JP2023546383A

JP2023546383A - アネキシンａ５組成物及び方法

Info

Publication number: JP2023546383A
Application number: JP2023521687A
Authority: JP
Inventors: フェン、チンピン; ルー、シャンルー; ビー．スタソプロス、ピーター; バール、スティーブン
Original assignee: London Health Sciences Centre Research Inc
Current assignee: London Health Sciences Centre Research Inc
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2023-11-02
Also published as: CA3198378A1; US20230374091A1; WO2022073134A1

Abstract

アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と相互作用するため、ならびに／又はコロナウイルス感染症を予防及び／もしくは処置するためのアネキシンＡ５が、態様で本明細書に記載されている。ＡＣＥ２媒介性感染症及び／又はコロナウイルス感染症を予防及び／又は処置する方法であって、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法も記載されている。

Description

本発明は、ＡＣＥ２に関する。特に、本発明は、ＡＣＥ２及びアネキシンＡ５の相互作用、ならびに関連する組成物及び方法に関する。

コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、新規コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる気道感染症である。重篤な場合、疾患は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症及び敗血症性ショック、ならびに肺及び心臓を含む多臓器不全を併発する。研究により、内皮損傷、敗血症及び血栓性の炎症応答が、ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＡＲＤＳ及び多臓器不全の発症の重要な原因であることが示されている。^６，７現在、ＣＯＶＩＤ－１９を効果的に予防又は処置するための実証された治療法はない。レムデシビルが、有意な生存ベネフィットなしに回復までの時間を短縮することが示された^１，２が、ヒドロキシクロロキンは、臨床的回復までの時間がより長く、全体的な臨床的回復が少なかった。^３

アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、肺、動脈、心臓、腎臓、及び腸に位置する細胞の細胞膜に結合された酵素である。ＡＣＥ２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのいくつかのコロナウイルスの細胞への侵入点として作用する。ＡＣＥ２はまた、アンジオテンシンＩＩ（血管収縮ペプチド）のアンジオテンシン（血管拡張剤）への加水分解を触媒することによって血圧を低下させることが公知である。

アネキシンＡ５（又はアネキシンＶ）は、アネキシン群の細胞タンパク質である。フローサイトメトリーでは、アネキシンＶは、原形質膜の外葉にある場合にアポトーシスのマーカーであるホスファチジルセリンに結合する能力によって、アポトーシス細胞を検出するために一般的に使用される。アネキシンＡ５（Ａ５）は、強力な抗炎症及び抗アポトーシス及び抗凝固／抗血栓特性を有する内因性タンパク質である。加えて、Ａ５はまた、内皮グリコカリックスの主な構成要素であるヘパラン硫酸にも結合し、それによってトロンビンの内皮産生を阻害する。組換えヒトＡ５は、細菌性敗血症の齧歯類モデルにおいて炎症誘発性応答を阻害し、動物の生存を改善する。米国特許第９，１９２，６４９号は、炎症性障害の処置で使用するための、及び臓器機能の改善で使用するための、有効量のアネキシンＡ５を含む組成物を記載している。動物の処置のためにそのような組成物を投与するための方法も提供されている。

一態様によれば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と相互作用するためのアネキシンＡ５が提供される。

一態様では、アネキシンＡ５はＡＣＥ２に結合する。

一態様では、ＡＣＥ２に結合するアネキシンＡ５は、ＡＣＥ２の酵素活性に実質的に影響を及ぼさない。

一態様では、アネキシンＡ５は、ウイルス又はウイルスタンパク質などの別の分子のＡＣＥ２との相互作用を阻害する。

一態様では、アネキシンＡ５は、コロナウイルス又はコロナウイルスタンパク質のＡＣＥ２との相互作用を阻害する。

一態様では、アネキシンＡ５は、コロナウイルススパイクタンパク質のＡＣＥ２との相互作用を阻害する。

一態様によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の研究ツールとしてのアネキシンＡ５が提供される。

一態様によれば、ＡＣＥ２の研究ツールとしてのアネキシンＡ５が提供される。

一態様では、アネキシンＡ５はヒト型である。

一態様では、アネキシンＡ５は組換え型である。

一態様では、アネキシンＡ５は、配列番号１：

に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
又はその活性断片を含む。

一態様では、アネキシンＡ５は配列番号１のアミノ酸配列を含む。

一態様では、アネキシンＡ５は配列番号１のアミノ酸配列からなる。

一態様では、アネキシンＡ５は、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤などの部分に結合しており、場合により部分はペプチド又は小分子である。

一態様によれば、本明細書に記載のアネキシンＡ５及び薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。

一態様では、組成物は吸入可能な組成物又は鼻腔用スプレーである。

一態様によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を予防及び／又は処置する方法が提供され、方法は、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。

一態様では、アネキシンＡ５はヒト型である。

一態様では、アネキシンＡ５は組換え型である。

一態様では、アネキシンＡ５は吸入されるか、又は鼻腔用スプレーである。

一態様では、対象は、高血圧又は糖尿病などの慢性症状を有し、６０歳を超えており、及び／又はＡＣＥ阻害剤を服用している。

一態様では、アネキシンＡ５は、約０．００１～約１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９～約０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．０１～約１μｇ／ｍｌ、１日に１回、２回、３回、もしくは４回以上、又は週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回の用量で、又は症候が出現した時、又は疑わしいもしくは認知された曝露時に使用される。

一態様によれば、コロナウイルス感染症を予防及び／もしくは処置する、ならびに／又はコロナウイルス感染症におけるウイルス負荷を低減させる方法が提供され、方法は、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。

一態様では、コロナウイルス感染は、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む。

一態様では、アネキシンＡ５はヒト型である。

一態様では、アネキシンＡ５は組換え型である。

一態様によれば、コロナウイルス感染症の症候を予防及び／又は処置する方法が提供され、方法は、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。

一態様では、アネキシンＡ５はヒト型である。

一態様では、アネキシンＡ５は組換え型である。

一態様では、症候は、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ならびに／又は心不全及び／もしくは肺不全などの臓器不全を含む。

