RBD。我们假设这种多价结合会导致超高亲和力抑制剂，所述超高亲和力抑制剂比其单体对应物更能抵抗逃逸突变。这些多价相互作用产生的亲合力可以改善逃逸单个结构域的突变的影响。此外，包含靶向多个不同表位的结构域或包含与靶表位的不同接触集的单个蛋白质可以进一步提高设计对突变逃逸的稳健性。从LCB1、AHB2和LCB3微型结合剂(在下文中分别称为M1、M2和M3；表11)及其已知的结合模式开始，我们采用两种并行策略来设计多价抑制剂、自装配同源三聚体和多结构域融合体。

表11.用于描述多价微型结合剂的缩写列表

为了使得能够对所设计的蛋白质进行快速原型制作，我们开发了一种无细胞DNA装配和蛋白质表达工作流程，使得能够大大缩短设计-构建-测试周期，从而更好地匹配大流行的紧迫性。该工作流程结合了利用Gibson装配的无细胞DNA装配步骤，之后进行PCR以生成用于驱动无细胞蛋白质合成(CFPS)的线性表达模板。所开发的工作流程允许我们在短短6小时内将合成DNA转化为纯化的蛋白质，很容易扩展成高通量格式(例如，96孔板或384孔板)，并且适用于自动化液体处置。此外，我们将这种无细胞工作流程与AlphaLISATM蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)竞争测定相结合，以便能够比较所设计的蛋白质针对单体RBD或三聚体hexapro SARS-CoV-2-S-糖蛋白(S6P)的解离速率。因为多价在很大程度上只影响相互作用的解离速率常数，所以我们推断溶液中的解离速率筛选将使我们能够区分单价和多价结合。所得工作流程可每周评估数百个候选多价蛋白质。

多价结合剂的设计和验证

在第一策略中，我们设计了与刺突三聚体中的三个RBD在几何上匹配的M1、M2和M3微型蛋白的自装配三聚体版本(在下文中称为H[结合结构域编号]-[同源三聚体编号]；例如，H1-1表示具有同源三聚化结构域1的M1同源三聚体，表11)。我们使用我们的无细胞表达和多价筛选工作流程设计、表达和评估了大于一百种包含各种同源三聚化结构域和接头长度的不同蛋白质。我们鉴定出了每种同源三聚体的显示出缓慢解离速率的版本，所述缓慢解离速率可能指示多价结合(图14)。

在第二策略中，我们生成了由柔性接头分隔的M1、M2和M3结合结构域的双结构域和三结构域融合体(在下文中称为F[结合结构域编号s]-[接头]；例如，F231-P12表示均由PAS12接头分隔的M2至M3至M1的融合体，表11)。我们评估了被选择为在结合到“开放”和“关闭”状态的RBD时跨越结构域末端之间的距离的一系列接头长度。我们再次表达和评估了大于一百种改变结合结构域连接性和接头长度以优化多价性的不同设计。几个经鉴定的双结构域和三结构域融合体显示出与上述同源三聚体构建体相当的缓慢解离速率(图14)。

在与竞争者竞争14天后，来自每种策略的最佳候选者都表现为几乎没有解离，进一步的测量受到S6P的稳定性限制。根据这些数据，我们估计该复合物的解离速率常数低于1×10^-7s^-1。据我们所知，这些是迄今为止报道的合成蛋白质-蛋白质相互作用的最慢测量解离速率常数。

接下来，我们使用单粒子冷冻电子显微镜(cryo-EM)来表征S6P与上面的候选微结合剂构建体之间的复合物(图15)。分别以

和/>

的分辨率确定H2-1、F31-G10和F231-P24构建体的Cryo-EM结构。发现H2-1同时接合所有三个RBD，导致所有三个RBD都采用开放状态。设计模型准确地与所观察到的结构密切匹配。F31-G10结合两个RBD，所述两个RBD在结合时似乎都采用开放构象。所述结构表明这种接头长度允许同时接合两个处于天然状态的RBD。第三游离RBD在结构中采用开放或封闭构象。F231-P24结合三个RBD，M1结合闭合构象的RBD，并且M2和M3结合开放构象的RBD。这表明接头长度长到足以使所有三个结合结构域能够同时接合所有三个RBD，而不会显著扭曲天然状态。在F31-G10和F231-P24两者中，所述图谱高度表明了多价结合，但是柔性接头在EM图谱中没有产生密度来确认结构域的连接。