一態様によれば、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合する方法が提供され、方法は、アネキシンＡ５をインビトロ又はインビボで投与することを含む。

一態様では、アネキシンＡ５はヒト型である。

一態様では、アネキシンＡ５は組換え型である。

一態様によれば、ＡＣＥ２媒介性感染症を予防及び／又は処置する方法が提供され、方法は、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。

一態様では、ＡＣＥ２媒介性感染はコロナウイルスである。

一態様では、コロナウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。

一態様では、アネキシンＡ５はヒト型である。

一態様では、アネキシンＡ５は組換え型である。

一態様では、アネキシンＡ５は、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその活性断片を含む。

本発明の新規な特徴は、本発明の以下の詳細な説明を検討することによって当業者に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の詳細な説明及び提示されている具体例は、本発明のある特定の態様を示しているが、本発明の趣旨及び範囲内で様々な変更及び改変が本発明の詳細な説明及び以下の特許請求の範囲から当業者に明らかになり得るので、例示目的でのみ提供されていることを理解されたい。

本発明は、図を参照して以下の説明からさらに理解されるであろう。

ＡＣＥ２細胞外ドメイン（青色のカートゥーンリボン）は、三次元空間において凹状のクレフトを形成する。Ａ５に推定的に結合する残基は、ＡＣＥ２クレフト内に連続する領域を作り出す（マゼンタ色の球）。連続するＡ５相互作用領域を形成する２０残基を特定する拡大図。Ａ５（緑色のカートゥーンリボン）ヘリックスは、構造の長軸に垂直に配置されている。ＡＣＥ２（マゼンタ色の球）と推定的に相互作用する表面は、Ａ５の一方の面に局在している。この面は、Ａ５の４つのカルシウム（Ｃａ^２＋）結合部位と同じ側に位置しており、Ｃａ^２＋が相互作用を調節し得ることを示唆している。Ａ５の２６残基は、ＡＣＥ２との相互作用を媒介すると予測される。ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質のＣ末端ドメイン（オレンジ色のカートゥーンリボン）との複合体中のＡＣＥ２細胞外ドメイン（青色のカートゥーンリボン）の結晶構造。組換えヒトアネキシンＡ５によるスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）のアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）への結合の阻害。データは、ＡＣＥ２：スパイクＲＢＤ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）阻害剤スクリーニングアッセイキット（カタログ＃７９９３６、ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した３回の独立した試験の平均±ＳＥＭである。２．５μｇ／ｍｌのアネキシンＡ５は、スパイク－ＲＢＤのＡＣＥ２への結合を４６％阻害した。組換えヒトアネキシンＡ５（Ａ５）の存在下でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた、又は感染させていないヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞の代表的な画像。細胞を、Ａ５の非存在下、０．０１のＭＯＩで２時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。２時間後、ウイルスを除去し、細胞をＡ５を含有する新鮮な培地で７２時間インキュベートした。明視野画像を、ＥＶＯＳＭ７０００イメージングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、感染の７２時間後に得た。６つの独立した隣接する画像を各ウェルの中心で撮影し、ＩｍａｇｅＪ（ｖ２．１．０／１．５３ｃ）を使用してつなぎ合わせた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞の生存に対する組換えヒトアネキシンＡ５（Ａ５）の効果。細胞を、Ａ５の非存在下、０．０１のＭＯＩで２時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。２時間後、ウイルスを除去し、細胞を、Ａ５の２倍希釈物を含有する新鮮な培地で７２時間インキュベートした。生存パーセントを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。スパイクタンパク質：ＡＣＥ２相互作用に対するアネキシンＡ５の効果の溶液核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析。Ａ．この研究で使用するための、成功したヒトＡＣＥ２及びスパイク－ＲＢＤタンパク質発現を示すクーマシーブルー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル。Ｂ．試料の非常に優れた収率及び非凝集及び主に単分散性を強調する、^１５Ｎ－スパイク－ＲＢＤのサイズ排除クロマトグラフィー。Ｃ．単離（青色）、ＡＣＥ２との複合体（マゼンタ色）及びＡＣＥ２＋Ａｎｘ５との混合（緑色）における^１５Ｎ－スパイク－ＲＢＤのアミドの（^１Ｈ－^１５Ｎ）化学環境に大きな差を示す^１Ｈ－^１５Ｎ－ＨＳＱＣ重ね合わせスペクトル。直接的なＡＣＥ２の結合は、^１Ｈ－^１５Ｎピークの強度及び位置の変化によって示されている（黒色の矢印）。^１５Ｎ－スパイク－ＲＢＤ：ＡＣＥ２相互作用に対するアネキシンＡ５の構造的効果は、複合体特異的^１Ｈ－^１５Ｎピークパータベーション（白抜き矢印）によって示されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子発現に対するヒト組換えアネキシンＡ５の効果。ヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を、それぞれ０．０１又は０．００１のＭＯＩで、アネキシンＡ５（０～５μｇ／ｍｌ）の存在下において４８時間、ＷＴ（Ａ）又はＢ．１．１．７バリアント（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた。Ｎ遺伝子のｍＲＮＡレベルを、２回の独立した実験からのｑＰＣＲによって分析した（ＷＴ：ＩＣ５０＝０．０３６μｇ／ｍｌ；Ｂ．１．１．７バリアント：ＩＣ５０＝０．０１０μｇ／ｍｌ）。データは、アネキシンＡ５がＷＴ及びＢ．１．１．７バリアント感染細胞の両方においてウイルス負荷を効果的に低下させることを示す。

定義
別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、ＢｅｎｊａｍｉｎＬｅｗｉｎ、ＧｅｎｅｓＶ、（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓにより公表）、１９９４（ＩＳＢＮ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、ＴｈｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅＬｔｄ．により公表）、１９９４（ＩＳＢＮ０－６３２－０２１８２－９）；及びＲｏｂｅｒｔＡ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ、（ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により公表）、１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）に見出すことができる。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験の実践において使用することができるが、典型的な材料及び方法は本明細書に記載されている。本発明の説明及び特許請求の範囲において、以下の専門用語が使用される。

本明細書で使用される専門用語は、特定の態様のみを説明する目的であり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。記載された態様の理解を助けるために、多くの特許出願、特許、及び刊行物が本明細書で参照され得る。これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願の範囲を理解する際に、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」は、１つ又は複数の要素があることを意味することを意図している。さらに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその派生語は、本明細書で使用される場合、述べられた特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又は工程の存在を指定するが、他の述べられていない特徴、要素、構成要素、群、整数、及び／又は工程の存在を排除しないオープンエンドの用語であることを意図している。上記はまた、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの派生語などの同様な意味を有する単語にも適用される。

ある特定の構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として記載される任意の態様はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」であってもよく、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」は、クローズドエンド又は制限的な意味を有し、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」は、指定された構成要素を含むが、不純物として存在する材料、構成要素を提供するために使用される方法の結果として存在する不可避の材料、及び本発明の技術的効果を達成すること以外の目的で追加される構成要素を除く他の構成要素を除外することを意味することが理解されよう。例えば、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」という語句を使用して定義される組成物は、任意の既知の許容される添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包含する。典型的には、構成要素のセットから本質的になる組成物は、５重量％又は体積％未満、典型的には３重量％未満、より典型的には１％未満、さらにより典型的には０．１重量％未満の特定されていない構成要素（複数可）を含み得る。

含まれるとして本明細書で定義される任意の構成要素が、条件又は否定的な限定によって特許請求される発明から明示的に除外され得ることが理解されよう。

さらに、本明細書で与えられるすべての範囲は、明示的に述べられているか否かにかかわらず、範囲の端部及び任意の中間範囲点も含む。

本明細書で使用される、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」、及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの程度の用語は、最終結果が大きく変化しないように、修飾された用語の妥当な偏差の量を意味する。これらの程度の用語は、この偏差が修飾する単語の意味を否定しない場合、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。

本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を、本開示の実践又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。略語「ｅ．ｇ．」は、ラテン語ｅｘｅｍｐｌｉｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．」は、用語「例えば（ｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。「又は（ｏｒ）」という単語は、文脈が明確にそうでないことを示さない限り、「及び（ａｎｄ）」を含むことを意図している。

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに連結された２つ又はそれを超えるアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖、及び当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、その多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組み合わせが含まれる。

「バリアント」は、比較配列内の１つ又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、改変及び／又は置換によってコンパレーター配列とは異なるアミノ酸配列を有する、生物学的に活性な構築物、ポリペプチド、又はそれらの断片である。バリアントは、一般に、比較配列と１００％未満の配列同一性を有する。しかしながら、通常、生物学的に活性なバリアントは、比較配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、例えば少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するであろう。バリアントは、コンパレーター配列の生物学的活性のある程度のレベルを保持する少なくとも１０個のアミノ酸のペプチド断片を含む。バリアントはまた、１つ又は複数のアミノ酸残基が比較配列のＮ末端又はＣ末端に、又は比較配列内に付加されているポリペプチドも含む。バリアントはまた、いくつかのアミノ酸残基が欠失され、場合により１つ又は複数のアミノ酸残基によって置換されたポリペプチドも含む。バリアントはまた、例えば天然に存在するアミノ酸以外の部分を用いた置換によって、又はアミノ酸残基を改変して天然に存在しないアミノ酸を生成することによって共有結合的に改変され得る。

「アミノ酸配列同一性パーセント」は、最大配列同一性パーセントを達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、本発明のポリペプチドなどの目的の配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。Ｎ末端、Ｃ末端、又は内部伸長、欠失又は候補配列への挿入のいずれも、配列同一性又は相同性に影響を及ぼすと解釈されないものとする。アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは、「ＢＬＡＳＴ」など、当技術分野で周知である。

本明細書に記載の構築物は、改変を含み得る。そのような改変には、以下に限定されないが、エフェクター分子へのコンジュゲーションが含まれる。改変にはさらに、以下に限定されないが、検出可能なレポーター部分へのコンジュゲーションが含まれる。半減期を延長する改変（例えば、ペグ化）も含まれる。タンパク質及び非タンパク質剤は、当技術分野で公知の方法によって構築物にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーション方法には、直接連結、共有結合したリンカーを介した連結、及び特異的結合ペアメンバー（例えば、アビジン－ビオチン）が含まれる。そのような方法には、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５０、６６００－６６０７（１９９０）（参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているもの、ならびにＡｍｏｎら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３０３、７９－９０（１９９１）及びＫｉｓｅｌｅｖａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ＵＳＳＲ）２５、５０８－５１４（１９９１）（その両方ともが参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているものが含まれる。

本明細書の目的のための「活性な」又は「活性」は、本明細書に記載のアネキシンＡ５の生物学的活性を指し、「生物学的」活性は、アネキシンＡ５によって引き起こされる生物学的機能（阻害性又は刺激性のいずれか）、例えば、ＡＣＥ２への結合及び／又は病原体のＡＣＥ２への結合の阻害を指す。

「治療有効量」、「有効量」又は「十分量」という用語は、哺乳動物、例えばヒトを含む対象に投与される場合、所望の結果を達成するのに十分な量、例えば感染症又はその症候を処置及び／又は予防するのに有効な量を意味する。本明細書に記載の化合物の有効量は、病原体、又は対象の年齢、性別、及び体重などの要因によって変動し得る。当業者によって理解されるように、投与量又は処置レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調整され得る。例えば、本明細書に記載されている治療有効量のアネキシンＡ５の投与は、態様では、感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２）及び／又はその症候を処置及び／又は予防するのに十分である。