多价微型结合剂中和广泛流行的SARS-CoV-2变体

接下来，我们试图确定多价构建体中和SARS-CoV-2变体的能力。我们针对一组突变刺突蛋白筛选了最佳多价微型结合剂的解离率(图16)。同源三聚体表现出最大的突变抗性，其中H2同源三聚体表现为在24小时后对任何突变刺突几乎没有解离。双结构域融合体显示出对所测试的点突变体的恢复性几乎没有增加。三结构域融合体显示出与所测试的点突变体的更加一致的结合，尽管有些仍然影响结合。

我们另外经由中和测定评估了这些蛋白质对SARS-CoV-2 HIV假病毒以及真SARS-CoV-2分离株两者的效力(图16)。H2-0和H2-1同源三聚体在所有测试的构建体中始终表现最佳，其中IC₅₀在低pM范围内。三结构域融合体也表现良好，其中所有测试变体的IC₅₀都在亚nM范围内。H2同源三聚体的更大的中和广度可能反映了M2单体更接近模拟ACE2结合位点，这是蛋白质设计带来的独特优势。

多价微型结合剂抵抗病毒逃逸

除了评估上面的候选药物中和当前流行的SARS-CoV-2突变体的能力外，我们还测试了抑制剂抵抗逃逸病毒逃逸的能力(图17)。为此，使用在Vero E6细胞上复制的VSV-SARS-CoV-2嵌合病毒执行噬菌斑测定。为了选择对抑制剂有抗性的突变体，将抑制剂包含在覆盖层中以中止非抗性病毒的复制。在阳性对照中和抗体(2B04)中，每板选择多个逃逸突变体。对于F231-P12和H2-1两者，在每种抑制剂的35个重复孔中均未分离出逃逸突变体。

H2-0在表达人ACE2的转基因小鼠中提供预防性保护

为了确定我们的多价微型结合剂在体内模型中的保护能力，我们将它们作为在表达人类ACE2的转基因小鼠中的暴露前预防性治疗进行评估(图17)。在接种103个病灶形成单位的SARS-CoV-2变体B.1.1.7、B1.351、B.1.1.24前一天鼻内(i.n.)施用单次50μg剂量的H2-0。在所有情况下，H2-0的鼻内施用都保护小鼠免受SARS-CoV-2诱发的重量减轻。在感染后6天，经由RT-qPCR确定各种组织中的病毒负荷。值得注意的是，在所有情况下，肺部的病毒载量都减少了。这些结果表明，经由鼻内施用给予的H2-0可以在相关小鼠模型中提供针对SARS-CoV-2感染的预防性保护。

结论

我们预计无细胞蛋白质表达和评估工作流程将在对单独蛋白质变体的评估是限制性过程步骤的许多不同应用中发挥作用。此外，我们开发的多价筛选将加速研究人员开发多价蛋白治疗剂的能力。

所设计的蛋白质构建体在预防和治疗COVID-19感染方面相较于单克隆抗体具有许多优势。1)直接施用到呼吸系统中，2)商品成本低，并且适合非常大规模的生产，3)稳定性高并且不需要冷链，以及4)对单一化合物中的逃逸突变体有非常广泛的抵抗力。更一般地说，所设计的高亲和力多价微型结合剂可以为对抗病毒大流行提供强大的平台。

Claims

1.一种多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101，其中所述多肽与SARS-CoV-2刺突糖蛋白受体结合结构域(RBD)结合。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中相对于参考多肽氨基酸序列的氨基酸取代选自表1中提供的示例性氨基酸取代。

3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中界面残基与所述参考多肽中的那些界面残基相同，或相对于所述参考多肽中的界面残基被保守取代。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33至SEQID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136。

6.根据权利要求5所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在选自由2、4、5、14、15、17、18、27、28、32、37、38、39、41、42、49、52和55组成的组的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或全部18个残基处的氨基酸取代。

7.根据权利要求6所述的多肽，其中所述取代选自表4中在给定行中单独地或组合列出的取代。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。

9.根据权利要求8所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:13的氨基酸序列在选自由2、6、8、9、13、14、19、22、25、26、28、29、34、35、37、40、43、45、49和62组成的组的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或全部20个残基处的氨基酸取代。

10.根据权利要求6所述的多肽，其中所述取代选自表6中在给定行中单独地或组合列出的取代。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述多肽包含相对于SEQ ID NO:101的氨基酸序列在选自由63和75组成的组的一个或两个残基处的氨基酸取代。