さらに、治療有効量を用いた対象の処置レジメンは、単回投与からなり得るか、又は代替的に一連の適用を含み得る。処置期間の長さは、病原体、対象の年齢、薬剤の濃度、薬剤に対する患者の応答性、又はそれらの組み合わせなどの様々な要因に依存する。処置のために使用される薬剤の有効投与量は、特定の処置レジームの経過にわたって増加又は減少し得ることも理解されよう。投与量の変化は、当技術分野で公知の標準的な診断アッセイによって生じ、明らかになり得る。本明細書に記載のアネキシンＡ５は、態様では、当該疾患又は障害のための従来の治療（例えば、抗ウイルス剤）を用いた処置の前、間又は後に投与され得る。

本明細書で使用される「対象」という用語は、動物界の任意のメンバー、典型的には哺乳動物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒト、他の高等霊長類、家畜及び農場動物、ならびに動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。

１つ又は複数のさらなる治療剤「と組み合わせて」の投与には、任意の順序での併用（同時）及び連続投与が含まれる。

「薬学的に許容される」という用語は、化合物又は化合物の組み合わせが医薬用途の製剤の残りの成分と適合性であり、米国食品医薬品局によって公布されたものを含む確立された政府基準に従ってヒトに投与することが一般に安全であることを意味する。

「薬学的に許容される担体」という用語は、以下に限定されないが、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張及び／又は吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の使用は周知である。

組成物及び方法
アネキシンＡ５と、宿主細胞侵入のためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他の病原体の受容体であるヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）との間の推定的な相互作用を示すインシリコ分析が本明細書に記載されている。Ａ５及びＡＣＥ２の間の予測された相互作用は、ＡＣＥ２へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２結合に対するアロステリック阻害を引き起こし得る。アネキシンＡ５のこの新規な作用機序のために、アネキシンＡ５は、このような病原体による感染から保護するために使用することができる予防剤として、また新規な処置モダリティとして同定されている。

アネキシンＡ５は、ＡＣＥ２への結合ならびに炎症誘発性応答、凝固、及び血栓の阻害を含む多面的な作用を有するので、ＣＯＶＩＤ－１９に対する処置としての使用によく適している。したがって、アネキシンＡ５は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞への侵入を防ぎ、したがって感染を直接予防及び処置することができ、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症及び敗血症性ショック、ならびに肺及び心臓を含む多臓器不全などのＣＯＶＩＤ－１９に関連する有害症候のいくつかを標的とすることもできる。

したがって、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と相互作用するためのアネキシンＡ５が本明細書に記載されている。アネキシンＡ５が、この目的のためにインビトロ又はインビボで使用され得、アネキシンＡ５が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスを研究するため、及び／又はＡＣＥ２を研究するための研究ツールとして使用され得ることが理解されよう。

本明細書に記載のアネキシンＡ５は、ＡＣＥ２への直接的な結合を介して、ＡＣＥ２と直接的に相互作用し得る。態様では、この結合は、ＡＣＥ２の酵素活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない可能性がある。追加の又は代替の態様では、アネキシンＡ５は、それ自体がＡＣＥ２と相互作用する別の分子との相互作用を介して、ＡＣＥ２と間接的に相互作用し得る。例えば、いくつかのウイルス又はウイルスタンパク質は、細胞に侵入するためにＡＣＥ２を使用することが公知である。アネキシンＡ５は、ＡＣＥ２と直接的に相互作用して、ウイルス侵入を低減又は防止し得るか、又はウイルス自体と相互作用して、ウイルス侵入を低減又は防止し得る。典型的な態様では、アネキシンＡ５は、コロナウイルス又はコロナウイルスタンパク質のＡＣＥ２との相互作用を阻害する。より典型的な態様では、アネキシンＡ５は、コロナウイルススパイクタンパク質のＡＣＥ２との相互作用を阻害する。

本明細書に記載のアネキシンＡ５は任意の種のものであり得るが、典型的には、対象がヒトである場合、ヒトアネキシンＡ５が使用される。アネキシンＡ５は、典型的には組換え型であり、配列番号１：

に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
又はその活性断片を含む。

態様では、アネキシンＡ５は単独で提供され、他の態様では、アネキシンＡ５は別の部分に結合、例えば共有結合している。例えば、アネキシンＡ５は、アネキシンＡ５のアミノ酸配列が別の配列に結合している融合タンパク質として提供され得る。態様では、他の部分は、例えば、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤である。他の部分は、アネキシンＡ５に結合することができる任意の種類の部分であり得、例えば、ペプチド又は小分子であり得る。

アネキシンＡ５及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む組成物、例えば治療用組成物も本明細書で提供される。組成物は、任意の使用形態のために構成され得る。しかしながら、典型的な態様では、組成物は吸入可能な組成物又は鼻腔用スプレーである。

アネキシンＡ５に関する方法及び使用も本明細書に記載されている。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を予防及び／又は処置する方法が本明細書で提供される。方法は、本明細書に記載のアネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。態様では、対象は、高血圧又は糖尿病などの慢性症状に罹患している可能性がある。追加の又は代替の態様では、対象は約６０歳を超えていてもよい。追加の又は代替の態様では、対象はＡＣＥ阻害剤を服用していてもよい。

コロナウイルス感染症を予防及び／又は処置する方法も本明細書で提供される。コロナウイルス感染症におけるウイルス負荷を低減させる方法がさらに提供される。コロナウイルス感染症の予防及び／もしくは処置に関連し得る、又はコロナウイルス感染症の予防及び／もしくは処置から独立であり得る、コロナウイルス感染症の症候を予防及び／又は処置する方法も提供される。これらの方法は、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。

アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）に結合させるための方法も本明細書で提供される。方法は、アネキシンＡ５をインビトロ又はインビボで投与することを含む。ＡＣＥ２に結合させるための方法は、疾患を処置及び／もしくは予防する目的、又は研究もしくは診断目的のためであり得ることが理解されよう。他の態様では、ＡＣＥ２媒介性感染症を予防及び／又は処置する方法が本明細書で提供される。この方法は、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む。