13.根据权利要求12所述的多肽，其中所述取代包括R63A和/或K75T。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含在N末端和/或C末端处添加的一个或多个半胱氨酸残基。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的多肽，所述多肽包含N-连接的糖基化位点(即：NX(S/T)，其中X是任何氨基酸)。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的多肽，所述多肽包含两个或更多个拷贝的所述氨基酸序列，所述氨基酸序列与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101。

17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述两个或更多个拷贝的多肽都是相同的。

18.根据权利要求16所述的多肽，其中所述两个或更多个拷贝的多肽是不完全相同的。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的多肽，其中所述两个或更多个拷贝的多肽被氨基酸接头序列分开。

20.根据权利要求9所述的多肽，其中氨基酸接头序列包含富含Gly-Ser的(至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的Gly-Ser残基)氨基酸接头。

21.根据权利要求20所述的多肽，其中所述富含Gly-Ser的接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GG以及SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:165至SEQ ID NO:171。

22.根据权利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸接头序列包含富含Pro(至少15％、20％、25％或更多的Pro残基)的氨基酸接头。

23.根据权利要求22所述的多肽，其中所述富含Pro的氨基酸接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:97至SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:172至SEQ ID NO:176。

24.根据权利要求19所述的多肽，其中所述氨基酸接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:177至SEQ ID NO:178。

25.根据权利要求19-24中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸接头的长度独立地介于2-100个氨基酸之间。

26.根据权利要求16-25中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含式Z1-Z2-Z3，其中：

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164；

Z2包含任选的氨基酸接头；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164；

其中Z1和Z3可以是相同或不同的。

27.根据权利要求26所述的多肽，其中Z1和Z3是相同的。

28.根据权利要求26所述的多肽，其中Z1和Z3是不同的。

29.根据权利要求26-28中任一项所述的多肽，其中：

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136；并且

30.根据权利要求26-28中任一项所述的多肽，其中：

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:137至SEQ ID NO:163；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:137至SEQ ID NO:163。

31.根据权利要求26-28中任一项所述的多肽，其中：

Z1包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ IDNO:164；并且

Z3包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:100和SEQ IDNO:164。

32.根据权利要求26-28中任一项所述的多肽，其中：

Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136；并且

Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。

33.根据权利要求26-28中任一项所述的多肽，其中：

Z1和Z3中的另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQID NO:100和SEQ ID NO:164。

34.根据权利要求26-28中任一项所述的多肽，其中：

Z1和Z3中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163；并且

35.根据权利要求26-34任一项所述的多肽，其中所述多肽包含式B1-B2-Z1-Z2-Z3-B3-B4，其中：

Z1、Z2和Z3如权利要求26-34中任一项中所定义；

B2和B3包含任选的氨基酸接头；并且

36.根据权利要求35所述的多肽，其中B1和B4中的一者不存在。

37.根据权利要求35所述的多肽，其中B1和B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164。

38.根据权利要求37所述的多肽，其中B1和B4是相同的。

39.根据权利要求37所述的多肽，其中B1和B4是不同的。

40.根据权利要求35-39中任一项所述的多肽，其中当存在时的B1和当存在时的B4与Z1和Z3中的一者或两者相同，或者其中当存在时的B1和当存在时的B4与Z1和Z3中的任一者都不同。

41.根据权利要求35-40中任一项所述的多肽，其中当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:164。

42.根据权利要求35-40中任一项所述的多肽，其中当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQ ID NO:136。

43.根据权利要求35-40中任一项所述的多肽，其中当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163。

44.根据权利要求35-40中任一项所述的多肽，其中当存在时的B1和当存在时的B4独立地包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。

45.根据权利要求35-40中任一项所述的多肽，其中B1和B4都存在，并且其中

·B1和B4中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQID NO:136，并且另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163；

·B1和B4中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:102至SEQID NO:136，并且另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:100至SEQID NO:101和SEQ ID NO:164；或者