本明細書に記載のＡＣＥ２媒介性感染症は、ＡＣＥ２が感染因子によって使用されて細胞に侵入、及び／又は疾患の症候を引き起こす任意の感染症であり得る。ＡＣＥ２媒介性感染症の例は、コロナウイルス感染症である。例えば、コロナウイルス感染は、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり得る。任意のそのようなコロナウイルスのバリアントは、例えば以下のものも本明細書では包含される：
・アルファ（Ｂ．１．１．７及びＱ系統）
・ベータ（Ｂ．１．３５１及び子孫系統）
・デルタ（Ｂ．１．６１７．２及びＡＹ系統）
・ガンマ（Ｐ．１及び子孫系統）
・イプシロン（Ｂ．１．４２７及びＢ．１．４２９）
・イータ（Ｂ．１．５２５）
・イオタ（Ｂ．１．５２６）
・カッパ（Ｂ．１．６１７．１）
・１．６１７．３
・ミュー（Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）
・ゼータ（Ｐ．２）

アネキシンＡ５がコロナウイルスの症候を処置及び／又は予防するために使用される方法では、症候は、例えば敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ならびに／又は心不全及び／もしくは肺不全などの臓器不全であり得る。凝固、血栓、及び炎症反応も企図される。

特定の態様では、アネキシンＡ５を投与される対象は、任意の年齢であり得、併存症を有し得るか、又は他の点で健康であり得る。いくつかの態様では、対象は小児対象又は成人対象である。いくつかの態様では、対象は、６０歳以上、例えば６５、７０、又は７５歳以上などの高齢な対象である。態様における対象は、高血圧又は糖尿病などの慢性症状を有し得、態様では、別の症状を処置するために医薬品を服用していてもよい。いくつかの態様では、対象はＡＣＥ阻害剤を服用している。

アネキシンＡ５は、処置／予防するための所望の用途及び条件に応じて、任意の適切な用量で投与され得ることが理解されよう。態様では、アネキシンＡ５は、約０．００１～約１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、又は９～約０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０μｇ／ｍｌの用量で使用される。例えば、約０．１～約１μｇ／ｍｌ。同様に、投与の頻度は、対象、用途、及び症状に応じて所望するように漸増され得る。例えば、投与は、１日に１回、２回、３回、もしくは４回以上、又は週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回であり得る。態様では、アネキシンＡ５は、ＡＣＥ２媒介性感染症もしくはコロナウイルス感染症の症候が出現した時、及び／又はそのような感染に曝露した疑いがあるもしくは認知された時に投与され得る。

上記の配列と実質的に同一である配列は、例えば、少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一である配列も企図される。配列の断片又は実質的に同一なバリアント配列も本明細書で企図される。

実質的に同一な配列は、１つ又は複数の保存的アミノ酸変異を含み得る。参照配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的、又は機能的特性に実質的な変化がない変異ペプチドをもたらし得ることは、当技術分野で公知である；そのような場合、参照及び変異配列は「実質的に同一」なポリペプチドとみなされ得る。保存的アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、欠失、又は置換を含み得；保存的アミノ酸置換は、本明細書では、類似の化学的特性（例えば、サイズ、電荷、又は極性）を有する別のアミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換として定義される。

非限定的な例では、保存的変異はアミノ酸置換であり得る。そのような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸を同じ群の別のものと置換し得る。「塩基性アミノ酸」という用語は、７を超える側鎖のｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味し、これらは典型的には生理的ｐＨで正に帯電している。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」でもある）という用語は、生理的ｐＨでは帯電していないが、２つの原子によって共通して共有されている電子対が原子のうちの一方によってより密接に保持されている少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸には、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が含まれる。「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」でもある）という用語は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス疎水性スケール（１９８４）に従って０より大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸には、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が含まれる。

「酸性アミノ酸」は、７未満の側鎖のｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指し、これらは典型的には生理的ｐＨで負に帯電している。酸性アミノ酸には、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が含まれる。

配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用される；それは、２つの配列が残基の位置間で最大対応関係のためにアラインされた時に同じである残基のパーセントを計算することによって求められる。任意の公知の方法を使用して配列同一性を計算することができる；例えば、コンピュータソフトウェアが配列同一性を計算するために利用可能である。限定することを望むものではないが、配列同一性は、ＳｗｉｓｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（及び、ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／で見られるように）によって維持されているＮＣＢＩＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、Ｂｌａｓｔ－Ｎ、もしくはＦＡＳＴＡ－Ｎなどのソフトウェア、又は当技術分野で公知の任意の他の適切なソフトウェアによって計算され得る。

本発明の実質的に同一な配列は、少なくとも８５％同一であり得る；別の例では、実質的に同一な配列は、本明細書に記載の配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％（又はその間の任意のパーセンテージ）同一であり得る。特定の態様では、実質的に同一な配列は、参照配列の活性及び特異性を保持する。非限定的な実施形態では、配列同一性の違いは、保存的アミノ酸変異（複数可）に起因し得る。

様々な方法論を使用して表面に固定化された、単離又は精製されたポリペプチド、又はその断片も本明細書に包含され；例えば、限定することを望むものではないが、ポリペプチドは、Ｈｉｓ－タグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着などを介して表面に連結又はカップリングされ得る。固体表面は、任意の適切な表面、例えば、以下に限定されないが、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、膜、ビーズ（例えば、磁気ベースもしくはセファロースベースのビーズ、又は他のクロマトグラフィー樹脂）、ガラス、フィルム、又は任意の他の有用な表面であり得る。

本明細書に記載の構築物をコードする核酸分子、ならびに核酸分子を含むベクター及びベクターを含む宿主細胞も本明細書に記載されている。

本明細書に記載のアネキシンＡ５は、追加のアミノ酸残基に融合され得る。そのようなアミノ酸残基は、例えば、単離を容易にするためのペプチドタグであり得る。抗体を特定の臓器又は組織にホーミングするための他のアミノ酸残基も企図される。

本明細書に記載のアネキシンＡ５を投与するために、任意の適切な方法又は経路を使用することができる。投与の経路には、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内投与が含まれる。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症などの呼吸器感染症を処置及び／又は予防するための、鼻腔用スプレー及び吸入可能な組成物などの経鼻及び吸入投与経路が企図される。