·B1和B4中的一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19至SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:137至SEQ ID NO:163，并且另一者包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:33至SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:100至SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:164。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:47至SEQID NO:60、SEQ ID NO:193至SEQ ID NO:355和SEQ ID NO:454至SEQ ID NO:588，以及选自表8的右手栏中列举的那些的属，其中属位置X1、X2、X3和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列，并且其中所述多肽中可以存在或不存在任何N末端甲硫氨酸残基，优选地其中所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:454至SEQ ID NO:588，并且最优选地其中所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:693至SEQ ID NO:701，其中任何N末端甲硫氨酸残基可以不存在或存在，并且其中括号中的残基可以存在或不存在(优选地不存在)并且在确定同一性百分比时不被考虑。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的多肽，所述多肽进一步包含附加的功能肽结构域。

48.根据权利要求47所述的多肽，其中所述附加功能肽结构域包含靶向结构域、可检测结构域、支架结构域、分泌信号、Fc结构域或另外的治疗肽结构域。

49.根据权利要求48所述的多肽，其中所述附加功能结构域包含Fc结构域，所述Fc结构域包括但不限于包含氨基酸序列的Fc结构域，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。

50.根据权利要求47-49中任一项所述的多肽，其中所述添加的功能结构域包含寡聚化结构域。

51.根据权利要求50所述的多肽，其中所述寡聚化结构域包含同源三聚化结构域。

52.根据权利要求50或51所述的多肽，其中所述寡聚化结构域包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:179至SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:589至SEQ ID NO:594。

53.根据权利要求50-52中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:356至SEQ ID NO:453和SEQ ID NO:595至SEQ ID NO:692，以及选自表9的右手栏中列举的那些的属，其中属位置X1、X2、X3和X4可以存在或不存在，并且当存在时可以是任何1个或多个氨基酸的序列，并且其中所述多肽中可以存在或不存在任何N末端甲硫氨酸残基，优选地其中所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:595至SEQ ID NO:692。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的多肽，其中所述多肽连接至稳定化结构域，所述稳定化结构域包括但不限于聚乙二醇(PEG)、白蛋白、羟乙基淀粉(HES)、由氨基酸Pro、Ala和/或Ser构成的构象无序多肽序列(‘PAS化’)，和/或由氨基酸Lys和Ala构成的有或没有Glu的粘蛋白扩散性多肽。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的多肽，所述多肽包含与选自由以下组成的组的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:65至SEQID NO:96，其中在存在分泌信号(MARAWIFFLLCLAGRALA；SEQ ID NO:63)的实施方案中，所述分泌信号可以用任何其他分泌信号代替。

56.根据权利要求1-55中任一项所述的多肽，其中所述多肽以如在所附实施例中所述测量的至少10nM的亲和力结合SARS-CoV-2刺突糖蛋白。

57.一种核酸，其编码如权利要求1-56中任一项所述的多肽。

58.一种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接到启动子的根据权利要求57所述的核酸。

59.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸和/或表达载体。

60.根据权利要求1-56中任一项所述的多肽的寡聚物。

61.根据权利要求60所述的寡聚物，其中所述寡聚物包括三聚体，包括但不限于同源三聚体。

62.一种组合物，所述组合物包含2个、3个、4个或更多个拷贝的根据权利要求1-56中任一项所述的多肽，所述多肽附接至支持物，包括但不限于多肽粒子支持物。

63.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物和/或组合物，以及药学上可接受的载体。

64.一种用于治疗严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒感染(包括SARS-Co-V和SARS-CoV-2)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物、组合物和/或药物组合物，以有效治疗所述感染。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2。

66.一种用于限制严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒感染(包括SARS-Co-V和SARS-CoV-2)的发展的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用一定量的根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、寡聚物、组合物和/或药物组合物，以有效治疗所述感染。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述SARS冠状病毒包括SARS-CoV-2。

68.根据权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述多肽、所述核酸、所述表达载体、所述宿主细胞、所述寡聚物、所述组合物和/或所述药物组合物是鼻内施用的。

69.根据权利要求64-67中任一项所述的方法，其中所述多肽、所述核酸、所述表达载体、所述宿主细胞、所述寡聚物、所述组合物和/或所述药物组合物是全身施用的。

70.一种用于设计结合SARS-Cov-2的受体结合位点(RBD)的多肽的方法，其中所述方法包括如在本文所公开的任何实施方案或实施方案组合中所述的步骤。

71.根据权利要求70所述的方法，所述方法进一步包括所设计的多肽的无细胞合成，以及使用任何合适的技术评估所合成的多肽的SARS-Cov-2 RBD结合。

72.一种无细胞体系，所述无细胞体系包含根据前述权利要求中任一项所述的多肽、核酸和/或表达载体。