本明細書に記載のアネキシンＡ５は、予防又は処置の目的のために哺乳動物で使用される場合、典型的には、薬学的に許容される担体を追加で含む組成物の形態で投与され得ることが理解される。適切な薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１つ又は複数、及びそれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容される担体は、アネキシンＡ５の貯蔵寿命又は有効性を増強する、湿潤もしくは乳化剤、保存剤又は緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含み得る。注射の組成物は、当技術分野で周知なように、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速な、持続的な、又は遅延的な放出をもたらすように配合され得る。

本明細書に記載の組成物は、処置される感染症もしくは他の症状の重症度及び種類、再発の可能性があると考えられるかどうか、又は感染症もしくは他の症状を予防することなどを含むいくつかの要因に応じて、数時間、数日、数週間又は数ヶ月にわたって投与され得る。投与は、一定、例えば、数時間、数日、数週間、数ヶ月にわたって一定の注入であり得る。あるいは、投与は断続的であり得、例えば、組成物は、数日間にわたって１日１回、数時間にわたって１時間１回、又は適切と考えられる任意の他のスケジュールで投与され得る。

本明細書に記載の組成物は、有効量の活性物質を薬学的に許容されるビヒクルと混合して組み合わせるように、対象に投与することができる薬学的又は外見的に許容される組成物を調製するためのそれ自体公知な方法によって調製され得る。適切なビヒクルは、例えば、「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＡｄｄｉｔｉｖｅｓ」（Ｍｉｃｈａｅｌ及びＩｒｅｎｅＡｓｈ（編）、ＧｏｗｅｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＬｉｍｉｔｅｄ、Ａｌｄｅｒｓｈｏｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９５））に記載されている。これに基づいて、組成物は、排他的ではないが、１つ又は複数の薬学的に許容されるビヒクル又は希釈剤と組み合わせた物質の溶液を含み、適切なｐＨの緩衝溶液に含まれ得、及び／又は生理液と等浸透圧であり得る。これに関して、米国特許第５，８４３，４５６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。

薬学的に許容される担体は当業者に周知であり、例えば、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、大麻油、及び水を含む。さらに、組成物は、１つ又は複数の安定化剤、例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストリン及びグルコースを含む炭水化物、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ならびにアルカリホスファートのような緩衝液を含み得る。

本明細書に記載の組成物は、実施形態では、例えば、非経口、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、嚢内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、膣内、吸入、経鼻、エアロゾル、経口、局所、又は経皮投与によって投与され得る。典型的には、本発明の組成物は、吸入又は経鼻的に投与される。

本明細書に記載の組成物は、例えば対象における感染症の予防及び／又は処置のための公知な療法と組み合わせて使用され得ることが当業者によって理解される。本明細書に記載の組成物は、実施形態では、感染症及び／又はそれらの症候に対する従来の処置と組み合わせて、同時に又は逐次的に投与され得る。本明細書に記載の組成物は、必要に応じて、そのような従来の処置と共に処方され得る。

以下の例は、ベクター及びプラスミドの構築、そのようなベクター及びプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、又は宿主細胞へのプラスミドの導入に用いるものなど、従来の方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は、当業者に周知であり、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを含む多数の刊行物に記載されている。

さらなる説明がなければ、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求される方法を実践することができると考えられる。したがって、以下の作業例は、本発明の典型的な態様を具体的に指摘しており、決して本開示の残りの部分を限定するものと解釈されるべきではない。

例
例１：ヒトアンジオテンシン変換酵素関連カルボキシペプチダーゼ（ＡＣＥ２）及びヒトアネキシンＡ５の間の推定される相互作用．
方法：
インシリコ分析：ヒトＡＣＥ２（１Ｒ４２．ｐｄｂ）及びＣａ^２＋負荷ヒトアネキシンＶ（１ＡＮＸ．ｐｄｂ）結晶構造の原子座標をインシリコ予測の入力として使用し、デフォルトパラメータを使用して実行した。ヒトＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質複合体構造（６ＬＺＧ．ｐｄｂ）を使用して、ＡＣＥ２上のＡ５及びスパイクタンパク質結合部位の相対位置を比較した。構造の画像を、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）において、１Ｒ４２、１ＡＮＸ及び６ＬＺＧ座標ファイルを使用してレンダリングした。

結果：
図１は、ヒトアンジオテンシン変換酵素関連カルボキシペプチダーゼ（ＡＣＥ２）及びヒトアネキシン５（Ａ５）の間の推定相互作用を示し、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質結合のアロステリック阻害を示唆している。（Ａ）ＡＣＥ２細胞外ドメイン（青色のカートゥーンリボン）は、三次元空間において凹状のクレフトを形成する。（Ｂ）Ａ５に推定的に結合する残基は、ＡＣＥ２クレフト内に連続する領域を作り出す（マゼンタ色の球）。（Ｃ）連続するＡ５相互作用領域を形成する２０残基を特定する拡大図。（Ｄ）Ａ５（緑色のカートゥーンリボン）ヘリックスは、構造の長軸に垂直に配置されている。（Ｅ）ＡＣＥ２（マゼンタ色の球）と推定的に相互作用する表面は、Ａ５の一方の面に局在している。この面は、Ａ５の４つのカルシウム（Ｃａ^２＋）結合部位と同じ側に位置しており、Ｃａ^２＋が相互作用を調節し得ることを示唆している。（Ｆ）Ａ５の２６残基は、ＡＣＥ２との相互作用を媒介すると予測される。（Ｇ）ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質のＣ末端ドメイン（オレンジ色のカートゥーンリボン）との複合体中のＡＣＥ２細胞外ドメイン（青色のカートゥーンリボン）の結晶構造。（Ａ～Ｆ）において、ＡＣＥ２：Ａ５相互作用部位はＢＩＰＳＰＩウェブサーバーを使用してインシリコで識別された。^１（Ｂ及びＣ）において、破線のボックスはＡＣＥ２の同様の領域を包含する。（Ｄ～Ｆ）において、Ｃａ^２＋イオンは黄色の球として示されている。（Ａ及びＤ）において、分子は、水平面に沿った移動によって、適合可能な相互作用モードを示すように配向されている。（Ｇ）において、推定のＡ５相互作用部位（マゼンタ色の球）はＡＣＥ２クレフト内にある一方、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質相互作用部位はクレフト外にある。ヒトＡＣＥ２（１Ｒ４２．ｐｄｂ）^２及びＣａ^２＋負荷ヒトアネキシンＶ（１ＡＮＸ．ｐｄｂ）^３結晶構造の原子座標をインシリコ予測の入力として使用し、デフォルトパラメータを使用して実行した。ヒトＡＣＥ２：ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２スパイクタンパク質複合体構造（６ＬＺＧ．ｐｄｂ）^４を使用して、ＡＣＥ２上のＡ５及びスパイクタンパク質結合部位の相対位置を比較した。構造の画像を、ＰｙＭＯＬ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）において、１Ｒ４２、１ＡＮＸ及び６ＬＺＧ座標ファイルを使用してレンダリングした。

参考文献：

例２：結合実験
方法：
ヒトアネキシンＡ５のｍＲＮＡ配列（アクセッション＃ＮＭ＿００１１５４）：

コーディング配列（９６３ｂｐ）がハイライトされている。

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌における完全長ヒトアネキシンＡ５タンパク質発現のためのコドン最適化配列（９６３ｂｐ）を作製し、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎＢｉｏｔｅｃｈ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、ＵＳＡ）によって合成した。

コドン最適化配列を、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（ｐＥＸ－Ｎ－Ｈｉｓ、カタログ＃ＰＳ１０００３０）を有するＯｒｉＧｅｎｅ（ｗｗｗ．ｏｒｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ）細菌発現ベクターに挿入した。このプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌にトランスフェクトして、組換えヒトアネキシンＡ５タンパク質を産生させた。Ｎ末端Ｈｉｓタグは、ＴＥＶを使用して切断可能である。

全長組換えヒトアネキシンＡ５配列は以下の通りである：

ＡＣＥ２結合阻害剤に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）スクリーニングアッセイを、製造業者の説明書（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に従って行った：簡潔には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤを９６ウェルプレートにコーティングした。次に、ＡＣＥ２－Ｈｉｓを、アネキシンＡ５（０～１０μｇ／ｍｌ）と一緒に、プレート上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤと共にインキュベートした。最後に、プレートを抗Ｈｉｓ－ＨＲＰで処理し、続いてＨＲＰ基質を添加して化学発光を生じさせ、次いで、これを化学発光リーダーを使用して測定した。

ウイルス感染細胞アッセイ：ヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を、様々な濃度のアネキシン５の存在下又は非存在下において、０．０１のＭＯＩで２時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｗｕｈａｎ株）に感染させた。このＭＯＩは、培養の７２時間後にほぼ完全な細胞病原性を誘導する。感染の２時間後、ウイルスを除去し、細胞を、アネキシン５を含有する新鮮な培地で７２時間インキュベートした。細胞の明視野画像を、ＥＶＯＳＭ７０００イメージングシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、感染の７２時間後に得た。生存パーセントを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＣｅｌｌＶｉａｂｉｌｉｔｙＡｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。

結果：
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）結合に関するスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する組換えヒトアネキシンＡ５の効果を調べた。図２は、アネキシンＡ５が、約０．０２μｇ／ｍｌという低い用量でスパイクＲＢＤのＡＣＥ２への結合を阻害し、１μｇ／ｍｌが試験された最も有効な用量であることを示す。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞の生存に対する組換えヒトアネキシンＡ５の効果を調べた。図３及び図４は、未処理細胞及び未感染細胞が健康であったことを示す。アネキシンＡ５で処理しなかった感染細胞は、生存が非常に低かった（図２には示さず）。約０．０２μｇ／ｍｌ又はそれを超えるアネキシンＡ５用量で処理した細胞は、８５％以上の生存を示した。

これらのデータは、組換えヒトアネキシンＡ５がＡＣＥ２へのスパイク－ＲＢＤ結合を阻害し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされる細胞死から保護することを示す。本発明者らの結果は、アネキシンＡ５がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防において、及びＣＯＶＩＤ－１９の処置として治療的可能性を有し得ることを示唆する。

例３：スパイクタンパク質：ＡＣＥ２相互作用に対する組換えヒトアネキシンＡ５の効果
高レベルの均一に^１５Ｎ標識されたスパイク－ＲＢＤ及びヒトＡＣＥ２細胞外ドメインが首尾よく発現された（図５Ａ、図５Ｂ）。溶液ＮＭＲモニターアミド（^１Ｈ－^１５Ｎ）の化学シフト変化によって、これらのタンパク質間の直接的な相互作用が実証された（図５Ｃ）。特に、組換えヒトアネキシンＡ５を二成分混合物に添加することは、複合体に固有ないくつかの^１Ｈ－^１５Ｎピークの位置及び強度を変化させ、スパイク－ＲＢＤ：ＡＣＥ２相互作用に対するアネキシンＡ５の大きな効果と一致した。

例４：組換えヒトアネキシンＡ５は、２９３Ｔ細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子発現を阻害する．
ヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞を、アネキシンＡ５（０～５μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２野生型（ＷＴ、オリジナルのＷｕｈａｎ株）又はＢ．１．１．７バリアント株に感染させた。ウイルス負荷を評価するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子レベルのｑＰＣＲ分析を、ウイルス感染の４８時間後に行った。図６は、組換えヒトアネキシンＡ５が、ＷＴ（Ａ）又はＢ．１．１．７バリアント（Ｂ）のいずれかに感染させた２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞において、Ｎ遺伝子発現を９０％超阻害したことを示し、アネキシンＡ５が、ヒト２９３Ｔ－ＡＣＥ２細胞におけるＷＴ及びＢ．１．１．７バリアント感染の両方において、ウイルス負荷を低減させることを示唆している。

上記の開示は、本発明を一般的に説明している。本明細書では特定の用語が用いられているが、そのような用語は説明的な意味が意図されており、限定を目的とするものではない。

上記で引用されたすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の好ましい実施形態を本明細書で詳細に説明したが、本発明の趣旨又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、変形がなされ得ることが当業者には理解されよう。

Claims

アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）と相互作用するためのアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５がＡＣＥ２に結合する、請求項１に記載のアネキシンＡ５。
ＡＣＥ２に結合するアネキシンＡ５が、ＡＣＥ２の酵素活性に実質的に影響を及ぼさない、請求項２に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が、ウイルス又はウイルスタンパク質などの別の分子のＡＣＥ２との相互作用を阻害する、請求項１に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が、コロナウイルス又はコロナウイルスタンパク質のＡＣＥ２との相互作用を阻害する、請求項４に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が、コロナウイルススパイクタンパク質のＡＣＥ２との相互作用を阻害する、請求項５に記載のアネキシンＡ５。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の研究ツールとしてのアネキシンＡ５。
ＡＣＥ２の研究ツールとしてのアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５がヒト型である、請求項１～８のいずれか一項に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が組換え型である、請求項１～９のいずれか一項に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が、配列番号１：

に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
又はその活性断片
を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載のアネキシンＡ５。
アネキシンＡ５が、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤などの部分に結合しており、場合により前記部分がペプチド又は小分子である、請求項１～１３のいずれか一項に記載のアネキシンＡ５。
請求項１～１４のいずれか一項に記載のアネキシンＡ５及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
組成物が吸入可能な組成物又は鼻腔用スプレーである、請求項１５に記載の組成物。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を予防及び／又は処置する方法であって、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
アネキシンＡ５がヒト型である、請求項１７に記載の方法。
アネキシンＡ５が組換え型である、請求項１７又は１８に記載の方法。
アネキシンＡ５が、配列番号１：

に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
又はその活性断片
を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２１に記載の方法。
アネキシンＡ５が、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤などの部分に結合しており、場合により前記部分がペプチド又は小分子である、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が吸入されるか、又は鼻腔用スプレーである、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
対象が、高血圧又は糖尿病などの慢性症状を有し、６０歳を超えており、及び／又はＡＣＥ阻害剤を服用している、請求項１７～２４のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、約０．００１～約１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９～約０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．１～約１μｇ／ｍｌ、１日に１回、２回、３回、もしくは４回以上、又は週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回の用量で、又は症候が出現した時、又は疑わしいもしくは認知された曝露時に使用される、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
コロナウイルス感染症を予防及び／もしくは処置する、ならびに／又はコロナウイルス感染症におけるウイルス負荷を低減させる方法であって、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
コロナウイルス感染が、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む、請求項２７に記載の方法。
アネキシンＡ５がヒト型である、請求項２７又は２８に記載の方法。
アネキシンＡ５が組換え型である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、配列番号１：

に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
又はその活性断片
を含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項３２に記載の方法。
アネキシンＡ５が、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤などの部分に結合しており、場合により前記部分がペプチド又は小分子である、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が吸入されるか、又は鼻腔用スプレーである、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
対象が、高血圧又は糖尿病などの慢性症状を有し、６０歳を超えており、及び／又はＡＣＥ阻害剤を服用している、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、約０．００１～約１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９～約０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．１～約１μｇ／ｍｌ、１日に１回、２回、３回、もしくは４回以上、又は週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回の用量で、又は症候が出現した時、又は疑わしいもしくは認知された曝露時に使用される、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
コロナウイルス感染症の症候の予防及び／又は処置する方法であって、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
コロナウイルス感染が、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む、請求項３８に記載の方法。
アネキシンＡ５がヒト型である、請求項３８又は３９に記載の方法。
アネキシンＡ５が組換え型である、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、配列番号１：

に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
又はその活性断片
を含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の方法。
アネキシンＡ５が、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤などの部分に結合しており、場合により前記部分がペプチド又は小分子である、請求項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が吸入されるか、又は鼻腔用スプレーである、請求項３８～４５のいずれか一項に記載の方法。
症候が、敗血症、敗血症性ショック、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、ならびに／又は心不全及び／もしくは肺不全などの臓器不全を含む、請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。
対象が、高血圧又は糖尿病などの慢性症状を有し、６０歳を超えており、及び／又はＡＣＥ阻害剤を服用している、請求項３８～４７のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、約０．００１～約１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９～約０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．１～約１μｇ／ｍｌ、１日に１回、２回、３回、もしくは４回以上、又は週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回の用量で、又は症候が出現した時、又は疑わしいもしくは認知された曝露時に使用される、請求項３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
ＡＣＥ２媒介性感染症を予防及び／又は処置する方法であって、アネキシンＡ５をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法。
ＡＣＥ２媒介性感染がコロナウイルスである、請求項５０に記載の方法。
コロナウイルスが、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項５１に記載の方法。
アネキシンＡ５がヒト型である、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が組換え型である、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその活性断片を含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の方法。
アネキシンＡ５が配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項５６に記載の方法。
アネキシンＡ５が、治療剤、検出可能な薬剤、及び／又は標的化剤などの部分に結合しており、場合により前記部分がペプチド又は小分子である、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が吸入されるか、又は鼻腔用スプレーである、請求項５０～５８のいずれか一項に記載の方法。
対象が、高血圧又は糖尿病などの慢性症状を有し、６０歳を超えており、及び／又はＡＣＥ阻害剤を服用している、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の方法。
アネキシンＡ５が、約０．００１～約１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９～約０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０μｇ／ｍｌ、例えば約０．１～約１μｇ／ｍｌ、１日に１回、２回、３回、もしくは４回以上、又は週に１回、２回、３回、４回、５回、もしくは６回の用量で、又は症候が出現した時、又は疑わしいもしくは認知された曝露時に使用される、請求項５０～６０のいずれか一項に記載の方法。